Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Realtidsovervågning af menneskelige Glioma celle migration på dorsale root ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-kulturer

Published: December 13, 2019 doi: 10.3791/59744
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Molecular Neuro-oncology Laboratory, Brown University, Rhode Island Hospital, 2University of Minnesota, College of Veterinary Medicine, 3Department of Neurosurgery, Brown University

Summary

Her præsenterer vi et ex-vivo blandet enkeltlags kultur system til studiet af human gliom Cell (HGC) migration i realtid. Denne model giver mulighed for at observere interaktioner mellem hGCs og både myelinerede og ikke-myelinerede axoner i et opdelt kammer.

Abstract

Glioblastoma er en af de mest aggressive menneskelige kræftformer på grund af omfattende cellulære heterogenitet og migrations egenskaber af hGCs. For bedre at forstå de molekylære mekanismer underliggende gliom celle migration, en evne til at studere samspillet mellem hgcs og axoner i tumor mikromiljø er afgørende. For at modellere denne cellulære interaktion, udviklede vi et blandet kultur system bestående af hgcs og dorsale root basale ganglier (DRG) Axon-oligodendrocyte Co-kulturer. DRG-kulturerne blev udvalgt, fordi de kan isoleres effektivt og kan danne de lange, omfattende fremskrivninger, der er ideelle til migrationsundersøgelser af denne art. Renset rotte oligodendrocytter blev derefter tilsat på renset rotte DRG axoner og induceret til myelinat. Efter at have bekræftet dannelsen af kompakt myelin, blev hgcs endelig føjet til co-kulturen og deres interaktioner med DRG axoner og oligodendrocytter blev overvåget i realtid ved hjælp af tidsforskudt mikroskopi. Under disse betingelser, hgcs danner tumor-lignende aggregat strukturer, der udtrykker GFAP og Ki67, migrere langs både myelinerede og ikke-myelerede axonal spor og interagere med disse axoner gennem dannelsen af pseudopodia. Vores ex vivo Co-Culture system kan bruges til at identificere nye cellulære og molekylære mekanismer af hGC migration og kunne potentielt anvendes til in vitro Drug effektivitet test.

Introduction

Glioblastoma er en af de mest aggressive og dødbringende tumorer i den menneskelige hjerne. Den nuværende standard for pleje omfatter kirurgisk resektion af tumoren efterfulgt af stråling1 plus samtidig og adjuverende administration af temozolomid2. Selv med denne multi-terapeutiske tilgang, tumor gentagelse er uundgåelig3. Dette skyldes til dels den omfattende migrerende karakter af tumorceller, som invaderer hjernen parenkym skabe flere finger-lignende fremskrivninger i hjernen4 , der gør fuldstændig resektion usandsynligt.

I de seneste år, er det blevet klart, at aggressivitet af glioblastoma skyldes, til dels, tilstedeværelsen af en population af kræft stamceller i tumormassen5,6, som udviser højt migrerende potentiale7,8, resistens over for kemoterapi og stråling9,10 og evnen til at danne sekundære tumorer11. GSCs er i stand til at rekapitulere oprindelige polyklonale tumorer, når xenografted til Nude mus5.

På trods af den rigdom af viden om Glioblastomas genetiske baggrund, er undersøgelser af gliom Cell (GC) migration i øjeblikket hæmmet af mangel på effektive in vitro-eller in vivo-migrations modeller. Især mens gliom celle-axonal interaktioner moduleret af cellulære og miljømæssige faktorer er en kernekomponent i gliom invasion, til vores viden er der i øjeblikket ingen eksperimentel system med evnen til at modellere disse interaktioner12,13,14. For at afhjælpe denne mangel udviklede vi et ex vivo-kultur system af primære Hgc'er, der er co-dyrket med rensede DRG Axon-oligodendrocytter, som resulterer i forhøjet ekspression af differentierede tumor markører samt omfattende migration og interaktion af hGCs med myelinerede og ikke-myelerede fibre. Denne ex vivo platform, på grund af sin opdelte layout, er egnet til at teste virkningerne af nye Therapeutics på hGC migration mønstre.,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollerne for indsamling, isolering og formering af patient-afledte humane gliom celler blev godkendt af IRB-Komitéen for Rhode Island Hospital. Alle dyr blev vedligeholdt i henhold til NIH guide til pleje og brug af forsøgsdyr. Alle protokoller om anvendelse af dyr blev godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse på Rhode Island Hospital.

