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Cancer Research

Monitoreo en tiempo real de la migración de células de glioma humano en cocultivos de axón-oligodendrocitos de ganglios de raíz dorsal

Published: December 13, 2019 doi: 10.3791/59744
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Molecular Neuro-oncology Laboratory, Brown University, Rhode Island Hospital, 2University of Minnesota, College of Veterinary Medicine, 3Department of Neurosurgery, Brown University

Summary

Aquí presentamos un sistema de cultivo monocapa mixto ex-vivo para el estudio de la migración de células de glioma humano (hGC) en tiempo real. Este modelo proporciona la capacidad de observar interacciones entre hGCs y axones mielinados y no mielinizados dentro de una cámara compartimentada.

Abstract

El glioblastoma es uno de los cánceres humanos más agresivos debido a la extensa heterogeneidad celular y las propiedades migratorias de los hGCs. Con el fin de comprender mejor los mecanismos moleculares subyacentes a la migración de células glioma, es esencial una capacidad para estudiar la interacción entre los hGCs y los axones dentro del microambiente tumoral. Con el fin de modelar esta interacción celular, desarrollamos un sistema de cultivo mixto que consiste en hGCs y ganglios de raíz dorsal (DRG) co-cultivos de axondrocitos. Las culturas DRG fueron seleccionadas porque pueden ser aisladas eficientemente y pueden formar las proyecciones largas y extensas que son ideales para estudios migratorios de esta naturaleza. Luego se añadieron oligodendrocitos de rata purificados en axones DRG de rata purificada e inducidos a mielinato. Después de confirmar la formación de mielina compacta, los hG ctuó finalmente se añadieron al cocultivo y sus interacciones con axones DRG y oligodendrocitos fueron monitoreados en tiempo real usando microscopía de lapso de tiempo. En estas condiciones, los hGCs forman estructuras agregadas similares a tumores que expresan GFAP y Ki67, migran a lo largo de pistas axonales mielinadas y no mielinizadas e interactúan con estos axones a través de la formación de pseudopodia. Nuestro sistema de cocultivo ex vivo se puede utilizar para identificar nuevos mecanismos celulares y moleculares de la migración de hGC y podría utilizarse potencialmente para pruebas in vitro de eficacia de fármacos.

Introduction

El glioblastoma es uno de los tumores más agresivos y letales del cerebro humano. El estándar actual de atención incluye la resección quirúrgica del tumor seguida de la radiación1 más la administración concomitante y adyuvante de temozolomida2. Incluso con este enfoque multiterapéutico, la recurrencia tumoral es inevitable3. Esto se debe en parte a la naturaleza migratoria extensa de las células tumorales, que invaden el parénquima cerebral creando múltiples proyecciones similares a los dedos dentro del cerebro4 que hacen improbable la resección completa.

En los últimos años, se ha puesto de manifiesto que la agresividad del glioblastoma se debe, en parte, a la presencia de una población de células madre cancerosas dentro de la masa tumoral5,6,que presentan un alto potencial migratorio7,8,resistencia a la quimioterapia y la radiación9,10 y la capacidad de formar tumores secundarios11. Los SSG son capaces de recapitular tumores policlonales originales cuando se xenoinjertan en ratones desnudos5.

A pesar de la riqueza de conocimientos sobre los antecedentes genéticos de los glioblastomas, los estudios sobre la migración de células gliomas (GC) se ven obstaculizados actualmente por la falta de modelos eficientes de migración in vitro o in vivo. En particular, mientras que las interacciones célula-axonal glioma moduladas por factores celulares y ambientales son un componente central de la invasión del glioma, hasta nuestro conocimiento actualmente no existe un sistema experimental con la capacidad de modelar estas interacciones12,13,14. Para hacer frente a esta deficiencia, desarrollamos un sistema de cultivo ex vivo de hGCs primarios co-cultivados con axon-oligodendrocitos DRG purificados que resulta en la expresión elevada de marcadores tumorales diferenciados, así como una amplia migración e interacción de hGCs con fibras mielinadas y no mielinizadas. Esta plataforma ex vivo, debido a su disposición compartimentada, es adecuada para probar los efectos de las nuevas terapias en los patrones de migración de hGC.,

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Protocol

Los protocolos para la recolección, aislamiento y propagación de células de glioma humano derivadas del paciente fueron aprobados por el comité de IRB del Hospital Rhode Island. Todos los animales fueron mantenidos de acuerdo con la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los protocolos de uso de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de Rhode Island.

