Summary
Her presenterer vi en ex-vivo blandet monolag kultur system for studiet av menneskelig glioma celle (hGC) migrasjon i sanntid. Denne modellen gir muligheten til å observere interaksjoner mellom hGCs og både myelinated og ikke-myelinated axons i et compartmentalized kammer.
Abstract
Glioblastom er en av de mest aggressive menneskelige kreft på grunn av omfattende mobilnettet heterogenitet og migrasjon egenskapene til hGCs. For å bedre forstå den molekylære mekanismer underliggende glioma celle migrasjon, en evne til å studere samspillet mellom hGCs og axons innen tumor mikromiljøet er avgjørende. For å modellere dette mobilnettet interaksjon, utviklet vi et blandet kultur system bestående av hGCs og rygg root ganglia (DRG) axon-oligodendrocyte co-kulturer. DRG kulturer ble valgt fordi de kan isoleres effektivt og kan danne den lange, omfattende anslag som er ideelle for migrasjon studier av denne art. Renset rotten oligodendrocytes var så addert opp på renset rotten DRG axons og indusert å myelinate. Etter å ha bekreftet dannelsen av kompakte myelin, hGCs ble til slutt lagt til co-kulturen og deres interaksjon med DRG axons og oligodendrocytes ble overvåket i sanntid ved hjelp av time-lapse mikroskopi. Under disse forholdene, hGCs form tumor-lignende samlet strukturer som uttrykker GFAP og Ki67, migrere langs både myelinated og ikke-myelinated axonal spor og samhandle med disse axons gjennom dannelsen av pseudopodia. Vår ex vivo co-kultur system kan brukes til å identifisere romanen cellulære og molekylære mekanismer av hGC migrasjon og kan potensielt brukes til in vitro narkotika effektivitet testing.
Introduction
Glioblastom er en av de mest aggressive og dødelige svulster i den menneskelige hjerne. Gjeldende standard for omsorg inkluderer kirurgisk reseksjon av svulsten etterfulgt av stråling1 pluss samtidig og adjuvant administrering av temozolomid2. Selv med denne multi-terapeutiske tilnærmingen, er tumor gjentakelse uunngåelig3. Dette er delvis på grunn av den omfattende trekk karakter av tumorceller, som invaderer hjernen parenchyma skape flere finger-lignende anslag i hjernen4 som gjør fullstendig reseksjon usannsynlig.
I de senere årene har det blitt klart at aggressivitet av glioblastom skyldes, delvis, til tilstedeværelsen av en populasjon av kreft stamceller i tumor massen5,6, som viser høy vandrende potensial7,8, motstand mot kjemoterapi og stråling9,10 og evnen til å danne sekundære svulster11. GSCs er dugelig av recapitulating original polyklonale svulst når xenografted å Nude mus5.
Til tross for vell av kunnskap om genetisk bakgrunn av glioblastomas, studier på glioma celle (GC) migrasjon er for tiden hindret av mangel på effektive in vitro eller in vivo migrasjon modeller. Spesielt, mens glioma celle-axonal interaksjoner modulert av cellulære og miljømessige faktorer er en kjernekomponent i glioma invasjon, til vår kunnskap er det for tiden ingen eksperimentelle system med mulighet til å modellere disse interaksjoner12,13,14. For å møte denne mangelen, utviklet vi en ex vivo kultur system av primære hGCs co-kultivert med renset DRG axon-oligodendrocytes som resulterer i forhøyet uttrykk for differensiert tumor markører samt omfattende migrasjon og samhandling av hGCs med myelinated og ikke-myelinated fibre. Denne ex vivo-plattformen, på grunn av sin compartmentalized layout, er egnet for å teste virkningene av romanen legemiddel selskap på hGC migrasjon mønstre.,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollene for innsamling, isolering, og forplantning av pasient-avledet menneskelige glioma celler ble godkjent av IRB komité Rhode Island Hospital. Alle dyrene ble opprettholdt i henhold til NIH guide for Stell og bruk av Laboratoriedyr. Alle dyr bruk protokoller ble godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee of Rhode Island Hospital.
1. Media og buffer forberedelser
- Forbered 50 mL Neurosphere Media: 1x neuronal basal medium w/o vitamin A, 1x serum gratis supplement w/o vitamin A, 2 mM L-glutamin, 20 ng/mL epidermal vekstfaktor (EGF), 20 ng/mL Basic-Fibroblast vekstfaktor (FGF), 2 μg/mL heparin, og 1x antibiotika-antimykotisk (anti-anti).