1. medier og buffer præparater

  1. Forbered 50 mL Neuro Sphere medier: 1x neuronal basal medium w/o vitamin A, 1x serum gratis supplement w/o vitamin A, 2 mM L-glutamin, 20 ng/mL epidermal vækstfaktor (EGF), 20 ng/mL grundlæggende-fibroblast vækstfaktor (FGF), 2 μg/mL heparin, og 1x antibiotikum-antimykotisk (anti-anti).
  2. Forbered 50 mL suppleret neuronal basal medium: 1x neuronal basal medium, 1x serum gratis supplement, 4 g/L D-glucose, 2 mM L-glutamin, og 50 ng/mL nerve vækstfaktor (NGF).
  3. Forbered 500 mL N2B2 medium: 1:1 Dulbecco's modificerede Eagle medium-skinke F12 næringsstof blanding (DMEM-F12), 1x insulin-transferrin-selen (ITS-G), 66 mg/mL bovin serumalbumin (BSA), 0,1 mg/mL transferrin, 0,01 mg/mL biotin, 6,29 mg/mL progesteron, 5 μg/mL N-acetyl-L-cystin (NAC), og 1 mM putriscine. Og fryse ved-20 °C.
  4. Forbered 500 mL C-medium: 1x minimum essentiel medium (MEM), D-glucose (Final 4 g/L), 10% føtal bovint serum (FBS) og 2 mM L-glutamin. Og fryse ved-20 °C. Tilsæt nerve vækstfaktoren (NGF) frisk før brug (50 ng/mL).
  5. Forbered 200 mL papain buffer: 1x Earle afbalanceret salt opløsning (EBSS), 100 mM mg2så4, 30% GLUCOSE, 0,25 M EGTA, og 1 M NaHCO3.
  6. Forbered 10 mL DMEM-G-medium: 1x DMEM, 0,5% BSA og 1x ITS-G.
  7. Forbered 200 mL PB buffer: 1x Dulbecco's fosfat-Buffered saltvand (DPBS) uden ca2 + og mg2 + og 0,5% BSA. Degas buffer før brug og holde på is.

2. isolation og kultur af Glioma stamcelle Neuro kugler

  1. Isolering af Neuro kugler
    1. Saml IRB-godkendt og patienten indvilligede i frisk humant glioblastoma (GBM) væv fra operationsstuen. Overfør GBM-prøver på is i DPBS, der indeholder 2x anti-anti til et BL2 certificeret biologisk sikkerhedskabinet.
    2. Overfør en 1 cm3 GBM prøve med minimal nekrose eller rød blod celle forurening til en 60 mm plade og skæres i 1 mm3 fragmenter; Fjern eventuelle overskydende DPBS.
    3. Fordøje vævet med 5 mL kollagenase/dispase (1 mg/mL) i 30 min ved 37 °C og Hvirvl forsigtigt skålen hver 5-10 min.
    4. Overføre fordøjet fragmenter til et 50 mL rør og triturat ved pipettering med en 10 mL pipette flere gange for at adskille vævet.
    5. Tilsæt en tilsvarende mængde Neuro Sphere medier og udriv vævet igen; tillader de store fragmenter at bosætte sig.
    6. Fjern mediet uden vævs fragmenter og passere langsomt gennem et 70 μM cellefilter placeret over et frisk 50 mL rør.
    7. Gentag trin 2.1.5-2.1.6, indtil al vævet er blevet dissocieret, og Skift celle sien efter behov.
    8. Drej cellesuspensionen ved 110 x g i 10 min.
    9. Fjern supernatanten og Genoptag pellet i 10 ml ACK-lyserende-buffer for at fjerne kontaminering af røde blodlegemer. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
    10. Drej cellesuspensionen ved 110 x g i 5 min.
    11. Fjern supernatanten og resuspender cellerne i 10 mL Neuro Sphere-medier. Tag 10 μL af cellesuspensionen, og fortynd med 10 μL trypan og et blå. Tælle 10 μL af cellesuspensionen ved hjælp af en automatiseret celle tæller eller hemocytometer og plade i 10 mL Neuro Sphere medier ved en tæthed på 3 x 106 celler i 100 mm suspension kultur plader.
    12. Tilsæt 2 mL frisk Neurosphere medier til kulturen 2-3 gange om ugen.
      Bemærk: Neuro kugler vil danne i suspension inden for 3-4 uger. Efter afdyrkning i 2-4 gange, Bekræft stemthed via den begrænsende fortynding analyse og tumor rekapitulation via xenographic transplantation i immunkompromitterede mus som tidligere beskrevet 22.
  2. Sub-culturing Neuro kugler
    1. Når kugler form og nå en diameter mellem 200-500 μm, overføre Neuro kugler til en 15 mL rør og spin på 110 x g i 5 min.
    2. Genopsæt Neuro kugler i 1 mL forvarmet celle løsrivelse.
    3. Overføres til et 1,5 mL rør og inkubates ved 37 °C i 5 min.
    4. Sæt en P200 pipette til 150 μl og udriv ved pipettering op og ned for at adskille Neuro kugler.
    5. Overfør dissocierede celler til et 15 mL rør. Tilsæt 4 mL Neurosphere Media og spin ved 300 x g i 5 min.
    6. Fjern supernatanten og resuspender cellerne i 5 mL Neuro Sphere-medier. Tag 10 μL af cellesuspensionen, og fortynd med 10 μL trypan og et blå. Tælle 10 μL af cellesuspensionen ved hjælp af en automatiseret celle tæller eller hemocytometer og plade med en densitet på 1 x 106 celler/60 mm parabol i en endelig volumen på 4 ml.
    7. Opdater medier 2 gange om ugen og subkultur celler efter behov. Fryse hele Neuro kugler når det ønskes i neuronal basal Media w/o vitamin A suppleret med 10% DMSO. Neuro kugler kan anvendes til eksperimenter efter P4.

