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Neuroscience

वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई का उपयोग कर मस्तिष्क स्लाइस में वाइड-फील्ड सिंगल-फोटोन ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59692
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory for Neural Circuit Systems, Institute of Neuroscience, Tokushima Bunri University

Summary

हम वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई का उपयोग कर मस्तिष्क स्लाइस के लिए एक reproduible और स्थिर ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग विधि परिचय. लेख वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई धुंधला और पारंपरिक हिप्पोकैम्पस टुकड़ा तैयारी का उपयोग कर ऑप्टिकल संकेतों की रिकॉर्डिंग का वर्णन करता है.

Abstract

व्यापक क्षेत्र एकल फोटॉन वोल्टेज-संवेदी डाई (VSD) मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी की इमेजिंग तंत्रिका सर्किट में कार्यात्मक कनेक्टिविटी का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है. प्रकाश संकेत में आंशिक परिवर्तन के कारण, यह एक मात्रात्मक परख के रूप में इस विधि का उपयोग करने के लिए मुश्किल हो गया है. यह लेख विशेष प्रकाशिकी और टुकड़ा हैंडलिंग सिस्टम का वर्णन करता है, जो इस तकनीक को स्थिर और विश्वसनीय प्रदान करता है। वर्तमान लेख विस्तार से VSD दाग हिप्पोकैम्पस स्लाइस की टुकड़ा हैंडलिंग, धुंधला, और रिकॉर्डिंग को दर्शाता है। प्रणाली एक लंबे समय के लिए शारीरिक स्थितियों को बनाए रखता है, अच्छा धुंधला के साथ, और रिकॉर्डिंग के दौरान टुकड़ा के यांत्रिक आंदोलनों को रोकता है. इसके अलावा, यह डाई की एक छोटी राशि के साथ स्लाइस के धुंधला सक्षम बनाता है. प्रकाशिकी कम आवर्धन पर उच्च संख्यात्मक एपर्चर प्राप्त है, जो 10 kHz की अधिकतम फ्रेम दर पर VSD संकेत की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है, 100 पिक्सेल x 100 पिक्सेल स्थानिक संकल्प के साथ. उच्च फ्रेम दर और स्थानिक संकल्प के कारण, इस तकनीक तंत्रिका सर्किट में परिवर्तन का आकलन करने के लिए पर्याप्त संकेत करने के लिए शोर अनुपात प्रदान करते हैं कि पोस्ट रिकॉर्डिंग फिल्टर के आवेदन की अनुमति देता है।

Introduction

व्यापक क्षेत्र एकल फोटॉन वोल्टेज-संवेदी डाई (VSD) थोक दाग मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी की इमेजिंग तंत्रिका सर्किट1,2,3,4 की गतिशीलता का आकलन करने के लिए एक उपयोगी मात्रात्मक उपकरण बन गया है . झिल्ली उत्तेजना5,6,7,VSD इमेजिंग के कारण ऑप्टिकल गुणों में परिवर्तन के विश्लेषण के बाद पहली बार कोहेन और अन्य6,8, 9. ; यह वास्तविक समय में मस्तिष्क कार्यों की निगरानी के लिए एक उपयुक्त तरीका है के रूप में डाई सीधे झिल्ली संभावित परिवर्तन की जांच (यानी, न्यूरॉन्स के प्राथमिक संकेत).

जल्द से जल्द VSDs वांछनीय विशेषताओं के पास मस्तिष्क प्रणाली को समझने के लिए, इस तरह के एक तेजी से समय के रूप में लगातार न्यूरॉन झिल्ली संभावित घटनाओं के तेजी से गतिकी का पालन करने के लिए, और झिल्ली संभावित9में परिवर्तन के साथ रैखिकता, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. अन्य इमेजिंग प्रयोगों के समान, इस तकनीक के लिए वांछित परिणामों को पूरा करने के लिए विशिष्ट ट्यूनिंग की एक विस्तृत श्रृंखला की आवश्यकता होती है, जैसे कैमरे, प्रकाशिकी, सॉफ्टवेयर, और शरीर क्रिया विज्ञान को स्लाइस करें। इन तकनीकी नुकसान की वजह से, प्रारंभिक प्रयासों के दौरान अपेक्षित लाभ जरूरी प्रयोगशालाओं है कि इस तकनीक में विशेषज्ञ नहीं था की सबसे के लिए materialize नहीं था.

तकनीकी कठिनाई का मौलिक कारण झिल्ली संभावित परिवर्तन की ओर VSD की कम संवेदनशीलता जब टुकड़ा तैयारी के थोक धुंधला करने के लिए लागू किया गया था. ऑप्टिकल संकेत का परिमाण (यानी, फ्लोरोसेंट में आंशिक परिवर्तन) आमतौर पर 10-4-10-3 नियंत्रण के शारीरिक स्थितियों के तहत संकेत है. एक न्यूरॉन में झिल्ली संभावित परिवर्तन के समय पैमाने लगभग मिलीसेकंड के कुछ सैकड़ों करने के लिए मिलीसेकंड है. न्यूरॉन की झिल्ली क्षमता में परिवर्तन को मापने के लिए, रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा रहा कैमरा उच्च गति के साथ छवियों को प्राप्त करने में सक्षम होना चाहिए (10 kHz करने के लिए 100 हर्ट्ज). VSD की कम संवेदनशीलता और तंत्रिका संकेत का पालन करने के लिए आवश्यक गति एक उच्च गति पर कैमरे पर एकत्र किया जाकरने के लिए प्रकाश की एक बड़ी राशि की आवश्यकता है, एक उच्च संकेत से शोर अनुपात के साथ (एस /

रिकॉर्डिंग प्रणाली के प्रकाशिकी भी पर्याप्त प्रकाश का संग्रह सुनिश्चित करने के लिए और S/N में सुधार करने के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व हैं। प्रकाशिकी द्वारा प्राप्त आवर्धन अक्सर जरूरत से ज्यादा कम है, इस तरह के 1X से 10X के रूप में, एक स्थानीय कार्यात्मक तंत्रिका सर्किट कल्पना करने के लिए. उदाहरण के लिए, हिप्पोकैम्पस सर्किट की गतिशीलता कल्पना करने के लिए, लगभग 5 का आवर्धन उपयुक्त होगा। इस तरह के कम आवर्धन कम फ्लोरोसेंट दक्षता है; इसलिए, उन्नत प्रकाशिकी ऐसी रिकॉर्डिंग के लिए फायदेमंद होगा।

इसके अलावा, टुकड़ा शरीर क्रिया विज्ञान भी आवश्यक है. चूंकि इमेजिंग विश्लेषण स्लाइस बरकरार होने की आवश्यकता है, सावधान टुकड़ा हैंडलिंग17की जरूरत है. इसके अलावा, एक लंबे समय के लिए टुकड़ा व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए किए गए उपाय महत्वपूर्णहैं 18.

