Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Enregistrement optique à grand champ à un seul photon dans des tranches de cerveau à l'aide de teinture sensible à la tension

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59692
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory for Neural Circuit Systems, Institute of Neuroscience, Tokushima Bunri University

Summary

Nous introduisons une méthode d'enregistrement optique reproductible et stable pour les tranches de cerveau à l'aide de colorant sensible à la tension. L'article décrit la coloration de colorant tension-sensible et l'enregistrement des signaux optiques utilisant les préparations conventionnelles de tranche hippocampal.

Abstract

L'imagerie à large champ de teinture sensible à la tension du photon (VSD) des préparations de tranches de cerveau est un outil utile pour évaluer la connectivité fonctionnelle dans les circuits neuronaux. En raison du changement fractionnaire dans le signal lumineux, il a été difficile d'utiliser cette méthode comme un essai quantitatif. Cet article décrit des systèmes spéciaux d'optique et de manipulation de tranches, qui rendent cette technique stable et fiable. Le présent article montre la manipulation de la tranche, la coloration et l'enregistrement des tranches hippocampales tachées de VSD en détail. Le système maintient des conditions physiologiques pendant une longue période, avec une bonne coloration, et empêche les mouvements mécaniques de la tranche pendant les enregistrements. En outre, il permet la coloration des tranches avec une petite quantité de colorant. L'optique atteint une ouverture numérique élevée à faible grossissement, ce qui permet l'enregistrement du signal VSD à la vitesse maximale de 10 kHz, avec une résolution spatiale de 100 pixels x 100 pixels. En raison de la fréquence de trame élevée et de la résolution spatiale, cette technique permet l'application des filtres post-enregistrement qui fournissent un rapport signal-bruit suffisant pour évaluer les changements dans les circuits neuronaux.

Introduction

L'imagerie à large champ de teinture sensible à la tension du photon (VSD) des préparations de tranches de cerveau tachées en vrac est devenue un outil quantitatif utile pour évaluer la dynamique des circuits neuronaux1,2,3,3 . Après l'analyse des changements dans les propriétés optiques dues à l'excitation de membrane5,6,7, l'imagerie VSD a été décrite pour la première fois au début des années 1970 par Cohen et d'autres6,8, 9. .; il s'agit d'une méthode appropriée pour surveiller les fonctions cérébrales en temps réel, car le colorant sonde directement les changements potentiels de la membrane (c.-à-d., le signal principal des neurones).

Les premiers VSD possédaient les caractéristiques souhaitables pour comprendre le système cérébral, comme un temps-constant rapide pour suivre la cinétique rapide des événements potentiels de membrane neuronale, et la linéarité avec le changement dans le potentiel de membrane9, 10 Ans et plus , 11 Ans, états-unis ( , 12 Ans, états-unis , 13 (en) , 14 (en) , 15. Semblable à d'autres expériences d'imagerie, cette technique nécessite un large éventail de accords spécifiques, tels que les caméras, l'optique, le logiciel et la physiologie des tranches, pour obtenir les résultats souhaités. En raison de ces écueils techniques, les avantages attendus au cours des efforts initiaux ne se sont pas nécessairement matérialisés pour la plupart des laboratoires qui ne se spécialisaient pas dans cette technique.

La cause première de la difficulté technique était la faible sensibilité du VSD vers le changement potentiel de membrane une fois appliqué à la coloration en vrac des préparations de tranche. L'ampleur du signal optique (c.-à-d. le changement fractionnaire de la fluorescence) est habituellement de 10-4-10-3 du signal de contrôle (F0) dans des conditions physiologiques. L'échelle temporelle du changement potentiel de membrane dans un neurone est d'environ millisecondes à quelques centaines de millisecondes. Pour mesurer les changements dans le potentiel membranaire du neurone, la caméra utilisée pour l'enregistrement devrait être en mesure d'acquérir des images à grande vitesse (10 kHz à 100 Hz). La faible sensibilité de VSD et la vitesse nécessaire pour suivre le signal neuronal nécessite une grande quantité de lumière à recueillir à la caméra à grande vitesse, avec un rapport signal-bruit élevé (S/N)2,16.

L'optique du système d'enregistrement est également un élément essentiel pour assurer la collecte de suffisamment de lumière et pour améliorer S /N. Le grossissement réalisé par l'optique est souvent excessivement faible, comme 1X à 10X, pour visualiser un circuit neuronal fonctionnel local. Par exemple, pour visualiser la dynamique du circuit hippocampique, un grossissement d'environ 5 serait approprié. Un tel grossissement faible a une faible efficacité de fluorescence; par conséquent, l'optique avancée serait bénéfique pour un tel enregistrement.