3. opdelt kultur af rotte dorsalrodsganglier (DRG), Oligodendrocytter (OPCs) og hGCs

  1. Fremstilling af opdelte kultur retter
    Bemærk: Udfør følgende trin dagene før den planlagte høst af Drg'erne.
    1. Saml opdelte kultur retter.
    2. Fortyndet kollagen stamopløsning til 500 μg/mL i steril destilleret H2O; Bland grundigt.
    3. Med en steril overførings pipette fyldes en 35 mm kulturret med 2 mL kollagenopløsning; Fjern opløsningen, efterlader en tynd film af kollagen bag og Placer den i den næste 35 mm skål. Gentag denne proces, tilføje mere kollagen løsning efter behov, indtil alle retter er blevet belagt.
    4. Når alle plader er belagt, Placer pladerne i en 245 mm x 245 mm kultur bakke og læg tre 1 mm x 1 mm gaze puder i midten af bakken.
    5. For at polymerisere kollagen, våd gaze puder med 1 mL koncentreret ammoniumhydroxid og dække bakkerne for 15 min.
    6. Fjern gaze puder og lad 35 mm retterne tørre i laminar flow hætten.
    7. Mens retterne tørrer, bør du lægge cylinderen på sprøjtens smøremiddel med højt vakuum fedt. Placer de opdelte kamre i en stor mund medie flaske fyldt med destilleret vand. Steriliser både ved autoklave og lad den køle af.
    8. Fil off punktet af en 18-G nålefilt at gøre en stump spids. Steriliser i 70% ethanol. Fastgør kanylen til fedtsprøjten.
    9. Steriliser PIN rake ved iblødsætning i 70% ethanol; Lad det lufttørre i laminar flow hætten.
    10. Fjern låget fra en tør, kollagen belagt 35 mm skål. Hold skålen mellem tommelfingeren og pegefinger. Hold PIN rake med den anden hånd. Påfør et fast tryk for at skabe endnu 200 μM brede ridser over midten af skålen.
    11. Ved hjælp af en græs pipette, placere to dråber suppleret neuronal basal medium i midten af ridser.
    12. Gentag trin 3.1.10-3.1.11 indtil alle retter er ridset.
    13. Tør de opdelte kamre i en laminar flow hætte.
    14. Med sterile hæostatisk pincet, tag fat i et opdelt kammer ved midterdivideren. Vend hæostatisk pincet, så bunden af kammeret vender opad.
    15. Påfør silikone fedt til det opdelte kammer, startende i toppen. Sørg for, at fedtet er placeret pænt og overlapper i alle hjørner.
    16. Fjern låget fra en 35 mm skål. Vend skålen om, og Anbring skrammer over kammeret. Tryk forsigtigt ned på bunden af pladen med et par pincet.
    17. Vend forsigtigt pladen om ved hjælp af hæostatisk pincet. Slip forceps.
    18. Placer en Mound af fedt i bunden af midterrummet. Fyld hvert kammer med suppleret neuronal basal medium (NB) og kontrollere for lækager. Forsegl lækager med silikone fedt efter behov.
    19. Fortsæt med at samle alle kultur retter og opbevar natten over på 37 °, 5% CO2.
  2. Isolering af rotte DRG neuroner og kultur i det opdelte kammer
    1. Ofrer en tidsindstillet gravid E16 Sprague-Dawley rat ved CO2 kvælning eller ved kemisk overdosering.
    2. Dyret placeres i liggende stilling på en ren overflade. Desinficer maven med 70% ethanol.
    3. Tag fat i huden på underlivet med pincet og løft forsigtigt.
    4. Ved hjælp af en saks, lave en "jeg" snit langs midterlinjen af dyret, at passe på ikke at punktere musklerne i bugvæggen.
    5. Med et rent par pincet, tag fat i muskel væggen og lav en tværgående indsnit med et rent saks ved hjælp af forsigtighed for ikke at punktere livmoderen eller tarmene.