वर्तमान लेख स्लाइस की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, VSD धुंधला, और माप. लेख भी VSDs, इमेजिंग डिवाइस, और प्रकाशिकी, और प्रयोगात्मक प्रणाली है कि इस विधि को सक्षम किया है के लिए अन्य अतिरिक्त शोधन के लिए सुधार की रूपरेखा एक सरल, शक्तिशाली, और मात्रात्मक परख visualizing के लिए के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए मस्तिष्क कार्यों में संशोधन19,20,21,22,23,24,25. तकनीक भी व्यापक रूप से हिप्पोकैम्पस स्लाइस1के CA1 क्षेत्र में दीर्घकालिक potentiation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, यह तकनीक एकल तंत्रिका कोशिका26में झिल्ली की क्षमताओं के ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग में भी उपयोगी है।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों Tokushima Bunri विश्वविद्यालय के पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया. टुकड़ा तैयारी के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल लगभग एक मानक प्रक्रिया27 है, लेकिन संशोधनों के धुंधला और VSD के साथ रिकॉर्डिंग के प्रोटोकॉल किया गया है.

1. प्रयोग के दिन से पहले तैयारी

  1. स्टॉक ए (सारणी 1), स्टॉक बी ( सारणी2) और स्टॉक ब् ( सारणी3) समाधान तैयार करें और रेफ्रिजरेटर में संग्रह करें।
  2. 1 L कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) (तालिका 4, चरण 3 देखें) की 1 L तैयार करें और इसे रेफ्रिजरेटर में रखें।
  3. संशोधित एसीएसएफ के 1ल को तैयार की जा यूँ , और इसे फ्रिज में रखिए।
  4. 2 एमएल शीशियों में भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 500 डिग्री एल एलिकोट का वितरण करें और एक फ्रीजर में स्टोर करें।
  5. एसीएसएफ (का. 120 एमएल) में 4% एगार पाउडर को माइक्रोवेव में घोलकर 90 मिमी डिस्पोजेबल पेट्री डिश में डाल दें। आगे के उपयोग से पहले आगर प्लेट को फ्रिज में रखा जाना चाहिए।
  6. प्रयोग से पहले दिन एक फ्रीजर में निम्नलिखित आइटम रखें: एक शल्य ट्रे, एक स्लाइसर कंटेनर और एक एल्यूमीनियम ठंडा ब्लॉक (120 x 120 x 20 मिमी3).
  7. सुनिश्चित करें कि वहाँ पर्याप्त Plexiglass के छल्ले झिल्ली फिल्टर के साथ टुकड़ा हैंडलिंग प्रणाली के लिए कर रहे हैं17,28 (चरण 6.12 देखें).
  8. 3 एम केसीएल के 50 एमएल में 2% एगार पाउडर को माइक्रोवेव में घोल लें। भू-परिचालक के लिए माइक्रोपाइपेट का उपयोग करके 200 डिग्री सेल्सियस युक्तियों में गर्म एगार-केसीएल विसमाधान के लगभग 85 डिग्री सेल्सियस लें। अभी भी गर्म agar 3 एम KCl जेल में टिप detach. 2% agar के साथ के बारे में 20-40 युक्तियाँ भरने के लिए कदम दोहराएँ.

2. VSD की तैयारी (di-4-ANEPPS) स्टॉक समाधान

  1. अल्ट्रा शुद्ध पानी के साथ 10% polyethoxylated कैस्टर तेल समाधान के 1 एमएल तैयार करें।
  2. di-4-ANEPPS (5 मिलीग्राम शीशी), भंवर और 10 मिनट के लिए sonicate की एक शीशी के लिए इथेनॉल के 1 एमएल जोड़ें। समाधान di-4-ANEPPS क्रिस्टल के संभावित छोटे अवशेषों के साथ एक गहरे लाल रंग में बदल जाएगा।
    नोट: इस चरण में प्रयुक्त एथेनॉल को हौसले से खोला जाना चाहिए।
  3. एक ओ-अंगूठी के साथ एक 2 एमएल माइक्रोट्यूब के लिए समाधान स्थानांतरण। समाधान को स्पिन करें और 10% पॉलीएथॉक्सीलेट कैस्टर तेल समाधान के 500 $L जोड़ें।
    नोट: डाई अत्यधिक lipophilic है. DMSO और poloxamer भी di-4-ANEPPS भंग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन झिल्ली क्षमता में परिवर्तन पर ऑप्टिकल संकेत के संदर्भ में, हमने पाया कि इथेनॉल -polyethoxylated अरंडी तेल का उपयोग शोर अनुपात के लिए एक बेहतर संकेत देता है. यह विलायक की कोशिका झिल्ली को हस्तांतरण दर से संबंधित हो सकता है.
  4. भंवर और sonicate जब तक डाई पूरी तरह से भंग कर दिया है.
  5. प्रकाश के संपर्क से बचें और इसे फ्रिज में रखें। फ्रीजर में स्टोर न करें। शेयर कुछ महीनों के लिए पिछले कर सकते हैं.
    नोट: प्रयोग के दिन, 3-9 चरणों का पालन करें.