- Forbered 50 mL supplert neuronal basal medium: 1x neuronal basal medium, 1x serum fritt supplement, 4 g/L D-glukose, 2 mM L-glutamin, og 50 ng/mL nerve vekstfaktor (NGF).
- Forbered 500 mL N2B2 medium: 1:1 Dulbecco ' s modifisert Eagle medium-skinke ' s F12 næringsstoff blanding (DMEM-F12), 1x insulin-transferrin-selen (ITS-G), 66 mg/mL storfe serum albumin (BSA), 0,1 mg/mL transferrin, 0,01 mg/mL biotin, 6,29 mg/mL progesteron, 5 μg/mL N-acetyl-L-cystin (NAC), og 1 mM putriscine. Alikvot og fryse ved-20 ° c.
- Forbered 500 mL av C-medium: 1x minimum essensiell medium (MEM), D-glukose (siste 4 g/L), 10% fosterets storfe serum (FBS), og 2 mM L-glutamin. Alikvot og fryse ved-20 ° c. Tilsett nerve vekstfaktor (NGF) fersk før bruk (50 ng/mL).
- Forbered 200 mL Papain buffer: 1x Earle ' s balansert salt løsning (EBSS), 100 mM mg2så4, 30% GLUKOSE, 0,25 M EGTA, og 1 M NaHCO3.
- Forbered 10 mL DMEM-ITS-G medium: 1x DMEM, 0,5% BSA og 1x ITS-G.
- Forbered 200 mL av PB buffer: 1x Dulbecco ' s fosfat-bufret saltvann (DPBS) uten ca2 + og mg2 + og 0,5% BSA. Degas av buffer før bruk og holde på isen.
2. isolering og kultur av glioma Stem Cell Neurospheres
-
Isolering av Neurospheres
- Samle IRB godkjent og pasienten samtykket fersk humant glioblastom (GBM) vev fra operasjonsstuen. Overfør GBM-prøver på is i DPBS som inneholder 2x anti-anti til et BL2-sertifisert biologisk sikkerhetskabinett.
- Overfør en 1 cm3 GBM prøve med minimal nekrose eller røde blodlegemer forurensning til en 60 mm plate og skåret i 1 mm3 fragmenter; fjerne overflødig DPBS.
- Fordøye vevet med 5 mL kollagenase/dispase (1 mg/mL) i 30 min ved 37 ° c og forsiktig virvler parabolen hver 5-10 min.
- Overfør fordøyd fragmenter til en 50 mL rør og triturate ved pipettering med en 10 mL pipette flere ganger for å distansere vevet.
- Legg til et lik volum av Neurosphere Media og triturate vevet igjen; slik at store fragmenter å bosette seg.
- Fjern medier uten vevs fragmenter og passere langsomt gjennom en 70 μM celle sil plassert over en frisk 50 mL tube.
- Gjenta trinn 2.1.5-2.1.6 til alt vevet har blitt dissosiert, endre celle sil etter behov.
- Snurr celle fjæringen på 110 x g i 10 min.
- Fjern supernatanten og resuspend pellet i 10 mL av ACK lysering buffer for å fjerne røde blodlegemer forurensning. Ruge i 10 minutter ved romtemperatur.
- Snurr celle fjæringen på 110 x g i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og resuspend celler i 10 mL Neurosphere Media. Ta 10 μL av celle fjæringen og fortynne med 10 μL av trypan blå. Tell 10 μL av celle fjæringen ved hjelp av en automatisert celle teller eller hemocytometer og plate i 10 mL Neurosphere Media ved en tetthet på 3 x 106 celler i 100 mm fjærings kultur plater.
- Tilsett 2 mL fersk Neurosphere Media til kulturen 2-3 ganger i uken.
Merk: Neurospheres vil danne suspensjon innen 3-4 uker. Etter subculturing for 2-4 ganger, bekrefter stemness via begrensende fortynning analysen og tumor recapitulation via xenographic transplantasjon i immunsupprimerte mus som tidligere beskrevet 22.
-
Sub-dyrking Neurospheres
- Når kulene dannes og når en diameter mellom 200-500 μm, overføres neurospheres til et 15 mL rør og spinner ved 110 x g i 5 min.
- Resuspend neurospheres i 1 mL pre-varmet celle avløsning løsning.
- Overføring til 1,5 mL rør og ruge ved 37 ° c i 5 min.
- Sett en P200 pipette til 150 μL og triturate ved pipettering opp og ned til distansere neurospheres.
- Overfør dissosiert celler til et 15 mL rør. Tilsett 4 mL Neurosphere Media og snurr på 300 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspend celler i 5 mL Neurosphere Media. Ta 10 μL av celle fjæringen og fortynne med 10 μL av trypan blå. Tell 10 μL av celle fjæringen ved hjelp av en automatisert celle teller eller hemocytometer og plate i en tetthet på 1 x 106 celler/60 mm rett i et endelig volum på 4 ml.
- Oppdater Media 2 ganger i uken og under kultur celler etter behov. Frys hele neurospheres når ønskelig i neuronal basal Media w/o vitamin A supplert med 10% DMSO. Neurospheres kan brukes til eksperimenter etter P4.
3. compartmented kultur av Rat rygg rot ganglia (DRGs), Oligodendrocytes (OPCs) og hGCs
- Utarbeidelse av compartmented kultur retter
Merk: Utfør følgende trinn dagene før den planlagte innhøstingen av DRGs.- Monter compartmented kultur retter.
- Fortynnet kollagen lagerløsning på 500 μg/mL i steril destillert H2O; Bland godt.
- Med en steril overførings pipette fyller du en 35 mm kultur rett med 2 mL kollagen oppløsning; fjerne løsningen, etterlot seg en tynn film av kollagen bak og plassere den i neste 35 mm parabolen. Gjenta denne prosessen, legge til mer kollagen løsning etter behov, inntil alle rettene er belagt.
- Når alle platene er belagt, plasser platene i et 245 mm x 245 mm kultur magasin og Legg tre 1 mm x 1 mm gasbind pads i midten av skuffen.
- For å polymeres kollagen, våte gasbind pads med 1 mL konsentrert ammonium natriumhydroksid og dekke brettene i 15 min.
- Fjern gasbind pads og la 35 mm retter tørke i laminær Flow panseret.
- Mens rettene tørker, Last sylinderen på sprøyte fett applikator med høyt vakuum fett. Plasser compartmented kamre i en stor munn Media flaske fylt med destillert vann. Sterilisere både ved autoklavering og la avkjøles.
- Fil av poenget med en 18-G Needled å lage en stump spissen. Sterilisere i 70% etanol. Fest kanylen til fett sprøyten.
- Sterilisere PIN rake ved soaking i 70% etanol; la den lufttørke i den laminær strømnings panseret.
- Fjern lokket fra en tørr, kollagen belagt 35 mm parabolen. Hold parabolen mellom tommelen og pekefingeren. Hold PIN rake med den andre hånden. Påfør et fast press for å skape enda 200 μM brede riper over midten av fatet.
- Ved hjelp av en beite pipette, plassere to dråper supplert neuronal basal medium i midten av riper.
- Gjenta trinn 3.1.10-3.1.11 til alle rettene er riper.
- Tørk compartmented kamre i en laminær strømnings hette.
- Med steril hemostatic tang, ta tak i ett compartmented kammer ved Senter skille ren. Vend hemostatic tang slik at bunnen av kammeret vender opp.
- Påfør silikon fett til compartmented kammer, som starter på toppen. Sørg for at fett er plassert pent og overlapper i alle hjørner.
- Fjern lokket fra en 35 mm rett. Inverter fatet og plassere riper over kammeret. Trykk ned på undersiden av platen forsiktig med et par tang.
- Vend forsiktig platen over ved hjelp av hemostatic tang. Slipp Tangen.
- Plasser en haug med fett i bunnen av senter rommet. Fyll hvert kammer med supplert neuronal basal medium (NB) og sjekk for lekkasjer. Forsegle lekkasjer med silikon fett etter behov.
- Fortsett å montere alle kultur retter og lagre over natten på 37 °, 5% CO2.
- Isolering av Rat DRG neurons og kultur i compartmented Chamber
- Ofre en tidsbestemt gravid E16 Sprague-Dawley rotte av CO2 kvelning eller ved kjemisk overdose.
- Plasser dyret i liggende posisjon på en ren overflate; desinfisere magen med 70% etanol.
- Ta tak i huden på nedre del av magen med pinsett og løft forsiktig.
- Bruke saks, lage en "jeg" innsnitt langs midtlinjen av dyret, ta vare ikke å punktering musklene i bukveggen.
- Med en ren par tang, ta tak i muskel veggen og gjøre en tverrgående snitt med en ren saks ved hjelp av forsiktighet for ikke å stikke hull i livmoren eller tarmen.
- Med et par sløv tang, ta tak i livmoren og løft rett opp ut av bukhulen.
- Ved hjelp av friske, sterile saks, klippet bindevev ved foten av hver livmor horn.
- Plasser hele livmoren i en steril 100 mm vev kultur parabolen.
- Bær livmoren til en laminær strømnings hette for disseksjon.
- Fjern embryo fra livmoren, en om gangen, ved klipping gjennom fostervann SAC og forsiktig teasing fosteret ut og inn i en 60 mm parabolen inneholder 5 mL av L-15 med 1x penn-strep.
- Med fin tang, plass 3-4 embryo i en 60 mm parabolen inneholder 5 mL av L-15 med 1x penn-strep.
- Arbeide under et dissekere mikroskop og med ett embryo om gangen, euthanize av halshogging.
- Lie embryo ventrale side opp og fjerne lemmer og hale.
- Med fine tang, lage et midtlinjen snitt i dyret.
- Fjern indre organer og vev for å avdekke rygg konstruksjoner, spesielt ryggmargen som skal være synlig ved ferdigstillelse.
- Plasser ett blad av mikro-dissekere saks mellom vertebrale kolonnen og spinal kanalen og forsiktig skjære gjennom vertebrale kolonnen for å avdekke ryggmargen. Pass på at du ikke klipper gjennom ryggmargen.
- Med fin tang, lett gripe den rostral enden av ryggmargen og langsomt løfte ut av fosteret. DRGs vil bli festet til ryggmargen.
- Overfør rygg snorer og festet DRGs til en 35 mm rett som inneholder 2 ml L-15 med 1x penn-strep. Plasser på isen.
- Når alle spinal ledninger har blitt isolert, bruk fine tang til individuelt plukke DRGs fra ryggmargen. Plasser DRGs i en fersk 35 mm rett.
- Hvis nerverøtter er til stede på DRGs, klipp dem bort.
- Fjern forberedt 35 mm retter fra 37 ° c, 5% CO2 inkubator. Fjern mediet fra forrige dag. Plasser 80 μL av supplert neuronal basal Media (NBF) som inneholder 10 μM 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR) i senter rommet og 250 μL av medier i hvert ytter rom.
- Plasser 2 ganglia i hvert senter rom. Retur retter til 37 ° c, 5% CO2 inkubator.
- Dagen etter legger 2,5 mL av NBF.
- Feed kulturene etter planen i tabell 1, endre planen basert på den dagen valgt å starte DRG prep.
- På dag 21 (eller når axons når slutten av den som er i front), enten seedet kulturer med en GBM neurosphere (Fortsett til trinn 3.2.26) og levende bilde eller myelinate kulturer med oligodendrocytes kulturer (Fortsett til trinn 3,3) og deretter frø med en GBM neurosphere etter myelination.
- Skift ut supplert NB medium i hvert enkelt compartmented kammer som vil bli sådd med en GBM neurosphere med supplert NB medium som inneholder 10% FBS.
- Med en P20 Pipetter satt til 10 μL, Fjern en GBM neurosphere fra kultur fatet. GBM-neurosphere skal måle omtrent 200 mikron i størrelse.
- Plasser tuppen på pipette i det fjerne kammeret og fjern GBM-neurosphere langsomt slik at den forsiktig faller på axons i den delen av det fjerne kammeret som er nærmest midten kammer, over axons nær sentrum kammeret. Vær forsiktig så du ikke lar pipette spissen forstyrre axons.
- La kulturen i biosafety kabinett for 1 time ved romtemperatur slik at GBM neurosphere å feste.
- Når neurosphere har festet, må du nøye bytte ut mediene i det store rommet med et supplert NB medium.
- Levende bilde kulturer for 3-7 dager, legge til medier etter behov. I dette tilfellet er en kontrollert CO2 Live celle kabinett festet til mikroskopet (f. eks, Zeiss Axiovert) ble brukt til kontinuerlig overvåke celle migrasjon i 7 dager ved hjelp av brightfield. Bilder ble kjøpt hver 10 min bruker tilhørende programvare. Gjenta den samme protokollen ved hjelp av hGCs som har vært stabilt transfekterte å uttrykke GFP og bilder ble tatt ved hjelp av en kombinasjon av brightfield og 488 NM laser.
Merk: Neurospheres kan være transduced med lentivirus eller transfekterte med plasmider eller siRNAs. Rom kan også behandles med ønsket små molekyl hemmere å studere migrasjon.
- Myelination av DRG-axons med Oligodendrocytes
- Dagen før oligodendrocyte isolasjon, Skift ut NB medium i DRGs med C-medium.
- Før disseksjon, plasser 10 mL Papain buffer i en 60 mm rett i inkubator til likevekt.
- I en laminær strømnings hette, fyll 1 100 mm parabol og 1 60 mm rett med iskald HBSS. Plasser på isen.
- Ofring en P2 rotten pup av halshogging. Fjern huden ved hjelp av en saks. Etter at huden er fjernet, kutt skallen langs midtlinjen med et par fine saks.
- Forsiktig fjerne skallen med fine tang. Ved hjelp av en slikkepott, forsiktig scoop hjernen fra bunnen av skallen og overføre til en invertert vev kultur plate lokket.
- Fjern lillehjernen og dele cerebrum i to cerebral halvkule. Fjern olfactory pærer, hippocampus, og basal ganglia under hjernebarken på hver halvkule. Plasser cerebral cortex i 100 mm parabolen inneholder HBSS. Gjenta trinn 3.3.4-3.3.6 for de resterende dyrene.
- Arbeide med en cortex om gangen, fjerne hjernehinnene med fine Dumont tang. Plasser alle hjernehinnene-frie barken i friske 60 mm retter med HBSS.
- Terninger det kortikale vevet inn i 1 mm3 stk. Plasser på isen.
- Plasser equilibrated Papain buffer i en 15 mL tube. Tilsett 200 enheter av Papain og 2 mg L-cystein. Filteret steriliseres og tilsett 200 μL av sterile DNase I.
- Fjern HBSS fra terninger hjernevevet og erstatte med Papain buffer fra 3.3.2. Plasser parabolen i 37 ° c, 5% CO2 inkubator for 80 min, forsiktig risting hver 15 min.
- Overfør det fordøyd vevet til en 50 mL rør og tilsett 2 mL C-medium.
- Triturate med en 5 mL serologisk pipette for å distansere vevet; tillate større biter av vev å bosette seg. Fjern supernatanten og plasser dem i et sterilt 15 mL rør.
- Tilsett 2 mL C-medium og gjenta trituration med en 5 mL serologisk pipette en gang til. Bytt til en 1 mL pipette spissen og triturate til vevet er helt dissosiert. Overføring til 15 mL rør.
- Snurr triturated vevet ved 300 x g i 15 min. Fjern forsiktig supernatanten og resuspend pellet i 8 ml DMEM-Its-g medium.
- Pre-Wet en steril 30 μM celle sil med 2 mL PB buffer. Plasser celle sil over et 50 mL rør og Filtrer celle fjæringen 1 mL om gangen. Skyll filteret med 5 mL PB buffer.
- Overfør celle fjæringen til en 100 mm bakteriologiske plate; ruge for 15 min i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator for å tillate mikroglia å feste.
- Fjern mediet og plasser det i et 15 mL rør. Skyll platen forsiktig med 2 mL DMEM-ITS-G medium og Overfør til 15 mL rør.
- Resuspend celle fjæringen forsiktig. Ta 10 μL av celle fjæringen og fortynne med 10 μL av trypan blå. Tell 10 μL av celle fjæringen ved hjelp av en automatisert celle teller eller hemocytometer.
- Snurr celle fjæringen på 300 x g i 10 min.
- Aspirer supernatanten helt og resuspend celler i 70 til μL av PB buffer for hver 1 x 107 celler. Bland godt og ruge ved 4 ° c i 10 min.
- Tilsett 20 μL av anti-A2B5 mikroperler for hver 1 x 107 celler. Bland godt og ruge ved 4 ° c.
- Tilsett 1-2 mL PB buffer for hver 1 x 107 celler og sentrifuger ved 300 x g i 10 min i en 4 ° c sentrifuge.
- Aspirer supernatanten helt. Resuspend opp til totalt 108 celler i 500, ΜL av PB buffer. Fortsett isen.
- Plasser en magnetisk perle spalte i det magnetiske feltet i et skilletegn.
- Klargjør kolonnen ved å skylle med 500 μL av PB buffer. Påfør celle fjæringen til kolonnen. Kast gjennomstrømningsmengde i en avfallsbeholder (dette inneholder celler med un-merket).
- Vask kolonnen med 500 μL av PB buffer 3 ganger. Kast gjennomstrømning.
- Fjern kolonnen fra magnet skilletegnet og plasser i et oppsamlings rør.
- Pipetter 1 mL PB buffer på søylen. Skyll de magnetisk merkede cellene ved å skyve stempelet godt inn i kolonnen.
- Tilsett 4 mL C-medium til celle fraksjonen og snurr på 300 x g i 10 min.
- Fjern supernatanten og resuspend i 5 mL N2B2 medium. Ta 10 μL av celle fjæringen og fortynne med 10 μL av trypan blå. Tell 10 μL av celle fjæringen ved hjelp av en automatisert celle teller eller hemocytometer.
- Plate oligodendrocytes ved en konsentrasjon på 150 000 celler per compartmented kammer som inneholder en DRG med fullt utvidet axons.
- Dagen etter endrer mediene i compartmented kammeret til N2B2 for å muliggjøre myelination. Erstatt Media hver 2-3 dager. Myelination vil være ferdig om 14 dager.
- På dag 14, frø kultur med en GBM neurosphere som i 3.2.26-3.2.32. Oppretthold myelinated kulturer i N2B2 medium for varigheten av eventuelle eksperimenter.
Merk: protokollen presenteres som en flytskjema skjematisk i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å studere samspillet av hGCs med axons, genererte vi renset DRG axons som tidligere beskrevet15,16,17,18. Disse renset DRG axons ble deretter sådd med hGCs, som dannet GFAP +/Ki67 + tumor-lignende strukturer integrert i axonal nettverket, mens enkelte hGCs migrert enten i foreningen eller mellom axons (figur 2). Å avgjøre hvor hGCs påvirke hverandre gjensidig med myelinated axons, vi seeded DRG axon kulturen med renset rotten oligodendrocytes og indusert myelination idet tidligere beskrevet19,20,21. Tilsetting av hGCs på myelinated DRG-oligodendrocyte co-kulturer viste at hGCs migrere i samarbeid med myelinated axons og bort fra tumor massen gjennom dannelsen av pseudopodia som vist i våre siste papir (Figur 3)22. Oligodendrocyte myelination kan bestemmes ved hjelp av myelin Basic protein (MBP) farging av kulturer. For å kvantifisere migrasjon av hGCs i disse kulturene målte vi det totale arealet av kulturen okkupert av migrerer hGCs ved hjelp av image J programvare22.
| Mandag | Onsdag | Fredag | |
| DAG 1 | Nbf | ||
| UKE 1 | Nb | Nbf | Nb |
| UKE 2 | Nbf | Nb | Nb |
| UKE 3 | Nb | Nb |
Tabell 1: fôring tidsplan for DRG kulturer.
Figur 1: skjematisk oppsummering av protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: hGCs form tumor-lignende strukturer i co-kultur med DRG axons. Kulturen var fast og beiset for tumor markører GFAP (rød) og Ki67 (grønn), mens axons ble farget med Neurofilament (blå). Scale bar: 200 μm. Dette tallet har blitt endret fra vår nylig publisert papir22. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: hGCs migrere langs myelinated axonal spor. hGCs uttrykker den grønne fluorescerende protein (GFP) migrere langs myelinated axonal spor farget rødt for MBP i hGC-DRG-oligodendrocyte kultur system. Scale bar: 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Migrasjon studier for hGCs kan utføres ved hjelp av Boyden kammer systemer eller scratch analyser. Men mens disse eksperimentene ikke klarer å gi noen informasjon om interaksjoner av tumorceller med andre omkringliggende vev, dagens system kan recapitulate GC interaksjoner med myelinated og ikke-myelinated fibre. Videre, å studere tumor dannelse og sluttpunkt migrasjon, organotypic Slice kulturer av gnager hjernen eller in vivo implantation av glioma celler i gnager hjernen eller flanken har tidligere blitt benyttet23,24,25. Nyere innsats på tredimensjonal modellering av glioma celler har benyttet systemer som kollagen lag26,27,28, astrocytt-baserte stillaser29,30, ekstracellulære Matrix lag31, elektrospunfibre nanofibre32, og hydrogeler33. Disse eksperimentene gir tilfredsstillende sluttpunkt resultater i forbindelse med migrasjon, men de mangler evnen til å bli studert i sanntid av mikroskopi med høy oppløsning.
Her har vi vist en ny tilnærming til å studere migrasjon av hGCs ved å utarbeide en DRG co-kultur i et compartmented kammer. Hvis tilgang til frisk GBM vev er tilgjengelig, hGCs kan isoleres og kultivert pålitelig. Selv om hGCs tar lang tid å danne neurospheres i utgangspunktet, er kulturene enkle å vedlikeholde og under kultur når kulene danner. For å sikre suksess for hGC kulturen, bør vevet behandles så raskt som mulig. Tiden mellom reseksjon og behandlingen bør minimeres så mye som mulig, og prøvene skal alltid transporteres på is.
Den DRG er også lett å isolere, utvider sin axons lenger enn kortikale neurons og kan lett myelinated i kultur med oligodendrocytes. hGC neurospheres eller dissosiert hGCs er co-kultivert i den opp-av rom i kamrene, noe som åpner for Live celle bilde og sanntids kvantifisering av cellulære interaksjoner med axons og myelinated fibre. I tillegg er denne protokollen ikke er begrenset til bare DRG kulturer, som kortikale neurons kan også være isolert og myelinated med få modifikasjoner på denne protokollen. Denne modellen kan også brukes til å studere andre former for kreft i hjernen.
Mens DRG er relativt enkel å isolere og vedlikeholde, er tillegg av compartmented kammeret tidkrevende og skaper en rekke tekniske begrensninger som krever opplæring og praksis for å lykkes. Kritisk til suksessen til denne protokollen er ensartet kollagen belegg og skrape av kulturen retter fordi ujevn eller overdrevet tykt kollagen tendens til å skrelle. Ekstrem forsiktighet bør også tas når du plasserer silikon fett på compartmented kamre. Hvis jevnt trykk ikke brukes under uttaket av silikon fett, vil det være hull langs bunnen av compartmented kammer som vil kreve tetting med overflødig fett for å hindre medie lekkasje. I tillegg bør minimum press brukes når man overholder compartmented kamre til kulturen parabolen gulvet. Hvis axons unnlater å krysse ut av midten kupé etter uke en og DRG ser ellers frisk, er det sannsynlig at for mye press ble brukt ved plassering av compartmented kammeret eller et overflødig mengde fett ble brukt.
hGC migrasjon langs myelinated og ikke-myelinated axonal traktater i hjernen har ikke vært godt beskrevet på grunn av mangel på effektive og reproduserbar ex vivo modeller. Vi beskriver her utviklingen av en innovativ ex vivo kultur system for å studere hvordan glioma celler migrere langs axons og myelin, en avgjørende komponent i utviklingen av nye behandlinger som spesifikt mål tumor celle migrasjon. Vårt kultur system er allsidig siden det er fluidic isolasjon mellom rom, tilrettelegging for evnen til å studere ulike romanen behandlinger eller ulike konsentrasjoner av stoffer som påvirker glioma celle migrasjon. En ekstra fordel med vår co-kultur-systemet er evnen til å overvåke hGC migrasjon og virkningene av de ulike behandlingene i sanntid. Protokollen som beskrives her blir nå brukt som grunnlag for utvikling av mer sofistikerte BioMimetic 3-dimensjonale ex vivo-systemer som bruker utelukkende menneskelige cellulære komponenter som kan brukes til å vurdere toksikologiske og effekt av romanen narkotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av interne midler ved Institutt for nevrokirurgi, Brown University til N.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
| 60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
| Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
| AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
| Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
| Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| D-Glucose | Sigma | G5146 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
| DNase I | Sigma | D7291 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
| E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
| EBSS | Sigma | E7510 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
| HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
| Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
| Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
| Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
| Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
| NAC | Sigma | A8199 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
| Ordinary forceps | |||
| P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
| Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
| Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Uridine | Sigma | U3003 |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
- Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Visvader, J. E.
- Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
- Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
- Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).
- Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U. Glioblastoma. De Vleeschouwer, S. , (2017).
- Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
- Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
- Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
- Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
- Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
- Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
- Chen, H. C.
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
- Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
- Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
- Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
- Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
- Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
- Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).
