Summary
We introduceren een reproduceerbare en stabiele optische opnamemethode voor hersen schijfjes met spannings gevoelige kleurstof. Het artikel beschrijft spanning-gevoelige kleurstof beitsen en het opnemen van optische signalen met behulp van conventionele hippocampale slice preparaten.
Abstract
Wide-veld single foton voltage-Sensitive Dye (VANHOOF) Imaging van de hersenen slice preparaten is een nuttig instrument om de functionele connectiviteit in neurale circuits te beoordelen. Wegens de verwaarloosbare verandering in het lichtsignaal, is het moeilijk geweest om deze methode als kwantitatieve analyse te gebruiken. Dit artikel beschrijft speciale optica en slice handling systemen, die deze techniek stabiel en betrouwbaar maken. Het huidige artikel toont de slice handling, kleuring, en de opname van de VANHOOF-gekleurd hippocampale plakjes in detail. Het systeem handhaaft lange tijd fysiologische voorwaarden, met het goede bevlekken, en verhindert mechanische bewegingen van het segment tijdens de opnamen. Bovendien maakt het kleuring van plakjes met een kleine hoeveelheid van de kleurstof. De optica bereiken hoge numerieke diafragma bij lage vergroting, die het mogelijk maakt de opname van de VANHOOF signaal op de maximale frame rate van 10 kHz, met 100 pixel x 100-pixel ruimtelijke resolutie. Door de hoge frame rate en ruimtelijke resolutie, deze techniek maakt het mogelijk de toepassing van de post-Recording filters die voldoende signaal-ruisverhouding te bieden aan de veranderingen in de neurale circuits te beoordelen.
Introduction
Wide-veld Single Photon voltage-Sensitive Dye (Vanhoof) beeldvorming van bulk-gekleurde hersenen slice preparaten is uitgegroeid tot een nuttig kwantitatief instrument om de dynamiek van de neurale circuits1,2,3,4 te beoordelen . Na de analyse van de veranderingen in optische eigenschappen toe te schrijven aan membraan opwinding5,6,7, werd de weergave van Vanhoof eerst beschreven in de vroege jaren ' 70 door Cohen en anderen6,8, 9.; het is een geschikte methode om de hersenen functies in real-time te controleren als de kleurstof direct sondes het membraan potentiële veranderingen (dat wil zeggen, het primaire signaal van de neuronen).
Vroegste VSDs bezat de wenselijke kenmerken om het hersenen systeem, zoals een snelle tijd-constante te begrijpen om de snelle kinetica van neuronale membraan potentiële gebeurtenissen te volgen, en lineariteit met de verandering in membraan potentieel9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. vergelijkbaar met andere Imaging experimenten, deze techniek vereist een breed scala van specifieke tunings, zoals de camera's, optica, software, en slice fysiologie, om de gewenste resultaten te bereiken. Vanwege deze technische valkuilen, de verwachte voordelen tijdens de initiële inspanningen niet noodzakelijkerwijs materialiseren voor de meeste van de laboratoria die niet gespecialiseerd in deze techniek.
De oorspronkelijke oorzaak van de technische moeilijkheid was de lage gevoeligheid van de VANHOOF in de richting van het membraan potentiële verandering wanneer toegepast op bulk kleuring van slice preparaten. De grootte van het optische signaal (d.w.z., de verwaarloosbare verandering in fluorescentie) is gewoonlijk 10-4-10-3 van het signaal van de controle (F0) onder fysiologische voorwaarden. De tijdschaal van membraanpotentiaal verandering in een neuron is ongeveer milliseconden tot enkele honderden milliseconden. Voor het meten van de veranderingen in het membraan potentieel van het neuron, de camera wordt gebruikt voor de opname moet in staat zijn om beelden te verwerven met hoge snelheid (10 kHz tot 100 Hz). De lage gevoeligheid van de Vanhoof en de snelheid die nodig is om het neurale signaal te volgen, vereist een grote hoeveelheid licht die bij de camera op hoge snelheid moet worden verzameld, met een hoge signaal-ruisverhouding (S/N)2,16.
De optica van het opnamesysteem is ook een kritisch element om inzameling van voldoende licht te verzekeren en S/N te verbeteren. De vergroting bereikt door de optiek is vaak overdreven laag, zoals 1X tot 10X, om een lokale functionele neurale circuit te visualiseren. Bijvoorbeeld om de dynamiek van het hippocampale circuit te visualiseren, zou een vergroting van ongeveer 5 geschikt zijn. Dergelijke lage vergroting heeft lage fluorescentie efficiency; Daarom zou geavanceerde optiek gunstig zijn voor een dergelijke opname.
Daarnaast is de slice fysiologie is ook van essentieel belang. Aangezien de Imaging-analyse vereist dat de plakjes intact zijn, is zorgvuldige slice handling nodig17. Bovendien zijn maatregelen genomen om de slice levensvatbaarheid voor een langere tijd te handhaven belangrijk18.
Het onderhavige artikel beschrijft het protocol voor de voorbereiding van plakjes, VANHOOF kleuring en metingen. Het artikel schetst ook de verbeteringen aan de VSDs, imaging-apparaat, en optica, en andere extra verfijningen aan de experimentele systeem dat hebben ingeschakeld deze methode te worden gebruikt als een eenvoudige, krachtige en kwantitatieve assay voor het visualiseren van de wijziging van de hersenen functies19,20,21,22,23,24,25. De techniek kan ook op grote schaal worden gebruikt voor lange termijn potentiëring in de CA1 gebied van hippocampale slices1. Bovendien, deze techniek is ook nuttig bij optische opname van membraanpotentiaal in een enkele zenuwcel26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de protocollen goedgekeurd door de Dierenzorg en het gebruik Comite van Tokushima Bunri University. Het volgende protocol voor slice voorbereiding is bijna een standaard procedure27 , maar de wijzigingen zijn de protocollen van kleuring en opname met de Vanhoof.
1. voorbereiding voor de dag van het experiment
- Bereid de voorraad A (tabel 1), voorraad B (tabel 2), en Stock C (tabel 3) oplossingen en op te slaan in een koelkast.
- Bereid 1 L van kunstmatige hersenvocht (ACSF) (tabel 4, zie stap 3) en bewaar deze in de koelkast.
- Bereid 1 L gemodificeerde ACSF (tabel 5) en bewaar deze in de koelkast.
- Doseer 500 µ L van foetale boviene serum (FBS) in 2 mL flacons en bewaar in een diepvries.
- Los 4% agar poeder op in ACSF (ca. 120 mL) in een magnetron en giet het in een 90 mm wegwerp Petri schaaltje. De agar plaat zou vóór verder gebruik moeten worden gekoeld.
- Plaats de volgende items in een vriezer op de dag voor het experiment: een chirurgische tray, een slicer container en een aluminium koelblok (120 x 120 x 20 mm3).
- Zorg ervoor dat er voldoende plexiglas ringen met membraanfilters voor slice handling systeem17,28 (zie stap 6,12).
- Los 2% agar poeder op in 50 mL van 3 M KCl in een magnetron. Neem rond 85 µ L van de warme agar-KCl oplosmiddel in 200 µ L tips met behulp van een micropipet voor de aarding elektrode. Maak de tip los in de nog warme agar 3 M KCl gel. Herhaal de stap om ongeveer 20-40 uiteinden met 2% agar te vullen.
2. voorbereiding van de (di-4-ANEPPS) voorraad-oplossing
- Bereid 1 mL van 10% polyethoxylated ricinusolie oplossing met ultra-zuiver water.
- Voeg 1 mL ethanol toe aan een flacon van di-4-ANEPPS (5 mg flacon), Vortex en bewerk voor 10 min. De oplossing zal veranderen in een dieprode kleur met mogelijke kleine residuen van de di-4-ANEPPS kristallen.
Opmerking: De ethanol gebruikt in deze stap moet vers worden geopend. - Breng de oplossing over naar een 2 mL micro tube met een O-ring. Spin vaststelling van de oplossing en voeg 500 µ L van 10% polyethoxylated Castor olie-oplossing.
Opmerking: De kleurstof is zeer lipophilic. DMSO en poloxamer kan ook worden gebruikt om te ontbinden di-4-ANEPPS, maar in termen van het optische signaal bij verandering in membraanpotentiaal, vonden we dat het gebruik van ethanol-polyethoxylated ricinusolie geeft een beter signaalruisverhouding. Dit kan worden gerelateerd aan de overdrachtsnelheid van oplosmiddel naar de celmembraan. - Vortex en bewerk tot de kleurstof volledig is opgelost.
- Vermijd blootstelling aan licht en bewaar het in een koelkast. Niet opslaan in een vriezer. De voorraad kan duren voor een paar maanden.