3. ACSF की दैनिक तैयारी (1 एल) (तालिका 4)

  1. एक फ्लास्क मेंवजन NaCl, NaHCO 3, और ग्लूकोज.
  2. फ्लास्क के लिए आसुत पानी के 950 एमएल जोड़ें और 95% हे2/
  3. 2.5 एमएल स्टॉक जोड़ें एक समाधान फ्लास्क के लिए और कमरे के तापमान पर लगभग 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  4. फ्लास्क में 2.5 एमएल स्टॉक सी घोल जोड़ें।
  5. 1 ल तक घोल बनाने के लिए आसुत जल डालें।

4. दाग VSD समाधान की दैनिक तैयारी

  1. 5 मिनट के लिए एक अल्ट्रा-sonicator में FBS और VSD स्टॉक समाधान (चरण 2) के एक 500 डिग्री एल शीशी Sonicate।
  2. FBS की शीशी में ताजा तैयार ACSF के 500 $L जोड़ें.
  3. जोड़ें 20 (चूहों के मामले में) या 40 (राटों के मामले में) शीशी के लिए VSD स्टॉक समाधान के $L.
  4. अल्ट्रा-सोनेट और समाधान पीला नारंगी हो जाता है जब तक शीशी भंवर।

5. सर्जरी के लिए तैयारी

  1. एक 300 एमएल स्टेनलेस स्टील कंटेनर, एक 300 एमएल बीकर, और एक प्लास्टिक कंटेनर में अलग से ठंडा ACSF के 100 एमएल ले लो, और उन्हें एक फ्रीजर में जगह है. एक और बीकर में ठंडा संशोधित ACSF (तालिका 2) के 150 एमएल डालो और इसे फ्रीजर में रखें. समाधान ठंडा कर रहे हैं जब तक प्रतीक्षा करें; लिया गया समय पहले से मापा और निर्धारित किया जाना चाहिए।
  2. एक उस्तरा ब्लेड को तोड़ने के लिए गुना (कार्बन स्टील, औद्योगिक ग्रेड 0.13 मिमी मोटी, दोनों पक्षों पर ब्लेड) स्लाइसर के लिए आधे में.
    नोट: अन्य आधा एक उचित ब्लेड धारक के साथ विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. ACSF 4% agar प्लेट से एक समायोजन जिग के साथ एक ब्लॉक तैयार करें (चित्र 1)।
  4. मस्तिष्क स्लाइस शारीरिक रूप से जीवित रखने के लिए एक नम ऊष्मायन कक्ष (एक इंटरफ़ेस प्रकार कक्ष; एक सिलिकॉन पैकिंग के साथ एक संशोधित 1.2 एल तंग सील बॉक्स) तैयार करें (चित्र 2; एक छोटे कंटेनर में ACSF जोड़ें और 95% ओ2/5% सीओ2 गैस के साथ कार्बोनेट, और शीर्ष में ACSF के साथ एक 90 मिमी x 20 मिमी पेट्री डिश भरें.
    नोट: एक छोटे पेट्री पकवान (60 मिमी x 20 मिमी) 90 मिमी पकवान के केंद्र में रखा जाना चाहिए पकवान पर एक फिल्टर कागज का समर्थन.
  5. एक हीटिंग डिवाइस पर बॉक्स रखो और 20 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए यह गर्म करने के लिए 28 डिग्री सेल्सियस.
  6. स्लाइसर के कंटेनर में कुचल बर्फ जोड़ें. एक स्टेनलेस स्टील वैट (छोटे) बर्फ पर निम्नलिखित उपकरणों प्लेस: स्केलपेल, ब्लेड धारक, अंगूठी छनसीब, agar ब्लॉक, और स्लाइसर का एक चरण. जमे हुए ACSF और बर्फ और 95% हे2/5% सीओ2 गैस (उर्फ. कार्बोगेन) के साथ बुलबुला पर संशोधित ACSF रखें।
  7. एक कुंड (बड़े): कैंची (बड़े, छोटे), छनकाई, एक spatula, एक चम्मच, और विकर्ण प्लास में निम्नलिखित उपकरणों प्लेस.

6. सर्जरी (मीस)

  1. एक धूआं हुड में isoflurane का उपयोग कर माउस एनेस्थेटाइज। टो चुटकी पर जानवर के पेडल पलटा की जाँच करके संज्ञाहरण के स्तर का आकलन।
  2. माउस decapitate और एक स्टेनलेस स्टील सर्जिकल ट्रे में बर्फ ठंडा ACSF में सिर विसर्जित.
  3. 1 मिनट के भीतर मस्तिष्क निकालें और 5 मिनट के लिए ठंडा ACSF युक्त एक बीकर में जगह है.
  4. मस्तिष्क को बीकर से बाहर निकालो और स्कैल्पल का उपयोग करके मस्तिष्क को ट्रिम करके मस्तिष्क को ट्रिम कर दिया जाए (चित्र 3क)।
  5. मस्तिष्क ब्लॉक को 4% गार ब्लॉक पर रखें (चरण 5-3, चित्र 3ख)। दोनों गोलार्द्धों एक agar ब्लॉक पर रखा जा सकता है. एक फिल्टर पेपर के साथ ब्लॉक से अतिरिक्त ACSF साफ करें.
  6. स्लाइसर तालिका के लिए पतली चिपकने वाला (सुपर गोंद) लागू करें। उस पर agar ब्लॉक प्लेस और एक फिल्टर कागज का उपयोग कर अतिरिक्त चिपकने वाला पोंछ.
  7. धीरे से मस्तिष्क-आगर ब्लॉक के शीर्ष से एक पिपेट का उपयोग कर बर्फ ठंडा ACSF ($ 5 एमएल) की एक छोटी राशि लागू होते हैं। यह अतिरिक्त सुपर गोंद ठोस और मस्तिष्क को कवर और टुकड़ा करने परेशान करने से गोंद को रोकने में मदद मिलेगी.
  8. स्लाइसर तालिका स्लाइसर ट्रे (चित्र 3C) को ठीक करें और संशोधित ACSF डालदें.
  9. अधिकतम पर ब्लेड आवृत्ति के साथ, एक धीमी गति के लिए स्लाइसर सेट करें।
  10. स्लाइस की मोटाई को 350-400 उ पर सेट करें और टुकड़ा करना प्रारंभ करें (चित्र 3C)। स्लाइस ट्रे के कोने पर स्लाइस को अनुक्रम में रखें, ताकि स्लाइस की गहराई को आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सके। आमतौर पर तीन से पांच स्लाइस एक गोलार्द्ध से प्राप्त किया जा सकता है.
  11. 30 जी सुई का उपयोग करके मस्तिष्क के तने के भाग को काट दें (चित्र 3D)
    नोट: इस तरह के CA3-CA1 सीमा के बीच एक कटौती के रूप में मस्तिष्क टुकड़ा पर Microsurgery एक दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत इस स्तर पर किया जाना चाहिए, यदि आवश्यक हो.
  12. एक छोटे से टिप पेंट ब्रश का उपयोग करना, झिल्ली फिल्टर के केंद्र पर टुकड़ा जगह (0.45 मिमी pores, PTFE झिल्ली, 13 मिमी व्यास) Plexiglass अंगूठी के साथ आयोजित17 (15 मिमी बाहरी व्यास, 11 मिमी आंतरिक व्यास, 1 मिमी मोटाई, चित्रा 3E). अंगूठी को नम वसूली कक्ष में रखें (चित्र 2) और आंतरिक दबाव को उच्च रखने के लिए कवर को सुरक्षित करें।
    नोट: स्लाइस 30 मिनट के भीतर झिल्ली के लिए छड़ी और रिकॉर्डिंग कक्ष में बाद के चरणों में छल्ले के साथ नियंत्रित किया जा सकता है. वहाँ वजन या अन्य उपायों का उपयोग करने के लिए जगह में टुकड़ा रखने की कोई जरूरत नहीं है.
  13. यह अच्छी तरह से केंद्रित है और एक सुसंगत दिशा है यह सुनिश्चित करने के लिए अंगूठी में टुकड़ा की दिशा और स्थिति को समायोजित करें (चरण 9.3 देखें).।
  14. 30 मिनट के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर नमूना छोड़ दो, और फिर स्लाइस की वसूली के लिए कम से कम 10 से 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर।
    नोट: स्लाइस अब कम से कम 15 एच के लिए अच्छी शारीरिक स्थिति बनाए रख सकते हैं.