    6. Med et par stumpe pincet, tag fat i livmoderen og løft forsigtigt lige op af peritonealhulen.
    7. Brug frisk, steril saks, klip bindevæv i bunden af hver livmoder horn.
    8. Placer hele livmoderen i en steril 100 mm vævskultur skål.
    9. Bær livmoderen til en laminar flow hætte til dissektion.
    10. Fjern embryoner fra livmoderen, en ad gangen, ved at klippe gennem den amniotiske sæk og forsigtigt drille embryonet ud og ind i en 60 mm skål indeholdende 5 mL L-15 med 1x pen-STREP.
    11. Med fine pincet, Placer 3-4 embryoner i en 60 mm skål indeholdende 5 mL L-15 med 1x pen-STREP.
    12. Arbejder under en dissekere mikroskop og med et embryo ad gangen, aflive ved halshugning.
    13. Læg embryonen ventrale side opad og fjern lemmerne og halen.
    14. Med fine pincet, lave en mellemlinje indsnit i dyret.
    15. Fjern indre organer og væv til at afsløre rygmarv strukturer, især rygmarven, som bør være synlige ved afslutningen.
    16. Placer en kniv af mikro-dissecting saks mellem rygsøjlen og rygmarvskanalen og omhyggeligt skåret gennem rygsøjlen for at udsætte rygmarven. Pas på ikke at klippe gennem rygmarven.
    17. Med fine pincet, tag let fat i den rostrale ende af rygmarven og løft langsomt ud af embryonet. Drg'erne vil blive fastgjort til rygmarven.
    18. Overfør rygmarvs ledninger og fastgjort DRG til en 35 mm skål indeholdende 2 ml L-15 med 1x pen-STREP. Sted på isen.
    19. Når alle rygmarven er blevet isoleret, skal du bruge fine pincet til individuelt plukke drg'er fra rygmarven. Placer DRG i en frisk 35 mm skål.
    20. Hvis nerve rødder er til stede på DRG, klip dem væk.
    21. Fjern forberedte 35 mm retter fra 37 °C, 5% CO2 inkubator. Fjern mediet fra den foregående dag. Placer 80 μL suppleret neuronal basal Media (NBF) indeholdende 10 μM 5-fluoro-2'-deoxyuridin (FUDR) i midterrummet og 250 μL af medierne i hvert ydre rum.
    22. Placer 2 ganglier i hvert midterrum. Retur retter til 37 °C, 5% CO2 inkubator.
    23. Den følgende dag tilsættes 2,5 mL NBF.
    24. Feed kulturerne efter tidsplanen i tabel 1, ændre tidsplanen baseret på den dag valgt til at begynde DRG prep.
    25. På dag 21 (eller når axoner nå slutningen af de distale rum), enten frø kulturer med en GBM sfære (Fortsæt til trin 3.2.26) og levende billede eller myelinere kulturer med oligodendrocytter kulturer (Fortsæt til trin 3,3) og derefter frø med en GBM sfære efter myelination.
    26. Udskift suppleret NB medium i hver distale opdelte kammer, der vil blive seedet med en GBM sfære med suppleret NB medium indeholdende 10% FBS.
    27. Med en P20-pipette, der er indstillet til 10 μl, fjernes en GBM sfære fra kultur skålen. GBM Neuro Sphere bør måle ca. 200 mikroner i størrelse.
    28. Placer spidsen af pipetten i det distale kammer og Udsæt GBM sfære langsomt, så den forsigtigt falder på akonerne i den del af det distale kammer, der er tættest på midterkammeret, over axonerne nær midterkammeret. Pas på ikke at lade pipettespidsen forstyrre axonerne.
    29. Lad kulturen i biosikkerhed kabinet for 1 h ved stuetemperatur for at gøre det muligt for GBM sfære at vedhæfte.
    30. Når Neuro Sphere har fastgjort, meget omhyggeligt erstatte medierne i det distale rum med suppleret NB medium.