En outre, la physiologie de tranche est également essentielle. Étant donné que l'analyse d'imagerie exige que les tranches soient intactes, une manipulation soigneuse des tranches est nécessaire17. En outre, les mesures prises pour maintenir la viabilité de la tranche pour une plus longue période sont importantes18.

Le présent article décrit le protocole pour la préparation des tranches, la coloration VSD, et les mesures. L'article décrit également les améliorations apportées aux VSD, aux appareils d'imagerie et à l'optique, ainsi que d'autres améliorations supplémentaires au système expérimental qui ont permis d'utiliser cette méthode comme un test simple, puissant et quantitatif pour visualiser le modification des fonctions cérébrales19,20,21,22,23,24,25. La technique peut également être largement utilisée pour la potentialisation à long terme dans la zone CA1 des tranches hippocampal1. En outre, cette technique est également utile dans l'enregistrement optique des potentiels membranaires dans une seule cellule nerveuse26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université Tokushima Bunri. Le protocole suivant pour la préparation des tranches est presque une procédure standard27 , mais les modifications ont été les protocoles de coloration et d'enregistrement avec VSD.

1. Préparation avant le jour de l'expérience

  1. Préparer le stock A (tableau 1), stock B (tableau 2), et le stock C ( tableau3) solutions et stocker dans un réfrigérateur.
  2. Préparer 1 L de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) (tableau4, voir l'étape 3) et le conserver au réfrigérateur.
  3. Préparer 1 L d'ACSF modifié (tableau 5) et le conserver au réfrigérateur.
  4. Distribuer 500 aliquots de sérum bovin fœtal (FBS) dans des flacons de 2 ml et conserver au congélateur.
  5. Dissoudre 4 % de la poudre d'agar dans l'ACSF (environ 120 ml) dans un four à micro-ondes et la verser dans un plat De 90 mm jetable Petri. La plaque d'agar doit être réfrigérée avant d'être utilisée.
  6. Placer les articles suivants dans un congélateur la veille de l'expérience : un plateau chirurgical, un récipient de trancheur et un bloc de refroidissement en aluminium (120 x 120 x 20 mm3).
  7. Assurez-vous qu'il y a suffisamment d'anneaux en plexiglas avec filtres à membrane pour le système de manipulation des tranches17,28 (voir l'étape 6.12).
  8. Dissoudre 2 % de poudre d'agar dans 50 ml de 3 M KCl au micro-ondes. Prenez environ 85 l de la dissoute chaude d'agar-KCl dans 200 pointes de L utilisant une micropipette pour l'électrode d'échouement. Détachez la pointe dans le gel d'agar 3 M KCl encore chaud. Répétez l'étape pour remplir environ 20-40 conseils avec 2% d'agar.

2. Préparation de vsD (di-4-ANEPPS) Solution d'actions

  1. Préparer 1 ml de 10% d'huile de ricin polyéthylique à l'eau ultra-pure.
  2. Ajouter 1 mL d'éthanol à un flacon de di-4-ANEPPS (5 mg flacon), vortex et sonicate pendant 10 min. La solution se transformera en une couleur rouge foncé avec de petits résidus possibles des cristaux di-4-ANEPPS.
    REMARQUE: L'éthanol utilisé dans cette étape doit être fraîchement ouvert.
  3. Transférer la solution sur un microtube de 2 ml avec un anneau O. Faites tourner la solution et ajoutez 500 l de 10 % de solution d'huile de ricin polyéthylilate d'une valeur de 10 %.
    REMARQUE: Le colorant est très lipophile. DMSO et poloxamer peuvent également être utilisés pour dissoudre di-4-ANEPPS, mais en termes de signal optique lors du changement dans le potentiel membranaire, nous avons constaté que l'utilisation de l'éthanol -huile de ricin polyéthyoxylé donne un meilleur rapport signal/bruit. Cela pourrait être lié au taux de transfert de solvant à la membrane cellulaire.
  4. Vortex et sonicate jusqu'à ce que le colorant soit complètement dissous.
  5. Évitez l'exposition à la lumière et conservez-la au réfrigérateur. Ne pas conserver au congélateur. Le stock peut durer quelques mois.
    REMARQUE: Le jour de l'expérience, suivez les étapes 3-9.

3. Préparation quotidienne de l'ACSF (1 L) (tableau 4)

  1. Peser NaCl, NaHCO3, et le glucose dans un flacon.
  2. Ajouter 950 ml d'eau distillée dans le flaconet commencer à bouillonner avec 95 % de gaz co 2 /5 % de CO2.
  3. Ajouter 2,5 ml de bouillon Une solution au flacon et incuber pendant environ 10 min à température ambiante.
  4. Ajouter 2,5 ml de résilique C à la fiole.
  5. Ajouter de l'eau distillée pour faire la solution à 1 L.