7. स्लाइस के दाग और rinsing (मिस)

  1. धीरे से एक micropipette का उपयोग कर अंगूठी पर प्रत्येक टुकड़ा पर धुंधला समाधान (चरण 4) के 100-110 $L लागू होते हैं. आठ से नौ स्लाइस एक धुंधला समाधान चरण 4 में तैयार के साथ दाग किया जा सकता है. धुंधला के लिए 20 मिनट के लिए स्लाइस छोड़ दें.
  2. एक कंटेनर में ACSF के 50-100 एमएल तैयार है और यह दाग समाधान कुल्ला करने के लिए उस में कटा हुआ नमूना के साथ अंगूठी डाल दिया।
  3. कुल्ला हुआ स्लाइस को एक अन्य ऊष्मायन कक्ष में संग्रहीत करें. प्रयोग से पहले वसूली के लिए 1 से अधिक h प्रतीक्षा करें।
    नोट: ऊष्मायन कक्ष को गैस से अलग किया जा सकता है और एक तंग सील हालत में रिकॉर्डिंग के स्थान पर ले जाया जा सकता है। टुकड़ा गैस की आपूर्ति के बिना कम से कम 20 मिनट के लिए जीवित रह सकते हैं. इस मामले में आप रिकॉर्डिंग के लिए किसी अन्य जगह पर टुकड़ा ले जाने की जरूरत में उपयोगी है.

8. प्रायोगिक परिधानों की दैनिक तैयारी

  1. एम्पलीफायर, कंप्यूटर, और कैमरा सिस्टम को चालू करें, और जाँचें कि सॉफ़्टवेयर चल रहा है.
  2. एक 50 एमएल ट्यूब और कार्बोजन के साथ बुलबुला में ACSF प्लेस.
  3. ACSF प्रसारित करने के लिए एक peristaltic पंप का प्रयोग करें. प्रवाह दर को लगभग 1 एमएल/मिनट तक समायोजित करें.
  4. चूषण पिपेट की ऊँचाई को समायोजित करें ताकि प्रयोग कक्ष के अंदर द्रव स्तर हमेशा स्थिर रहे।
    नोट: समाधान का स्तर एक स्थिर रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए, समायोजन एक micromanipulator का उपयोग किया जाना चाहिए.
  5. 3 एम केसीएल एगार से भरी पीली चिप से बना ग्राउंड इलेक्ट्रोड स्थापित करें (2%) (चरण 1-8) 3 एम केसीएल विलयन की छोटी राशि के साथ एजी-एगसीएल तार के धारक में।
  6. ACSF की एक छोटी राशि भरें (लगभग दो मात्रा के तिहाई) कांच इलेक्ट्रोड में (1 मिमी बाहरी व्यास, 0.78 मिमी आंतरिक व्यास एक micropipette खींचने के साथ खींच लिया) एक पतला पतली ट्यूब पीले टिप का उपयोग कर और इलेक्ट्रोड धारक में जगह है.
  7. हेरफेर में स्थापित रॉड के लिए धारक संलग्न. एक एम्पलीफायर का उपयोग कर सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड प्रतिरोध लगभग है 1 M].
    नोट: लंबी टांग व्यापक खोलने (4-8 मीटर खोलने) पैच प्रकार इलेक्ट्रोड क्षेत्र रिकॉर्डिंग के लिए अच्छा होना चाहिए और एक उत्तेजक इलेक्ट्रोड के रूप में.

9. एक रिकॉर्डिंग सत्र शुरू

  1. संदंश के साथ नम कक्ष से एक टुकड़ा तैयारी ले लो.
  2. स्लाइस को सूक्ष्मदर्शी के नीचे प्रायोगिक कक्ष में शीघ्रता से रख दी जाए (चित्र 4)।
  3. सिलिकॉन ओ-अंगूठी में मजबूती से अंगूठी के किनारे धक्का। झिल्ली या प्रयोग कक्ष के नीचे को तोड़ने के लिए नहीं सावधान रहना.
    नोट: टुकड़ा की दिशा को देखने के क्षेत्र में उत्तेजक और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की दिशा के संबंध में ध्यान में रखा जाना चाहिए. स्वस्थ टुकड़ा झिल्ली फिल्टर करने के लिए छड़ी चाहिए तो इस तरह के वजन और नायलॉन meshes के रूप में स्लाइस को ठीक करने के लिए अन्य उपकरणों का उपयोग करने की कोई जरूरत नहीं है।
  4. संचारित प्रकाश के साथ माइक्रोस्कोप के नीचे टुकड़ा पर उत्तेजक इलेक्ट्रोड और क्षेत्र संभावित रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की नोक प्लेस.
  5. प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग सिस्टम का उपयोग करें। दिए गए विन्यास के साथ सामान्य (गैर दाग) इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग की पुष्टि करें।
    नोट: रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड छोड़ा जा सकता है लेकिन टुकड़ा के शरीर क्रिया विज्ञान की जांच करने के लिए उपयोगी है.
  6. 5x पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस और 1x योजना एपीओ ट्यूब लेंस के साथ 10 kHz पर नमूना जब नमूना पर 13-15 mW/cm2 से मेल खाती है कि कैमरे पर अधिकतम क्षमता के लगभग 70-80% के लिए उत्तेजना प्रकाश तीव्रता समायोजित करें। उत्तेजना प्रकाश तरंगदैर्ध्य 530 एनएम है, और उत्सर्जन फिल्टर होना चाहिए और 590 एनएम.
    नोट: उत्तेजना प्रकाश की मात्रा को कम करने के लिए एक शटर का उपयोग करें। लगातार प्रकाश जोखिम टुकड़ा शरीर क्रिया विज्ञान खराब हो सकता है. प्रकाश का संभावित हानिकारक प्रभाव प्रकाश की तीव्रता और अवधि पर निर्भर करता है। प्रकाश के प्रभाव का न्याय करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग का उपयोग करें। 13-15 mW/cm2की ताकत के मामले में, के बारे में 1 s जोखिम सहिष्णुता की ऊपरी सीमा होनी चाहिए.
  7. फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत का उपयोग कर अधिग्रहण प्रणाली के साथ ध्यान समायोजित करें क्योंकि ध्यान तरंगदैर्ध्य के आधार पर अलग हो सकता है और अधिग्रहण शुरू करते हैं.
  8. किसी छवि प्राप्ति सॉफ़्टवेयर में डेटा की जाँच करें.
    नोट: हम विस्तृत विश्लेषण के लिए संख्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर के मूल microprogramming पैकेज का इस्तेमाल किया.

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Representative Results

चित्रा 5 एक माउस हिप्पोकैम्पस टुकड़ा के क्षेत्र CA1 में Schaffer संपार्श्विक की विद्युत उत्तेजना पर प्रतिनिधि ऑप्टिकल संकेत से पता चलता है. चित्र5क में लगातार छवियों को किसी भी स्थानिक और लौकिक फिल्टर लागू करने से पहले ऑप्टिकल संकेत दिखाने के लिए, जबकि चित्र 5B एक 5 x 5 x 5 घन फिल्टर लागू करने के बाद एक ही डेटा से पता चलता है (एक गॉसियन कर्नेल कनवल्शन, 5 x 5 स्थानिक- और 5 करने के लिए शंख-आयाम) दो बार। उच्च फ्रेम दर (0.1 एमएस/फ्रेम) और उच्च स्थानिक संकल्प (100 पिक्सल x 100 पिक्सेल) के कारण, फिल्टर के आवेदन संकेत नहीं बदला है, लेकिन शोर है, जो भी एक ही परीक्षण में पिक्सल में दर्ज समय पाठ्यक्रम में मनाया जा सकता है बाहर फ़िल्टर ( चित्र 5C, कोई फ़िल्टर नहीं; चित्र 5D, फ़िल्टर के साथ; और चित्र 5E, अध्यारोपित).

चित्र 6 माउस के बीच हिप्पोकैम्पस स्लाइस के क्षेत्रक ब्1 में विशिष्ट अनुक्रिया की तुलना करता है (चित्र 6क) तथा चूहा (चित्र 6ठ) . के रूप में आंकड़ा में स्पष्ट है, निरोधात्मक आदानों के कारण hyperpolarizing प्रतिक्रिया CA1/CA3 सीमा के पास Schaffer संपार्श्विक के लिए एक ही उत्तेजना लागू करने पर चूहे हिप्पोकैम्पस टुकड़ा में स्पष्ट है. छोटे hyperpolarizing प्रतिक्रिया माउस हिप्पोकैम्पस टुकड़ा में 24 एमएस के बाद CA1 के distal पक्ष में मनाया जाता है, लेकिन अधिक बड़े पैमाने पर hyperpolarizing प्रतिक्रिया चूहे हिप्पोकैम्पस टुकड़ा में depolarizing प्रतिक्रिया overtook. VSD इमेजिंग स्पष्ट रूप से माउस और चूहे हिप्पोकैम्पस स्लाइस के बीच अंतर प्रदर्शित कर सकते हैं.

Figure 1
चित्र 1 : ऐगार ब्लॉक का एक उदाहरण जिसका उपयोग ब्लॉक बनाने के लिए टुकड़ा करने और जिग के लिए मस्तिष्क के ऊतकों को माउंट करने के लिए किया जाता है। ((A) मस्तिष्क ब्लॉक और 4% एगर ब्लॉक (बी) का एक योजनाबद्ध चित्रण । (सी, डी) एक Plexiglass प्लेट (5 मिमी मोटी प्रत्येक) द्वारा किए गए एक समायोज्य जिग की तस्वीर agar ब्लॉक बनाने के लिए. agar ब्लॉक तैयार करते समय, ऊपरी और निचले प्लेटें के रूप में खड़ी किया जाना चाहिए D. में दिखाया गया है (ई) लंबी पतली स्लॉट में एक ब्लेड डालने से (1) और (2), त्रिकोणीय हिस्सा बाहर काट रहा है, स्लॉट (3) ब्लॉक की पूरी गहराई ट्रिम करने के लिए प्रयोग किया जाता है. (4) ऊपरी प्लेट को हटाने गैर आवश्यक भागों से बाहर टुकड़ा करने में सक्षम बनाता है. स्लॉट का उपयोग कर 1 और 2, केवल 5 मिमी गहरी कटौती इतनी है कि जिसके परिणामस्वरूप ब्लॉक में दिखाया गया है (ए) और (बी). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 2
चित्र 2 : टुकड़ा शरीर क्रिया विज्ञान बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया इंटरफेस प्रकार incubating कक्ष का एक उदाहरण. (ए) प्रणाली का अवलोकन. (बी) आंतरिक विवरण. (ग) वसूली कक्ष का चित्रण। Specimen एक ACSF से भरे 90 मिमी और 60 मिमी पेट्री डिश पर तैनात एक फिल्टर कागज पर रखा जाना चाहिए. बाद पकवान फिल्टर कागज का समर्थन करने के लिए है. व्यंजन और ACSF bubbling कंटेनर एक Plexiglass प्लेट के साथ जगह में रखा जाता है. फिल्टर पेपर हवा तंग बॉक्स और न ही कंटेनर की दीवार को छूने नहीं करना चाहिए. हवा एक bubbling बोतल है कि कक्ष में गीला गैसों को शामिल के माध्यम से आपूर्ति की है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : एक माउस मस्तिष्क से हिप्पोकैम्पस टुकड़ा तैयारी। (क) अलग-थलग चूहे का मस्तिष्क पहले डैश्ड लाइन (क) में काटा जाना चाहिए, फिर (ख) । अंत में, कटौती लाइन (ग) के साथ किया जाना चाहिए. कटौती नीचे के सीधा होना चाहिए। (बी) मस्तिष्क ब्लॉक एक आगर ब्लॉक पर रखा जाना चाहिए। (ग) आगर ब्लॉक स्लाइसर पर रखा जाना चाहिए। (डी) परिणामी टुकड़ा. अतिरिक्त ऊतक डैश्ड लाइन पर काटा जाना चाहिए। (ई) टुकड़ा एक Plexiglass धारक के साथ झिल्ली फिल्टर के केंद्र में रखा जाना चाहिए (बाहरी व्यास 15 मिमी, इनर व्यास 11 मिमी, PTFE झिल्ली फिल्टर 13 मिमी). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : टुकड़ा तैयारी से ऑप्टिकल संकेतों के लिए रिकॉर्डिंग प्रणाली. (ए) वर्तमान पांडुलिपि में स्लाइसों की छवि बनाने के लिए प्रयुक्त सूक्ष्मदर्शी का एक फोटोग्राफ। प्रकाशिकी एक उद्देश्य लेंस से मिलकर बनता है (5x NA0.60), dichroic फिल्टर के लिए एक दर्पण बॉक्स (580 एनएम), और एक प्रक्षेपण (ट्यूब) लेंस (प्लान एपीओ x1.0). एक उच्च गति कैमरा एक सी-माउंट के माध्यम से प्रक्षेपण लेंस के शीर्ष पर संलग्न है. वहाँ अवलोकन के लिए एक और सामान्य यूएसबी कैमरा है. उत्तेजना प्रकाश फाइबर प्रकाशिकी का उपयोग कर शुरू की है. (ख) दर्पण बॉक्स के साथ संगत लेंसों का फोटोग्राफ। (C) रिकॉर्डिंग प्रणाली का योजनाबद्ध आरेख. इमेजिंग प्रणाली और electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रणाली एक पीसी द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. एक फोटो-डायोड प्रतिक्रिया नियंत्रण प्रणाली के साथ एलईडी रोशनी प्रणाली एक प्रकाश स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 5
चित्र 5 : एक ही परीक्षण में एक माउस हिप्पोकैम्पस टुकड़ा के क्षेत्र CA1 में प्रतिनिधि ऑप्टिकल संकेत. (क) लगातार चित्र किसी भी स्थानिक और लौकिक फिल्टर (प्रत्येक 0.2 एमएस) को लागू करने से पहले शैफर संपार्श्विक मार्ग के साथ 0.1 एमएस/फ्रेम की फ्रेम दर पर प्राप्त न्यूरॉन संकेत का संचरण दिखाते हैं। उत्तेजना 530 एनएम था और उत्सर्जन था और 590 एनएम था. (ख) एक ही डेटा 5 x 5 x 5 दो बार की एक तीन आयामी गौसियन कर्नेल के एक आवेदन के बाद. (सी, डी) प्रतिनिधि पिक्सेल में ऑप्टिकल संकेतों के निशान [प्रत्येक दो पिक्सेल (36 डिग्री मी) CA1 के बीच में एक पंक्ति के साथ एक में वर्ग में दिखाया गया है, * स्तर पिरामिड में पिक्सेल को दर्शाता है] A और B में दिखाए गए डेटा से (ई) से अधिरोपित संकेत सी और डी में ऑप्टिकल संकेतों कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 6
चित्र 6 : माउस और चूहे हिप्पोकैम्पस स्लाइस के बीच ऑप्टिकल संकेत की तुलना. एक माउस (ए) और चूहे (बी) हिप्पोकैम्पस स्लाइस के CA3/CA1 सीमा के पास Schaffer संपार्श्विक मार्ग की विद्युत उत्तेजना पर प्रतिनिधि लगातार छवियों. वीडियो 1 माउस हिप्पोकैम्पस टुकड़ा से पता चलता है और वीडियो 2 चूहे हिप्पोकैम्पस टुकड़ा से पता चलता है. स्तर पिरामिडेल (st. pyr.) और स्तर radiatum (st. rad.) पर CA1 के बीच में ऑप्टिकल संकेत के समय पाठ्यक्रम आंकड़ा के दाईं ओर दिखाया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

अंतिम एम.एम. वजन
नाह2पीओ4 • 2एच2ओ 1.25 एम.एम. 3.90 ग्राम
MgSO4•7H2हे 2 एम.एम. 9.86 ग्राम
केसीएल 2.5 एम.एम. 3.73 ग्राम
50 एमएल बनाने के लिए एच2ओ जोड़ें

तालिका 1: स्टॉक ए

अंतिम एम.एम. वजन
MgSO4•7H2हे 2 एम.एम. 12.32 ग्राम
50 एमएल बनाने के लिए एच2ओ जोड़ें

तालिका 2: स्टॉक B.