    31. Live image kulturer i 3-7 dage, tilføje medier efter behov. I dette tilfælde, et kontrolleret CO2 levende celle kabinet knyttet til mikroskopet (f. eks, Zeiss Axiovert) blev brugt til kontinuerligt at overvåge celle migration i 7 dage ved hjælp af brightfield. Billeder blev erhvervet hver 10 min ved hjælp af den tilhørende software. Gentag den samme protokol ved hjælp af hgc'er, der er blevet stabilt overført til Express gfp, og billeder blev taget med en kombination af lysfelt og 488 nm laser.
      Bemærk: Neuro kugler kan være transduceret med lentivirus eller transficeret med plasmider eller sirna'er. Rum kan også behandles med ønskede små molekyle hæmmere til at studere migration.
  3. Myelination af DRG axoner med Oligodendrocytter
    1. Dagen før oligodendrocyte isolation, erstatte NB medium i DRG med C-medium.
    2. Før dissektion placeres 10 mL papain buffer i en 60 mm skål i inkubator for at ækvibrere.
    3. I en laminar flow hætte, fyld 1 100 mm skål og 1 60 mm skål med iskold HBSS. Sted på is.
    4. Ofrer en P2 rotte pup ved decapitation. Fjern huden ved hjælp af et par saks. Når huden er fjernet, skæres kraniet langs midterlinjen med et par fine saks.
    5. Forsigtigt fjerne kraniet med fine pincet. Ved hjælp af en spatel, forsigtigt scoop hjernen fra bunden af kraniet og overføres til en inverteret vævskultur plade låg.
    6. Fjern cerebellum og opdele cerebrum i to cerebrale halvkugler. Fjern olfaktoriske pærer, hippocampus, og basal ganglier under hjernebarken af hver halvkugle. Placer hjernebarken i 100 mm skålen indeholdende HBSS. Gentag trin 3.3.4-3.3.6 for de resterende dyr.
    7. Arbejde med en cortex ad gangen, fjerne meninges med fine Dumont pincet. Placer alle meninges-fri corticer i friske 60 mm retter med hbss.
    8. Terninger det kortikale væv i 1 mm3 stykker. Sted på is.
    9. Placer den ækvibrerede papain-buffer i et 15 mL rør. Tilsæt 200 enheder af papain og 2 mg L-Cystein. Filter Steriliser og tilsæt 200 μL steril DNase I.
    10. Fjern hbss fra det tern hjernevæv og Udskift med papain buffer fra 3.3.2. Placer skålen i 37 °C, 5% CO2 inkubator for 80 min, forsigtigt ryster hver 15 min.
    11. Det Ford øjede væv overføres til et 50 mL rør, og der tilsættes 2 mL C-medium.
    12. Triturat med en 5 mL serologisk pipette for at adskille vævet; Lad større stykker af væv til at bosætte sig. Fjern supernatanten og Placer den i et sterilt 15 mL rør.
    13. Tilsæt 2 ml C-medium og Gentag formalings med en 5 ml serologisk pipette endnu en gang. Skift til en 1 mL pipettespids og triturat, indtil vævet er fuldstændig dissocieret. Overføres til 15 mL røret.
    14. Drej det triturerede væv ved 300 x g i 15 min. Fjern forsigtigt supernatanten og resuspender pellet i 8 ml DMEM-dens-g medium.
    15. Pre-våd en steril 30 μM celle sien med 2 mL PB buffer. Placer celle sien over et 50 mL rør og Filtrer cellesuspensionen 1 mL ad gangen. Filteret skylles med 5 mL PB-buffer.
    16. Cellesuspensionen overføres til en 100 mm bakteriologisk plade; Inkubér i 15 min i en 37 °C, 5% CO2 inkubator, så microglia kan fastgøres.
    17. Fjern mediet, og Placer det i et 15 mL rør. Pladen skylles forsigtigt med 2 mL DMEM-G-medium og overføres til 15 mL-røret.