Opmerking: Volg de stappen 3-9 op de dag van het experiment.
3. dagelijkse voorbereiding van ACSF (1 L) (tabel 4)
- Weeg NaCl, NaHCO3, en glucose in een kolf.
- Voeg 950 mL gedestilleerd water toe aan de kolf en begin met het borrelen met 95% O2/5% Co2 gas.
- Voeg 2,5 mL voorraad een oplossing toe aan de kolf en incubeer ongeveer 10 min bij kamertemperatuur.
- Voeg 2,5 mL Stock C oplossing toe aan de kolf.
- Voeg gedistilleerd water om de oplossing te maken tot 1 L.
4. dagelijkse voorbereiding van de kleuring VANHOOF Ssolution
- Bewerk een 500 µ L flacon van FBS en de VANHOOF stockoplossing (stap 2) in een ultra-geen ultrasoonapparaat voor 5 min.
- Voeg 500 µ L van vers bereide ACSF in de flacon van FBS.
- Voeg 20 (in het geval van muizen) of 40 (in geval van ratten) µ L van de VANHOOF voorraad oplossing voor de flacon.
- Ultra-Bewerk en Vortex de flacon tot de oplossing wordt bleke sinaasappel.
5. voorbereiding voor chirurgie
- Neem 100 mL gekoelde ACSF afzonderlijk in een roestvrijstalen container van 300 mL, een bekerglas van 300 mL en een plastic bakje, en plaats ze in een vriezer. Giet 150 mL gekoelde gemodificeerde ACSF (tabel 2) in een ander bekerglas en plaats deze in de vriezer. Wacht tot de oplossingen zijn gekoeld; de genomen tijd moet vooraf worden gemeten en bepaald.
- Vouw om een scheermesje (koolstofstaal, industriële rang 0,13 mm dik, mes aan beide zijden) te breken in de helft voor de Slicer.
Opmerking: De andere helft kan worden gebruikt voor dissectie met een goede mes houder. - Bereid een blok van de ACSF 4% agar plaat met een aanpassings kaliber (Figuur 1).
- Bereid een vochtige incubatie kamer (een interfacetype kamer; een gemodificeerde 1,2 L strakke verzegelde doos met een siliconen verpakking) voor het houden van de hersenen segmenten fysiologisch in leven (Figuur 2); Voeg ACSF in een kleine container en carbonaat met 95% O2/5% Co2 gas, en vul een 90 mm x 20 mm PETRI schaaltje met ACSF in naar de top.
Opmerking: Een kleinere Petri schaal (60 mm x 20 mm) moet worden geplaatst in het midden van de 90 mm schotel om een filtreerpapier op de schotel te ondersteunen. - Zet de doos op een verwarmingstoestel en wacht 20 min om het te verwarmen tot 28 ˚ C.
- Voeg crushed ice in de container van de Slicer. Plaats de volgende instrumenten in een roestvrijstalen vat (klein) op ijs: scalpel, mes houder, ring pincet, agar blok, en een fase van Slicer. Houd bevroren ACSF en gewijzigde ACSF op ijs en bel met 95% O2/5% Co2 gas (aka. carbogen).
- Plaats de volgende instrumenten in een vat (groot): schaar (groot, klein), pincet, een spatel, een lepel, en diagonale Tang.
6. chirurgie (muizen)
- Verdoven de muis met behulp van Isofluraan in een rook kap. Beoordeel het niveau van de anesthesie door het controleren van de pedaal reflex van het dier op Teen pinch.
- Onthoofd de muis en dompel de kop in ijskoude ACSF in een roestvrijstalen chirurgische tray.
- Haal de hersenen binnen 1 minuut en plaats deze in een bekerglas met gekoelde ACSF voor 5 min.
- Neem de hersenen uit het bekerglas en gebruik een scalpel om het hersen blok te trimmen (Figuur 3a).
- Plaats het hersen blok op een 4% agar blok (stap 5,3, Figuur 3b). Beide halfronden kunnen worden gemonteerd op een agar-blok. Veeg de overtollige ACSF uit het blok met een filterpapier.
- Breng dunne lijm (superlijm) aan de slicer tabel. Plaats de agar-blok op en veeg de overtollige lijm met behulp van een filterpapier.
- Breng voorzichtig een kleine hoeveelheid ijskoude ACSF (~ 5 mL) met behulp van een pipet van de bovenkant van de Brain-agar blok. Dit zal helpen stollen overtollige superlijm en voorkomen dat de lijm van de dekking van de hersenen en het verstoren van de snijden.