अंतिम एम.एम. वजन
CaCl2•2H2हे 2 एम.एम. 5.88 ग्राम
50 एमएल बनाने के लिए एच2ओ जोड़ें

तालिका 3: स्टॉक सी.

अंतिम (एमएम) वजन
Nacl 124 एमएम 7.25 ग्राम
नाHको3 26 एमएम 2.18 ग्राम
ग्लूकोज 10 एमएम 1.8 ग्राम
स्टॉक ए 2.5 एमएल
लगभग 950 एमएल एच2व् जोड़ें और मिश्रित गैस के साथ बुलबुला (95 % O2/5 % CO2) (10 मि)
स्टॉक सी (CaCl2) 2 एम.एम. 2.5 एमएल
1,000 एमएल बनाने के लिए एच2ओ जोड़ें

तालिका 4: ACSF की दैनिक तैयारी.

अंतिम (एमएम) वजन
नाHको3 26 एमएम 2.18 ग्राम
Sucrose 205.35 मीटर 70.29 ग्राम
ग्लूकोज 10 एमएम 1.8 ग्राम
स्टॉक ए 2.5 एमएल
स्टॉक बी 2.0 एमएल
लगभग 900 एमएल एच2ओ जोड़ें और मिश्रित गैस के साथ बुलबुला (95 % O2/5% CO2) (10 मि)
स्टॉक सी 0.4 एम.एम. 0.5 एमएल
1,000 एमएल बनाने के लिए एच2ओ जोड़ें

तालिका 5: संशोधित ACSF (कटिंग समाधान).

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Discussion

टुकड़ा शरीर क्रिया विज्ञान सही संकेत इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल में रिंग-मेम्ब्रेन फिल्टर सिस्टम का उपयोग यह सुनिश्चित करता है कि स्लाइस पूरी प्रक्रिया2,16,17में स्वस्थ और संयुक्त राष्ट्र विकृत बनी रहे। अन्य प्रणालियों रिकॉर्डिंग के दौरान टुकड़ा शरीर क्रिया विज्ञान बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इमेजिंग स्वस्थ होने के लिए टुकड़ा के हर हिस्से की जरूरत के रूप में टुकड़ा किसी भी समय विकृत नहीं होना चाहिए. अंगूठी झिल्ली फिल्टर प्रणाली भी धुंधला के लिए बेहतर है, क्योंकि यह हमें धुंधला समाधान की मात्रा को कम करने की आवश्यकता में मदद करता है. यह भी उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में यह समय के संबंध में कम होना चाहिए-fraction. सतत रोशनी नमूना नुकसान पहुंचा सकता है; इसलिए, शटर का उचित उपयोग आवश्यक है।

VSD की विषाक्तता अक्सर चर्चा की गई है29, लेकिन यह डाई एकाग्रता के गैर रेखीय गुणन का एक परिणाम है, उत्तेजना प्रकाश तीव्रता, और प्रकाश के लिए जोखिम की अवधि. इस प्रोटोकॉल में दिखाए गए दाग प्रक्रिया इस तरह के क्षेत्र-संभावित रिकॉर्डिंग के इनपुट-आउटपुट संबंधों और लंबी अवधि के potentiation (LTP), युग्मित-पल्स पर उन लोगों के रूप में टुकड़ा के शारीरिक मापदंडों में कोई औसत दर्जे का परिवर्तन का कारण नहीं था सुविधा (पीपीएफ)। टुकड़ा शरीर क्रिया विज्ञान की गिरावट विशेष रूप से निरंतर रोशनी16के तहत बड़ा है, लेकिन यह क्षेत्र की क्षमता की निगरानी के द्वारा प्रबंधित किया जा सकता है. इन सावधानियों का उपयोग करके, हम से अधिक के लिए VSD का उपयोग सतत ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के साथ एलटीपी रिकॉर्ड कर सकते हैं 12 एच24,जो इन विट्रो प्रयोगों में सबसे अच्छा वातानुकूलित करने के लिए तुलनीय है.

रिकॉर्डिंग के दौरान, हवा तालिका उपयोगी हो सकता है, लेकिन अन्य उपकरणों से इन्सुलेशन प्रकाशिकी के कम आवर्धन की वजह से अनुमति दी जानी चाहिए. हालांकि, यांत्रिक गड़बड़ी गरीब इमेजिंग के पीछे महत्वपूर्ण कारणों में से एक हैं। यदि छवि में झूठी संकेत की काफी राशि वस्तु के किनारे पर विपरीत संकेत के होते हैं, इस प्रकार चमक का अंतर, यह सबसे शायद यांत्रिक गड़बड़ी की वजह से है. नमूना और तरल पदार्थ के आंदोलनों गति शोर का सबसे लगातार कारण हैं, और इसलिए, से बचा जाना चाहिए या minimalized.

VSD संकेत (प्रकाश तीव्रता में आंशिक परिवर्तन) छोटा है (10-3 करने के लिए 10-4 प्रारंभिक फ्लोरोसेंट के). इस तरह के एक छोटे से परिवर्तन का पता लगाने के लिए, फ्लोरोसेंट फोटॉन शॉट शोर के प्रभाव को दूर करने के लिए समय के अंश में डिटेक्टर पर 105 से 106 फोटॉनों से अधिक होना चाहिए। इसके अलावा, न्यूरॉन गतिविधि का पालन करने के लिए, फ्रेम दर तेजी से होना चाहिए, इस तरह के kHz रेंज के आसपास है कि के रूप में विद्युत भौतिक रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक समय स्थिरांक के करीब. इन दो स्थितियों का एक संयोजन फ्लोरोसेंट की राशि है कि फ्लोरोसेंट इमेजिंग के अन्य प्रकार की तुलना में कहीं अधिक व्यापक है की आवश्यकता है. यह पूरे प्रकाशिकी में एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर की आवश्यकता है, और हमेशा की तरह माइक्रोस्कोप सबसे अच्छा विकल्प नहीं है. चित्र 4में दर्शाए अनुसार बृहत् पुतली और छिद्र की आवश्यकता है।

recoding प्रणाली बड़ा फोटॉन अच्छी तरह से गहराई, तेजी से फ्रेम दर, और कम शोर के साथ मेल खाना चाहिए. चुनाव ज्यादातर तंत्रिका प्रणाली की गति पर निर्भर करता है. इस तरह के हिप्पोकैम्पस संकेत transduction के रूप में तेजी से संकेत विशेष अल्ट्राफास्ट, कम शोर प्रणाली की जरूरत है। हालांकि, इस तरह के cortices में गतिविधि की धीमी गति से प्रसार के रूप में धीमी गति से संकेत सामान्य लेकिन वैज्ञानिक ग्रेड कैमरों का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है.