    18. Resuspendér cellesuspensionen forsigtigt. Tag 10 μL af cellesuspensionen, og fortynd med 10 μl trypan og et blå. Tælle 10 μl af cellesuspensionen ved hjælp af en automatiseret celle tæller eller hemocytometer.
    19. Drej cellesuspensionen ved 300 x g i 10 min.
    20. Aspirér supernatanten fuldstændigt, og resuspender cellerne i 70 μL PB-buffer for hver 1 x 107 -celle. Bland godt og Inkuber ved 4 °C i 10 minutter.
    21. Tilsæt 20 μl anti-A2B5 mikroperler for hver 1 x 107 celler. Bland godt og Inkuber ved 4 °C.
    22. Tilsæt 1-2 mL PB buffer for hver 1 x 107 celler og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter i en 4 °c centrifuge.
    23. Aspirere supernatanten helt. Resuspension op til i alt 108 celler i 500 ΜL PB buffer. Hold på is.
    24. Placer en magnetisk perle søjle i magnetfeltet på en separator.
    25. Forbered kolonnen ved skylning med 500 μL PB-buffer. Anvend cellesuspensionen på kolonnen. Kassér gennemstrømning i en affaldscontainer (dette indeholder UN-mærkede celler).
    26. Kolonnen vaskes med 500 μL PB-buffer 3 gange. Kassér gennemstrømning.
    27. Fjern kolonnen fra magnetisk separator, og Placer den i en opsamlings slange.
    28. 1 mL PB-buffer afpipetteres på søjlen. Skyl de magnetisk mærkede celler ved at skubbe stemplet kraftigt ind i kolonnen.
    29. Tilsæt 4 mL C-medium til celle fraktionen og spin ved 300 x g i 10 min.
    30. Supernatanten fjernes og resuspenderes i 5 mL N2B2 medium. Tag 10 μL af cellesuspensionen, og fortynd med 10 μL trypan og et blå. Tælle 10 μL af cellesuspensionen ved hjælp af en automatiseret celle tæller eller hemocytometer.
    31. Plade oligodendrocytter i en koncentration på 150.000 celler pr. opdelt kammer indeholdende en DRG med fuldt udvidede axoner.
    32. Den følgende dag ændre medierne i det opdelte kammer til N2B2 at give mulighed for myelination. Udskift medierne hver 2-3 dage. Myelinering vil være komplet i 14 dage.
    33. På dag 14, frøkultur med en GBM sfære som i 3.2.26-3.2.32. Opretholde myelinerede kulturer i N2B2 medium for varigheden af eventuelle eksperimenter.
      Bemærk: protokollen præsenteres som et flowdiagram skematisk i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at studere samspillet mellem hgcs og axoner genererede vi rensede DRG axoner som tidligere beskrevet15,16,17,18. Disse rensede DRG axoner blev derefter seedet med hGCs, som dannede GFAP +/Ki67 + tumor lignende strukturer integreret i axonal Network, mens individuelle Hgc'er migrerede enten i forening eller mellem axonerne (figur 2). For at afgøre, hvordan hgcs interagerer med myelinerede axoner, vi seedede DRG Axon kulturer med renset rotte oligodendrocytter og induceret myelination som tidligere beskrevet19,20,21. Tilsætning af hGCs på myelinerede DRG-oligodendrocyte Co-kulturer viste, at hGCs migrere i forbindelse med myelinerede axoner og væk fra tumormassen gennem dannelsen af pseudopodia som vist i vores seneste papir (figur 3)22. Oligodendrocyt myelination kan bestemmes ved hjælp af myelin grundlæggende protein (MBP) farvning af kulturerne. For at kvantificere migrationen af Hgc'er i disse kulturer målte vi det samlede område af kulturen besat af migrerende hGCs ved hjælp af image J software22.

