Summary
Este protocolo demonstra as metodologias para um modelo do rato do ferimento de cérebro traumático do abrir-crânio e a transplantação de pilhas células-derivadas pluripotentes induzidas humanas cultivadas no local da lesão. Os testes comportamentais e histologic dos resultados destes procedimentos são descritos igualmente em breve.
Abstract
A lesão cerebral traumática (TCE) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. A patologia da doença devido ao TBI progride do insulto mecânico preliminar aos processos secundários da lesão, incluindo o apoptose e a inflamação. A modelagem animal tem sido valiosa na busca de desvendar os mecanismos de lesão e avaliar potenciais terapias neuroprotetoras. Este protocolo descreve o modelo de impacto cortical controlado (CCI) de TBI focal, de cabeça aberta. Especificamente, os parâmetros para produzir um ferimento cortical unilateral suave são descritos. As conseqüências comportáveis do CCI são analisadas usando o teste da remoção da fita adesiva da integração sensorimotor bilateral. A respeito da terapia experimental para a patologia de TBI, este protocolo igualmente ilustra um processo para transplantar pilhas cultivadas no cérebro. As culturas de pilha neural derivadas das pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) foram escolhidas para seu potencial mostrar a restauração funcional superior em pacientes humanos de TBI. A sobrevivência crônica de hiPSCs no tecido cerebral do rato do anfitrião é detectada usando um processo immunohistochemical modificado de DAB.
Introduction
A lesão cerebral traumática (TCE) é um termo geral para a lesão adquirida no cérebro devido a forças mecânicas indiretas (aceleração/desaceleração rotacional ou contra-golpe) de golpes na cabeça ou dano direto de objetos ou ondas de explosão. Estima-se que a TBI seja a causa de aproximadamente 9% das mortes mundiais e observada em uma estimativa de 50 milhões casos por ano1,2. Um relatório 2017 dos centros de controle e prevenção de doenças estimou que, em 2013, houve um total de 2,8 milhões visitas hospitalares e óbitos por TBI nos Estados Unidos3. Muitos TBIs mais leves não são relatados todos os anos. TBI grave pode levar ao comprometimento vitalício da cognição, função motora e qualidade de vida geral. As conseqüências da TBI leve, especialmente TBI repetitiva relacionada ao esporte, foram apenas recentemente apreciadas por seus efeitos insidiosos de saúde4,5.
A modelagem pré-clínica é um componente vital do desenvolvimento de novas percepções mecanísticas e da terapia restauradora potencial para a TBI. O modelo controlado do impacto cortical (CCI) de TBI é um modelo da abrir-cabeça de ferimento mecânico da contusão ao córtice. Os parâmetros de impacto podem ser modificados para produzir lesões CCI que variam de leve a grave6. Os ferimentos do CCI são focais um pouco do que difuso, como visto com outros modelos de cabeça fechados de TBI. CCI pode ser realizado para induzir uma lesão unilateral, de tal forma que o córtex contralateral pode servir como um comparador interno. Este protocolo demonstra as características de um CCI suave a uma parcela do córtice que abrange as regiões somatosensory e motoras preliminares. Esta área cortical foi escolhida para sua participação em comportamentos sensorimotor para que os testes de comportamento numerosos podem detectar deficits ferimento-induzidos7. As melhorias comportamentais devido às intervenções terapêuticas para o TBI podem ser detectadas, também.
Uma característica da TBI é a disfunção neural generalizada na região lesada. Neurônios feridos sofrem morte celular, e a conectividade de rede neuronal é interrompida8,9. O TBI interrompe o recrutamento de células-tronco endógenas, o que leva a mais déficits de comportamento downstream10,11. A transplantação de pilhas de haste neural e de pilhas de pilha-derivadas da haste foi explorada como uma possibilidade restaurar a função no cérebro ferido. Além do potencial para restaurar os circuitos neurais danificados, as células transplantadas exercem efeitos paracrinos que promovem a sobrevida neuronal e a recuperação funcional do TBI12. Uma variedade de tipos de células foram transplantadas pré-clinicamente para avaliar seu potencial restaurador em modelos de distúrbios neurológicos13,14,15. A recente popularização da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas16 facilitou o desenvolvimento de inúmeras linhagens de células-tronco humanas para uso experimental. O teste pré-clínico com células derivadas de hiPSC é um primeiro passo importante para caracterizar a potencial eficácia terapêutica de uma determinada linha celular contra doenças humanas. Este laboratório desenvolveu protocolos para diferenciar hipscs aos fenótipos neural17 na perseguição de pilhas transplantáveis para ajudar à recuperação do ferimento de cérebro traumático.
As experiências neste protocolo usam um CCI unilateral para induzir o TBI ao córtice somatosensory e do motor esquerdo de ratos adultos. Uma lesão leve do CCI conduz a um deficit funcional sustentado no forepaw direito que é usado para controlar os efeitos do Engraftment hiPSC-derivado da pilha neural na recuperação funcional. O teste sensorimotor do forepaw neste protocolo foi adaptado da metodologia estabelecida por Bouet e por colegas18 e demonstrado previamente por Fleming e por colegas19. Este protocolo esboça um fluxo de trabalho completo para executar uma lesão cerebral experimental, transplantação terapêutica de pilhas dos quadris, e análise comportamental e histologic de medidas experimentais do resultado.
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Protocol
Todos os experimentos descritos neste protocolo foram revisados e aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais universitários da Uniformed Services.
1. craniectomia e impacto cortical controlado
- Preparação do dispositivo de impacto cortical controlado e suprimentos cirúrgicos.
- Coloque uma seringa de 1 mL de ponta de deslizamento com 0,5 mL de soro fisiológico estéril para irrigação de feridas. Coloque uma agulha de 25 G na seringa para controlar a irrigação.
- Prepare uma solução diluir de CsA no DMSO à concentração final de 1 mg/mL. Carregue uma segunda seringa de 1 mL com ponta de deslizamento com 0,5 mL de solução de ciclosporina A (CsA) para imunossupressão. Fixe uma agulha de 25 G ou maior à seringa CsA.
- Prenda o pistão controlado do impacto cortical a um braço em um frame Stereotaxic e ajuste-o a um ângulo de 15 °. Prenda uma sonda de pêndulo de 3 mm ao pistão.
- Ajuste a velocidade do impacto a 1,5 m/s e o tempo de permanência do impacto a 0,1 s para produzir uma lesão cortical suave.
- Realize uma craniectomia unilateral
- Coloque o rato numa câmara de indução anestésica ligada a um vaporizador isoflurano com fonte de oxigénio comprimido. Induza a anestesia com ~ 3% de isoflurano em ~ 0,7 L/min de oxigênio. Verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta ao dedo do pé-pitada.
- Raspar o couro cabeludo usando tosquiadeiras elétricas e limpe qualquer pele solta.
- Coloc o rato em um frame Stereotaxic com o cone de nariz anexado da entrega do anestésico.
- Coloc uma almofada de aquecimento ajustada a 37 ° c no frame Stereotaxic o rato para manter a temperatura de corpo a anestesia. Fixar a cabeça no lugar com barras de ouvido e uma barra de mordida e orientar a cabeça de tal forma que o osso frontal do crânio é horizontal. Manter a anestesia em ~ 1,5%-2% isoflurano para a duração da cirurgia.
- Para realizar o cuidado pré-operativo e a preparação cirúrgica asséptica, aplique a pomada oftálmica antibiótica aos olhos usando um cotonete estéril do algodão. Aplique uma solução à base de iodo na área do couro cabeludo raspado. Remova isto com 70% de etanol. Cubra o animal com um drapejar cirúrgico fenestrado de modo que a parte superior da cabeça é visível, mas os olhos são cobertos.
- Faça uma incisão na linha média (1,5-2 cm) no couro cabeludo usando um bisturi ou tesoura. Use cotonetes estéreis de algodão para limpar a ferida e para limpar a fáscia esquerda da linha média em Bregma.
- Use a sonda de pêndulo para identificar o local da craniectomia.
- Defina o ponto de referência estereotódico (X = 0, Y = 0) para Bregma. Regule a sonda lateralmente para 2 mm à esquerda da linha média. Delinear um círculo de 5 mm de diâmetro ao redor da sonda usando um marcador cirurgicamente seguro de ponta fina. Levante e gire o pêndulo para fora da posição.
- Use a ferramenta giratória de alta velocidade do jogo do micromotor da mão para fazer um furo aberto no crânio usando um bocado de broca do Burr da redondo-ponta 0,6 milímetro ou de 0,8 milímetros na velocidade máxima de ~ 70%-80%. Aplique a pressão clara ao crânio ao perfurar ao longo do esboço circunferencial de 5 milímetros para diluir esta beira.
- Não aplique excesso de pressão durante a perfuração. Isto pode causar ferimento cortical devido à vibração, à compressão, ou à penetração acidental. Permitir que a velocidade da broca para fazer o trabalho.
- Não perfurar em qualquer ponto dado por muito tempo para evitar o excesso de atrito de aquecimento do crânio. Irrigar a craniectomia ocasionalmente com soro fisiológico estéril para remover detritos e reduzir o aquecimento da ferramenta rotativa.
- Preste muita atenção durante a perfuração sobre a linha de sutura coronal como estes pontos são vulneráveis à hemorragia.
- Use um par de pinças finas para remover a aleta do crânio quando o contorno craniectomy é suficientemente diluído. Agarre a aleta medially, e levante-a delicadamente e puxe lateralmente com um movimento radial.
- Não danificar a dura-máter ao levantar o retalho; Isto pode causar ferimento severo e hemorragia.
- Realize uma lesão de impacto cortical controlada leve
- Limpe a sonda de pêndulo com uma almofada de preparação de álcool estéril. Mova a sonda de pêndulo de volta para a posição sobre o córtex exposto. Abaixe a sonda até tocar a superfície da dura-máter. Marque esta posição como Z = 0.
- Retire o pistão e mova-se para Z =-1,0 mm. Descarregue o pistão para impactar o córtex.
- Levante rapidamente o pistão e mova o braço para fora da posição. Aplique quantidades generosas de soro fisiológico para irrigar o córtex após a lesão. Enxágüe o local da cirurgia com soro fisiológico conforme necessário e sugue a incisão do couro cabeludo usando simples stiches interrompidos com 5,0 sutura de seda.
- Realizar cuidados pós-operatórios no rato
- Interrompa a anestesia. Entregar CsA por injeção subcutânea em scruff em dose de 10 mg/kg. Coloc o rato em uma gaiola postoperative limpa e pre-warmed.
- Forneça o analgésico do paracetamol na água bebendo em 1,0 mg/ml.
Nota: fornecer analgesia de acordo com o procedimento de operação padrão IACUC adequado e em consideração de variáveis de desfecho experimental (por exemplo, sedação, neuroinflamação). - Forneça o alimento umedecido da comida em uma gaiola aquecida da recuperação para ajudar na reidratação e na recuperação.
- Proceda da secção 2 para a secção 4 acima quando efectuar controlos apenas de craniectomia (Sham).
2. transplantação Stereotaxic da suspensão da pilha
- Comece o procedimento da transplantação da pilha aproximadamente 24 h após a craniectomia.
- Prepare o equipamento de transplante de células e suprimentos cirúrgicos
- Encha uma seringa com ponta de deslizamento de 1 mL com soro fisiológico estéril para irrigação de feridas. Coloque uma agulha de 25 G na seringa para controlar a irrigação.
- Encha uma seringa da deslizamento-ponta de 1 mL com solução de CsA para o immunosuppression. Fixe uma agulha de 25 G ou maior à seringa CsA. Encha a seringa CsA conforme necessário entre as cirurgias.
- Prepare agulhas de vidro de 1,0 mm de pipetas capilares de vidro de borosilicato OD usando métodos padrão.
- Use pinças finas para quebrar as pontas da agulha para aproximadamente um diâmetro de 200 μm. Certifique-se de que o eixo cilíndrico da agulha não é mais do que 2,5 cm.
- Calibre a bomba da seringa para utilização com uma seringa de 10 μL. Insira uma vazão de 0,2 μL/min para entregar um volume total de 2,0 μL.
- Prepare a suspensão pluripotente induzida humana da pilha de haste (iPSC).
- Realize toda a manipulação da pilha em uma capa da cultura de célula BSL-2 usando técnicas de manipulação estéreis padrão.
- Prepare as culturas de células com antecedência de acordo com as condições padrão definidas para o tipo de célula. Consulte Lischka et al.17 como exemplo.
Nota: as experiências mostradas nesta demonstração usaram várias pilhas neurais do phenotype derivadas de hiPSCs. - Dissociar suavemente as células em uma suspensão de célula única usando uma solução de descolamento de células, ou outros meios enzimáticos ou químicos preferidos.
- Contagem de células em suspensão, em seguida, diluir a suspensão para 5 x 104 células/μl em meio de cultura celular mínima (por exemplo, DMEM) em um tubo de teste flip top 1,7 ml.
- Observe as seguintes notas para transplante:
- Manter as células em suspensão a 37 ° c durante a duração dos procedimentos.
- Carregue a seringa apenas imediatamente antes de realizar a injeção intraparenquimatosa (passo 4,5 abaixo).
Nota: a gravidade pode fazer com que a suspensão da célula se estabeleça ou se agarre ao lado da seringa se colocada ao seu lado. Isso leva a irregularidades no número de células injetadas. - Allot ~ 5 x 105 células (10 μL de suspensão) por rato se executar vários procedimentos de transplante de células em um dia.
- Realizar cirurgia de transplante estereotódico
- Coloque o rato numa câmara de indução anestésica ligada a um vaporizador isoflurano com fonte de oxigénio comprimido. Induza a anestesia com ~ 3% de isoflurano em ~ 0,7 L/min de oxigênio.
- Coloc o rato em um frame Stereotaxic com o cone de nariz anestésico anexado.
- Fixar a cabeça no lugar com barras de ouvido e uma barra de mordida e orientar a cabeça de tal forma que o osso frontal do crânio é horizontal. Manter a anestesia em ~ 1,5%-2% isoflurano para a duração da cirurgia.
- Realizar cuidados pré-operatórios e preparação asséptica
- Aplique a pomada oftálmica hidratando que contem o antibiótico aos olhos usando um cotonete de algodão.
- Lavage o local da incisão com soro fisiológico estéril para limpar o local e para afrouxar suturas. Aplique suavemente 70% de etanol com um cotonete de algodão para esterilizar o local da incisão.
- Retire as suturas usando pinças finas e tesouras oftálmicas. Irrigar o local da cirurgia e a craniectomia com salina estéril abundante.
- Considere o animal para a exclusão se o córtice indica as características de desqualificação que incluem o herniation excessivo, a descoloração, a vascularização interrompida, ou a hemorragia.
- Carregar a seringa de transplante de células
- Mova a suspensão da pilha da incubadora de 37 ° c a uma capa da Biossegurança da cultura de pilha. Gire suavemente ou bata o tubo para garantir uma suspensão celular homogênea.
- Use um micro pipetador para carregar a suspensão da pilha de ~ 7,5 μL na seringa de Hamilton através da extremidade do atuador.
- Segure a seringa a um ângulo de ~ 120 ° com a extremidade do êmbolo virada para baixo. Insira o êmbolo, tendo o cuidado de não introduzir uma bolha de ar entre a suspensão e a ponta do êmbolo.
- Fixe o conjunto da junta à agulha da pipeta e, em seguida, prenda a agulha à seringa.
- Empurre o êmbolo para mover a suspensão da célula para a agulha da pipeta. Se houver resistência contra o escoamento da suspensão, use pinças finas para quebrar a ponta da agulha para ampliar o diâmetro.
- Prenda a seringa à bomba de seringa estereotótaxa. Avance o êmbolo para se certificar de que o conjunto da bomba de seringa está a funcionar correctamente.
- Mova a agulha para as coordenadas para a injecção.
- Alinhe a ponta da agulha à Bregma. Defina as coordenadas X e Y como 0. Em seguida, mova a ponta da agulha sobre a craniectomia para 2,0 mm lateral e-1,0 mm posterior para Bregma. Toque na ponta da agulha na superfície da dura-máter e defina a coordenada estereotástrica como Z = 0.
- Empurre o êmbolo para garantir que a suspensão da célula esteja a fluir adequadamente antes de introduzir a agulha no cérebro.
- Introduzir a agulha no cérebro a uma profundidade de Z =-1,4 mm. Estas coordenadas Stereotaxic coloc a corrupção na beira cinzenta da matéria-matéria branca do córtice profundo20.
- Inicie a bomba da seringa para inutilizar a suspensão celular. Ajuste o temporizador do banco do laboratório a 15 minutos e comece o temporizador. Use um microscópio de longa distância de trabalho para monitorar a saída da suspensão celular.
- Irrigar o local da cirurgia com soro fisiológico estéril durante a injeção para manter a hidratação tecidual.
- A 15 min, retire lentamente a agulha de transplante. Irrigar o local da cirurgia com soro fisiológico e fechar a incisão com suturas.
- Realizar cuidados pós-operatórios
- Interrompa a anestesia. Entregar CsA por injeção subcutânea em scruff em dose de 10 mg/kg. Coloc o rato em uma gaiola postoperative limpa e pre-warmed.
- Forneça o analgésico do paracetamol na água bebendo em 1,0 mg/ml.
Nota: fornecer analgesia de acordo com o protocolo de operação padrão IACUC (SOP) adequado e em consideração das variáveis de desfecho experimental. - Forneça a gaiola umedecida da recuperação do alimento de Chow para ajudar na reidratação e na recuperação.
- Continue injeções diárias de CsA em 10 mgs/quilograma durante todo a duração da sobrevivência do rato.
3. teste da remoção da fita adesiva da integração sensorimotor
- Corte a fita elétrica em tiras de 3 mm x 5 mm usando uma navalha pequena antes de realizar o teste de comportamento. Use uma superfície de vidro Lisa para cortar as tiras adesivas.
Nota: use fita amarela e vermelha, pois os camundongos têm dificuldade em distinguir entre estas cores21.- Selecione um pequeno espelho que se encaixa bem dentro da caixa de plástico transparente.
- Fixe o espelho no lugar em um ângulo de aproximadamente 45 ° com argila de modelagem ou fita adesiva a fim ver o comportamento animal de abaixo.
- Coloc a caixa e o conjunto do espelho em um banco em uma sala de teste dedicada quieta do comportamento. Organize o cilindro na caixa de plástico acima do espelho.
- Arranje o pano de manipulação, as pinças, e as tiras adesivas na bancada ao lado da caixa do teste do comportamento.
- Limpe a caixa e o cilindro com 70% de etanol e toalhas de papel. Deixe as superfícies secar completamente.
- Tragam os ratos para a sala de testes de comportamento. Permita que os ratos aclimatar à sala de testes por pelo menos 30 minutos antes do teste do comportamento.
- Remova as fontes de água das gaiolas para minimizar eventos de micção durante o teste, o que pode interferir no desempenho eficiente do teste.
- Selecione um pequeno espelho que se encaixa bem dentro da caixa de plástico transparente.
- Realize o teste de remoção de adesivo
Nota: este teste de comportamento é melhor executado por dois a três investigadores: um para operar os cronômetros, e um ou dois para lidar com os ratos e observar o comportamento.- Use cada pinça para descascar uma tira adesiva de cada cor.
- Escolha qual cor de faixa corresponde a qual forepaw e permanecem consistentes durante todo o julgamento.
- Use o pano de manipulação para conter um rato pelo scruff da garganta e da parte traseira tais que o rato prende as patas dianteiras longe de seu corpo e cabeça.
- Use pinças para colocar uma tira adesiva na superfície plantar de cada pata. Use a pressão delicada e consistente do dedo para fixar as tiras às patas.
- Coloque rapidamente o rato no cilindro plástico. Iniciar os dois cronômetros quando o mouse tem todas as quatro patas na caixa de plástico.
- Use os dois cronômetros para registrar as latências para os seguintes quatro eventos: aviso de pata esquerda, remoção de pata esquerda, aviso de pata direita, remoção da pata direita.
- Grave um evento de aviso quando o animal faz reconhecimento inequívoco da tira adesiva agitando ou arremessando a pata ou mordendo a tira.
- Grave um evento de remoção quando o animal efetivamente remove a faixa da superfície plantar da pata dianteira.
Nota: o evento remove não é desclassificado pelo readherence da tira ou se a tira se agarra à superfície lateral do forepaw. - Pare o temporizador em 120 s se a tira correspondente não foi removida.
- Registre os tempos decorridos para os quatro eventos na folha de dados.
- Executar uma segunda avaliação em cada mouse
- Permitir que um mínimo de 5 min para decorrer entre ensaios para um mouse individual para reduzir o stress, que pode interferir com o desempenho eficiente no teste.
- Limpe o aparelho com toalhas de papel entre os ratos de teste para remover os resíduos ao testar vários ratos de uma única gaiola.
- Limpe o aparelho cuidadosamente com 70% de etanol e toalhas de papel ao testar camundongos de várias gaiolas.
- Inverta a ordem de colocação de pata de cor para a segunda avaliação da sessão para randomizar qualquer efeito de cor.
- Calcule a latência média de cada evento entre dois ensaios por sessão diária para cada animal.
- Use cada pinça para descascar uma tira adesiva de cada cor.
- Limpe o aparelho e manuseando completamente o pano com água, substitua as fontes de água da gaiola e devolva os ratos à sua instalação de detenção.
- Repita as etapas 3.1-3.2 em sucessivos temporais experimentais para um experimento de avaliação de medidas repetidas.
Nota: Repita as etapas 3.2.1-3.2.5.3 diariamente por 5 dias antes de qualquer coleta de dados para acliestar os animais para a tarefa. A aquisição de dados basal antes da cirurgia é recomendada.
4. análise imuno-histoquímica da diaminobenzidina (DAB) da sobrevida do enxerto e patologia de lesão
- Eutanizar os animais e realizar uma perfusão perfusão.
- Prepare soluções de 0,1 M de solução salina tampão fosfato (PBS) e 4% paraformaldeído (PFA) em PBS. Equilibrar o pH de ambas as soluções para 7,4.
- Coloc as duas soluções no gelo em uma capa das emanações. Coloc uma bomba peristáltica na capa das emanações, e funcione a bomba para encher a tubulação com PBS. Ajuste a vazão da bomba para ~ 7 ml/min. Ligue uma agulha de 25 G ao tubo de saída da bomba.
- Coloque uma bandeja de drenagem com um substrato macio no capô. Levante uma extremidade da bandeja em um ângulo ligeiro de modo que os líquidos da perfusão drenem à extremidade mais baixa.
- Coloque um rato numa câmara de indução anestésica. Encha a câmara com o isoflurano de 4% usando o gás comprimido do veículo do oxigênio de 100%.
- Mova o rato anestesiado da câmara para um cone de nariz de anestesia. Diminua o isoflurano para 2%.
- Faça uma toracotomia para expor o coração. Interromper a anestesia, como a toracotomia provoca eutanásia.
- Coloque cuidadosamente a agulha de saída da bomba de perfusão no ventrículo esquerdo ao longo do longo eixo do coração. Não perfure o septo cardíaco, pois isso causará má perfusão.
- Use tesouras pequenas para cortar o vestíbulo direito, a seguir gire imediatamente sobre a bomba peristáltica.
- Continue o fluxo de PBS até que o fluido deixando o átrio direito corre clara de sangue.
- Desligue a bomba. Mova o tubo de admissão da bomba para o recipiente de PFA. Reinicie a bomba. Continue a perfusing PFA até que o animal seja suficientemente rígido ou até que um volume de 20 mL seja bombeado.
- Desligue a bomba. Retire a agulha de saída do coração. Mova o tubo de admissão do PFA para o PBS e lave completamente o PFA do tubo.
- Retire o cérebro do crânio por dissecção cuidadosa. Coloque o cérebro em um pequeno recipiente preenchido com 4% paraformaldeído, e permitir que o cérebro para pós-Fix durante a noite a 4 ° c.
- No dia após a pós-fixação, substitua o P por PBS e 0,1% de azida sódica. Armazene os cérebros nesta solução até a preparação para o seccionamento histológico.
- Colete 40-50 μm seções de tecido de cérebro formaldeído-fixo através de um micrótomo congelante ou vibratome temperatura ambiente.
- Pretrate os tecidos em peróxido de hidrogênio a 0,3% em água para inativar peroxidases endógenas, que podem produzir coloração não específica.
- Realize a recuperação do antígeno usando o tampão do ácido cítrico (citrato de sódio de 10 mM, 0, 5% Polysorbate-20, pH 6,0) a 60 ° c por 30 min.
- Realize a rotulagem de anticorpos por métodos padrão. Consulte Lundell et al.' s relatório22 deste laboratório para mais detalhes.
- Use um kit de neutralização de IgG do mouse (consulte a tabela de materiais) para reduzir a reatividade cruzada com anticorpos endógenos. Incubar os tecidos no tampão de neutralização de IgG por pelo menos 1 h à temperatura ambiente (RT), seguindo as instruções do fabricante.