1. Preparaciones de medios y tampón

  1. Preparar 50 mL de Neurosphere Media: 1x medio basal neuronal sin vitamina A, 1 suplemento sin suero sin vitamina A, 2 mM de L-glutamina, 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento básico de fibroblastos de 20 ng/ml (FGF), 2 g/ml de heparina y 1x antibiótico-antimicótico (antiantianti).
  2. Preparar 50 mL de medio basal neuronal suplementado: 1x medio basal neuronal, 1x suplemento libre de suero, 4 g/L D-glucosa, 2 mM de L-glutamina, y factor de crecimiento del nervio 50 ng/ml (NGF).
  3. Preparar 500 mL de N2B2 Medio: 1:1 Mezcla de nutrientes F12 de Dulbecco de Dulbecco,s Medium-Ham (DMEM-F12), 1x Insulina-Transferrina-Selenio (ITS-G), 66 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), 0,1 mg/ml de transferrina, 0,01 mg/ml de biotina, 6,29 mg/ml de progesterona, 5 g/ml de N-acetil-L-cistina (NAC) y 1 mM de putriscina. Aliquot y congelar a -20oC.
  4. Preparar 500 ml de C-Medio: 1x Medio Esencial Mínimo (MEM), D-glucosa (final 4 g/L), 10% suero bovino fetal (FBS) y 2 mM de L-glutamina. Aliquot y congelar a -20oC. Añadir factor de crecimiento nervioso (NGF) fresco antes de su uso (50 ng/ml).
  5. Preparar 200 ml de Papain Buffer: 1x Solución de Sal Equilibrada de Earle (EBSS), 100 mM Mg2SO4, 30% Glucosa, 0.25 M EGTA, y 1 M NaHCO3.
  6. Prepare 10 mL de DMEM-ITS-G Medio: 1x DMEM, 0.5% BSA, y 1x ITS-G.
  7. Preparar 200 ml de PB Buffer: 1 salina con fosfato de Dulbecco (DPBS) sin Ca2+ y Mg2+ y 0.5% BSA. Desgasifique el tampón antes de usarlo y manténgalo en hielo.

2. Aislamiento y cultivo de las Neuroesferas de Células Madre de Glioma

  1. Aislamiento de las neuroesferas
    1. Recoger el tejido de glioblastoma humano (GBM) aprobado por el IRB y el paciente consintió del quirófano. Transfiera muestras GBM sobre hielo en DPBS que contengan 2 x antianti a un gabinete de seguridad biológico certificado por BL2.
    2. Transfiera una muestra de 1 cmy 3 GBM con necrosis mínima o contaminación de glóbulos rojos a una placa de 60 mm y corte en 1 mm3 fragmentos; eliminar cualquier exceso de DPBS.
    3. Digerir el tejido con 5 ml de colagenasa/dispensa (1 mg/ml) durante 30 min a 37 oC y agitar suavemente el plato cada 5-10 min.
    4. Transfiera fragmentos digeridos a un tubo de 50 ml y triturar pipeteando con una pipeta de 10 ml varias veces para disociar el tejido.
    5. Añadir un volumen igual de Medios de La Neuroesfera y triturar el tejido de nuevo; permitiendo que los fragmentos grandes se asienten.
    6. Retire los medios sin fragmentos de tejido y pase lentamente a través de un colador de células de 70 m colocado sobre un tubo fresco de 50 ml.
    7. Repita los pasos 2.1.5-2.1.6 hasta que todo el tejido se haya disociado, cambiando el colador celular según sea necesario.
    8. Gire la suspensión de la celda a 110 x g durante 10 min.
    9. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 ml de tampón de levas aCK para eliminar la contaminación de los glóbulos rojos. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
    10. Gire la suspensión de la celda a 110 x g durante 5 min.
    11. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 10 ml de Neurosphere Media. Tomar 10 l de la suspensión celular y diluir con 10 s de trippan azul. Cuente 10 l de la suspensión celular utilizando un contador de células automatizado o hemocitómetro y placa en 10 ml de Neurosphere Media a una densidad de 3 x 106 celdas en placas de cultivo de suspensión de 100 mm.
    12. Añadir 2 mL de nuevos Medios de Neuroesfera al cultivo 2-3 veces a la semana.
      NOTA: Las neuroesferas se formarán en suspensión dentro de 3-4 semanas. Después de sumergirse 2-4 veces, confirme la talloza a través del ensayo de dilución limitante y la recapitulación tumoral mediante trasplante xenográfico en ratones inmunocomprometidos como se describió anteriormente 22.
  2. Neuroesferas subculantes
    1. Cuando las esferas se formen y alcancen un diámetro entre 200-500 m, transfiera las neuroesferas a un tubo de 15 ml y gire a 110 x g durante 5 min.
    2. Resuspenda las neuroesferas en 1 ml de solución de desprendimiento celular precalentada.
    3. Pasar a un tubo de 1,5 ml e incubar a 37oC durante 5 min.
    4. Ajuste una pipeta P200 a 150 l y triturar pipeteando hacia arriba y hacia abajo para disociar las neuroesferas.
    5. Transfiera las células disociadas a un tubo de 15 ml. Añadir 4 mL de Neurosphere Media y girar a 300 x g durante 5 min.
    6. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 5 ml de Neurosphere Media. Tomar 10 l de la suspensión celular y diluir con 10 s de trippan azul. Cuente 10 l de la suspensión celular utilizando un contador de celdas automatizado o hemocitómetro y una placa a una densidad de 1 x 106 células/60 mm de plato en un volumen final de 4 ml.
    7. Actualice los medios 2 veces a la semana y las celdas de subcultivo según sea necesario. Congele las neuroesferas enteras cuando se desee en medios basales neuronales sin vitamina A suplementada con 10% DMSO. Las neuroesferas se pueden utilizar para experimentos después de P4.

