Summary
نحن نقدم طريقة تسجيل بصري قابل للتكرار ومستقرة لشرائح الدماغ باستخدام صبغة حساسة للجهد. تصف المقالة تلطيخ الصبغة الحساسة للجهد الكهربائي وتسجيل الإشارات البصرية باستخدام الاستعدادات التقليدية لشريحة الحصين.
Abstract
واسعة المجال واحد الفوتون الجهد الحساسة صبغ (VSD) التصوير من الاستعدادات شريحة الدماغ هو أداة مفيدة لتقييم الاتصال الوظيفي في الدوائر العصبية. بسبب التغير الجزئي في إشارة الضوء، كان من الصعب استخدام هذه الطريقة كتحليل كمي. توضح هذه المقالة البصريات الخاصة وأنظمة معالجة الشرائح، مما يجعل هذه التقنية مستقرة وموثوق بها. توضح هذه المقالة التعامل مع شريحة، تلطيخ، وتسجيل شرائح الحصين الملطخة VSD بالتفصيل. يحافظ النظام على الظروف الفسيولوجية لفترة طويلة، مع تلطيخ جيد، ويمنع الحركات الميكانيكية للشريحة أثناء التسجيلات. وعلاوة على ذلك، فإنه يتيح تلطيخ شرائح مع كمية صغيرة من الصبغة. تحقق البصريات فتحة رقمية عالية عند التكبير المنخفض، مما يسمح بتسجيل إشارة VSD بمعدل إطار أقصى قدره 10 كيلو هرتز، مع دقة مكانية 100 بكسل × 100 بكسل. ونظرا لارتفاع معدل الإطار والدقة المكانية، تسمح هذه التقنية بتطبيق مرشحات ما بعد التسجيل التي توفر نسبة كافية من الإشارة إلى الضوضاء لتقييم التغيرات في الدوائر العصبية.
Introduction
وقد أصبح واسعة المجال واحد الفوتون الحساسة للفولطية الحساسة (VSD) التصوير من الاستعدادات شريحة الدماغ الملطخة بالجملة أداة كمية مفيدة لتقييم ديناميات الدوائر العصبية1،2،3،4 . بعد تحليل التغيرات في الخصائص البصرية بسبب الإثارة الغشاء5,6,7, تم وصف التصوير VSD لأول مرة في أوائل 1970s من قبل كوهين وآخرون6,8, 9. وهو طريقة مناسبة لمراقبة وظائف الدماغ في الوقت الحقيقي كما الصبغة تحقيقات مباشرة التغيرات المحتملة غشاء (أي، إشارة أساسية من الخلايا العصبية).
يمتلك أقرب VSDs الخصائص المرغوبة لفهم نظام الدماغ، مثل سريع الوقت ثابت لمتابعة الحركية السريعة للأحداث المحتملة غشاء الخلايا العصبية، والخطي مع التغير في الغشاء المحتملة9، 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. على غرار تجارب التصوير الأخرى، تتطلب هذه التقنية مجموعة واسعة من التوليفات المحددة، مثل الكاميرات والبصريات والبرمجيات وعلم وظائف الأعضاء، لتحقيق النتائج المرجوة. وبسبب هذه المزالق التقنية، لم تتحقق بالضرورة الفوائد المتوقعة خلال الجهود الأولية بالنسبة لمعظم المختبرات التي لم تكن متخصصة في هذه التقنية.
كان السبب الأولية للصعوبة التقنية ضعف حساسية VSD تجاه التغير المحتمل للغشاء عند تطبيقه على تلطيخ الجزء الأكبر من الاستعدادات شريحة. حجم الإشارة البصرية (أي التغير الكسري في الفلورية) عادة مايكون 10-4 -10-3 من إشارة التحكم (F0) تحت الظروف الفسيولوجية. المقياس الزمني للتغير المحتمل في الغشاء في الخلايا العصبية هو ما يقرب من ميلي ثانية إلى بضع مئات من مللي ثانية. لقياس التغيرات في التغيرات في الغشاء المحتمل للخلايا العصبية، يجب أن تكون الكاميرا المستخدمة للتسجيل قادرة على الحصول على صور بسرعة عالية (10 كيلو هرتز إلى 100 هرتز). تتطلب الحساسية المنخفضة لـ VSD والسرعة اللازمة لمتابعة الإشارة العصبية كمية كبيرة من الضوء ليتم جمعها في الكاميرا بسرعة عالية، مع نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية (S/N)2،16.
كما أن بصريات نظام التسجيل عنصر حاسم لضمان جمع الضوء الكافي وتحسين S/N. التكبير الذي تحققه البصريات غالبا ما يكون منخفضا بشكل مفرط، مثل 1X إلى 10X، لتصور الدائرة العصبية الوظيفية المحلية. على سبيل المثال، لتصور ديناميات الدائرة الحصين، فإن التكبير من حوالي 5 سيكون مناسبا. مثل هذا التكبير منخفضة منخفضة الكفاءة الفلورسنت; لذلك، فإن البصريات المتقدمة تكون مفيدة لمثل هذا التسجيل.
وبالإضافة إلى ذلك، فإن الفسيولوجيا شريحة ضرورية أيضا. وبما أن تحليل التصوير يتطلب أن تكون الشرائح سليمة، فإن هناك حاجة إلى التعامل مع شريحة دقيقة17. وعلاوة على ذلك، فإن التدابير المتخذة للحفاظ على صلاحية الشريحة لفترة أطول هي18.
تصف هذه المقالة بروتوكول إعداد الشرائح، تلطيخ VSD، والقياسات. كما توضح المقالة التحسينات التي أدخلت على VSDs وجهاز التصوير والبصريات، وغيرها من التحسينات الإضافية للنظام التجريبي التي مكنت من استخدام هذه الطريقة كاختبار مباشر وقوي وكمي لتصور تعديل وظائف الدماغ19,20,21,22,23,24,25. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية على نطاق واسع للتقوية على المدى الطويل في منطقة CA1 من شرائح الحصين1. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية هي أيضا مفيدة في التسجيل البصري لإمكانات الغشاء في خلية عصبية واحدة26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة توكوشيما بونري. البروتوكول التالي لإعداد شريحة هو تقريبا إجراء قياسي27 ، ولكن التعديلات كانت بروتوكولات تلطيخ وتسجيل مع VSD.
1. التحضير قبل يوم التجربة
- إعداد المخزون A(الجدول 1) ، والمخزون B (الجدول2)، والمخزون C (الجدول3) الحلول وتخزينها في الثلاجة.
- إعداد 1 لتر من السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF) (الجدول4، انظر الخطوة 3) والاحتفاظ بها في الثلاجة.
- إعداد 1 لتر من ACSF المعدلة (الجدول5)والاحتفاظ بها في الثلاجة.
- يوزع 500 لتر من مصل جنين البقر (FBS) في قنينات مل2 ويخزن في الفريزر.
- قم بـِتَب4% من مسحوق الأجار في ACSF (120 مل تقريباً) في الميكروويف وصبّه في طبق بتري القابل للتصرف بـ 90 مم. يجب تبريد طبق الأجار قبل الاستخدام الإضافي.
- ضع العناصر التالية في الثلاجة في اليوم السابق للتجربة: صينية جراحية، وعاء تقطيع وكتلة تبريد من الألومنيوم (120 × 120 × 20 مم3).
- تأكد من وجود حلقات زجاج شبكي كافية مع مرشحات غشاء لشريحة نظام التعامل مع17،28 (انظر الخطوة 6.12).
- قم بـِتَبَب 2% من مسحوق الأجار في 50 مل من 3 م كل في الميكروويف. تناول حوالي 85 ميكرولتر من الذوبان الدافئ من أجار-كي كل في 200 ميكروبليت باستخدام ميكروبليت للقطب الكهربائي. فصل طرف في أجار لا يزال دافئ 3 M KCl هلام. كرر الخطوة لملء حوالي 20-40 نصائح مع 2% أجار.
2. إعداد VSD (di-4-ANEPPS) حل المخزون
- إعداد 1 مل من 10٪ بوليثوكسيدلاتيد حل زيت الخروع مع الماء النقي جدا.
- إضافة 1 مل من الإيثانول إلى قارورة من دي-4-ANEPPS (5 ملغ قارورة)، دوامة وسونيكات لمدة 10 دقيقة. سوف يتحول الحل إلى لون أحمر عميق مع بقايا صغيرة ممكنة من بلورات DI-4-ANEPPS.
ملاحظة: الإيثانول المستخدمة في هذه الخطوة ينبغي أن تفتح حديثا. - نقل الحل إلى ميكروتيوب 2 مل مع O-حلقة. تدور أسفل الحل وإضافة 500 ميكرولتر من 10٪ بوليثوكسيدلاتيد حل زيت الخروع.
ملاحظة: الصبغة هو يدهون للغاية. ويمكن أيضا أن تستخدم DMSO وpoloxamer لحل دي-4-ANEPPS ولكن من حيث الإشارة البصرية عند التغيير في الغشاء المحتملة، وجدنا أن استخدام الإيثانول -بوليثوكسيدلاتيد زيت الخروع يعطي إشارة أفضل إلى نسبة الضوضاء. هذا يمكن أن تكون ذات صلة إلى معدل نقل المذيبات إلى غشاء الخلية. - دوامة وسونيكات حتى الصبغة قد حلت تماما.
- تجنب التعرض للضوء وإبقائه في الثلاجة. لا تخزن في الثلاجة. يمكن أن تستمر الأسهم لبضعة أشهر.
ملاحظة: في يوم التجربة، اتبع الخطوات 3-9.
3- الإعداد اليومي لـ ACSF (1 L) (الجدول 4)
- وزن كلوريد الصوديوم،NAHCO 3، والجلوكوز في قارورة.
- أضف 950 مل من الماء المقطر إلى القارورة وابدأ بالفقاعة مع غاز ثاني2 بنسبة 95%
- إضافة 2.5 مل من المخزون حل للقارورة واحتضان لمدة 10 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 2.5 مل من محلول C المخزون إلى قارورة.
- إضافة الماء المقطر لجعل الحل إلى 1 لتر.
4. تحضير يومي للتلطيخ VSD Ssolution
- Sonicate قارورة 500 ميكرولتر من فبس وVSD حل الأسهم (الخطوة 2) في سونيكاتور فائقة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 500 μL من ACSF أعدت حديثا في قارورة FBS.
- إضافة 20 (في حالة الفئران) أو 40 (في حالة الفئران) μL من حل المخزون VSD إلى القارورة.
- فائقة سونيكات ودوامة القارورة حتى يصبح الحل البرتقالي شاحب.
5. التحضير للجراحة
- خذ 100 مل من ACSF المبردة بشكل منفصل في وعاء من الفولاذ المقاوم للصدأ 300 مل، وكوب سعة 300 مل، وحاوية بلاستيكية، ووضعها في الثلاجة. صب 150 مل من المبردة تعديلACSF (الجدول 2) في كوب آخر ووضعها في الثلاجة. انتظر حتى يتم تبريد الحلول؛ الوقت الذي استغرقه يجب أن يقاس ويحدد مسبقاً.
- أضعاف لكسر شفرة الحلاقة (الكربون الصلب، الصناعية الصف 0.13 مم سميكة، شفرة على كلا الجانبين) إلى نصف لتقطيع اللحم.
ملاحظة: يمكن استخدام النصف الآخر للتشريح مع حامل شفرة مناسبة. - إعداد كتلة من ACSF 4٪ أجار لوحة مع تهزهز تعديل (الشكل 1).
- إعداد غرفة حضانة رطبة (غرفة نوع واجهة؛ تعديل 1.2 L مربع مختومة ضيق مع التعبئة سيليكون)للحفاظ على شرائح الدماغ على قيد الحياة من الناحية الفسيولوجية (الشكل 2)؛ أضف ACSF في حاوية صغيرة وكربونات مع 95% O2/5% CO2 gas، وملء طبق بيتري 90 مم × 20 مم مع ACSF في الأعلى.
ملاحظة: يجب وضع طبق بيتري أصغر (60 مم × 20 مم) في وسط طبق 90 مم لدعم ورقة مرشح على الطبق. - وضع مربع على جهاز التدفئة وانتظر لمدة 20 دقيقة لتسخينه حتى 28 درجة مئوية.
- يُضاف الثلج المسحوق إلى وعاء تقطيع اللحم. ضع الأدوات التالية في وعاء من الفولاذ المقاوم للصدأ (صغير) على الجليد: مشرط، حامل شفرة، ملاقط حلقة، كتلة أجار، ومرحلة من تقطيع اللحم. الحفاظ على ACSF المجمدة وتعديل ACSF على الجليد والفقاعة مع 95٪ O2/5٪ CO2 الغاز (ويعرف أيضا باسم. كاربوجين).
- ضع الأدوات التالية في ضريبة القيمة المضافة (كبيرة): مقص (كبير، صغير)، ملاقط، ملعقة، ملعقة، كماشة قطري.
6. جراحة (الفئران)
- تخدير الماوس باستخدام isoflurane في غطاء محرك الدخان. تقييم مستوى التخدير عن طريق التحقق من رد فعل دواسة الحيوان على قرصة إصبع القدم.
- قم بقطع رأس الفأر وغمر الرأس في ACSF المثلج في صينية جراحية من الفولاذ المقاوم للصدأ.
- استخراج الدماغ في غضون 1 دقيقة ووضعها في كوب يحتوي على ACSF المبردة لمدة 5 دقائق.
- تأخذ الدماغ من الكأس و, باستخدام مشرط, تقليم كتلة الدماغ (الشكل 3A).
- ضع كتلة الدماغ على كتلة أجار 4٪ (الخطوة 5.3، الشكل 3B). يمكن تركيب نصفي الكرة الأرضية على كتلة أجار. امسح الـ ACSF الزائدة من الكتلة بورقة تصفية.
- تطبيق لاصق ةيلائع (سوبر الغراء) على الجدول تقطيع اللحم. ضع كتلة الأجار عليها وامسح اللصق الزائد باستخدام ورقة فلتر.
- تطبيق بلطف كمية صغيرة من ACSF الجليد الباردة (~5 مل) باستخدام ماصة من الجزء العلوي من كتلة الدماغ أجار. وهذا سوف يساعد على ترسيخ الغراء السوبر الزائدة ومنع الغراء من تغطية الدماغ وإزعاج التقطيع.
- إصلاح الجدول تقطيع اللحم إلى صينية تقطيع اللحم (الشكل3C)وصب ACSF المعدلة.
- تعيين تقطيع اللحم إلى سرعة بطيئة، مع تردد شفرة في الحد الأقصى.
- تعيين شريحة سمك إلى 350-400 ميكروم والبدء في تقطيع (الشكل3C). ضع الشرائح على زاوية صينية الشرائح في تسلسل، بحيث يمكن تمييز عمق الشرائح بسهولة. عادة ما يمكن الحصول على ثلاث إلى خمس شرائح من نصف الكرة الأرضية.
- قطع جزء جذع الدماغ باستخدام إبرة 30 G (الشكل 3D).
ملاحظة: يجب إجراء الجراحة المجهرية على شريحة الدماغ مثل قطع بين الحدود CA3-CA1 في هذه المرحلة تحت مجهر منظار، إذا لزم الأمر. - باستخدام فرشاة طلاء صغيرة، ضع الشريحة في وسط مرشح الغشاء (0.45 ميكروم المسام، PTFE-الغشاء، 13 مم قطر) عقد مع حلقة زجاج شبكي17 (15 مم القطر الخارجي، 11 مم قطرها الداخلي، 1 مم سمك، الشكل 3E). وضع حلقة في غرفة الانتعاشرطبة (الشكل 2) وتأمين الغطاء للحفاظ على الضغط الداخلي عالية.
ملاحظة: سوف تمسك الشرائح بالغشاء في غضون 30 دقيقة ويمكن التعامل معها مع الحلقات في الخطوات اللاحقة في غرفة التسجيل. ليس هناك حاجة لاستخدام الأوزان أو تدابير أخرى للحفاظ على شريحة في مكانها. - ضبط اتجاه وموضع الشريحة في الحلبة لضمان أنها تركز بشكل جيد ولها اتجاه ثابت (انظر الخطوة 9.3).
- اترك العينة عند درجة حرارة 28 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 30 دقيقة على الأقل لاسترداد الشرائح.
ملاحظة: يمكن للشرائح الآن الاحتفاظ بحالة فسيولوجية جيدة على الأقل لمدة 15 ساعة.
7. تلطيخ والرين من شرائح (الفئران)
- ضعي 100-110 ميكرولتر من محلول تلطيخ (الخطوة 4) برفق على كل شريحة على الحلبة باستخدام ميكروبليت. ثمانية إلى تسع شرائح يمكن أن تكون ملطخة مع محلول تلطيخ واحد أعدت في الخطوة 4. اترك الشرائح لمدة 20 دقيقة لتلطيخها.
- إعداد 50-100 مل من ACSF في وعاء ووضع حلقة مع عينة شرائح في ذلك لشطف محلول تلطيخ.
- قم بتخزين الشريحة المشطة إلى غرفة حضانة أخرى. انتظر أكثر من 1 ساعة للتعافي قبل التجربة.
ملاحظة: يمكن فصل غرفة الحضانة عن الغاز ونقلها إلى مكان التسجيل في حالة محكمة الإغلاق. يمكن أن تبقى الشريحة على قيد الحياة لمدة 20 دقيقة على الأقل دون إمدادات الغاز. هذا مفيد في حال كنت بحاجة إلى نقل شريحة إلى مكان آخر للتسجيل.
8. تحضير يومي لجهاز تجريبي
- قم بتشغيل مكبر الصوت والكمبيوتر ونظام الكاميرا، وتحقق من تشغيل البرنامج.
- ضع ACSF في أنبوب 50 مل وفقاعة مع الكاربوجين.
- استخدام مضخة التمعجية لتعميم ACSF. ضبط معدل التدفق إلى ما يقرب من 1 مل / دقيقة.
- ضبط ارتفاع ماصة شفط بحيث مستوى السائل داخل غرفة التجربة هو دائما ثابتة.
ملاحظة: مستوى الحل مهم للحصول على تسجيل مستقر، وبالتالي، ينبغي أن يتم التعديل باستخدام micromanipulator. - تثبيت القطب الأرض تتكون من رقاقة صفراء مليئة 3 M KCl أجار (2٪ (الخطوة 1.8) إلى حامل مع سلك Ag-AgCl مع كمية صغيرة من 3 M KCl الحل.
- ملء كمية صغيرة من ACSF (حوالي ثلثي حجم) في القطب الزجاجي (1 مم القطر الخارجي، 0.78 مم القطر الداخلي سحبت مع سحب micropipette) باستخدام طرف مدبب رقيقة أنابيب صفراء ووضعها في حامل القطب.
- إرفاق حامل إلى قضيب تثبيت في المتلاعب. تأكد باستخدام مكبر للصوت أن مقاومة القطب الكهربائي هو ما يقرب من 1 MΩ.
ملاحظة: يجب أن يكون القطب الكروي الواسع الذي يفتح على نطاق واسع طويل الساق (4-8 ميكرومتر) من نوع الرقعة جيدًا لتسجيل الحقل وكقطب محفز.
9. بدء جلسة تسجيل
- تأخذ إعداد شريحة من غرفة رطبة مع ملقط.
- وضع شريحة بسرعة على غرفة تجريبية تحت المجهر (الشكل 4).
- دفع حافة الحلبة بحزم في سيليكون O-حلقة. يجب الحرص على عدم كسر الغشاء أو الجزء السفلي من غرفة التجربة.
ملاحظة: وينبغي أن يؤخذ اتجاه الشريحة في الاعتبار فيما يتعلق باتجاه الأقطاب الكهربائية المحفزة والتسجيل في مجال الرؤية. يجب أن شريحة صحية التمسك مرشح غشاء حتى لا تكون هناك حاجة لاستخدام الأجهزة الأخرى لإصلاح شرائح مثل الأوزان والنايلون. - ضع طرف القطب المحفز والقطب المحتمل لتسجيل الحقل على الشريحة تحت المجهر مع الضوء المنقول.
- استخدام نظام التسجيل الكهربي للتحقق من الاستجابة. تأكيد المعتاد (غير ملطخة) تسجيل الكهربيمع تكوين معين.
ملاحظة: يمكن حذف قطب التسجيل ولكن مفيد للتحقق من علم وظائف الأعضاء من شريحة. - قم بضبط كثافة ضوء الإثارة إلى ما يقرب من 70-80% من السعة القصوى في الكاميرا التي تتوافق مع 13-15 ميغاواط/سم2 عند العينة عند أخذ العينات بسرعة 10 كيلو هرتز مع عدسة موضوعية للغمر المائي 5 مرات وعدسة أنبوبية 1x PLAN APO. الإثارة ضوء الطول الموجي هو 530 نانومتر، ويجب أن يكون مرشح الانبعاثات > 590 نانومتر.
ملاحظة: استخدم مصراع لتقليل كمية ضوء الإثارة. التعرض المستمر للضوء قد تتدهور شريحة الفسيولوجيا. تأثير الضرر المحتمل للضوء يعتمد على شدة ومدة الضوء. استخدام تسجيل الكهربية للحكم على تأثير الضوء. في حالة قوة 13-15 mW/cm2، يجب أن يكون التعرض حوالي 1 s الحد الأعلى للتسامح. - ضبط التركيز مع نظام الاستحواذ باستخدام مصدر الضوء الفلورسنت لأن التركيز قد تكون مختلفة اعتمادا على الطول الموجي وبدء الاستحواذ.
- فحص البيانات في برنامج الحصول على صورة.
ملاحظة: استخدمنا الحزمة الأصلية microprogramming من برامج التحليل العددي لتحليل مفصل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 5 الإشارة البصرية التمثيلية عند التحفيز الكهربائي لضمانات شافر في المنطقة CA1 لشريحة فرس النهر. الصور المتتالية في الشكل 5A تظهر الإشارة البصرية قبل تطبيق أي مرشحات مكانية وزمنية، في حين يظهر الشكل 5B نفس البيانات بعد تطبيق 5 x 5 x 5 مرشح مكعب (التفاف نواة غاوسي، 5 x 5 مكانية و5 إلى البعد الزمني) مرتين. نظرا لارتفاع معدل الإطار (0.1 مللي /الإطار) وارتفاع دقة المكاني (100 بكسل × 100 بكسل)، لم يغير تطبيق مرشح إشارة ولكن تصفيتها من الضوضاء، والتي يمكن أيضا أن يلاحظ في دورة الوقت المسجلة في بكسل في تجربة واحدة ( الشكل 5C،لا مرشح؛ الشكل 5D، مع مرشح؛ و الشكل 5E،فرضه).
الشكل 6 يقارن الاستجابة النموذجية في منطقة CA1 من شريحة الحصين بين الماوس (الشكل6A)والفئران (الشكل6B). وكما هو واضح في هذا الشكل، تظهر استجابة فرط الاستقطاب بسبب المدخلات المثبطة في شريحة الحصين الجرذان عند تطبيق نفس الحافز على ضمان شافر بالقرب من حدود CA1/CA3. ويلاحظ استجابة فرط الاستقطاب الصغيرة في الجانب البعيد من CA1 بعد 24 مللي ثانية في شريحة الحصين الماوس، ولكن أكثر ضخمة فرط الاستقطاب استجابة تجاوز استجابة depolarizing في شريحة الحصين الفئران. يمكن أن تظهر الصورة VSD بوضوح الفرق بين الماوس وشرائح الحصين الفئران.
الشكل 1 : رسم توضيحي لكتلة الأجار المستخدمة لتركيب أنسجة الدماغ للتشريح ورقصة لجعل كتلة. (أ) رسم تخطيطي لكتلة الدماغ وكتلة أجار 4٪ (B). (C, D) صورة لرقصة قابلة للتعديل مصنوعة من لوحة زجاج شبكي (سمك 5 ملم لكل منهما) لجعل كتلة أجار. عند إعداد كتلة أجار، يجب أن تكون مكدسة العلوي والسفلي لوحات كما هو مبين في D. (E) عن طريق إدراج شفرة في فتحات رقيقة طويلة (1) و (2)، يتم قطع الجزء الثلاثي، يتم استخدام الفتحة (3) لتقليم عمق كامل من كتلة. (4) إزالة اللوحة العلوية تمكن من تقطيع الأجزاء غير الضرورية. باستخدام الفتحة 1 و 2، جعل فقط 5 مم التخفيضات العميقة بحيث ينتج كتلة كما هو موضح في (A) و (B). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 توضيح لنوع الواجهة غرفة احتضان تستخدم للحفاظ على شريحة علم وظائف الأعضاء. (أ) نظرة عامة على النظام. (ب) التفاصيل الداخلية. (ج) توضيح لغرفة الاسترداد. يجب وضع العينة على ورقة مرشح توضع على طبق بتري مملوء بـ ACSF و60 مم. الطبق الأخير هو دعم ورقة فلتر. يتم الاحتفاظ بالأطباق وحاوية الفقاعة ACSF في مكانها مع لوحة زجاج شبكي. يجب أن لا تلمس ورقة فلتر جدار مربع الهواء ضيق ولا الحاوية. يتم توفير الهواء من خلال زجاجة الفقاعات التي تتضمن الغازات المرطبة في الغرفة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 الاستعدادات شريحة هيبوكامبال من الدماغ الماوس. (أ) يجب قطع الدماغ الماوس معزولة أولا في خط متقطع (أ)، ثم (ب). وأخيرا، ينبغي أن يتم خفض على طول الخط (ج). يجب أن يكون قطع عموديا على القاع. (ب) يجب تركيب كتلة الدماغ على كتلة أجار. (ج) يجب وضع كتلة أجار على تقطيع اللحم. (د) الناتجة شريحة. يجب قطع الأنسجة الزائدة في خط متقطع. (ه) يجب أن توضع شريحة في مركز مرشح غشاء مع حامل زجاج شبكي (القطر الخارجي 15 مم، القطر الداخلي 11 ملم، مرشح غشاء PTFE من 13 ملم). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : نظام تسجيل للإشارات البصرية من الاستعدادات شريحة. (أ) صورة للمجهر تستخدم لتصوير الشرائح في المخطوطة الحالية. تتكون البصريات من عدسة موضوعية (5x NA0.60)، وصندوق مرآة للفلتر ثنائي اللون (580 نانومتر)، وعدسة (أنبوب) (PLAN APO x1.0). يتم إرفاق كاميرا عالية السرعة على الجزء العلوي من عدسة الإسقاط من خلال ج جبل. هناك كاميرا USB أخرى المعتادة للمراقبة. يتم إدخال ضوء الإثارة باستخدام الألياف البصرية. (B) صورة للعدسات المتوافقة مع صندوق المرآة. (C) مخطط تخطيطي لنظام التسجيل. يتم التحكم في نظام التصوير ونظام التسجيل الكهربي بواسطة جهاز كمبيوتر. وقد استخدم نظام إضاءة LED مع نظام التحكم في ردود الفعل ذات صمام ثنائي للصور كمصدر للضوء. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 : إشارة بصرية تمثيلية في منطقة CA1 من شريحة فرس النهر الماوس في تجربة واحدة. (أ) تظهر الصور المتتالية انتشار الإشارة العصبية المكتسبة بمعدل إطار 0.1 مللي/إطار على طول مسار الضمان Schaffer قبل تطبيق أي مرشحات مكانية وزمنية (كل 0.2 مللي ثانية). وكان الإثارة 530 نانومتر والانبعاثات >590 نانومتر. (B) نفس البيانات بعد تطبيق نواة غوسية ثلاثية الأبعاد من 5 × 5 × 5 مرتين. (C, D) آثار الإشارات البصرية في بكسل تمثيلية [كل بكسل (36 ميكرومتر) على طول خط في منتصف CA1 يظهر في المربع في A، * يدل على بكسل في الطبقة الهرمية] من البيانات المبينة في A و B. (E) إشارة فوق ية من الإشارات البصرية في C و D. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 : مقارنة الإشارة البصرية بين الماوس وشرائح فرس النهر الفئران. الصور التمثيلية المتتالية على التحفيز الكهربائي للمسار الجانبي Schaffer بالقرب من الحدود CA3/CA1 من الماوس (A) والفئران (B) شريحة الحصين. فيديو 1 يظهر شريحة فرس النهر الماوس والفيديو 2 يظهر شريحة الحصين الفئران. يظهر في يمين الشكل الطبقة البيراميدية (ش. بير) والطبقة الشعاعية (st. rad.) الطبقة الشعاعية في منتصف المرجع المصدق CA1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الـمـمـايـة النهائي | الوزن | |
| NaH2PO4 • 2H2O | 1.25 مليون متر مربع | 3.90 غ |
| MgSO4•7H2O | 2 مليون متر مربع | 9.86 غ |
| KCl | 2.5 مليون متر مربع | 3.73 غ |
| إضافة H2O لجعل 50 مل |
الجدول 1: المخزون ألف
| الـمـمـايـة النهائي | الوزن | |
| MgSO4•7H2O | 2 مليون متر مربع | 12.32 غ |
| إضافة H2O لجعل 50 مل |
الجدول 2: المخزون باء
| الـمـمـايـة النهائي | الوزن | |
| CaCl2+2H2O | 2 مليون متر مربع | 5.88 غ |
| إضافة H2O لجعل 50 مل |
الجدول 3: المخزون جيم
| النهائي (mM) | الوزن | |
| كلوريد الصوديوم | 124 مليون متر مربع | 7.25 غ |
| نامكو3 | 26 مليون متر مربع | 2.18 غ |
| الجلوكوز | 10 مليون متر مربع | 1.8 غرام |
| الأسهم أ | 2.5 مل | |
| إضافة حوالي 950 مل من H2O وفقاعة مع الغاز المختلط (95٪ O2/ 5 ٪ CO2)(10 دقيقة) | ||
| سهم C (CaCl2) | 2 مليون متر مربع | 2.5 مل |
| إضافة H2O لجعل 1،000 مل | ||
الجدول 4: الإعداد اليومي لـ ACSF.
| النهائي (mM) | الوزن | |
| نامكو3 | 26 مليون متر مربع | 2.18 غ |
| السكروز | 205.35 متر مربع | 70.29 غ |
| الجلوكوز | 10 مليون متر مربع | 1.8 غرام |
| الأسهم أ | 2.5 مل | |
| المخزون B | 2.0 مل | |
| إضافة حوالي 900 مل من H2O وفقاعة مع الغاز المختلط (95٪ O2/ 5٪ CO2)(10 دقيقة) | ||
| المخزون C | 0.4 مليون متر مربع | 0.5 مل |
| إضافة H2O لجعل 1،000 مل | ||
الجدول 5: حل القطع المعدل
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الفسيولوجيا شريحة أمر حيوي لجمع الإشارة الصحيحة. استخدام نظام تصفية غشاء حلقة في هذا البروتوكول يضمن أن شريحة لا تزال صحية وغير مشوهة في جميع أنحاء الإجراء2,16,17. يمكن استخدام أنظمة أخرى للاحتفاظ بشريحة وظائف الأعضاء أثناء التسجيل، ولكن يجب أن لا يتم تشويه شريحة في أي وقت كما يحتاج التصوير كل جزء من شريحة لتكون صحية. نظام تصفية غشاء حلقة هو أيضا أفضل لتلطيخ، وهذا يساعدنا على تقليل حجم الحل تلطيخ المطلوبة. ومن المهم أيضا السيطرة على شدة ضوء الإثارة، لأنه ينبغي أن يكون منخفضا فيما يتعلق بالكسر الزمني. الإضاءة المستمرة يمكن أن تضر العينة; ولذلك، فإن الاستخدام المناسب للمصراع ضروري.
وقد نوقشت سمية VSD في كثير من الأحيان29, ولكنها نتيجة لتضاعف غير خطي من تركيز الصبغة, الإثارة شدة الضوء, ومدة التعرض للضوء. لم يتسبب إجراء التلطيخ المبين في هذا البروتوكول في أي تغييرات قابلة للقياس في المعلمات الفسيولوجية للشريحة مثل علاقات الإدخال والمخرجات للتسجيلات المحتملة للحقل وتلك الموجودة على الجهد الطويل الأجل (LTP)، والنبض المقترنة (PPF). تدهور الفسيولوجيا شريحة كبيرة وخاصة تحت الإضاءة المستمرة16، ولكن يمكن إدارتها من خلال رصد إمكانات الميدان. باستخدام هذه الاحتياطات، يمكننا تسجيل LTP مع التسجيل البصري المستمر باستخدام VSD لأكثر من 12 ح24،وهو ما يشبه أفضل التجارب في المختبر.
أثناء التسجيل، قد يكون جدول الهواء مفيدًا، ولكن يجب السماح بالعزل من الأجهزة الأخرى بسبب التكبير المنخفض للبصريات. ومع ذلك، فإن الاضطرابات الميكانيكية هي واحدة من الأسباب الهامة وراء سوء التصوير. إن المبلغة هامّة من إشارة زائفة في صورة يتألّف إشارات مضادّة في الحافة من الشيء, لذلك الفرق من السطوع, هو ال أكثر على الأرجح يسبّب بالاضطرابات آليّة. حركات العينة والسوائل هي الأسباب الأكثر شيوعا للضوضاء الحركة، وبالتالي، ينبغي تجنبها أو الحد الأدنى.
إشارة VSD (التغير الكسري في شدة الضوء) صغيرة (10-3 إلى 10-4 من الفلورسنت الأولي). للكشف عن مثل هذا التغيير الصغير، يجب أن يتجاوز الفلوري ة 105 إلى 106 فوتونات في الكاشف في جزء من الوقت للتغلب على تأثير الضوضاء الفوتونية. وعلاوة على ذلك، لمتابعة النشاط العصبي، يجب أن يكون معدل الإطار سريع، على مقربة من ثابت الوقت اللازم لأداء التسجيل الكهربي مثل ذلك حول نطاق كيلو هرتز. مزيج من هذين الشرطين يتطلب كمية من الفلورسنت التي هي أكثر اتساعا بكثير من أنواع أخرى من التصوير الفلورسنت. وهذا يتطلب فتحة رقمية عالية في البصريات بأكملها، والمجهر المعتاد ليس الخيار الأفضل. هناك حاجة إلى التلميذ أكبر وفتحة كما هو مبين في الشكل 4.
يجب أن يتطابق نظام إعادة الترميز مع عمق الفوتون الأكبر، ومعدل الإطار السريع، وانخفاض مستوى الضجيج. يعتمد الخيار في الغالب على سرعة النظام العصبي. تحتاج الإشارة الأسرع مثل نقل إشارة الحصين إلى نظام متخصص فائق السرعة ومنخفض الضوضاء. ومع ذلك، قد يتم الكشف عن إشارة بطيئة مثل الانتشار البطيء للنشاط في القشور باستخدام كاميرات الصف المعتادولكن العلمية.
اختيار مصدر الضوء هو أيضا حاسمة. يعتمد اختيار الضوء على شدته واستقراره ومجال الإضاءة. في حالة التصوير ذو الحقول الواسعة منخفض التكبير، يحتاج مصدر الضوء النقطي مثل الأقواس والليزر إلى التوسع، مما يجعل من الصعب استخدام هذه المصادر. والأقواس، مثل الزئبق ومصابيح زينون، هي مصدر الضوء الساطع ولكنها عادة ما تكون غير مستقرة. ومع ذلك، فإن التطور الأخير للضوء زينون قد التغلب على المشكلة. مصباح الهالوجين مستقر ويحتوي على مساحة أكبر من خيوط التي يمكن أن تتطابق بسهولة مع التصوير واسعة المجال، ولكن محدودة في قوة خاصة في 530 نانومتر. وقد مكننا التطور الأخير للطاقة LED من استخدامه كمصدر للضوء المحتمل، ولكن يجب أن يكون لديه مثبت التغذية المرتدة بسبب الاعتماد على درجة الحرارة. يمكن استخدام الليزر ولكن التماسك العالي يؤدي إلى ضوضاء متناثرة، وهو أمر غير مقبول عادة للتصوير على نطاق واسع.
يقيس بروتوكول التصوير VSD المعروض في هذه المقالة قيمة بالنسبة لحالة الراحة. لا يمكن إجراء القياس المطلق لإمكانات الغشاء باستخدام التقنية الحالية. يمكن استخدام قياس نسبة القياس وقياسات مدى الحياة الفلورية لتقييم إمكانات الغشاء المطلق.
تصوير شرائح الدماغ الملطخة بالجزء الأكبر مع VSD في التكبير المنخفض يمكن أن تظهر التغيرات المحتملة غشاء دون عتبة في التفاعلات الدوائر الصغيرة في الدماغ. هذا النطاق الوظيفي فيما يتعلق بالعلاقة بين الدوائر الدقيقة في الدقة في الوقت الحقيقي سيكون مفيدا في العديد من مجالات أبحاث الدماغ، وخاصة لتحليل الجوانب المرضية الأكثر احتمالا الناجمة عن مثل هذه الوظائف المثيرة والمثبطة الاتصالات بين مناطق الدماغ المختلفة. سيكون هذا التطبيق حاسما في التحقيق في التغيرات في الدوائر العصبية المتعلقة بأنواع معينة من الأمراض العصبية النفسية30,31,32.
تطوير مؤشر الجهد المشفرة وراثيا33،34 هو الاتجاه المستقبلي للتسجيلات المحتملة غشاء بصري من شأنها أن تمهد الطريق لتطبيقات جذابة من نوع خلية محددة تحليل العصبية الأحداث على مستوى الدائرة.
هناك مجال كبير للتحسين في البصريات، وخاصة لتصور الاتصالات الوظيفية واسعة الميدان. لدينا رواية البصريات البؤري35 سوف تمكن عالية السرعة وارتفاع S / N نسبة تسجيل إشارة VSD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تلقت TT منحة KAKENHI JSPS (JP16H06532، JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038, و JP15K00413) من MEXT والمنح من وزارة الصحة والعمل والرعاية الاجتماعية (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] وH30 [18062156]). نود أن نشكر Editage (www.editage.jp) على تحرير اللغة الإنجليزية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM - Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| Poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| Polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R.
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. Tominaga, T., Ichikawa, M. , US 6,448,063 B2 (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W.
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