- Bevestig de slicer tabel naar de slicer lade (figuur 3c) en giet de gewijzigde ACSF.
- Stel de slicer op een langzame snelheid, met de blad frequentie op maximaal.
- Stel de slice dikte in op 350-400 µm en begin met snijden (figuur 3c). Plaats de segmenten op de hoek van de slice-lade in een reeks, zodat de diepte van de segmenten gemakkelijk kan worden onderscheiden. Meestal drie tot vijf segmenten kunnen worden verkregen van een halfrond.
- Snijd de hersenstam gedeelte met behulp van een 30 G naald (figuur 3D).
Opmerking: Microchirurgie op de hersenen slice, zoals een snede tussen de CA3-CA1 grens moet worden gedaan in dit stadium onder een verrekijker Microscoop, indien nodig. - Met behulp van een kleine getipt penseel, plaats de slice op het midden van het membraanfilter (0,45 µm poriën, PTFE-membraan, 13 mm diameter) gehouden met de plexiglas ring17 (15 mm buitendiameter, 11 mm binnendiameter, 1 mm dikte, figuur 3e). Plaats de ring in de vochtige herstel kamer (Figuur 2) en zet de klep vast om de innerlijke druk hoog te houden.
Opmerking: De plakjes zullen vasthouden aan het membraan binnen 30 minuten en kan worden behandeld met de ringen in de daaropvolgende stappen in de opname kamer. Het is niet nodig om gewichten of andere maatregelen te gebruiken om de slice op zijn plaats te houden. - Pas de richting en de positie van het segment in de ring om ervoor te zorgen dat het goed gecentreerd en heeft een consistente richting (zie stap 9,3).
- Laat het specimen bij 28 °C gedurende 30 min, en vervolgens bij kamertemperatuur gedurende ten minste 10 tot 30 minuten voor het herstel van de plakjes.
Opmerking: De plakjes kunnen nu goed fysiologische conditie te behouden ten minste voor 15 h.
7. kleuring en spoelen van de plakjes (muizen)
- Breng voorzichtig 100-110 µ L van de kleuring oplossing (stap 4) op elk sneetje op de ring met behulp van een micropipet. Acht tot negen segmenten kunnen worden gekleurd met een kleuring oplossing voorbereid in stap 4. Laat de plakjes voor 20 min voor kleuring.
- Bereid 50-100 mL ACSF in een container en zet de ring met gesneden specimen in het aan de kleuring oplossing spoelen.
- Bewaar de gespoelde schijf naar een andere incubatie kamer. Wacht meer dan 1 uur voor herstel voor het experiment.
Opmerking: De incubatie kamer kan worden losgemaakt van het gas en verplaatst naar de plaats van de opname in een strakke verzegelde toestand. De slice kan blijven leven voor ten minste 20 min. zonder gas levering. Dit is nuttig voor het geval dat u het segment naar een andere plaats voor opname moet verplaatsen.
8. dagelijkse bereiding van experimentele toestellen
- Schakel de versterker, de computer en het camera systeem in en controleer of de software actief is.
- Plaats ACSF in een 50 mL buis en bel met carbogen.
- Gebruik een peristaltische pomp om de ACSF te circuleren. Stel het debiet in op ongeveer 1 mL/min.
- Pas de hoogte van de zuig pipet aan zodat het vloeistofniveau in de proefruimte altijd constant is.
Opmerking: Het niveau van de oplossing is belangrijk voor het verkrijgen van een stabiele opname, dus de aanpassing moet worden gedaan met behulp van een micromanipulator. - Installeer de gemalen elektrode opgebouwd uit gele chip gevuld met 3 M KCl agar (2%) (stap 1,8) in een houder met een Ag-AgCl draad met een kleine hoeveelheid van 3 M KCl oplossing.
- Vul een kleine hoeveelheid ACSF (ongeveer twee-derde van het volume) in de glaselektrode (1 mm buitendiameter, 0,78 mm binnendiameter getrokken met een micro pipette trekker) met behulp van een taps toelopende dunne buis geel uiteinde en plaats deze in de elektrode houder.
- Bevestig de houder op de stang die in de manipulator is geïnstalleerd. Zorg ervoor dat een versterker wordt gebruikt die de elektrode weerstand ongeveer 1 MΩ.
Opmerking: De lange-schacht wijde opening (4-8 µm opening) patch type elektrode moet goed zijn voor het veld opnemen en als een stimulerende elektrode.
9. een opname sessie starten
- Neem een slice voorbereiding van de vochtige kamer met een tang.
- Plaats het segment snel op een experimentele kamer onder de Microscoop (Figuur 4).
- Duw de rand van de ring stevig in de Silicone O-ring. Wees voorzichtig niet te breken het membraan of de onderkant van het experiment kamer.
Opmerking: De richting van het segment moet in aanmerking worden genomen met betrekking tot de richting van de stimulerende en de opname elektroden in het gezichtsveld. De gezonde slice moet vasthouden aan het Membraanfilter, dus er is geen noodzaak om andere apparaten te gebruiken om de plakjes vast te stellen, zoals gewichten en nylon mazen. - Plaats het uiteinde van de stimulerende elektrode en het veld potentiële opname elektrode op de slice onder de microscoop met overdraagbaar licht.
- Gebruik het elektrofysiologische opnamesysteem om de reactie te controleren. Bevestig de gebruikelijke (niet-gekleurd) elektrofysiologische opname met bepaalde configuratie.
Opmerking: De opname-elektrode kan worden weggelaten, maar is nuttig om de Fysiologie van het segment te controleren. - Pas de excitatie lichtintensiteit aan ongeveer 70-80% van de maximale capaciteit op de camera die overeenkomt met 13-15 mW/cm2 bij het monster bij bemonstering op 10 kHz met 5x wateronderdompeling objectief en 1x plan APO buis lens. De excitatie lichtgolf lengte is 530 nm, en de emissie filter moet worden > 590 nm.
Opmerking: Gebruik een sluiter om het bedrag van excitatie licht te minimaliseren. De ononderbroken lichte blootstelling kan de segment fysiologie verslechteren. Het mogelijke schadelijke effect van het licht hangt af van de intensiteit en de duur van het licht. Gebruik elektrofysiologische opname om het effect van licht te beoordelen. In het geval van de sterkte van 13-15 mW/cm2, ongeveer 1 s blootstelling moet de bovengrens van de tolerantie. - Pas de focus met de acquisitie systeem met behulp van de TL-lichtbron, omdat de focus kan verschillen afhankelijk van de golflengte en start de overname.
- Controleer de gegevens in een software voorbeeld overname.
Opmerking: We gebruikten originele microprogrammatie pakket van numerieke analyse software voor gedetailleerde analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 5 toont de representatieve optische signaal op elektrische stimulatie van de Schaffer onderpand in gebied Ca1 van een muis hippocampale slice. De opeenvolgende beelden in figuur 5a tonen het optische signaal voordat er ruimtelijke en temporele filters werden toegepast, terwijl Figuur 5b dezelfde gegevens toont na het aanbrengen van een 5 x 5 x 5 kubieke filter (een Gaussische kernel-winding, 5 x 5 ruimtelijke-en 5 tot temporele-dimensie) tweemaal. Door de hoge frame rate (0,1 MS/frame) en een hoge ruimtelijke resolutie (100 pixels x 100 pixels), de toepassing van het filter niet veranderen het signaal, maar gefilterd het geluid, die ook kan worden waargenomen in de tijd cursus opgenomen in pixels in een enkele proef ( Figuur 5C, geen filter; Figuur 5d, met filter; en figuur 5e, bovenop).
Figuur 6 vergelijkt de typische respons in gebied Ca1 van een hippocampale slice tussen muis (Figuur 6a) en rat (Figuur 6b). Zoals blijkt uit de figuur, hyperpolarizing reactie als gevolg van remmende ingangen is duidelijk in de rat hippocampale slice bij de toepassing van dezelfde stimulans om de Schaffer onderpand in de buurt van de CA1/CA3 grens. De kleine hyperpolarizing reactie wordt waargenomen in de distale kant van de CA1 na 24 MS in de muis hippocampale slice, maar meer massale hyperpolarizing reactie overhaalde de depolariseren reactie in de rat hippocampale slice. De VANHOOF beeldvorming kan duidelijk aantonen het verschil tussen muis en rat hippocampale plakjes.
Figuur 1 : Een illustratie van de agar-blok gebruikt om hersenweefsel te monteren voor het snijden en een mal om het blok te maken. (A) een schematische illustratie van het hersen blok en het 4% agar blok (B). (C, D) Foto van een verstelbare mal gemaakt door een plexiglas plaat (5-mm dik elk) om de agar-blok te maken. Bij de voorbereiding van de agar blok, de bovenste en de onderste platen moeten worden gestapeld zoals aangegeven in D. (E) door het invoegen van een mes in de lange dunne sleuven (1) en (2), de driehoekige deel is uitgesneden, de sleuf (3) wordt gebruikt om de gehele diepte van het blok trim. (4) verwijdering van de bovenste plaat maakt het snijden van de niet-noodzakelijke onderdelen. Met behulp van de sleuf 1 en 2, maken slechts 5 mm diep gesneden, zodat het resultaat van het blok is zoals aangegeven in (A) en (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Een illustratie van de interfacetype incubatie kamer gebruikt om de slice fysiologie te handhaven. (A) overzicht van het systeem. Binterieurdetails. Cillustratie van de herstel kamer. Specimen moet worden geplaatst op een filtreerpapier geplaatst op een ACSF 90 mm en 60 mm Petri schaaltje. De laatstgenoemde schotel moet het filter document steunen. De gerechten en ACSF borrelende container worden op hun plaats gehouden met een plexiglas plaat. Het filterpapier moet niet aanraken van de muur van de luchtdichte doos, noch de container. De lucht wordt geleverd door een borrelende fles die bevochtigde gassen in de kamer bevat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Hippocampale slice preparaten uit een muis brein. (A) de geïsoleerde muis hersenen moeten eerst worden gesneden op de stippellijn (a), dan (b). Ten slotte moet de snede worden gemaakt langs de lijn (c). De snede moet loodrecht op de bodem. (B) het hersen blok moet op een agar-blok worden gemonteerd. (C) het agar-blok moet op de slicer worden geplaatst. Ddaaruit voortvloeiende slice. Het overtollige weefsel moet worden gesneden op de stippellijn. (E) de slice moet worden geplaatst in het midden van het membraanfilter met een plexiglas houder (buitendiameter 15 mm, binnendiameter 11 mm, het PTFE-membraanfilter van 13 mm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Opnamesysteem voor optische signalen van slice preparaten. (A) een foto van de Microscoop gebruikt om de segmenten in het huidige manuscript te verbeelden. De optiek bestaat uit een objectieve lens (5x NA 0.60), een spiegel doos voor dichroïde filter (580 nm), en een projectie (buis) lens (PLAN APO x 1.0). Een high-speed camera is bevestigd op de top van de projectielens door middel van een c-mount. Er is een andere gebruikelijke USB-camera voor observatie. Excitatie licht wordt geïntroduceerd met behulp van Fiber Optics. (B) foto van de lenzen die compatibel zijn met de spiegel doos. (C) schematisch schema van het opnamesysteem. Het imaging systeem en elektrofysiologische opnamesysteem worden gecontroleerd door een PC. LED-verlichting systeem met een foto-diode feedback controlesysteem werd gebruikt als een lichtbron. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Representatief optisch signaal in gebied Ca1 van een muis hippocampale slice in een enkele proef. (A) de opeenvolgende beelden tonen de voortplanting van het neuronale signaal verworven op de frame rate van 0,1 MS/frame langs de Schaffer collaterale pad voor het aanbrengen van een ruimtelijke en temporele filters (elke 0,2 MS). De opwinding was 530 nm en de emissie was > 590 nm. (B) dezelfde gegevens na een toepassing van een drie-dimensionale Gauss-kernel van 5 x 5 x 5 tweemaal. (C, D) De sporen van optische signalen in de representatieve pixels [elke twee pixels (36 µm) langs een lijn in het midden van de CA1 wordt weergegeven op het plein in een, * duidt de pixel in het stratum pyramidale] van de gegevens weergegeven in A en B. (E) het opgelegde signaal van de optische signalen in C en D. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : Vergelijking van optisch signaal tussen muis en rat hippocampale plakjes. De representatieve opeenvolgende beelden op elektrische stimulatie van de Schaffer collaterale pad in de buurt van de CA3/CA1 grens van een muis (a) en rat (B) hippocampale slice. Video 1 toont de muis hippocampale slice en video 2 toont de rat hippocampale slice. De tijdsverloop van het optische signaal in het midden van de CA1 bij het stratum pyramidale (St....) en stratum radiatum (St. rad.) wordt rechts van de figuur getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Laatste mM | Gewicht | |
| NaH2po4 • 2H2O | 1,25 mM | 3,90 g |
| MgSO4• 7H2O | 2 mM | 9,86 g |
| Kcl | 2,5 mM | 3,73 g |
| Voeg H2O toe om 50 ml te maken |
Tabel 1: voorraad A.
| Laatste mM | Gewicht | |
| MgSO4• 7H2O | 2 mM | 12,32 g |
| Voeg H2O toe om 50 ml te maken |
Tabel 2: voorraad B.
| Laatste mM | Gewicht | |
| CaCl2• 2H2O | 2 mM | 5,88 g |
| Voeg H2O toe om 50 ml te maken |
Tabel 3: voorraad C.
| Def. (mM) | Gewicht | |
| Nacl | 124 mM | 7,25 g |
| NaHCO3 | 26 mM | 2,18 g |
| Glucose | 10 mM | 1,8 g |
| Voorraad een | 2,5 mL | |
| Voeg ongeveer 950 mL van H2O en Bubble met gemengd gas (95% O2/5% Co2) (10 min) | ||
| Voorraad C (CaCl2) | 2 mM | 2,5 mL |
| Voeg H2O toe om 1.000 ml te maken | ||
Tabel 4: dagelijkse voorbereiding van ACSF.
| Def. (mM) | Gewicht | |
| NaHCO3 | 26 mM | 2,18 g |
| Sacharose | 205,35 mM | 70,29 g |
| Glucose | 10 mM | 1,8 g |
| Voorraad een | 2,5 mL | |
| Voorraad B | 2,0 mL | |
| Voeg ongeveer 900 mL van H2O en Bubble met gemengd gas (95% O2/5% Co2) (10 min) | ||
| Voorraad C | 0,4 mM | 0,5 mL |
| Voeg H2O toe om 1.000 ml te maken | ||
Tabel 5: gewijzigde ACSF (snijoplossing).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De slice fysiologie is van vitaal belang voor het verzamelen van het juiste signaal. Het gebruik van het ring-membraanfilter systeem in dit protocol zorgt ervoor dat het segment gezond en onvervormd blijft gedurende de procedure2,16,17. Andere systemen kunnen worden gebruikt om segment fysiologie te behouden tijdens de opname, maar de slice moet niet vervormd te krijgen op elk moment als de beeldvorming moet elk deel van het segment om gezond te zijn. Het ring-membraanfilter systeem is ook beter voor kleuring, omdat dit ons helpt het volume van de benodigde kleuring oplossing te minimaliseren. Het is ook belangrijk om de intensiteit van excitatie licht controle, zoals het moet laag zijn met betrekking tot de tijd-Fractie. De ononderbroken verlichting kan het specimen beschadigen; Daarom is een passend gebruik van de sluiter nodig.
De toxiciteit van de VANHOOF is vaak besproken29, maar het is een gevolg van niet-lineaire vermenigvuldiging van de kleurstof concentratie, excitatie lichtintensiteit, en de duur van de blootstelling aan het licht. De in dit protocol vermelde kleuring procedure veroorzaakte geen meetbare veranderingen in de fysiologische parameters van het segment, zoals de input-output relaties van het veld-potentiële opnames en die op de lange termijn potentiëring (LTP), gepaarde-puls Facilitatie (PPF). De verslechtering van de slice fysiologie is omvangrijke vooral onder continue verlichting16, maar het kan worden beheerd door het toezicht op het veld potentieel. Door gebruik te maken van deze voorzorgsmaatregelen, kunnen we LTP opnemen met een continue optische opname met behulp van VANHOOF voor meer dan 12 h24, die vergelijkbaar is met de best geconditioneerde in vitro experimenten.
Tijdens de opname, kan de lucht tafel nuttig zijn, maar isolatie van andere apparaten moet worden toegestaan vanwege de lage vergroting van de optiek. Echter, mechanische storingen zijn een van de belangrijke oorzaken achter slechte beeldvorming. Als de aanzienlijke hoeveelheid vals signaal in beeld uit tegenovergestelde tekens bij de rand van het voorwerp bestaat, dus is het verschil van de helderheid, het het waarschijnlijkst veroorzaakt door de mechanische storingen. De bewegingen van het monster en de vloeistof zijn de meest voorkomende oorzaken van bewegings lawaai, en dus moet worden vermeden of geminimaliseerd.
De VANHOOF signaal (fractionele verandering in de lichtintensiteit) is klein (10-3 tot 10-4 van de eerste fluorescentie). Voor het opsporen van een dergelijke kleine verandering, de fluorescentie moet meer dan 105 tot 106 fotonen bij de detector in de Fractie van de tijd om het effect van foton-shot geluid te overwinnen. Bovendien, om de neuronale activiteit te volgen, moet de frame rate snel, dicht bij de tijdconstanten die nodig zijn om elektrofysiologische opname uit te voeren, zoals dat rond de kHz bereik. Een combinatie van deze twee voorwaarden vereist de hoeveelheid fluorescentie die veel uitgebreider is dan andere soorten fluorescente beeldvorming. Dit vereist een hoge numerieke diafragma in de hele optiek, en de gebruikelijke Microscoop is niet de beste optie. Grotere pupil en diafragma zijn nodig zoals weergegeven in Figuur 4.
De hercodering systeem moet overeenkomen met de grotere foton goed diepte, snelle frame rate, en een laag geluidsniveau. De keuze hangt meestal af van de snelheid van het neurale systeem. Het snellere signaal zoals de hippocampale signaaltransductie vergt gespecialiseerde unltrasnelle, laag-lawaai systeem. Nochtans, zou het langzame signaal zoals de langzame verspreiding van activiteit in cortices kunnen worden ontdekt gebruikend de gebruikelijke maar wetenschappelijke rang camera's.
De selectie van de lichtbron is ook kritisch. De keuze van het licht hangt af van de intensiteit, stabiliteit, en het gebied van verlichting. In het geval van een lage vergroting Wide-veld Imaging, punt lichtbron, zoals bogen en lasers nodig om uit te breiden, waardoor het moeilijk is om deze bronnen te gebruiken. Bogen, zoals kwik en Xenon lampen, zijn de heldere lichtbron, maar meestal zijn niet stabiel. Echter, de recente ontwikkeling van Xenon licht zou kunnen overwinnen van het probleem. De halogeen lamp is stabiel en heeft een groter gebied van gloeidraad die gemakkelijk kan overeenkomen met Wide-veld beeldvorming, maar is beperkt in de kracht vooral op 530 nm. De recente ontwikkeling van Power LED heeft ons in staat om het te gebruiken als de potentiële lichtbron, maar het moet de feedback stabilisator vanwege de temperatuur afhankelijkheid. Lasers kunnen worden gebruikt, maar de hoge coherentie resulteert in een gespikkeld geluid, dat is meestal onaanvaardbaar voor Wide-veld Imaging.
Het in dit artikel gepresenteerde protocol voor de weergave van de "VANHOOF" meet een waarde ten opzichte van de rust conditie. Absolute meting van het membraanpotentiaal kan niet worden uitgevoerd met behulp van de huidige techniek. Ratiometric Imaging en fluorescentie levensduur metingen kunnen worden gebruikt om het absolute membraanpotentiaal te beoordelen.
De beeldvorming van de hersenen slices bulk-gekleurd met VANHOOF bij lage vergroting kan aantonen dat de sub-drempel membraan potentiële veranderingen in de micro-circuit interacties van de hersenen. Deze functionele reikwijdte met betrekking tot de verbinding tussen de micro-circuits in real-time resolutie zal nuttig zijn op veel gebieden van hersenonderzoek, met name om de pathologische aspecten die het meest waarschijnlijk veroorzaakt door een dergelijke prikkelende en remmende functionele analyseren verbindingen tussen verschillende hersengebieden. Deze toepassing zal kritisch zijn om de veranderingen in neurale kringen met betrekking tot bepaalde types van neuropsychiatrische ziekten30,31,32te onderzoeken.
De ontwikkeling van de genetisch gecodeerde voltageindicator33,34 is de toekomstige richting voor optische membraan potentiële opnamen die de weg voor de aantrekkelijke toepassingen van cel type-specifieke analyse van neurale zullen effenen circuit-level evenementen.
Er is veel ruimte voor verbetering in de optiek, vooral voor het visualiseren van de Wide-Field functionele verbindingen. Onze nieuwe confocale optiek35 zal High-Speed en High-S/N-ratio opname van de Vanhoof signaal mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
TT ontving de JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038, en JP15K00413) uit MEXT en subsidies van het ministerie van volksgezondheid, arbeid en welzijn (MHLW-Kagaku-Ippan-H27 [15570760] en H30 [18062156]). Wij willen Editage (www.editage.jp) bedanken voor het bewerken van het Engels.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM - Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| Poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| Polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R.
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. Tominaga, T., Ichikawa, M. , US 6,448,063 B2 (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W.
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