3. Cultivo compartimiento de Rat Dorsal Root Ganglia (DRGs), Oligodendrocitos (OPO) y hGCs

  1. Preparación de platos de cultivo compartimentados
    NOTA: Realice los siguientes pasos los días previos a la cosecha prevista de los DRG.
    1. Ensamblar platos de cultura compartimentados.
    2. Diluir la solución de calusía de colágeno a 500 g/ml en h2O destilado estéril; Homogeneizar.
    3. Con una pipeta de transferencia estéril, llene un plato de cultivo de 35 mm con 2 ml de solución de colágeno; retirar la solución, dejando una fina película de colágeno detrás y colóquela en el siguiente plato de 35 mm. Repita este proceso, añadiendo más solución de colágeno según sea necesario, hasta que todos los platos hayan sido recubiertos.
    4. Una vez recubiertas todas las placas, coloque las placas en una bandeja de cultivo de 245 mm x 245 mm y coloque tres almohadillas de gasa de 1 mm x 1 mm en el centro de la bandeja.
    5. Para polimerizar el colágeno, las gasas húmedas con 1 ml de hidróxido de amonio concentrado y cubrir las bandejas durante 15 min.
    6. Retire las almohadillas de gasa y deje que los platos de 35 mm se sequen en la campana de flujo laminar.
    7. Mientras los platos se están secando, cargue el barril del aplicador de grasa de la jeringa con grasa de alto vacío. Coloque las cámaras compartimentadas en una botella de papel de boca grande llena de agua destilada. Esterilice ambos autoclavey y deje enfriar.
    8. Archivo fuera del punto de un 18-G necesitado para hacer una punta contundente. Esterilice en 70% de etanol. Fije la aguja a la jeringa de grasa.
    9. Esterilice el rastrillo del pasador empapando en 70% de etanol; dejar que se seque al aire en la campana de flujo laminar.
    10. Retire la tapa de un plato seco recubierto de colágeno de 35 mm. Sostenga el plato entre el pulgar y el dedo puntero. Sostenga el rastrillo del pasador con la otra mano. Aplica una presión firme para crear incluso rasguños de 200 m de ancho a través del centro del plato.
    11. Usando una pipeta de pasto, coloca dos gotas de Medio Basal Neuronal Suplementado en el centro de los arañazos.
    12. Repita los pasos 3.1.10-3.1.11 hasta que todos los platos hayan sido rayados.
    13. Seque las cámaras compartimentadas en una campana de flujo laminar.
    14. Con fórceps hemostáticos estériles, agarre una cámara compartimientoada por el divisor central. Voltee los fórceps hemostáticos para que la parte inferior de la cámara esté mirando hacia arriba.
    15. Aplique grasa de silicona a la cámara compartimentada, comenzando en la parte superior. Asegúrese de que la grasa esté colocada cuidadosamente y se superponga en todas las esquinas.
    16. Retire la tapa de un plato de 35 mm. Invierta el plato y coloque los arañazos sobre la cámara. Toque hacia abajo en la parte inferior de la placa suavemente con un par de fórceps.
    17. Voltee suavemente la placa usando los fórceps hemostáticos. Suelta los fórceps.
    18. Coloque un montículo de grasa en la base del compartimento central. Llene cada cámara con el Medio Basal Neuronal Suplementario (NB) y compruebe si hay fugas. Selle las fugas con grasa de silicona según sea necesario.
    19. Continúe montando todos los platos de cultivo y almacene durante la noche a 37o, 5% CO2.
  2. Aislamiento de las neuronas y el cultivo de Rat DRG en la cámara compartimiento
    1. Sacrificar una rata embarazada embarazada Embarazada E16 Sprague-Dawley por asfixia porCO2 o por sobredosis química.