प्रकाश स्रोत का चयन भी महत्वपूर्ण है. प्रकाश का चुनाव इसकी तीव्रता, स्थिरता, और रोशनी के क्षेत्र पर निर्भर करता है। कम-मैग्निफिकेशन वाइड-फील्ड इमेजिंग के मामले में, आर्क्स और लेज़रों जैसे बिंदु प्रकाश स्रोत को विस्तार करने की आवश्यकता होती है, जिससे इन स्रोतों का उपयोग करना मुश्किल हो जाता है। आर्क्स, जैसे पारा और Xenon लैंप, उज्ज्वल प्रकाश स्रोत हैं, लेकिन आम तौर पर स्थिर नहीं हैं. हालांकि, Xenon प्रकाश के हाल के विकास की समस्या को दूर हो सकता है. हैलोजन लैंप स्थिर है और फिलामेंट का एक बड़ा क्षेत्र है जो आसानी से वाइड फील्ड इमेजिंग के साथ मैच कर सकता है, लेकिन विशेष रूप से 530 एनएम पर शक्ति में सीमित है। बिजली एलईडी के हाल के विकास हमें संभावित प्रकाश स्रोत के रूप में उपयोग करने के लिए सक्षम किया गया है, लेकिन यह तापमान निर्भरता की वजह से प्रतिक्रिया स्टेबलाइजर होना चाहिए. लेजर का इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन एक धब्बेदार शोर में उच्च सामंजस्य परिणाम है, जो आम तौर पर व्यापक क्षेत्र इमेजिंग के लिए अस्वीकार्य है।

VSD इमेजिंग प्रोटोकॉल इस आलेख में प्रस्तुत आराम की स्थिति के सापेक्ष एक मान मापता है. वर्तमान तकनीक का उपयोग करके झिल्ली की क्षमता का निरपेक्ष माप नहीं किया जा सकता है। अनुपातमेट्रिक इमेजिंग और फ्लोरोसेंट जीवनकाल माप का उपयोग निरपेक्ष झिल्ली क्षमता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

मस्तिष्क स्लाइस की इमेजिंग कम आवर्धन पर VSD के साथ थोक दाग मस्तिष्क के माइक्रो सर्किट बातचीत में उप थ्रेसहोल्ड झिल्ली संभावित परिवर्तन प्रदर्शित कर सकते हैं. वास्तविक समय संकल्प पर माइक्रो सर्किटरी के बीच संबंध के बारे में इस तरह के कार्यात्मक गुंजाइश मस्तिष्क अनुसंधान के कई क्षेत्रों में उपयोगी हो जाएगा, विशेष रूप से इस तरह उत्तेजक और निरोधात्मक कार्यात्मक की वजह से सबसे अधिक संभावना रोग पहलुओं का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच कनेक्शन. यह आवेदन तंत्रिका मनोरोग रोगों के कुछ प्रकार से संबंधित तंत्रिका सर्किट में परिवर्तन की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा30,31,32.

आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग वोल्टेज सूचक33का विकास,34 ऑप्टिकल झिल्ली संभावित रिकॉर्डिंग है कि तंत्रिका के सेल प्रकार-विशिष्ट विश्लेषण के आकर्षक अनुप्रयोगों के लिए मार्ग प्रशस्त होगा के लिए भविष्य की दिशा है सर्किट स्तर की घटनाओं.

प्रकाशिकी में सुधार के लिए बहुत जगह है, विशेष रूप से व्यापक क्षेत्र कार्यात्मक कनेक्शन visualizing के लिए. हमारे उपन्यास confocal प्रकाशिकी35 उच्च गति और वीएसडी संकेत के उच्च एस /

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

टीटी को जेपीएस काकेनही ग्रांट (JP16H06532) मिला JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038, और JP15K00413) MEXT से और स्वास्थ्य, श्रम और कल्याण मंत्रालय से अनुदान (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] और H30 [18062156]. हम अंग्रेजी भाषा के संपादन के लिए संपादन (www.editage.jp) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High speed image acquisition system Brainvision co. Ltd. MiCAM - Ultima Imaging system
High speed image acquisition system Brainvision co. Ltd. MiCAM 02 Imaging system
Macroscepe for wide field imaging Brainvision co. Ltd. THT macroscope macroscope
High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer Brainvision co. Ltd. LEX-2G LED illumination
Image acquisition software Brainvision co. Ltd. BV-ana image acquisition software
Multifunctional electric stimulator Brainvision co. Ltd. ESTM-8 Stimulus isolator+AD/DA converter
Slicer Leica VT-1200S slicer
Slicer Leica VT-1000 slicer
Blade for slicer Feather Safety Razor Co., Ltd. #99027 carbon steel razor blade
Membrane filter for slice support Merk Millipore Ltd., MA, USA Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, membrane filter/0.45 13
Numerical analysis software Wavemetrics Inc., OR, USA IgorPro analysing software
Stimulation isolator WPI Inc. A395 Stimulus isolator
AD/DA converter Instrutech ITC-18 AD/DA converter
Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA catalog number: D-1199 VSD: Di-4-ANEPPS
Poloxamer Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Pluronic F-127 P30000MP poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)
Polyethoxylated castor oil Sigma-Aldrich Cremophor EL C5135 polyethoxylated castor oil

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References

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Tominaga, Y., Taketoshi, M., Maeda, N., Tominaga, T. Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye. J. Vis. Exp. (148), e59692, doi:10.3791/59692 (2019).

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