Mandag Onsdag Fredag
DAG 1 NBF
UGE 1 Nb NBF Nb
UGE 2 NBF Nb Nb
UGE 3 Nb Nb

Tabel 1: fodringsplan for DRG-kulturer.

Figure 1
Figur 1: skematisk oversigt over protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: hGCs danner tumor lignende strukturer i co-kultur med DRG axons. Kulturen blev fast og plettet for tumor markører GFAP (rød) og Ki67 (grøn), mens axoner blev farvet med neurofilament (blå). Skala bjælke: 200 μm. Dette tal er blevet ændret fra vores nyligt offentliggjorte papir22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: hGCs migrerer langs myelinerede axonal spor. hGCs udtrykker det grønne fluorescerende protein (GFP) migrere langs myelinerede axonal spor farvet rødt for MBP i hGC-DRG-oligodendrocyte kultur system. Skala bjælke: 200 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Migrationsundersøgelser for hGCs kan udføres ved hjælp af BoyDen kammer systemer eller ridse assays. Men, mens disse eksperimenter undlader at give nogen oplysninger om samspillet mellem tumorceller med andre omgivende væv, det nuværende system kan rekapitulere GC interaktioner med myelinerede og ikke-myelerede fibre. Endvidere, at studere tumordannelse og slutpunkt migration, organotypiske skive kulturer af gnaver hjernen eller in vivo implantation af gliom celler i gnaver hjernen eller flanke har tidligere været udnyttet23,24,25. Nyere indsats på tredimensionel modellering af gliom celler har udnyttet systemer som kollagen lag26,27,28, astrocyt-baserede stilladser29,30, ekstracellulære matrix lag31, elektro spundet nanofibre32, og silicagelrogeler33. Mens disse eksperimenter giver tilfredsstillende resultater i slutpunktet med hensyn til migration, mangler de evnen til at blive undersøgt i realtid ved højopløsnings mikroskopi.

Her har vi demonstreret en ny tilgang til at studere migrationen af tunge lastvogne ved at forberede en DRG-Co-kultur i et opdelt kammer. Hvis der er adgang til frisk GBM-væv, kan hGCs isoleres og kultiveret pålideligt. Selv om hGCs tage lang tid at danne Neuro kugler i første omgang, kulturerne er nemme at vedligeholde og subkultur når kugler form. For at sikre, at hGC-kulturen bliver en succes, bør vævet behandles så hurtigt som muligt. Tiden mellem resektion og behandling bør minimeres så meget som muligt, og prøverne skal altid transporteres på is.

DRG er også let at isolere, udvider sine axoner længere end kortikale neuroner og kan let myelineret i kultur med oligodendrocytter. HGC Neuro kugler eller dissocierede hgc'er er co-kultiveret i de distale rum i kamrene, giver mulighed for levende celle billeddannelse og real-time kvantificering af cellulære interaktioner med axoner og myelinerede fibre. Desuden er denne protokol ikke begrænset til kun DRG kulturer, som kortikale neuroner kan også være isoleret og myelineret med få ændringer til denne protokol. Denne model kan også anvendes til at studere andre former for kræft i hjernen.

Mens DRG er relativt enkel at isolere og vedligeholde, tilføjelsen af det opdelte kammer er tidskrævende og skaber en lang række tekniske begrænsninger, der kræver uddannelse og praksis for at lykkes. Afgørende for succesen af denne protokol er ensartet kollagen belægning og skrabe af kulturen retter fordi ujævn eller overdrevent tyk kollagen tendens til at skrælle. Ekstrem omhu bør også tages, mens du placerer silikone fedt på de opdelte kamre. Hvis selv trykket ikke bruges under dispensering af silikone fedtet, vil der være huller langs bunden af det opdelte kammer, der vil kræve forsegling med overskydende fedt for at forhindre medie lækage. Derudover bør der anvendes et minimumstryk ved fastholdelsen af de opdelte kamre til kultur skålen. Hvis axoner undlader at krydse ud af det midterste rum efter uge et og DRG ser ellers sundt, er det sandsynligt, at for meget pres blev anvendt, når du placerer den opdelte kammer eller en overskydende mængde af fedt blev brugt.