4. Préparation quotidienne de la ssolution VsD Detaining

  1. Sonicate une fiole de 500 ll de FBS et VSD stock solution (étape 2) dans un ultra-sonicator pour 5 min.
  2. Ajouter 500 l d'ACSF fraîchement préparé dans le flacon de FBS.
  3. Ajouter 20 (en cas de souris) ou 40 (en cas de rats) ll de solution de stock VSD au flacon.
  4. Ultra-soniéetale et vortex le flacon jusqu'à ce que la solution devienne orange pâle.

5. Préparation pour la chirurgie

  1. Prenez 100 ml d'ACSF réfrigéré séparément dans un contenant en acier inoxydable de 300 ml, un bécher de 300 ml et un contenant en plastique, et placez-les dans un congélateur. Verser 150 ml d'ACSF modifié réfrigéré (tableau2) dans un autre bécher et le placer au congélateur. Attendez que les solutions soient refroidies; le temps pris doit être mesuré et déterminé à l'avance.
  2. Pliez pour casser une lame de rasoir (acier de carbone, qualité industrielle 0,13 mm d'épaisseur, lame des deux côtés) en deux pour la trancheuse.
    REMARQUE: L'autre moitié peut être utilisée pour la dissection avec un porte-lame approprié.
  3. Préparer un bloc de la plaque d'agar ACSF 4% avec un gabarit d'ajustement (Figure 1).
  4. Préparer une chambre d'incubation humide (une chambre de type interface; une boîte scellée serrée de 1,2 L modifiée avec un emballage en silicone) pour maintenir les tranches de cerveau physiologiquement vivantes (figure2); ajouter l'ACSF dans un petit récipientet le carbonate avec 95 % de gaz co2 /5 % et remplir un plat Petri de 90 mm x 20 mm avec de l'ACSF vers le haut.
    REMARQUE: Un plat Petri plus petit (60 mm x 20 mm) doit être placé au centre du plat de 90 mm pour soutenir un papier filtre sur le plat.
  5. Placez la boîte sur un appareil chauffant et attendez 20 min pour la réchauffer jusqu'à 28 oC.
  6. Ajouter la glace concassée dans le récipient de la trancheuse. Placez les instruments suivants dans une cuve en acier inoxydable (petite) sur la glace : scalpel, porte-lame, pince à épiler, bloc d'agar et stade de trancheur. Gardez l'ACSF congelé et l'ACSF modifié sur la glace et la bulle avec 95% O2/5% CO2 gaz (aka. carbogen).
  7. Placer les instruments suivants dans une cuve (grande) : ciseaux (grands, petits), pinces, spatule, cuillère et pinces diagonales.

6. Chirurgie (Mice)

  1. Anesthésiez la souris à l'aide d'isoflurane dans une hotte à fumée. Évaluer le niveau de l'anesthésie en vérifiant le réflexe de pédale de l'animal sur le pincement des orteils.
  2. Décapiter la souris et immerger la tête dans un ACSF glacé dans un plateau chirurgical en acier inoxydable.
  3. Extraire le cerveau en 1 min et le placer dans un bécher contenant de l'ACSF réfrigéré pendant 5 min.
  4. Sortez le cerveau du bécher et, à l'aide d'un scalpel, coupez le bloc cérébral (Figure 3A).
  5. Placez le bloc cérébral sur un bloc d'agar de 4 % (étape 5.3, Figure 3B). Les deux hémisphères peuvent être montés sur un bloc d'agar. Essuyez l'excès d'ACSF du bloc avec un papier filtre.
  6. Appliquer un adhésif mince (super colle) sur la table de trancheur. Placez le bloc d'agar sur elle et essuyez l'adhésif excédentaire à l'aide d'un papier filtre.
  7. Appliquer délicatement une petite quantité d'ACSF glacé (5 ml) à l'aide d'une pipette du haut du bloc cerveau-agar. Cela aidera à solidifier l'excès de colle super et d'empêcher la colle de couvrir le cerveau et de perturber le tranchage.
  8. Fixez la table de trancheur au plateau de trancheur (figure 3C) et versez l'ACSF modifié.
  9. Régler la trancheuse à une vitesse lente, avec la fréquence de la lame au maximum.
  10. Définir l'épaisseur de la tranche à 350-400 m et commencer à trancher (Figure 3C). Placer les tranches sur le coin du plateau de tranche dans une séquence, de sorte que la profondeur des tranches peut être facilement distinguée. Habituellement, trois à cinq tranches peuvent être obtenues à partir d'un hémisphère.
  11. Couper la partie du tronc cérébral à l'aide d'une aiguille de 30 G (Figure 3D).
    REMARQUE: La microchirurgie sur la tranche de cerveau telle qu'une coupure entre la frontière DE CA3-CA1 devrait être faite à ce stade sous un microscope binoculaire, si nécessaire.
  12. À l'aide d'un petit pinceau à pointes, placez la tranche au centre du filtre à membrane (0,45 m pores, PTFE-membrane, 13 mm de diamètre) avec l'anneau de plexiglas17 (15 mm de diamètre extérieur, 11 mm de diamètre intérieur, 1 mm d'épaisseur, Figure 3E). Placez l'anneau dans la chambre de récupération humide (figure 2) et fixez le couvercle pour maintenir la pression intérieure élevée.
    REMARQUE: Les tranches colleront à la membrane dans un délai de 30 minutes et peuvent être manipulées avec les anneaux dans les étapes suivantes dans la chambre d'enregistrement. Il n'est pas nécessaire d'utiliser des poids ou d'autres mesures pour maintenir la tranche en place.
  13. Ajuster la direction et la position de la tranche dans l'anneau pour s'assurer qu'elle est bien centrée et qu'elle a une direction cohérente (voir l'étape 9.3).
  14. Laisser le spécimen à 28 oC pendant 30 min, puis à température ambiante pendant au moins 10 à 30 min pour la récupération des tranches.
    REMARQUE: Les tranches peuvent maintenant conserver un bon état physiologique au moins pendant 15 h.