- Use um anticorpo preliminar do antígeno nuclear do anti-Human do rato (hNA; 1:500 diluição) ao transplantar pilhas humanas iPSC-derivadas para encontrar as pilhas transplantadas. Incubar os tecidos com o anticorpo primário a 4 ° c por 48-72 h, utilizando agitação suave.
- Após enxaguar a solução de anticorpos primários, incubar os tecidos com anticorpo secundário de rato conjugado com HRP a 1:250 de diluição por 2 h em RT.
- Execute a reação do cromogénio de DAB por métodos padrão para revelar Immunolabeling. Permitir que a reação DAB se desenvolva por 5 a 10 min em RT.
- Anexar tecidos manchados a slides e aplicar deslizamentos de cobertura usando métodos padrão.
- Quantificar números de células rotuladas usando estereologia imparcial como descrito anteriormente23,24. Realize análises usando seções ópticas de 20 μm e um intervalo de seção entre três.
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Representative Results
A cirurgia da craniectomia facilita a lesão cerebral experimental e a transplantação terapêutica da pilha: o modelo de impacto cortical controlado de ferimento de cérebro e a terapia subseqüente da transplantação da pilha exigem a remoção cuidadosa do crânio sobrejacente. A craniectomia pode ser realizada em qualquer superfície dorsal do crânio para permitir manipulações para a região cerebral de interesse. O diagrama na Figura 1 retrata um esquema craniectomy de 5 mm de diâmetro para revelar os córtices somatosensoriais e motores primários (Figura 1a). Em 24 h após a craniectomia, uma segunda cirurgia foi executada para injetar a suspensão humana iPSC-derivada da pilha neural em camadas profundas do córtice (Figura 1B). Algum edema cerebral é normal no primeiro dia que segue craniectomy, e particularmente após CCI. No entanto, a vasculatura cerebral poupando durante todas as fases deste procedimento é crucial para a sobrevivência do córtex. A Figura 2 ilustra o procedimento da transplantação da pilha em um rato com o herniation cerebral mínimo, o sangramento mínimo, e o vascularization cortical extensivo. Estas características são bons indicadores prognósticos de uma cirurgia bem sucedida.
O teste da remoção da fita adesiva revela deficits sensorimotor após ferimento de cérebro unilateral: os parâmetros do modelo do ferimento de cérebro descrito acima foram previstos para afetar a função sensorial e do motor do membro torácico. O teste da remoção da fita adesiva foi escolhido para avaliar a severidade de deficits funcionais do membro torácico, e os benefícios terapêuticos potenciais da transplantação da pilha. Os camundongos foram treinados no procedimento de teste por 5 dias, em seguida, permitiu descansar por dois dias antes do teste de comportamento basal. As cirurgias foram realizadas no dia seguinte ao teste basal. Os testes de comportamento neste estudo foram realizados nos dias de pós-operatório 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35 e 42. A Figura 3 mostra os resultados de um experimento piloto no qual a função do membro torácico em camundongos com craniectomia isolada (Sham) e com lesão de CCI foi comparada com a função do membro torácico em camundongos ingênuos (n = 11 ingênuo, 12 Sham, 11 CCI). Camundongos submetidos à cirurgia exibiram latências aumentadas transitórias para notar estímulos adesivos por 1-3 dias imediatamente após a cirurgia (Figura 3A, B). Os camundongos mostraram déficits pós-operatórios transitórios na remoção adesiva do antepata ipsilateral também (Figura 3C). No entanto, camundongos que realizaram CCI apresentaram déficits significativos no desempenho motor no antepata contralateral à lesão em comparação com camundongos ingênuos até o dia de pós-operatório 28 (Figura 3D). Estes dados igualmente descrevem a severidade inesperada da perda sensorimotor em ratos craniotomized sem CCI, indicando que a craniectomia cirúrgica a esta área igualmente induz déficits Neurofuncional TBI-relacionados.
Immunodetection da pilha de haste pluripotente induzida humana (IPSC)-enxertos de pilha derivados em seções do cérebro do rato: as experiências foram executadas para determinar se as pilhas neurais IPSC-derivadas humanas sobreviveriam a transplantação a longo prazo no cérebro do rato. Células-tronco neurais humanas (NSCs) derivadas de iPSCs foram diferenciadas em neurônios imaturos ou astrócitos in vitro utilizando métodos estabelecidos17. Os transplantes de cada um dos três fenótipos de células neurais foram testados em nosso modelo CCI de lesão cerebral traumática utilizando o procedimento descrito acima e representado na Figura 2. Os camundongos foram eutanasiados para análise histológica aos 7 dias após o transplante. As seções do cérebro do rato foram immunomanchadas para o antígeno nuclear humano (hNA). Os enxertos de células humanas podem ser claramente distinguidos do tecido hospedeiro em cirurgia simuladora e cérebros CCI (Figura 4). As corrupções do astrocyte (n = 3 Sham, 2 CCI) mostraram a sobrevivência pobre comparada aos NSCs (n = 12 Sham, 15 CCI) e aos neurônios (n = 11 Sham, 10 CCI), e não foram considerados para experiências futuras.