    2. Coloque el animal en posición supina sobre una superficie limpia; desinfectar el abdomen con 70% de etanol.
    3. Sujete la piel de la parte inferior del abdomen con fórceps y levante suavemente.
    4. Usando tijeras, hacer una incisión "I" a lo largo de la línea media del animal, teniendo cuidado de no perforar los músculos de la pared abdominal.
    5. Con un par limpio de fórceps, agarre la pared muscular y haga una incisión transversal con un par de tijeras limpias usando precaución para no perforar el útero o los intestinos.
    6. Con un par de fórceps contundentes, agarre el útero y levante suavemente directamente de la cavidad peritoneal.
    7. Usando tijeras frescas y estériles, sujeta el tejido conectivo en la base de cada cuerno uterino.
    8. Coloque todo el útero en un plato estéril de cultivo de tejido de 100 mm.
    9. Lleve el útero a una campana de flujo laminar para la disección.
    10. Retire los embriones del útero, uno a la vez, cortando a través del saco amniótico y burlándose suavemente del embrión hacia fuera y en un plato de 60 mm que contiene 5 ml de L-15 con 1x pluma-estreptococo.
    11. Con fórceps finos, coloque 3-4 embriones en un plato de 60 mm que contenga 5 ml de L-15 con 1 x pen-strep.
    12. Trabajando bajo un microscopio disección y con un embrión a la vez, eutanasia por decapitación.
    13. Acuéstese el lado ventral del embrión hacia arriba y retire las extremidades y la cola.
    14. Con fórceps finos, haga una incisión en la línea media en el animal.
    15. Retire los órganos y tejidos internos para exponer las estructuras dorsales, particularmente la médula espinal que debe ser visible al finalizar.
    16. Coloque una hoja de tijeras microdiselas entre la columna vertebral y el canal espinal y corte cuidadosamente a través de la columna vertebral para exponer la médula espinal. Tenga cuidado de no atravesar la médula espinal.
    17. Con fórceps finos, agarre ligeramente el extremo rostral de la médula espinal y saque lentamente del embrión. Los DRG se unirán a la médula espinal.
    18. Transfiera las médulas espinales y los DRG conectados a un plato de 35 mm que contenga 2 ml de L-15 con 1 x estreptococo. Colóquelo en el hielo.
    19. Una vez que todas las médulas espinales han sido aisladas, utilice fórceps finos para extraer individualmente los DRG de la médula espinal. Coloque los DRG en un plato fresco de 35 mm.
    20. Si las raíces nerviosas están presentes en los DRG, recórtalas.
    21. Retirar los platos preparados de 35 mm de la incubadora de 37oC, 5%CO2. Quite el medio del día anterior. Colocar 80 l de medios basales neuronales suplementarios (NBF) que contengan 10 M 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (FUDR) en el compartimiento central y 250 l de medios en cada compartimiento exterior.
    22. Coloque 2 ganglios en cada compartimento central. Devolver los platos a la incubadora de 37oC, 5%co2.
    23. Al día siguiente añadir 2,5 mL de NBF.
    24. Alimentar los cultivos siguiendo la programación en la Tabla 1, modificando la programación en función del día elegido para comenzar la preparación de DRG.
    25. El día 21 (o cuando los axones llegan al final de los compartimentos distales), ya sea cultivos de semillas con una neuroesfera GBM (Proceder al paso 3.2.26) y la imagen en vivo o mielinar los cultivos con cultivos de oligodendrocitos (Proceder al paso 3.3) y luego semilla con una neusfera GBM después de la mielinización.
    26. Reemplace el medio NB complementado en cada cámara compartimentada distal que se sembrará con una neurósfera GBM con un medio NB complementado que contenga 10% DE FBS.
    27. Con una pipeta P20 establecida en 10 l, retire una neurosfera GBM de la placa de cultivo. La neuroesfera GBM debe medir aproximadamente 200 micras de tamaño.
    28. Coloque la punta de la pipeta en la cámara distal y expulse la neurosfera GBM lentamente para que caiga suavemente sobre los axones en la porción de la cámara distal más cercana a la cámara central, sobre los axones cerca de la cámara central. Tenga cuidado de no dejar que la punta de la pipeta interrumpa los axons.
    29. Deje el cultivo en el armario de bioseguridad durante 1 h a temperatura ambiente para permitir que la neuroesfera GBM se adhiera.
    30. Una vez que la neuroesfera se haya unido, reemplace con mucho cuidado los medios en el compartimiento distal con el medio NB complementado.
    31. Cultivos de imágenes en vivo durante 3-7 días, añadiendo medios según sea necesario. En este caso, se utilizó un gabinete de células vivasco2 controlado conectado al microscopio (por ejemplo, Zeiss Axiovert) para monitorear continuamente la migración celular durante 7 días utilizando brightfield. Las imágenes se adquirieron cada 10 minutos utilizando el software asociado. Repita el mismo protocolo utilizando hGCs que han sido establemente transinfectados para expresar GFP y las imágenes fueron capturadas usando una combinación de campo brillante y láser de 488 nm.
      NOTA: Las neuroesferas pueden ser transducidas con lentivirus o transcitarse con plásmidos o siRNAs. Los compartimentos también pueden tratarse con inhibidores de moléculas pequeñas deseados para estudiar la migración.
  3. Mielinización de axones DRG con oligodendrocitos
    1. El día antes del aislamiento de oligodendrocitos, reemplace el medio NB en los DRG por C-Medium.
    2. Antes de la disección, coloque 10 ml de Papain Buffer en un plato de 60 mm en la incubadora para equilibrar.
    3. En una campana de flujo laminar, llene un plato de 100 mm y un plato de 60 mm con HBSS helado. Colocar en hielo.
    4. Sacrificar a un cachorro de rata P2 por decapitación. Retire la piel con un par de tijeras. Después de retirar la piel, corta el cráneo a lo largo de la línea media con un par de tijeras finas.
    5. Retire suavemente el cráneo con fórceps finos. Usando una espátula, saque suavemente el cerebro de la parte inferior del cráneo y transfiera a una tapa de la placa de cultivo de tejido invertido.
    6. Retire el cerebelo y divida el cerebro en dos hemisferios cerebrales. Retire los bulbos olfativos, el hipocampo y los ganglios basales debajo de la corteza cerebral de cada hemisferio. Coloque la corteza cerebral en la placa de 100 mm que contiene HBSS. Repita los pasos 3.3.4-3.3.6 para los animales restantes.
    7. Trabajando con una corteza a la vez, retire las meninges con fórceps Dumont finos. Coloque todas las corticas libres de meninges en platos frescos de 60 mm con HBSS.
    8. Corta el tejido cortical en 1 mm3 piezas. Colocar en hielo.
    9. Coloque el tampón de papaína equilibrado en un tubo de 15 ml. Añadir 200 unidades de papaína y 2 mg de L-cisteína. Filtrar esterilizar y añadir 200 l de DNase I estéril.
    10. Retire el HBSS del tejido cerebral cortado en cubos y sustitúyalo por Papain Buffer de 3.3.2. Colocar el plato en una incubadora de 37oC, 5% de CO2 durante 80 min, agitando suavemente cada 15 minutos.
    11. Transfiera el tejido digerido a un tubo de 50 ml y agregue 2 ml de C-medio.
    12. Triturar con una pipeta serológica de 5 ml para disociar el tejido; permitir que pedazos más grandes de tejido se asienten. Retire el sobrenadante y colóquelo en un tubo estéril de 15 ml.
    13. Añadir 2 mL de C-Medium y repetir la trituración con una pipeta serológica de 5 ml una vez más. Cambie a una punta de pipeta de 1 ml y triturar hasta que el tejido esté completamente disociado. Traslado al tubo de 15 ml.
    14. Gire el tejido triturado a 300 x g durante 15 min. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el pellet en 8 ml de DMEM-ITS-G Medium.
    15. Humedezca previamente un colador de células estéril de 30 m con 2 ml de búfer de PB. Coloque el colador de celda sobre un tubo de 50 ml y filtre la suspensión celular 1 ml a la vez. Enjuague el filtro con 5 ml de PB Buffer.
    16. Transfiera la suspensión celular a una placa bacteriológica de 100 mm; incubar durante 15 min en una incubadora de 37oC, 5%CO2 para permitir la adentradación de microglia.
    17. Retire el medio y colóquelo en un tubo de 15 ml. Enjuague la placa suavemente con 2 ml de medio DMEM-ITS-G y transfiera al tubo de 15 ml.
    18. Vuelva a suspender suavemente la suspensión celular. Tomar 10 l de la suspensión celular y diluir con 10 l de trippan azul. Cuente 10 l de la suspensión celular utilizando un contador de células automatizado o un hemocitómetro.
    19. Gire la suspensión de la celda a 300 x g durante 10 min.
    20. Aspirar completamente el sobrenadante y resuspender las células en 70 l de búfer de PB por cada 1 x 107 células. Mezclar bien e incubar a 4oC durante 10 min.
    21. Añadir 20 l de microperlas anti-A2B5 por cada 1 x 107 células. Mezclar bien e incubar a 4oC.
    22. Añadir 1-2 mL de búfer de PB por cada 1 x 107 celdas y centrífuga a 300 x g durante 10 minutos en una centrífuga de 4 oC.
    23. Aspirar sobrenadante completamente. Resuspenda hasta un total de 108 celdas en 500 l de búfer PB. Manténgase en hielo.
    24. Coloque una columna de cordón magnético en el campo magnético de un separador.
    25. Prepare la columna encerrando con 500 sL de PB Buffer. Aplique la suspensión de celda a la columna. Deseche el flujo en un contenedor de residuos (contiene celdas no etiquetadas).
    26. Lave la columna con 500 s l de búfer de PB 3 veces. Deseche el flujo.
    27. Retire la columna del separador magnético y colóquela en un tubo de recogida.
    28. Pipeta 1 mL de PB Buffer en la columna. Enjuague las células etiquetadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo en la columna.
    29. Añadir 4 ml de C-Medio a la fracción de celda y girar a 300 x g durante 10 min.
    30. Retire el sobrenadante y resuspenda en 5 ml de N2B2 Medium. Tomar 10 l de la suspensión celular y diluir con 10 s de trippan azul. Cuente 10 s de la suspensión celular utilizando un contador de células automatizado o un hemocitómetro.
    31. Placa de oligodendrocitos a una concentración de 150.000 células por cámara compartimentada que contiene un DRG con axones completamente extendidos.
    32. Al día siguiente cambie el soporte de la cámara compartimentada a N2B2 para permitir la mielinización. Reemplace el soporte cada 2-3 días. La mielinización estará completa en 14 días.
    33. El día 14, cultivo de semillas con una neurosfera GBM como en 3.2.26-3.2.32. Mantener cultivos mielinizados en N2B2 Medium durante cualquier experimento.
      NOTA: El protocolo se presenta como un esquema de diagrama de flujo en la Figura 1.

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Representative Results

Con el fin de estudiar la interacción de hGCs con axons, generamos axónDRes DRG purificados como se describió anteriormente15,16,17,18. Estos axones DRG purificados fueron sembrados con hGCs, que formaron estructuras tipo tumor GFAP+/Ki67+ integradas dentro de la red axonal, mientras que los hCC individuales migraron en asociación o entre los axones (Figura 2). Para determinar cómo interactúan los hGCs con los axones mielinados, sembramos cultivos de axón DRG con oligodendrocitos de rata purificados y mielinización inducida como se describió anteriormente19,20,21. La adición de hGCs en los cocultivos mielinizados de DRG-oligodendrocitos mostró que los hGCs migran en asociación con los axones mielinados y lejos de la masa tumoral a través de la formación de pseudopodia como se muestra en nuestro reciente artículo(Figura 3)22. La mielinización de oligodendrocitos se puede determinar mediante la tinción de la proteína básica de mielina (MBP) de los cultivos. Para cuantificar la migración de hGCs en estas culturas medimos el área total de la cultura ocupada por los hGCs migratorios utilizando el software Image J22.

Lunes Miércoles Viernes
DIA 1 NBF
SEMANA 1 Nb NBF Nb
SEMANA 2 NBF Nb Nb
SEMANA 3 Nb Nb

Tabla 1: Horario de alimentación de los cultivos DRG.

Figure 1
Figura 1: Resumen esquemático del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: los hGCs forman estructuras similares a tumores en la cocultura con axones DRG. El cultivo fue fijado y manchado para los marcadores tumorales GFAP (rojo) y Ki67 (verde), mientras que los axones estaban manchados con Neurofilamento (azul). Barra de escala: 200 m. Esta cifra ha sido modificada de nuestro artículo22publicado recientemente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: los hGCs migran a lo largo de pistas axonales mielinadas. los hGC que expresan la proteína fluorescente verde (GFP) migran a lo largo de las pistas axonales mielinadas teñidas de rojo para MBP en el sistema de cultivo de hGC-DRG-oligodendrocitos. Barra de escala: 200 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los estudios de migración para hGCs se pueden realizar mediante el uso de sistemas de cámara Boyden o ensayos de arañazos. Sin embargo, mientras que estos experimentos no proporcionan ninguna información sobre las interacciones de las células tumorales con otros tejidos circundantes, el sistema actual puede recapitular las interacciones de GC con fibras mielinadas y no mielinizadas. Además, para estudiar la formación de tumores y la migración de punto final, cultivos de rodajas organotípicas del cerebro de roedores o implantación in vivo de células de glioma en el cerebro o flanco de roedores se han utilizado previamente23,24,25. Los esfuerzos más recientes en el modelado tridimensional de células glioma han utilizado sistemas como las capas de colágeno26,27,28, andamios a base de astrocitos29,30, capas de matriz extracelular31, nanofibras electrospun32e hidrogeles33. Si bien estos experimentos producen resultados satisfactorios de punto final con respecto a la migración, carecen de la capacidad de ser estudiados en tiempo real por microscopía de alta resolución.

Aquí, hemos demostrado un nuevo enfoque para estudiar la migración de hGCs mediante la preparación de un cocultivo DRG en una cámara compartimiento. Si el acceso al tejido GBM fresco está disponible, los hGCs se pueden aislar y cultivar de forma fiable. Aunque los hGCs tardan mucho tiempo en formar neuroesferas inicialmente, las culturas son fáciles de mantener y subcultura una vez que se forman las esferas. Para asegurar el éxito del cultivo hGC, el tejido debe procesarse lo más rápido posible. El tiempo entre la resección y el procesamiento debe minimizarse tanto como sea posible, y las muestras siempre deben transportarse sobre hielo.

El DRG también es fácil de aislar, extiende sus axones más tiempo que las neuronas corticales y se puede mielinar fácilmente en cultivo con oligodendrocitos. Las neuroesferas hGC o hGC disociados se cultivan en los compartimentos distales de las cámaras, lo que permite imágenes celulares vivas y cuantificación en tiempo real de interacciones celulares con axones y fibras mielinadas. Además, este protocolo no se limita sólo a los cultivos DRG, ya que las neuronas corticales también pueden ser aisladas y mielinadas con pocas modificaciones a este protocolo. Este modelo también se puede utilizar para estudiar otras formas de cáncer cerebral.

Mientras que el DRG es relativamente fácil de aislar y mantener, la adición de la cámara compartimientoa consume mucho tiempo y crea una multitud de limitaciones técnicas que requieren entrenamiento y práctica para tener éxito. Crítico para el éxito de este protocolo es el recubrimiento uniforme de colágeno y el rasguño de los platos de cultivo porque el colágeno desigual o excesivamente grueso tiende a pelar. También se debe tener mucho cuidado al colocar grasa de silicona en las cámaras compartimentadas. Si no se utiliza presión uniforme durante la dosificación de la grasa de silicona, habrá huecos a lo largo de la parte inferior de la cámara compartimientoa que requerirán sellado con exceso de grasa para evitar fugas de medios. Además, se debe utilizar una presión mínima al adherir las cámaras compartimentadas al suelo del plato de cultivo. Si los axones no se cruzan del compartimento central después de la semana uno y el DRG se ve de otra manera saludable, es probable que se haya aplicado demasiada presión al colocar la cámara compartimientoa o se haya utilizado una cantidad excesiva de grasa.

La migración de hGC a lo largo de las vías axonales mielinadas y no mielinizadas en el cerebro no ha sido bien descrita debido a la falta de modelos ex vivo eficientes y reproducibles. Aquí describimos el desarrollo de un innovador sistema de cultivo ex vivo para estudiar cómo las células del glioma migran a lo largo de los axones y la mielina, un componente crucial en el desarrollo de nuevos tratamientos que se dirigen específicamente a la migración de células tumorales. Nuestro sistema de cultivo es versátil ya que existe un aislamiento fluido entre compartimentos, facilitando la capacidad de estudiar diversos tratamientos novedosos o diferentes concentraciones de sustancias que afectan a la migración de células gliomas. Una ventaja adicional de nuestro sistema de cocultura es la capacidad de monitorear la migración de hGC y los efectos de los diversos tratamientos en tiempo real. El protocolo descrito aquí se está utilizando actualmente como base para el desarrollo de sistemas ex vivo sin dimensiones biméticos más sofisticados utilizando exclusivamente componentes celulares humanos que podrían utilizarse para evaluar la toxicología y la eficacia de nuevos fármacos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por fondos internos del Departamento de Neurocirugía de la Universidad De Brown a N.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Suspension Culture Dish Corning 430591
2.5S NGF ENVIGO B.5025
60 mm Suspension Culture Dish Corning 430589
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher A1049201
Ammonium Hydroxide Solution Fisher Scientific A669-500 Concentrated
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech AF-100-18B
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat Miltenyi Biotec 130-093-392
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher 15240062
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) Miltenyi Biotec 130-091-222
B27 Supplement Thermo Fisher 17504044
B27 Supplement, minus vitamin A Thermo Fisher 12587001
Bacteriological Plate BD Falcon 351029
Biotin Sigma B4639
BSA Sigma A9418
Campenot Chamber Tyler Research CAMP-10
Cell Culture Dish Corning 430165 35mm X 10mm
Cell Strainer BD Falcon 352350 70 uM, Nylon
Cell Strainer BD Falcon 352340 30 uM, Nylon
Collagenase/Dispase Roche 11097113001
Cultrex Rat Collagen I Trevigen 3440-100-01
D-Glucose Sigma G5146
DMEM Thermo Fisher 10313021
DNase I Sigma D7291
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Scientific 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5045
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat
EBSS Sigma E7510
EGTA Sigma E3889
FBS Hyclone SH30070.02
FUDR Sigma F0503
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35050061
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher 11765054
HBSS Thermo Fisher 14175095
Hemostatic Forceps Roboz RS-7035
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS Stem Cell Technologies 07980
Hypodermic Needle, 18G BD 511097
Insulin-Transferrin-Selenium G Thermo Fisher 41400045
L-Cysteine Sigma C7477
L-Glutamine Thermo Fisher 25030081
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MEM Thermo Fisher 1190081
Mg2SO4 Sigma M2643
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MS Columns plus tubes Miltenyi Biotec 130-041-301
NAC Sigma A8199
NaHCO3 Sigma S5761
Neurobasal Medium Thermo Fisher 21103049
Neurobasal-A Medium Thermo Fisher 10888022
Ordinary forceps
P2 Sprague Dawley Rat Pups
Papain Worthington LS003126
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140148
Pin Rake Tyler Research CAMP-PR
Progesterone Sigma P8783
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher A1110501
Syrine Grease Applicator Tyler Research CAMP-GLSS
Transferrin Sigma T2036
Uridine Sigma U3003

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Cancer Research Número 154 Células madre de Glioma migración modelo ex vivo cocultura axones DRG mielina
Monitoreo en tiempo real de la migración de células de glioma humano en cocultivos de axón-oligodendrocitos de ganglios de raíz dorsal
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