7. Coloration et rinçant des tranches (Mice)

  1. Appliquer délicatement 100-110 l de la solution de coloration (étape 4) sur chaque tranche sur l'anneau à l'aide d'une micropipette. Huit à neuf tranches peuvent être tachées avec une solution de coloration préparée à l'étape 4. Laisser les tranches pendant 20 min pour la coloration.
  2. Préparer 50-100 ml d'ACSF dans un récipient et y mettre l'anneau avec un spécimen tranché pour rincer la solution de coloration.
  3. Conserver la tranche rincée dans une autre chambre d'incubation. Attendez plus de 1 h avant l'expérience.
    REMARQUE: La chambre d'incubation peut être détachée du gaz et déplacée au lieu de l'enregistrement dans un état étanche serré. La tranche peut rester en vie pendant au moins 20 min sans approvisionnement en gaz. Ceci est utile dans le cas où vous avez besoin de déplacer la tranche à un autre endroit pour l'enregistrement.

8. Préparation quotidienne de l'apparatus expérimental

  1. Allumez l'amplificateur, l'ordinateur et le système de caméra, et vérifiez que le logiciel est en cours d'exécution.
  2. Placer l'ACSF dans un tube de 50 ml et la bulle avec le carbogen.
  3. Utilisez une pompe péristtaltique pour faire circuler l'ACSF. Ajuster le débit à environ 1 ml/min.
  4. Ajustez la hauteur de la pipette d'aspiration de sorte que le niveau de liquide à l'intérieur de la chambre d'expérience soit toujours constant.
    REMARQUE: Le niveau de la solution est important pour obtenir un enregistrement stable, par conséquent, l'ajustement doit être fait à l'aide d'un micromanipulateur.
  5. Installer l'électrode de sol composée de puce jaune remplie de 3 M KCl agar (2%) (étape 1.8) dans un support avec un fil Ag-AgCl avec une petite quantité de 3 M KCl solution.
  6. Remplissez une petite quantité d'ACSF (environ deux tiers du volume) dans l'électrode de verre (1 mm de diamètre extérieur, 0,78 mm de diamètre intérieur tiré avec une pulleuse micropipette) à l'aide d'une pointe jaune tube mince et effilée et placez-la dans le porte-électrode.
  7. Fixez le support à la tige installée dans le manipulateur. Assurez-vous à l'aide d'un amplificateur que la résistance à l'électrode est d'environ 1 M.
    REMARQUE: L'électrode large d'ouverture à longue tige (4-8 m d'ouverture) de type patch devrait être bonne pour l'enregistrement sur le terrain et comme une électrode stimulante.