Figura 1 : Coordenar parâmetros de manipulações cirúrgicas. Representações dos desenhos animados de regiões do cérebro do rato do interesse. Os círculos vermelhos indicam uma craniectomia de ~ 5 mm de diâmetro. Uma cruz vermelha indica o ponto central da craniectomia 2 milímetros lateral a Bregma. (A) a região sombreada do córtex cerebral no diagrama superior é afetada por CCI leve quando uma craniectomia é realizada como mostrado no diagrama inferior. (B) a seta azul no diagrama superior indica a localização aproximada das injeções de células a 1,4 mm de profundidade da superfície cortical. A cruz azul no diagrama inferior indica a colocação de injeção celular 2 mm lateral e 1 mm posterior a Bregma. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Monitoração intraoperativa da injeção da suspensão da pilha. Fotografia tomada através de um microscópio de trabalho longo da distância durante a injeção intraparenchymal da pilha. As características anatômicas são anotadas para a claridade. O couro cabeludo obscurece parcialmente o local da cirurgia para minimizar a desidratação durante o procedimento. O sangramento menor pode ocorrer durante a penetração da agulha como mostrado, que não é causa para a preocupação se os grandes vasos corticais permanecem intactos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Avaliação comportamental da integração sensoriomotora após lesão cerebral. Camundongos submetidos à craniectomia e CCI foram comparados aos controles ingênuos e aos camundongos submetidos a apenas cirurgia simulando (n = 11 ingênuo, 12 Sham, 11 CCI). Os dados são apresentados como latências médias de grupo, com barras de erro indicando SEM. (A) camundongos submetidos a ICC apresentaram aumento da latência para reconhecer estímulos adesivos aplicados ao antepata ipsilateral no primeiro dia de pós-operatório. (B) camundongos submetidos à craniectomia ou CCI exibiram latência substancialmente aumentada para notar estímulos adesivos aplicados ao antepata contralateral nos dias de pós-operatório 1 e 3. (C) camundongos submetidos à CRANIECTOMIA ou CCI exibiram latência substancialmente aumentada para remover estímulos adesivos do antepata ipsilateral nos dias de pós-operatório 1 e 3. (D) camundongos submetidos à craniectomia ou CCI exibiram latência substancialmente aumentada para remover estímulos adesivos do antepata contralateral nos dias de pós-operatório 1-5. Os deficits do motor nos ratos com CCI persistiram fortemente por 28 dias após ferimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Imuno-histoquímica DAB para enxertos de células humanas em cérebros de rato. As iPSCs humanas foram diferenciadas em células-tronco neurais (NSCs), neurônios ou astrócitos in vitro. As culturas de pilha foram transplantadas em cérebros do rato com ou sem CCI. Camundongos foram eutanasiados para análise histológica sete dias após o transplante celular. Os micrographs descrevem resultados representativos da mancha nuclear humana do antígeno. Os inserções pretos retratam marcadores para quantificação estereológica de números de células (ciano) e volume do enxerto (vermelho). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
CCI leve como um sistema modelo para testar a terapia regenerativa experimental
O modelo CCI é uma ferramenta valiosa para investigar mecanismos de disfunção tecidual após lesão mecânica no córtex. A tunabilidade dos parâmetros de ferimento é uma característica atrativa deste modelo. Alterando a profundidade Z de impacto, a velocidade, ou tempo de permanência pode aumentar ou diminuir a severidade da lesão conforme desejado pelo investigador10,25. O modelo CCI leve de lesão cerebral contusiva, quando realizado corretamente, deve causar morte celular modesta e cavitação mínima. A craniectomia e a remoção da aleta do crânio devem ser executadas com grande cuidado. A força descendente excessiva aplicou-se ao perfurar a trincheira da craniectomia pode causar ferimento cortical devido ao aquecimento e à vibração. O rompimento mecânico do Mater do dura durante a remoção da aleta do crânio preafirma quase uniformemente ferimento cortical severo. O rompimento de vasos sanguíneos corticais principais é provável conduzir ao lesioning excessivo do córtice e é razões para excluir o animal do experimento. Infelizmente, os sinais de uma lesão exacerbada podem ser sutis no dia após a cirurgia. Nem o edema nem a ruptura cortical pequena da embarcação são indicadores necessariamente negativos. Hematomas e coloração anormal devido à isquemia são indicadores mais claros de complicação cirúrgica. Documentar eventos intraoperativos e correlacionar complicações com resultados histopatológicos é crucial refinando a boa técnica do craniectomy.
Deve-se notar que a modelagem de mTBI em animais vem com certas advertências. Existem inúmeros modelos pré-clínicos de mTBI que não o modelo apresentado aqui. TBI experimental pode ser induzido através de forças mecânicas, ondas de jateamento através do ar, ou uma combinação dessas forças26,27,28. As lesões leves a severas são julgadas por uma combinação de desfechos histopatológicos e comportamentais (revisados em Petraglia29 e Siebold30). Os deficits do comportamento nos roedores podem resolver dentro dos dias às semanas31 visto que os deficits humanos dos pacientes do MTBI podem persistir por meses a forma da síndrome borne-concussive32. Embora nenhum modelo único seja um análogo completo para o mTBI clínico, o teste pré-clínico revela mecanismos fisiológicos que não podem ser avaliados na condição humana.