hGC-migrationen langs myelinerede og ikke-myelinerede axonal skrifter i hjernen er ikke blevet godt beskrevet på grund af manglen på effektive og reproducerbare ex vivo-modeller. Vi beskriver her udviklingen af en innovativ ex vivo kultur system til at studere, hvordan gliom celler migrere langs axoner og myelin, en afgørende komponent i udviklingen af nye behandlinger, der specifikt rettet mod tumor celle migration. Vores kultur system er alsidigt, da der er Fluidic isolation mellem rum, hvilket letter evnen til at studere forskellige nye behandlinger eller forskellige koncentrationer af stoffer, der påvirker gliom celle migration. En yderligere fordel ved vores co-Culture system er evnen til at overvåge hGC migration og virkningerne af de forskellige behandlinger i realtid. Den protokol, der er beskrevet her, anvendes i øjeblikket som grundlag for udviklingen af mere sofistikerede, biomimetiske 3-dimensionelle ex vivo-systemer, der udelukkende anvender humane cellulære komponenter, som kan anvendes til at vurdere nye lægemidlers toksikologi og virkning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af interne fonde af Department of neurosurgery, Brown University til N.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Suspension Culture Dish Corning 430591
2.5S NGF ENVIGO B.5025
60 mm Suspension Culture Dish Corning 430589
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher A1049201
Ammonium Hydroxide Solution Fisher Scientific A669-500 Concentrated
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech AF-100-18B
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat Miltenyi Biotec 130-093-392
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher 15240062
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) Miltenyi Biotec 130-091-222
B27 Supplement Thermo Fisher 17504044
B27 Supplement, minus vitamin A Thermo Fisher 12587001
Bacteriological Plate BD Falcon 351029
Biotin Sigma B4639
BSA Sigma A9418
Campenot Chamber Tyler Research CAMP-10
Cell Culture Dish Corning 430165 35mm X 10mm
Cell Strainer BD Falcon 352350 70 uM, Nylon
Cell Strainer BD Falcon 352340 30 uM, Nylon
Collagenase/Dispase Roche 11097113001
Cultrex Rat Collagen I Trevigen 3440-100-01
D-Glucose Sigma G5146
DMEM Thermo Fisher 10313021
DNase I Sigma D7291
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Scientific 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5045
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat
EBSS Sigma E7510
EGTA Sigma E3889
FBS Hyclone SH30070.02
FUDR Sigma F0503
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35050061
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher 11765054
HBSS Thermo Fisher 14175095
Hemostatic Forceps Roboz RS-7035
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS Stem Cell Technologies 07980
Hypodermic Needle, 18G BD 511097
Insulin-Transferrin-Selenium G Thermo Fisher 41400045
L-Cysteine Sigma C7477
L-Glutamine Thermo Fisher 25030081
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MEM Thermo Fisher 1190081
Mg2SO4 Sigma M2643
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MS Columns plus tubes Miltenyi Biotec 130-041-301
NAC Sigma A8199
NaHCO3 Sigma S5761
Neurobasal Medium Thermo Fisher 21103049
Neurobasal-A Medium Thermo Fisher 10888022
Ordinary forceps
P2 Sprague Dawley Rat Pups
Papain Worthington LS003126
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140148
Pin Rake Tyler Research CAMP-PR
Progesterone Sigma P8783
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher A1110501
Syrine Grease Applicator Tyler Research CAMP-GLSS
Transferrin Sigma T2036
Uridine Sigma U3003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
  3. Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
  4. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  5. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  6. Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).
  7. Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
  8. Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
  9. Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
  10. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  11. Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).
  12. Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U. Glioblastoma. De Vleeschouwer, S. , (2017).
  13. Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
  14. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
  15. Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
  16. Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
  17. Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
  18. Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
  19. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  20. Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
  21. Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
  22. Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
  23. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).
  24. Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
  25. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  26. Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
  27. Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
  28. Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
  29. Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
  30. Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  31. Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
  32. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
  33. Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).

Tags

Kræftforskning Glioma stamceller migration ex vivo model co-kultur DRG axons myelin
Realtidsovervågning af menneskelige Glioma celle migration på dorsale root ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-kulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zepecki, J. P., Snyder, K. M.,… More

Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Tapinos, N. Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures. J. Vis. Exp. (154), e59744, doi:10.3791/59744 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter