Summary
Nós introduzimos um método de gravação óptica reprodutível e estável para fatias do cérebro usando a tintura tensão-sensível. O artigo descreve a coloração de corante sensível à tensão e a gravação de sinais ópticos usando preparações convencionais de corte hipocampal.
Abstract
A imagem latente da tintura tensão-sensível do fóton do largo-campo único (VSD) de preparações da fatia do cérebro é uma ferramenta útil para avaliar a conectividade funcional em circuitos neurais. Devido à mudança fracionária no sinal de luz, tem sido difícil usar este método como um ensaio quantitativo. Este artigo descreve sistemas de manipulação óptica e fatia especiais, que tornam esta técnica estável e confiável. O artigo atual demonstra a manipulação, a mancha, e a gravação da fatia das fatias hippocampal VSD-manchadas em detalhe. O sistema mantém condições fisiológicas por um longo tempo, com boa coloração, e previne movimentos mecânicos da fatia durante as gravações. Além disso, permite a coloração de fatias com uma pequena quantidade do corante. O sistema ótico alcança a abertura numérica elevada na baixa ampliação, que permite a gravação do sinal de VSD na taxa de frame máxima de 10 quilohertz, com resolução espacial do pixel x 100-pixel 100. Devido à alta taxa de quadros e à resolução espacial, essa técnica permite a aplicação dos filtros pós-gravação que fornecem uma relação sinal-ruído suficiente para avaliar as mudanças nos circuitos neurais.
Introduction
A imagem latente da tintura tensão-sensível do fóton do largo-campo único (vsd) de preparações Bulk-manchadas da fatia do cérebro transformou-se uma ferramenta quantitativa útil para avaliar a dinâmica de circuitos neurais1,2,3,4 . Após a análise das alterações nas propriedades ópticas devido à excitação de membrana5,6,7, a imagem de VSD foi descrita pela primeira vez no início da década de 1970 por Cohen e outros6,7, 9.; é um método adequado para monitorar as funções cerebrais em tempo real, como o corante diretamente sonda as mudanças de potencial de membrana (ou seja, o sinal primário dos neurônios).
Os VSDs os mais adiantados possuíram as características desejáveis para compreender o sistema do cérebro, tal como um tempo-constante rápido para seguir a cinética rápida de eventos potenciais da membrana neuronal, e a linearidade com a mudança no potencial de membrana9, 10 de , 11 anos de , 12 anos de , 13 anos de , 14 anos de , 15. similar a outras experiências da imagem latente, esta técnica exige uma escala larga de afinações específicas, tais como as câmeras, o sistema ótico, o software, e a fisiologia da fatia, para realizar os resultados desejados. Devido a estas armadilhas técnicas, os benefícios esperados durante os esforços iniciais não se materializam necessariamente para a maioria dos laboratórios que não se especializou nesta técnica.
A causa primordial da dificuldade técnica era a baixa sensibilidade do VSD para a mudança potencial da membrana quando aplicada à mancha maioria de preparações da fatia. A magnitude do sinal óptico (ou seja, a alteração fracionária na fluorescência) é geralmente 10-4-10-3 do sinal de controle (F0) condições fisiológicas. A escala de tempo da mudança potencial da membrana em um neurônio é aproximadamente milissegundos a poucas centenas de milissegundos. Para medir as alterações no potencial de membrana do Neuron, a câmera que está sendo usada para a gravação deve ser capaz de adquirir imagens com alta velocidade (10 kHz a 100 Hz). A baixa sensibilidade do VSD e a velocidade necessária para seguir o sinal neural requer uma grande quantidade de luz a ser coletada na câmera em alta velocidade, com uma alta relação sinal-ruído (S/N)2,16.
A ótica do sistema de gravação também é um elemento crítico para garantir a coleta de luz suficiente e para melhorar S/N. A ampliação alcançada pela ótica é muitas vezes excessivamente baixa, como 1X a 10X, para visualizar um circuito neural funcional local. Por exemplo, para visualizar a dinâmica do circuito hipocampal, uma ampliação de aproximadamente 5 seria adequada. Essa baixa ampliação tem baixa eficiência de fluorescência; Conseqüentemente, o sistema ótico avançado seria benéfico para tal gravação.
Além disso, a fisiologia da fatia também é essencial. Uma vez que a análise de imagem requer que as fatias sejam intactas, é necessária uma manipulação cuidadosa da fatia17. Além disso, as medidas tomadas para manter a viabilidade da fatia por um tempo mais longo são importantes18.
O presente artigo descreve o protocolo para preparação de fatias, coloração de VSD e medições. O artigo também descreve as melhorias para o VSDs, dispositivo de imagem e óptica, e outros refinamentos adicionais para o sistema experimental que permitiram que este método para ser usado como um ensaio simples, poderoso e quantitativo para visualizar o modificação das funções cerebrais19,20,21,22,23,24,25. A técnica pode igualmente ser amplamente utilizada para a potenciação a longo prazo na área CA1 de fatias hippocampal1. Além disso, esta técnica também é útil na gravação óptica de potenciais de membrana em uma única célula nervosa26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais da Universidade Tokushima Bunri. O seguinte protocolo para a preparação da fatia é quase um procedimento padrão27 , mas as modificações têm sido os protocolos de coloração e gravação com VSD.
1. preparação antes do dia da experiência
- Prepare as soluções de estoque A (tabela 1), estoque B (tabela 2) e estoque C (tabela 3) e armazene em um refrigerador.
- Prepare 1 L de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) (tabela 4, ver passo 3) e mantê-lo na geladeira.
- Prepare 1 L de ACSF modificado (tabela 5) e mantenha-o na geladeira.
- Dispensar 500 μL de alíquotas de soro bovino fetal (FBS) em frascos de 2 mL e armazenar num congelador.
- Dissolva 4% de pó de ágar em ACSF (ca. 120 mL) em um microondas e despeje-o em um prato de Petri descartável de 90 mm. A placa de agar deve ser refrigerada antes da utilização.
- Coloque os seguintes itens em um freezer no dia anterior ao experimento: uma bandeja cirúrgica, um recipiente de fatiador e um bloco de resfriamento de alumínio (120 x 120 x 20 mm3).
- Assegure-se de que há uns anéis suficientes do plexiglass com os filtros de membrana para o sistema de manipulação da fatia17,28 (veja etapa 6,12).
- Dissolva 2% de pó de ágar em 50 mL de KCl de 3 M em um microondas. Tome em torno de 85 μL do dissolvente morno do agar-KCl em 200 pontas do μL usando uma micropipeta para o elétrodo de aterramento. Retire a ponta para o ágar ainda quente 3 M gel KCl. Repita o passo para preencher cerca de 20-40 pontas com 2% de agar.
2. preparação da solução de ações VSD (di-4-ANEPPS)
- Prepare 1 ml de solução de óleo de rícino polietoxilado 10% com água ultra-pura.
- Adicione 1 ml de etanol a um frasco para injetáveis de di-4-anepps (frasco para injetáveis de 5 mg), vortex e proceda durante 10 min. A solução transformar-se-á em uma cor vermelha profunda com os resíduos pequenos possíveis dos cristais de di-4-ANEPPS.
Nota: O etanol utilizado nesta etapa deve ser recém-aberto. - Transfira a solução para um microtubo de 2 mL com um anel-O. Gire para baixo a solução e adicione 500 μl da solução do óleo de rícino polietoxilado 10%.
Nota: O corante é altamente lipofílico. DMSO e POLOXAMER também pode ser usado para dissolver di-4-ANEPPS, mas em termos de sinal óptico em cima da mudança no potencial de membrana, descobrimos que o uso de óleo de rícino etanol-polyethoxylated dá uma melhor relação sinal-ruído. Isso pode estar relacionado à taxa de transferência de solvente para a membrana celular. - Vortex e proceda até que o corante foi completamente dissolvido.
- Evite a exposição à luz e mantê-lo em um refrigerador. Não conservar num congelador. O estoque pode durar por alguns meses.
Nota: No dia do experimento, siga as etapas 3-9.
3. preparação diária do ACSF (1 L) (tabela 4)
- Pesar NaCl, NaHCO3, e glicose em um balão.
- Adicionar 950 mL de água destilada ao balão e começar a borbulhar com 95% O2/5% co2 Gas.
- Adicionar 2,5 mL de stock uma solução ao balão e incubar durante aproximadamente 10 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 2,5 mL de solução de estoque C ao balão.
- Adicione a água destilada para fazer a solução a 1 L.
4. preparação diária da mancha VSD Ssolution
- SONICATE um frasco de 500 μL de FBS e VSD solução de ações (passo 2) em um ultra-sonicator por 5 min.
- Adicionar 500 μL de ACSF preparado na hora no frasco para injetáveis de FBS.
- Adicionar 20 (no caso de ratos) ou 40 (no caso de ratos) μL de solução de VSD para o frasco para injetáveis.
- Ultra-SONICATE e vórtice do frasco até que a solução se torne laranja pálido.
5. preparação para a cirurgia
- Tomar 100 mL de ACSF refrigerados separadamente em um recipiente de aço inoxidável 300 mL, um copo de 300 mL, e um recipiente de plástico, e colocá-los em um freezer. Despeje 150 mL de ACSF modificada refrigerada (tabela 2) em outro copo e coloque-o no congelador. Aguarde até que as soluções sejam refrigeradas; o tempo tomado deve ser medido e determinado de antemão.
- Dobre para quebrar uma lâmina de barbear (aço carbono, grau industrial 0,13 mm de espessura, lâmina em ambos os lados) na metade para o slicer.
Nota: A outra metade pode ser usada para a dissecção com um suporte apropriado da lâmina. - Prepare um bloco da placa de ágar ACSF 4% com um gabarito de ajuste (Figura 1).
- Prepare uma câmara de incubação úmida (uma câmara de tipo de interface; uma caixa selada apertada de 1,2 L com uma embalagem de silicone) para manter as fatias cerebrais fisiologicamente vivas (Figura 2); Adicionar ACSF em um pequeno recipiente e carbonato com 95% O2/5% co2 gás, e encher um 90 mm x 20 mm placa de Petri com ACSF em para o topo.
Nota: Um prato de Petri menor (60 mm x 20 mm) deve ser colocado no centro do prato de 90 mm para suportar um papel de filtro no prato. - Coloque a caixa em um dispositivo de aquecimento e aguarde 20 min para aquecê-lo até 28 ° c.
- Adicione gelo esmagado no recipiente da fatiadora. Coloque os seguintes instrumentos em uma cuba de aço inoxidável (pequena) no gelo: bisturi, porta-lâminas, pinças de anel, bloco de agar e um estágio de fatiador. Manter congelado ACSF e modificado ACSF em gelo e bolha com 95% O2/5% co2 gás (aka. Carbogen).
- Coloque os seguintes instrumentos em uma Cuba (grande): tesouras (grandes, pequenas), pinças, uma espátula, uma colher e alicates diagonais.
6. cirurgia (camundongos)
- Anestesie o rato utilizando isoflurano numa capa de fumos. Avalie o nível da anestesia verific o reflexo do pedal do animal em cima da pitada do dedo do pé.
- Decapitar o rato e mergulhar a cabeça em Ice-Cold ACSF em uma bandeja cirúrgica de aço inoxidável.
- Extraia o cérebro dentro de 1 min e coloque-o em um copo contendo ACSF refrigerados por 5 min.
- Tire o cérebro do copo e, usando um bisturi, aparar o bloco de cérebro (Figura 3a).
- Coloque o bloco cerebral em um bloco de ágar 4% (etapa 5,3, Figura 3B). Ambos os hemisférios podem ser montados em um bloco de ágar. Limpe o excesso de ACSF do bloco com um papel de filtro.
- Aplique o adesivo fino (colagem super) à tabela do slicer. Coloque o bloco de agar sobre ele e limpe o excesso de adesivo usando um papel de filtro.
- Aplique suavemente uma pequena quantidade de ACSF gelada (~ 5 mL) usando uma pipeta da parte superior do bloco de ágar-cérebro. Isso vai ajudar a solidificar o excesso de cola super e evitar a cola de cobrir o cérebro e perturbar o corte.
- Corrija a tabela de segmentação de dados na bandeja da segmentação de dados (Figura 3C) e despeje o ACSF modificado.
- Defina o slicer para uma velocidade lenta, com a freqüência da lâmina no máximo.
- Defina a espessura da fatia para 350-400 μm e comece a fatiar (Figura 3C). Coloque as fatias no canto da bandeja de fatia em uma seqüência, de modo que a profundidade das fatias pode ser facilmente distinguida. Geralmente três a cinco fatias podem ser obtidas de um hemisfério.
- Corte a porção do tronco cerebral usando uma agulha de 30 G (Figura 3D).
Nota: A microcirurgia na fatia do cérebro, como um corte entre a borda de-CA1, deve ser feita nesta fase um microscópio binocular, se necessário. - Usando uma pequena escova de pintura derrubado, coloque a fatia no centro do filtro de membrana (poros de 0,45 μm, membrana de PTFE, 13 mm de diâmetro) realizada com o anel de plexiglass17 (15 mm de diâmetro externo, 11 mm de diâmetro interno, 1 mm de espessura, Figura 3E). Coloque o anel na câmara de recuperação úmida (Figura 2) e fixe a tampa para manter a pressão interna alta.
Nota: As fatias furarão à membrana dentro de 30 minutos e podem ser seguradas com os anéis nas etapas subseqüentes na câmara de gravação. Não há necessidade de usar pesos ou outras medidas para manter a fatia no lugar. - Ajuste a direção e a posição da fatia no anel para garantir que ela esteja bem centralizada e tenha uma direção consistente (consulte a etapa 9,3).
- Deixe a amostra a 28 ° c durante 30 min e, em seguida, à temperatura ambiente durante pelo menos 10 a 30 min para a recuperação das fatias.
Nota: As fatias podem agora reter a boa condição physiological pelo menos para 15 h.
7. coloração e enxaguamento das fatias (camundongos)
- Aplique suavemente 100-110 μL da solução de coloração (passo 4) em cada fatia do anel utilizando uma micropipeta. Oito a nove fatias podem ser manchadas com uma solução de coloração preparada na etapa 4. Deixe as fatias por 20 min para a coloração.
- Prepare 50-100 mL de ACSF em um recipiente e põr o anel com o espécime cortado nele para enxaguar a solução de mancha.
- Guarde a fatia enxaguada em outra câmara de incubação. Aguarde mais de 1 h para recuperação antes do experimento.
Nota: A câmara de incubação pode ser separada do gás e movida para o local de gravação em uma condição selada apertada. A fatia pode permanecer viva por pelo menos 20 minutos sem abastecimento de gás. Isso é útil no caso de você precisar mover a fatia para outro local para gravação.
8. preparação diária de aparelhos experimentais
- Ligue o amplificador, o computador e o sistema de câmaras e verifique se o software está a funcionar.
- Coloque ACSF em um tubo de 50 mL e bolha com Carbogen.
- Use uma bomba peristáltica para circular o ACSF. Ajuste a vazão para aproximadamente 1 mL/min.
- Ajuste a altura da pipeta de sucção para que o nível de líquido dentro da câmara do experimento seja sempre constante.
Nota: O nível da solução é importante para obter uma gravação estável, portanto, o ajuste deve ser feito usando um micromanipulador. - Instale o eletrodo de aterramento composto de chip amarelo preenchido com 3 M de agar KCl (2%) (passo 1,8) num suporte com um fio Ag-AgCl com uma pequena quantidade de solução de 3 M de KCl.
- Encha uma pequena quantidade de ACSF (aproximadamente dois-terço do volume) no elétrodo de vidro (diâmetro exterior de 1 milímetro, diâmetro interno de 0,78 milímetros puxado com um extrator da micropipeta) usando uma ponta amarela Tube afilada fina e coloc a no suporte do elétrodo.
- Prenda o suporte à haste instalada no manipulador. Certifique-se de usar um amplificador que a resistência do eletrodo é de aproximadamente 1 MΩ.
Nota: A abertura larga da longo-pata (abertura de 4-8 μm) o tipo elétrodo do remendo deve ser bom para a gravação do campo e como um elétrodo de estimulação.
9. iniciando uma sessão de gravação
- Tome uma preparação da fatia da câmara úmida com fórceps.
- Coloque rapidamente a fatia sobre uma câmara experimental o microscópio (Figura 4).
- Empurre a borda do anel firmemente no anel-O de silicone. Tenha cuidado para não quebrar a membrana ou a parte inferior da câmara experimental.
Nota: A direção da fatia deve ser levada em consideração em relação à direção dos eletrodos estimulantes e de gravação no campo de visão. A fatia saudável deve furar ao filtro da membrana assim que não há nenhuma necessidade de usar outros dispositivos para fixar as fatias tais como pesos e malhas de nylon. - Coloc a ponta do elétrodo de estimulação e o elétrodo de gravação potencial do campo na fatia o microscópio com luz transmitida.
- Use o sistema de gravação eletrofisiológica para verificar a resposta. Confirme a gravação electrofisiológica usual (não manchada) com a configuração dada.
Nota: O eletrodo de gravação pode ser omitido, mas é útil para verificar a fisiologia da fatia. - Ajuste a intensidade da luz de excitação para aproximadamente 70-80% da capacidade máxima na câmera que corresponde a 13-15 mW/cm2 na amostra quando a amostragem em 10 kHz com 5x lente objetiva de imersão de água e 1x plano APO lente do tubo. O comprimento de onda claro da excitação é 530 nanômetro, e o filtro da emissão deve ser > 590 nanômetro.
Nota: Use um obturador para minimizar a quantidade de luz de excitação. A exposição à luz contínua pode deteriorar a fisiologia da fatia. O possível efeito prejudicial da luz depende da intensidade e duração da luz. Use a gravação eletrofisiológica para julgar o efeito da luz. Em caso da força de 13-15 mW/cm2, aproximadamente 1 s a exposição deve ser o limite superior da tolerância. - Ajuste o foco com o sistema de aquisição usando a fonte de luz fluorescente porque o foco pode ser diferente dependendo do comprimento de onda e iniciar a aquisição.
- Examine os dados em um software de aquisição de imagem.
Nota: Nós usamos o pacote original do microprogramação do software numérico da análise para a análise detalhada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 5 mostra o sinal ótico representativo em cima da estimulação elétrica da garantia de Schaffer na área CA1 de uma fatia do hippocampal do rato. As imagens consecutivas na Figura 5a mostram o sinal óptico antes de quaisquer filtros espaciais e temporais serem aplicados, enquanto a Figura 5b mostra os mesmos dados após a aplicação de um filtro cúbico 5 x 5 x 5 (uma convolução do kernel Gaussian, 5 x 5 espacial-e 5 a dimensão temporal) duas vezes. Devido à alta taxa de quadros (0,1 MS/frame) e alta resolução espacial (100 pixels x 100 pixels), a aplicação do filtro não mudou o sinal, mas filtrou o ruído, que também pode ser observado no curso de tempo gravado em pixels em um único julgamento ( Figura 5C, sem filtro; Figura 5D, com filtro; e Figura 5E, sobreposta).
A Figura 6 compara a resposta típica na área CA1 de uma fatia de hipocampal entre o mouse (Figura 6a) e o rato (Figura 6B). Como é evidente na figura, a resposta hiperpolarizante devido às entradas inibitórias é aparente na fatia do hippocampal do rato em cima de aplicar o mesmo estímulo à garantia de Schaffer perto da beira CA1/de o. A resposta hiperpolarizante pequena é observada no lado longe do ponto de origem do CA1 após 24 MS na fatia hippocampal do rato, mas a resposta hiperpolarizante mais maciça ultrapassou a resposta despolarizantes na fatia hippocampal do rato. A imagem latente de VSD pode claramente demonstrar a diferença entre fatias do hippocampal do rato e do rato.
Figura 1 : Uma ilustração do bloco do agar usado para montar o tecido do cérebro para fatiar e um gabarito para fazer o bloco. (A) uma ilustração esquemática do bloco cerebral e do bloco de ágar 4% (B). (C, D) Fotografia de um gabarito ajustável feito por uma placa do plexiglass (5 milímetros grossos cada um) para fazer o bloco do ágar. Ao preparar o bloco de agar, as placas superior e inferior devem ser empilhadas, como mostrado em D. (E), inserindo uma lâmina nos slots longos finos (1) e (2), a parte triangular é cortada, o slot (3) é usado para aparar toda a profundidade do bloco. (4) a remoção da placa superior permite fatiar fora das peças não-necessárias. Usando o slot 1 e 2, faça apenas cortes de profundidade de 5 mm para que o bloco resultante seja como mostrado em (A) e (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Uma ilustração do tipo de interface câmara incubadora usada para manter a fisiologia da fatia. (A) visão geral do sistema. (B) detalhes interiores. (C) ilustração da câmara de recuperação. O espécime deve ser coloc em um papel de filtro posicionado em um prato de Petri ACSF-enchido de 90 milímetros e de 60 milímetros. O último prato é apoiar o papel de filtro. Os pratos e o recipiente borbulhando de ACSF são mantidos no lugar com uma placa do plexiglass. O papel de filtro não deve tocar na parede da caixa apertada do ar nem no recipiente. O ar é fornecido através de uma garrafa de borbulhagem que incorpora gases umedecidos na câmara. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Preparações da fatia de hippocampal de um cérebro do rato. (A) o cérebro do rato isolado deve ser cortado primeiro na linha tracejada (a), depois (b). Finalmente, o corte deve ser feito ao longo da linha (c). O corte deve ser perpendicular ao fundo. (B) o bloco cerebral deve ser montado em um bloco de agar. (C) o bloco de agar deve ser colocado na fatiadora. (D) fatia resultante. O excesso de tecido deve ser cortado na linha tracejada. (E) a fatia deve ser colocada no centro do filtro de membrana com um suporte do plexiglass (diâmetro exterior 15 milímetros, diâmetro interno 11 milímetros, o filtro da membrana de PTFE de 13 milímetros). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Sistema de gravação para sinais ópticos de preparações de fatias. (A) uma fotografia do microscópio usado para a imagem das fatias no manuscrito atual. A ótica consiste em uma lente objetiva (5x NA 0.60), uma caixa de espelho para o filtro dichroic (580 nanômetro), e uma lente da projeção (tubo) (plano APO x 1.0). Uma câmera de alta velocidade é anexada na parte superior da lente de projeção através de um c-mount. Há uma outra câmera usual do USB para a observação. A luz da excitação é introduzida usando a fibra ótica. (B) fotografia das lentes compatíveis com a caixa espelhada. (C) diagrama esquemático do sistema de gravação. O sistema de imagem e sistema de gravação eletrofisiológica são controlados por um PC. O sistema da iluminação do diodo emissor de luz com um sistema de controlo do gabarito do foto-diodo foi usado como uma fonte luminosa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Sinal ótico representativo na área CA1 de uma fatia do hippocampal do rato em uma única experimentação. (A) as imagens consecutivas mostram a propagação do sinal neuronal adquirido na taxa de frame de 0,1 MS/frame ao longo da via colateral de Schaffer antes de aplicar todos os filtros espaciais e temporais (cada 0,2 ms). A excitação era 530 nanômetro e a emissão era > 590 nanômetro. (B) os mesmos dados após uma aplicação de um kernel Gaussian tridimensional de 5 x 5 x 5 duas vezes. (C, D) Os traços de sinais ópticos nos pixéis representativos [cada dois pixéis (36 μm) ao longo de uma linha no meio do CA1 são mostrados no quadrado em a, * denota o pixel no pyramidale do estrato] dos dados mostrados em a e B. (e) o sinal sobreposto do sinais ópticos em C e D. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Comparação do sinal ótico entre o rato e as fatias do hippocampal do rato. As imagens consecutivas representativas em cima da estimulação elétrica da via colateral de Schaffer perto da beira de i/CA1 de um rato (a) e de rato (B) fatia de hippocampal. O vídeo 1 mostra a fatia do hipocampal do rato e o vídeo 2 mostra a fatia do hipocampal do rato. O tempo-curso do sinal ótico no meio do CA1 no pyramidale do estrato (St. Pyr.) e radiatum do estrato (St. rad.) é mostrado na direita da figura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| MM final | Peso | |
| NaH2po4 • 2h2O | 1,25 milímetros | 3,90 g |
| MgSO4• 7h2O | de 2 mM | 9,86 g |
| Kcl | 2,5 milímetros | 3,73 g |
| Adicionar H2o para fazer 50 ml |
Tabela 1: estoque A.
| MM final | Peso | |
| MgSO4• 7h2O | de 2 mM | 12,32 g |
| Adicionar H2o para fazer 50 ml |
Tabela 2: estoque B.
| MM final | Peso | |
| CaCl2• 2h2O | de 2 mM | 5,88 g |
| Adicionar H2o para fazer 50 ml |
Tabela 3: estoque C.
| Final (milímetro) | Peso | |
| Nacl | 124 milímetros | 7,25 g |
| NaHCO3 | de 26 mM | 2,18 g |
| Glicose | de 10 mM | 1,8 g |
| Estoque A | 2,5 mL | |
| Adicionar cerca 950 mL de H2o e bolha com gás misto (95% o2/5% co2) (10 min) | ||
| Estoque C (CaCl2) | de 2 mM | 2,5 mL |
| Adicionar H2o para fazer 1.000 ml | ||
Tabela 4: preparação diária do ACSF.
| Final (milímetro) | Peso | |
| NaHCO3 | de 26 mM | 2,18 g |
| Sacarose | 205,35 milímetros | 70,29 g |
| Glicose | de 10 mM | 1,8 g |
| Estoque A | 2,5 mL | |
| Estoque B | 2,0 mL | |
| Adicionar cerca 900 mL de H2o e bolha com gás misto (95% o2/5% co2) (10 min) | ||
| Estoque C | 0,4 milímetros | 0,5 mL |
| Adicionar H2o para fazer 1.000 ml | ||
Tabela 5: ACSF modificada (solução de corte).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A fisiologia da fatia é vital para coletar o sinal direito. O uso do sistema de filtro da anel-membrana neste protocolo assegura-se de que a fatia permaneça saudável e un-distorcida durante todo o procedimento2,16,17. Outros sistemas podem ser usados para reter a fisiologia da fatia durante a gravação, mas a fatia não deve ficar deformada a qualquer momento, pois a imagem precisa de cada parte da fatia para ser saudável. O sistema do filtro da anel-membrana é igualmente melhor para manchar, porque este ajuda-nos a minimizar o volume da solução de mancha exigida. Também é importante controlar a intensidade da luz de excitação, pois deve ser baixa em relação ao tempo-fração. A iluminação contínua pode danificar o espécime; Portanto, o uso adequado do obturador é necessário.
A toxicidade do VSD tem sido discutida frequentemente29, mas é um resultado da multiplicação não-linear da concentração da tintura, da intensidade da luz da excitação, e da duração da exposição à luz. O procedimento de coloração apresentado neste protocolo não ocasionou alterações mensuráveis nos parâmetros fisiológicos da fatia, como as relações de entrada-saída das gravações em potencial de campo e aquelas sobre a potenciação de longo prazo (LTP), pulso pareado facilitação (PPF). A deterioração da fisiologia da fatia é considerável especialmente a iluminação contínua16, mas pode ser controlado monitorando o potencial de campo. Ao usar essas precauções, podemos gravar LTP com gravação óptica contínua usando VSD por mais de 12 h24, o que é comparável aos melhores experimentos in vitro condicionados.
Durante a gravação, a tabela do ar pôde ser útil, mas a isolação de outros dispositivos deve ser permitida por causa da baixa ampliação do sistema ótico. No entanto, distúrbios mecânicos são uma das causas significativas por trás da má imagem. Se a quantidade considerável de sinal falso na imagem consistir em sinais opostos na borda do objeto, assim a diferença do brilho, é o mais provavelmente causado pelos distúrbios mecânicos. Os movimentos da amostra e do fluido são as causas mais freqüentes de ruído de movimento e, portanto, devem ser evitados ou minimalizados.
O sinal de VSD (mudança fracionária na intensidade de luz) é pequeno (10-3 a 10-4 da fluorescência inicial). Para detectar uma alteração tão pequena, a fluorescência deve exceder 105 a 106 fótons no detector na fração de tempo para superar o efeito do ruído de disparo de fóton. Além disso, para seguir a atividade neuronal, a taxa de quadros deve ser rápida, perto das constantes de tempo necessárias para executar a gravação eletrofisiológica, como a que em torno da faixa de kHz. Uma combinação destas duas circunstâncias exige a quantidade de fluorescência que é distante mais extensiva do que outros tipos da imagem latente fluorescente. Isto exige uma abertura numérica elevada no sistema ótico inteiro, e o microscópio usual não é a melhor opção. A pupila e a abertura maiores são precisadas como mostrado na Figura 4.
O sistema de recodificação deve corresponder com a profundidade de poço de fóton maior, taxa de quadros rápida e baixo ruído. A escolha depende principalmente da velocidade do sistema neural. O sinal mais rápido, como a transdução de sinal hipocampal, precisa de um sistema ultrarrápido e de baixo ruído especializado. Entretanto, o sinal lento tal como a propagação lenta da atividade nos córtices pôde ser detectado usando as câmeras usuais mas científicas da classe.
A seleção da fonte luminosa também é crítica. A escolha da luz depende de sua intensidade, estabilidade, e a área de iluminação. No caso de imagens de grande campo de baixa ampliação, a fonte de luz pontual, como arcos e lasers, precisa se expandir, o que dificulta o uso dessas fontes. Os arcos, tais como o mercúrio e as lâmpadas de xénon, são a fonte luminosa brilhante mas geralmente não são estáveis. No entanto, o desenvolvimento recente de luz Xenon pode superar o problema. A lâmpada do halogênio é estável e tem uma área maior do filamento que possa facilmente combinar com a imagem latente do largo-campo, mas é limitada na força especial em 530 nanômetro. O recente desenvolvimento de LED de energia nos permitiu usá-lo como a fonte de luz potencial, mas deve ter o estabilizador de feedback por causa da dependência de temperatura. Lasers podem ser usados, mas os resultados de alta coerência em um ruído salsadas, que é geralmente inaceitável para a imagem de grande campo.
O protocolo de imagem de VSD apresentado neste artigo mede um valor relativo à condição de descanso. A medida absoluta do potencial da membrana não pode ser executada usando a técnica atual. As medições de vida por imagem e fluorescência ratiométrica podem ser usadas para avaliar os potenciais de membrana absoluta.
A imagem latente das fatias do cérebro-manchada em massa com o VSD na baixa ampliação pode demonstrar as mudanças potenciais da membrana do sublimiar nas interações do microcircuito do cérebro. Esse escopo funcional em relação à conexão entre o microcircuito em resolução em tempo real será útil em muitas áreas da pesquisa cerebral, especialmente para analisar os aspectos patológicos mais prováveis causados por tais excitatórios e inibidores funcionais conexões entre diferentes áreas cerebrais. Este aplicativo será crítico para investigar as mudanças nos circuitos neurais relacionados a certos tipos de doenças neuropsiquiátricas30,31,32.
O desenvolvimento do indicador de tensão geneticamente codificado33,34 é a direção futura para gravações de potencial de membrana óptica que irá pavimentar o caminho para as aplicações atraentes de análise específica do tipo de célula de neural eventos de nível de circuito.
Há muito espaço para melhoria na óptica, especialmente para visualizar as conexões funcionais de amplo campo. Nossa novela confocal óptica35 permitirá alta-velocidade e alta-S/N relação de gravação do sinal VSD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
TT recebeu o JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 e JP15K00413) da MEXT e subsídios do Ministério da saúde, trabalho e bem-estar (MHLW-Kagaku-Ippan-H27 [15570760] e h30 [18062156]). Gostaríamos de agradecer a Editage (www.editage.jp) para edição de idioma inglês.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM - Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| Poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| Polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R.
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. Tominaga, T., Ichikawa, M. , US 6,448,063 B2 (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W.
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