Os passos mais importantes no procedimento de transplante de células são o manuseio e a injeção da suspensão celular. A manipulação áspera causa o lysis da pilha, conduzindo à liberação do ADN genomic pegajoso e da agregação das pilhas suspendidas de sobrevivência. O diâmetro da ponta da agulha deve ser largo o suficiente para permitir o escoamento suave da suspensão; o fluxo restrito causa a entrega descontínua como os sedimentos da suspensão dentro da agulha. Ao seguir este protocolo e evitar as armadilhas discutidas aqui, enxertos robustos foram visíveis após tempos de sobrevida de 7 dias (Figura 4). A sobrevivência a longo prazo do enxerto em um modelo pré-clínico é fundamental para determinar a eficácia terapêutica potencial dessa abordagem.
Aplicação do teste de remoção de fita adesiva para modelagem de lesão cerebral contusiva
O teste de remoção adesiva revela déficits neurológicos positivos em termos de aumento da latência para remover os estímulos adesivos. A principal desvantagem potencial para este teste é a probabilidade de inibição do desempenho devido a fatores não relacionados à lesão. Lidar com o estresse pode reduzir o comportamento exploratório do mouse33, portanto, é crucial que os animais passam por extensa aclimatação de contenção antes da coleta de dados basal. É importante remover as fontes de água pelo menos 30 minutos antes do teste, a fim de mitigar os eventos de congelamento relacionados à micção. Finalmente, o aparelho de teste deve ser limpo muitas vezes como os animais podem tornar-se distraído em farejador investigatório de sinais de odor de animais desconhecidos.
Os resultados apresentados aqui mostram deficits significativos do motor do forepaw contralateral ao CCI suave até 28 dias após ferimento. Por outro lado, o teste simultâneo usando o teste do cilindro34 e acelerando o do3 mostrou déficits funcionais induzidos por lesão que resolveram dentro de 5 – 10 dias (dados não mostrados). A remoção da fita adesiva foi usada em uma variedade de experiências que avaliam deficits unilaterais no comportamento Integrativa sensorimotor7,35. O teste foi usado igualmente recentemente para avaliar a recuperação da função de motor que segue a intervenção regenerativa para ferimento cervical da medula espinal36. A gama dinâmica de desempenho neste teste pode ser ajustada para a variação de latência ou espécie, selecionando adesivos de força diferente. Aqui, sugere-se que a fita elétrica 3M é um estímulo ideal para camundongos com base na disponibilidade, durabilidade e latência substancialmente aumentada para remover estímulos após CCI leve. Embora os experimentos preliminares mostrados aqui não combinem transplante de células e testes de comportamento, experimentos em andamento em nosso laboratório avaliarão a sobrevida do transplante e os efeitos simultâneos na recuperação comportamental sensorimotor de lesão cerebral em 56 dias após o transplante.
Refinamento de imunodetecção DAB de enxertos de células humanas
O DAB immunohistochemistry foi escolhido a fim produzir a rotulagem forte, persistente das pilhas humanas no tecido do rato para a quantificação estereológico subseqüente. O pré-tratamento com peróxido de hidrogênio é crucial para reduzir a coloração inespecífica no tecido cerebral devido a peroxidases endógenas em eritrócitos. A coloração não específica nesses experimentos foi ainda mais reduzida usando um kit de neutralização de IgG do mouse. Este kit usa produtos químicos proprietários para reduzir a antigenicidade do rato endógeno IgGs, que pode extravasar no tecido cerebral após TBI37. As tentativas adiantadas empregaram uma combinação de anticorpo preliminar do rato anti-hNA, de anticorpos secundários biotina-conjugados, e de rotulagem terciária do conjugado de streptavidin-HRP usando o jogo do ABC dos laboratórios do vetor. O conjugado ABC exibiu extensa coloração DAB inespecífica no córtex ipsilateral à craniectomia (dados não mostrados). Ensaios de coloração subsequentes empregaram anticorpos secundários diretamente conjugados com HRP. Este protocolo modificado produz coloração nuclear de alta resolução com fundo muito reduzido para todos os tipos de células derivadas de quadris e condições de cirurgia (Figura 4). Experimentos inéditos deste laboratório usando esta técnica de coloração DAB modificada detectam células hNA-positivas em cérebros de mouse 56 dias após CCI leve. Globalmente, um procedimento de rotulagem de anticorpos binários economizou tempo e produziu imunocoloração mais clara em comparação com o procedimento de kit ABC de rotulagem terciário tradicional. Este protocolo poderia ser útil para outros estudos pré-clínicos de pilhas humanas transplantadas no sistema nervoso central do rato.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do centro de neurociência e medicina regenerativa (CNRM, número de subvenção G170244014). Agradecemos a assistência de Mahima Dewan e clara Selbrede em estudos piloto de remoção de adesivos. Kryslaine Radomski realizou lesões cerebrais preliminares e cirurgias de transplante de células. Amanda Fu e Laura Tucker do laboratório central de estudos pré-clínicos do USU CNRM forneceram conselhos valiosos sobre cirurgias animais e testes de comportamento, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures - 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
References
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