9. Démarrage d'une session d'enregistrement

  1. Prendre une tranche de préparation de la chambre humide avec des forceps.
  2. Placez rapidement la tranche sur une chambre expérimentale sous le microscope (Figure 4).
  3. Poussez fermement le bord de l'anneau dans l'anneau O en silicone. Veillez à ne pas casser la membrane ou le fond de la chambre d'expérience.
    REMARQUE: La direction de la tranche doit être prise en considération en ce qui concerne la direction des électrodes stimulantes et d'enregistrement dans le champ de vision. La tranche saine doit coller au filtre à membrane de sorte qu'il n'est pas nécessaire d'utiliser d'autres dispositifs pour fixer les tranches telles que les poids et les mailles de nylon.
  4. Placez la pointe de l'électrode stimulante et l'électrode d'enregistrement potentielle sur le champ sur la tranche sous le microscope avec la lumière transmise.
  5. Utilisez le système d'enregistrement électrophysiologique pour vérifier la réponse. Confirmer l'enregistrement électrophysiologique habituel (non taché) avec une configuration donnée.
    REMARQUE: L'électrode d'enregistrement peut être omise mais est utile pour vérifier la physiologie de la tranche.
  6. Ajustez l'intensité lumineuse d'excitation à environ 70-80% de la capacité maximale à la caméra qui correspond à 13-15 mW/cm2 au spécimen lors de l'échantillonnage à 10 kHz avec la lentille objective d'immersion d'eau 5x et la lentille de tube aPO 1x PLAN. La longueur d'onde de lumière d'excitation est 530 nm, et le filtre d'émission doit être 'gt; 590 nm.
    REMARQUE: Utilisez un obturateur pour minimiser la quantité de lumière d'excitation. L'exposition continue à la lumière peut détériorer la physiologie de la tranche. L'effet nocif possible de la lumière dépend de l'intensité et de la durée de la lumière. Utilisez l'enregistrement électrophysiologique pour juger de l'effet de la lumière. Dans le cas de la force de 13-15 mW/cm2,environ 1 s l'exposition devrait être la limite supérieure de la tolérance.
  7. Ajuster la mise au point avec le système d'acquisition en utilisant la source de lumière fluorescente parce que la mise au point peut être différente en fonction de la longueur d'onde et commencer l'acquisition.
  8. Examinez les données dans un logiciel d'acquisition d'images.
    REMARQUE: Nous avons utilisé un ensemble original de microprogrammation de logiciels d'analyse numérique pour une analyse détaillée.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La figure 5 montre le signal optique représentatif lors de la stimulation électrique de la garantie Schaffer dans la zone CA1 d'une tranche hippocampal de souris. Les images consécutives de la figure 5A montrent le signal optique avant l'application de filtres spatiaux et temporels, tandis que la figure 5B montre les mêmes données après l'application d'un filtre cubique 5 x 5 x 5 (une convolution du noyau gaussien, 5 x 5 dimension temporelle) deux fois. En raison de la fréquence d'image élevée (0,1 ms/cadre) et de la haute résolution spatiale (100 pixels x 100 pixels), l'application du filtre n'a pas changé le signal mais filtré le bruit, qui peut également être observé dans le temps enregistré en pixels dans un seul essai ( Figure 5C, pas de filtre; Figure 5D, avec filtre; et Figure 5E, superposé).

La figure 6 compare la réponse typique dans la zone CA1 d'une tranche hippocampal entre la souris (figure 6A) et le rat (figure 6B). Comme il est évident dans la figure, la réponse hyperpolarisante due aux intrants inhibiteurs est évidente dans la tranche hippocampal de rat en appliquant le même stimulus à la garantie de Schaffer près de la frontière CA1/CA3. La petite réponse hyperpolarisante est observée dans le côté distal du CA1 après 24 ms dans la tranche hippocampal de souris, mais la réponse hyperpolarisante plus massive a dépassé la réponse dépolarisante dans la tranche hippocampal de rat. L'imagerie VSD peut clairement démontrer la différence entre les tranches hippocampal de souris et de rat.

Figure 1
Figure 1 : Une illustration du bloc d'agar utilisé pour monter le tissu de cerveau pour trancher et un gabarit pour faire le bloc. (A) Une illustration schématique du bloc cérébral et du bloc d'agar de 4% (B). (C, D) Photographie d'un gabarit réglable fabriqué par une plaque de plexiglas (5 mm d'épaisseur chacun) pour faire le bloc d'agar. Lors de la préparation du bloc d'agar, les plaques supérieures et inférieures doivent être empilées comme indiqué dans D. (E) En insérant une lame dans les longues fentes minces (1) et (2), la partie triangulaire est découpée, la fente (3) est utilisée pour couper toute la profondeur du bloc. (4) L'enlèvement de la plaque supérieure permet de trancher les parties non nécessaires. À l'aide de la fente 1 et 2, faire seulement 5 mm de profondeur coupes de sorte que résultant du bloc est comme indiqué dans (A) et (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Figure 2
Figure 2 : Une illustration de la chambre d'incubation de type d'interface utilisée pour maintenir la physiologie de tranche. (A) Aperçu du système. (B) Détails intérieurs. (C) Illustration de la chambre de récupération. Le spécimen doit être placé sur un papier filtre placé sur un plat Petri rempli d'ACSF de 90 mm et 60 mm. Ce dernier plat est de soutenir le papier filtre. La vaisselle et le contenant bouillonnant ACSF sont conservés en place avec une assiette en plexiglas. Le papier filtre ne doit pas toucher le mur de la boîte étanche à l'air ni le récipient. L'air est fourni par une bouteille bouillonnante qui intègre des gaz humidifiés dans la chambre. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Préparations de tranches hippocampales à partir d'un cerveau de souris. (A) Le cerveau de souris isolé doit être coupé d'abord à la ligne pointillée (a), puis (b). Enfin, la coupe doit être faite le long de la ligne (c). La coupe doit être perpendiculaire au fond. (B) Le bloc cérébral doit être monté sur un bloc d'agar. (C) Le bloc d'agar doit être placé sur la trancheuse. (D) Tranche résultante. L'excès de tissu doit être coupé à la ligne pointillée. (E) La tranche doit être placée au centre du filtre à membrane avec un support en plexiglas (diamètre extérieur 15 mm, diamètre intérieur 11 mm, filtre à membrane PTFE de 13 mm). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Système d'enregistrement des signaux optiques provenant des préparations de tranches. (A) Une photographie du microscope utilisé pour l'image des tranches dans le manuscrit actuel. L'optique se compose d'une lentille objective (5x NA0.60), d'une boîte miroir pour filtre dichroïque (580 nm), et d'une lentille de projection (tube) (PLAN APO x1.0). Une caméra haute vitesse est fixée sur le dessus de l'objectif de projection à travers une monture c. Il ya une autre caméra USB habituelle pour l'observation. La lumière d'excitation est introduite utilisant la fibre optique. (B) Photographie des lentilles compatibles avec la boîte miroir. (C) Diagramme schématique du système d'enregistrement. Le système d'imagerie et le système d'enregistrement électrophysiologique sont contrôlés par un PC. Le système d'éclairage LED avec un système de contrôle de rétroaction de photo-diode a été employé comme source lumineuse. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Figure 5
Figure 5 : Signal optique représentatif dans la zone CA1 d'une tranche hippocampal de souris dans un seul essai. (A) Les images consécutives montrent la propagation du signal neuronal acquis au taux d'image de 0,1 ms/cadre le long de la voie collatérale Schaffer avant d'appliquer des filtres spatiaux et temporels (tous les 0,2 ms). L'excitation était de 530 nm et l'émission était de 590 nm. (B) Les mêmes données après l'application d'un noyau gaussien tridimensionnel de 5 x 5 x 5 deux fois. (C, D) Les traces de signaux optiques dans les pixels représentatifs [chacun deux pixels (36 m) le long d'une ligne au milieu du CA1 est montrée dans le carré en A, - désigne le pixel dans la pyramide des strates] à partir des données indiquées dans A et B. (E) Le signal superposé de la signaux optiques en C et D. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Figure 6
Figure 6 : Comparaison du signal optique entre les tranches hippocampal de souris et de rat. Les images consécutives représentatives sur la stimulation électrique de la voie collatérale de Schaffer près de la frontière CA3/CA1 d'une souris (A) et d'un rat (B) tranche hippocampal. La vidéo 1 montre la tranche hippocampal de souris et la vidéo 2 montre la tranche hippocampal de rat. Le cours temporel du signal optique au milieu du CA1 à la stratum pyramidale (st. pyr.) et stratum radiatum (st. rad.) est indiqué à droite de la figure. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

MM final poids
NaH2PO4 - 2H2O 1,25 mM 3,90 g
MgSO4'7H2O 2 mM 9,86 g
Kcl 2,5 mm 3,73 g
Ajouter H2O pour faire 50 ml

Tableau 1 : Stock A.

MM final poids
MgSO4'7H2O 2 mM 12,32 g
Ajouter H2O pour faire 50 ml

Tableau 2 : Stock B.

MM final poids
CaCl2h 2H2O 2 mM 5,88 g
Ajouter H2O pour faire 50 ml

Tableau 3 : Stock C.

Finale (mM) poids
Nacl 124 mM 7,25 g
NaHCO3 Annonces 26 mM 2,18 g
glucose 10 mM 1,8 g
Stock A 2,5 ml
Ajouter environ 950 ml de H2O et buller avec du gaz mélangé (95 % O2/5 % CO2) (10 min)
Stock C (CaCl2) 2 mM 2,5 ml
Ajouter H2O pour faire 1000 ml

Tableau 4 : Préparation quotidienne de l'ACSF.

Finale (mM) poids
NaHCO3 Annonces 26 mM 2,18 g
Saccharose 205,35 mM 70,29 g
glucose 10 mM 1,8 g
Stock A 2,5 ml
Stock B 2,0 ml
Ajouter environ 900 ml de H2O et buller avec du gaz mélangé (95 % O2/5 % CO2) (10 min)
Stock C 0,4 mm 0,5 ml
Ajouter H2O pour faire 1000 ml

Tableau 5 : ACSF modifié (solution de coupe).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La physiologie de la tranche est essentielle pour recueillir le bon signal. L'utilisation du système de filtre à membrane d'anneau dans ce protocole garantit que la tranche reste saine et non déformée tout au long de la procédure2,16,17. D'autres systèmes peuvent être utilisés pour conserver la physiologie des tranches pendant l'enregistrement, mais la tranche ne doit pas se déformer à tout moment que l'imagerie a besoin de chaque partie de la tranche pour être en bonne santé. Le système de filtre à membrane d'anneau est également meilleur pour la coloration, car cela nous aide à minimiser le volume de la solution de coloration requise. Il est également important de contrôler l'intensité de la lumière d'excitation, car elle devrait être faible par rapport à la fraction de temps. L'éclairage continu peut endommager le spécimen; par conséquent, l'utilisation appropriée de l'obturateur est nécessaire.

La toxicité du VSD a été souvent discutée29,mais elle est le résultat de la multiplication non linéaire de la concentration de colorant, de l'intensité lumineuse d'excitation, et de la durée de l'exposition à la lumière. La procédure de coloration montrée dans ce protocole n'a pas entraîné de changements mesurables dans les paramètres physiologiques de la tranche tels que les relations entrée-sortie des enregistrements sur le terrain potentiel et ceux sur la potentialisation à long terme (LTP), appariement-impulsion facilitation (PPF). La détérioration de la physiologie de la tranche est importante surtout sous l'éclairage continu16,mais elle peut être gérée en surveillant le potentiel de champ. En utilisant ces précautions, nous pouvons enregistrer LTP avec enregistrement optique continu en utilisant VSD pour plus de 12 h24, ce qui est comparable aux meilleures expériences in vitro conditionnés.

Pendant l'enregistrement, la table d'air peut être utile, mais l'isolation d'autres dispositifs devrait être autorisée en raison du faible grossissement de l'optique. Cependant, les perturbations mécaniques sont l'une des causes importantes derrière la mauvaise imagerie. Si la quantité considérable de faux signal dans l'image se compose de signes opposés au bord de l'objet, donc la différence de luminosité, c'est le plus probablement causé par les perturbations mécaniques. Les mouvements du spécimen et du liquide sont les causes les plus fréquentes du bruit de mouvement, et donc, devraient être évités ou minimalisés.

Le signal VSD (changement fractionnel de l'intensité lumineuse) est faible (10-3 à 10-4 de la fluorescence initiale). Pour détecter un si petit changement, la fluorescence doit dépasser 105 à 106 photons au détecteur dans la fraction de temps pour surmonter l'effet du bruit photon-shot. En outre, pour suivre l'activité neuronale, le taux d'image doit être rapide, proche des constantes de temps nécessaires pour effectuer l'enregistrement électrophysiologique comme celui autour de la gamme kHz. Une combinaison de ces deux conditions exige la quantité de fluorescence qui est beaucoup plus vaste que d'autres types d'imagerie fluorescente. Cela nécessite une ouverture numérique élevée dans l'ensemble de l'optique, et le microscope habituel n'est pas la meilleure option. Une plus grande pupille et une plus grande ouverture sont nécessaires comme indiqué à la figure 4.

Le système de recodage doit correspondre à la plus grande profondeur de puits de photon, la vitesse d'image rapide, et le bruit faible. Le choix dépend principalement de la vitesse du système neuronal. Le signal plus rapide comme la transduction du signal hippocampal nécessite un système spécialisé ultrarapide et à faible bruit. Cependant, le signal lent tel que la propagation lente de l'activité dans les cortices pourrait être détecté à l'aide des caméras habituelles mais scientifiques de qualité.

Le choix de la source lumineuse est également essentiel. Le choix de la lumière dépend de son intensité, de sa stabilité et de la zone d'éclairage. Dans le cas de l'imagerie à champ large à faible grossissement, la source de lumière ponctuelle comme les arcs et les lasers doit se dilater, ce qui rend difficile l'utilisation de ces sources. Les arcs, comme le mercure et les lampes au xénon, sont la source lumineuse, mais ne sont généralement pas stables. Cependant, le développement récent de la lumière xénon pourrait surmonter le problème. La lampe halogène est stable et a une plus grande surface de filament qui peut facilement correspondre à l'imagerie à large champ, mais est limitée dans la force en particulier à 530 nm. Le développement récent de la LED de puissance nous a permis de l'utiliser comme source de lumière potentielle, mais il doit avoir le stabilisateur de rétroaction en raison de la dépendance de température. Les lasers peuvent être utilisés, mais la cohérence élevée entraîne un bruit moucheté, ce qui est généralement inacceptable pour l'imagerie à champ large.

Le protocole d'imagerie VSD présenté dans cet article mesure une valeur par rapport à l'état de repos. La mesure absolue du potentiel membranaire ne peut pas être effectuée en utilisant la technique actuelle. L'imagerie ratiométrique et les mesures à vie de fluorescence peuvent être utilisées pour évaluer les potentiels absolus de la membrane.

La formation image de tranches de cerveau tachées de VSD à faible grossissement peut démontrer les changements potentiels de membrane de sous-seuil dans les interactions micro-circuitaires du cerveau. Une telle portée fonctionnelle concernant la connexion entre le micro-circuitage à la résolution en temps réel sera utile dans de nombreux domaines de la recherche sur le cerveau, en particulier pour analyser les aspects pathologiques probablement causés par ces excitatrices et inhibiteurs fonctionnelles connexions entre différentes zones du cerveau. Cette application sera essentielle pour étudier les changements dans les circuits neuronaux liés à certains types de maladies neuropsychiatriques30,31,32.

Le développement de l'indicateur de tension génétiquement codé33,34 est la direction future pour les enregistrements potentiels de membrane optique qui ouvrira la voie aux applications attrayantes de l'analyse de type cellulaire spécifique des neurones événements de niveau circuit.

Il ya beaucoup de place pour l'amélioration dans l'optique, en particulier pour la visualisation des connexions fonctionnelles à large champ. Notre nouvelle optique confocale35 permettra l'enregistrement à haute vitesse et à haut rapport S/N du signal VSD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

TT a reçu la subvention JSPS KAKENHI (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038, et JP15K00413) de MEXT et des subventions du Ministère de la Santé, du Travail et du Bien-être social (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] et H30 [18062156]). Nous tenons à remercier Editage (www.editage.jp) pour l'édition en anglais.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High speed image acquisition system Brainvision co. Ltd. MiCAM - Ultima Imaging system
High speed image acquisition system Brainvision co. Ltd. MiCAM 02 Imaging system
Macroscepe for wide field imaging Brainvision co. Ltd. THT macroscope macroscope
High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer Brainvision co. Ltd. LEX-2G LED illumination
Image acquisition software Brainvision co. Ltd. BV-ana image acquisition software
Multifunctional electric stimulator Brainvision co. Ltd. ESTM-8 Stimulus isolator+AD/DA converter
Slicer Leica VT-1200S slicer
Slicer Leica VT-1000 slicer
Blade for slicer Feather Safety Razor Co., Ltd. #99027 carbon steel razor blade
Membrane filter for slice support Merk Millipore Ltd., MA, USA Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, membrane filter/0.45 13
Numerical analysis software Wavemetrics Inc., OR, USA IgorPro analysing software
Stimulation isolator WPI Inc. A395 Stimulus isolator
AD/DA converter Instrutech ITC-18 AD/DA converter
Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA catalog number: D-1199 VSD: Di-4-ANEPPS
Poloxamer Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Pluronic F-127 P30000MP poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)
Polyethoxylated castor oil Sigma-Aldrich Cremophor EL C5135 polyethoxylated castor oil

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
  2. Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
  3. Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
  4. Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
  5. Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
  6. Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
  7. Hill, D., Keynes, R. Opacity changes in stimulated nerve. The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).
  8. Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
  9. Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
  10. Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
  11. Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
  12. Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
  13. Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
  14. Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
  15. Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
  16. Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
  17. Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. Tominaga, T., Ichikawa, M. , US 6,448,063 B2 (2002).
  18. Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).
  19. Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
  20. Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
  21. Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
  22. Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
  23. Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
  24. Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
  25. Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
  26. Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
  27. Sakmann, B., Stuart, G. Single-Channel Recording. , (1995).
  28. Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
  29. Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
  30. Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
  31. Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
  32. Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
  33. Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
  34. Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
  35. Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).

Tags

Neurosciences Numéro 148 colorant sensible à la tension enregistrement optique tranche hippocampique circuit neuronal in vitro monophoton
Enregistrement optique à grand champ à un seul photon dans des tranches de cerveau à l'aide de teinture sensible à la tension
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tominaga, Y., Taketoshi, M., Maeda,… More

Tominaga, Y., Taketoshi, M., Maeda, N., Tominaga, T. Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye. J. Vis. Exp. (148), e59692, doi:10.3791/59692 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter