Summary
Qui presentiamo un sistema di coltura motrice mista ex-vivo per lo studio della migrazione delle cellule glioma umane (hGC) in tempo reale. Questo modello fornisce la capacità di osservare le interazioni tra hGC e assoni mielinati e non mielinati all'interno di una camera compartimentata.
Abstract
Il glioblastoma è uno dei tumori umani più aggressivi a causa dell'estensiva eterogeneità cellulare e delle proprietà migratorie degli HCC. Per comprendere meglio i meccanismi molecolari alla base della migrazione delle cellule glioma, è essenziale la capacità di studiare l'interazione tra HG e assoni all'interno del microambiente tumorale. Per modellare questa interazione cellulare, abbiamo sviluppato un sistema di coltura mista costituito da hGC e gangli della radice dorsale (DRG) co-culture asson-oligodendrocite. Le culture DRG sono state selezionate perché possono essere isolate in modo efficiente e possono formare le proiezioni lunghe ed estese che sono ideali per studi di migrazione di questo tipo. Gli oligodendrociti purificati sono stati poi aggiunti agli assoni DRG di ratti purificati e indotti in mielinati. Dopo aver confermato la formazione di mielina compatta, gli hGC sono stati finalmente aggiunti alla co-coltura e le loro interazioni con gli assoni DRG e gli oligodendrociti sono state monitorate in tempo reale utilizzando la microscopia time-lapse. In queste condizioni, gli HGC formano strutture aggregate simili a tumori che esprimono GFAP e Ki67, migrano lungo tracce assonali mielinate e non mielinate e interagiscono con questi assoni attraverso la formazione di pseudopodi. Il nostro sistema di co-cultura ex vivo può essere utilizzato per identificare nuovi meccanismi cellulari e molecolari di migrazione hGC e potrebbe potenzialmente essere utilizzato per test di efficacia dei farmaci in vitro.
Introduction
Il glioblastoma è uno dei tumori più aggressivi e letali del cervello umano. L'attuale standard di cura comprende la resezione chirurgica del tumore seguita da radiazione1 più la somministrazione concomitante e adiuvante di temozolomide2. Anche con questo approccio multiterapeutico, la recidiva tumorale è inevitabile3. Ciò è in parte dovuto alla natura migratoria estesa delle cellule tumorali, che invadono il parenchyma cerebrale creando più proiezioni simili a dita all'interno del cervello4 che rendono improbabile la resezione completa.
Negli ultimi anni, è diventato evidente che l'aggressività del glioblastoma è dovuta, in parte, alla presenza di una popolazione di cellule staminali tumorali all'interno della massa tumorale5,6, che presentano un alto potenziale migratorio7,8, resistenza alla chemioterapia e radiazioni9,10 e la capacità di formare tumori secondari11. Le GSC sono in grado di ricapitolare i tumori originali del policlonale quando lo xenotrapianto viene ai topi nudi5.
Nonostante la ricchezza di conoscenze sul background genetico dei glioblastomi, gli studi sulla migrazione delle cellule glioma (GC) sono attualmente ostacolati dalla mancanza di modelli di migrazione in vitro o in vivo efficienti. In particolare, mentre le interazioni glioma-assonali modulate da fattori cellulari e ambientali sono una componente fondamentale dell'invasione del glioma, a nostra conoscenza non esiste attualmente un sistema sperimentale con la capacità di modellare queste interazioni12,13,14. Per affrontare questa carenza, abbiamo sviluppato un sistema di coltura ex vivo di hGC primari co-coltivati con fibre purificate di assoni-oligodendrociti che si traduce in un'espressione elevata di marcatori tumorali differenziati, nonché un'estesa migrazione e interazione di hGC con fibre mielinate e non mielinated. Questa piattaforma ex vivo, grazie al suo layout compartimentato, è adatta per testare gli effetti di nuove terapie sui modelli di migrazione hGC.
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Protocol
I protocolli per la raccolta, l'isolamento e la propagazione delle cellule glioma umano derivate dal paziente sono stati approvati dal comitato IRB del Rhode Island Hospital. Tutti gli animali sono stati mantenuti secondo la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutti i protocolli di utilizzo degli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Rhode Island Hospital.
1. Preparazione dei supporti e buffer
- Preparare 50 mL di Neurosfera Media: 1x Neuronale basale medium w/o vitamina A, 1x integratore senza siero libero w/o vitamina A, 2 mM L-glutamine, 20 ng/mL fattore di crescita epidermica (EGF), 20 ng/mL fattore di crescita fibroblasto di base (FGF), 2 g/mL di eparina e 1x antibiotic-antimycotic (anti-anti).
- Preparare 50 mL di integrato Neuronal Basal Medium: 1x Neuronal basal medium, 1x integratore senza siero, 4 g/L D-glucosio, 2 mM L-glutamine, e 50 ng/mL fattore di crescita del nervo (NGF).
- Preparare 500 mL di N2B2 Medium: 1:1 Modified Eagle Medium-Ham's F12 Nutrient Mixture (DMEM-F12), 1x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G), 66 mg/mL album di siero bovine (BSA), 0,1 mg/mL transferrin, 0,01 mg/mL di biotina, 6,29 mg/mL progesterone, 5 g/mL N-Acetyl-L-cistine (NAC) e 1 mM di putriscina. Aliquota e congelamento a -20 gradi centigradi.
- Preparare 500 mL di C-Medium: 1x Minimo Essenziale Medio (MEM), D-glucosio (finale 4 g/L), 10% siero bovino fetale (FBS) e 2 mM di l-glutamina. Aliquota e congelamento a -20 gradi centigradi. Aggiungere il fattore di crescita del nervo (NGF) fresco prima dell'uso (50 ng/mL).
- Preparare 200 mL di Papain Buffer: 1x Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), 100 mM Mg2SO4, 30% glucosio, 0,25 M EGTA e 1 M NaHCO3.
- Preparare 10 mL di DMEM-ITS-G Medium: 1x DMEM, 0.5% BSA e 1x ITS-G.
- Preparare 200 mL di PB Buffer: 1x la salina con buffer di fosfata (DPBS) di 1x Dulbecco senza CA2 e Mg2 e 0,5% BSA. Degas il buffer prima dell'uso e tenere sul ghiaccio.
2. Isolamento e cultura delle Neurosfere a cellule staminali di Glioma
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Isolamento delle neurosfere
- Raccogli il tessuto glioblastoma umano (GBM) approvato dall'IRB e acconsente al paziente dalla sala operatoria. Trasferire campioni GBM su ghiaccio in DPBS contenenti 2x anti-anti ad un armadietto di sicurezza biologico certificato BL2.
- Trasferire un campione di 1 cm3 GBM con necrosi minima o contaminazione da globuli rossi in una piastra da 60 mm e tagliare a 1 mm3 frammenti; rimuovere l'eventualità eccessiva di DPBS.
- Digerire il tessuto con 5 mL di collagenae/dispase (1 mg/mL) per 30 min a 37 gradi centigradi e ruotare delicatamente il piatto ogni 5-10 min.
- Trasferire i frammenti digeriti in un tubo da 50 mL e triturare pipettando con una pipetta da 10 mL più volte per dissociare il tessuto.
- Aggiungere un volume uguale di Neurosfera Media e triturare di nuovo il tessuto; permettendo ai grandi frammenti di depositarsi.
- Rimuovere i supporti senza frammenti di tessuto e passare lentamente attraverso un colino cellulare 70 -M posto sopra un tubo fresco da 50 mL.
- Ripetere i passaggi da 2.1.5-2.1.6 fino a quando tutto il tessuto non è stato dissociato, cambiando il colino cellulare in base alle esigenze.
- Girare la sospensione cellulare a 110 x g per 10 min.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 10 mL di tampone liscile ACK per rimuovere la contaminazione dei globuli rossi. Incubare per 10 min a temperatura ambiente.
- Girare la sospensione cellulare a 110 x g per 5 min.
- Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 10 mL di Neurosfera Media. Prendere 10 l della sospensione cellulare e diluire con 10 l di blu trypan. Contare 10 l della sospensione cellulare utilizzando un contatore cellulare automatizzato o un emocitometro e una piastra in 10 mL di Supporti di Neurosfera ad una densità di 3 x 106 cellule in piastre di coltura di sospensione da 100 mm.
- Aggiungere 2 mL di nuovi supporti di Neurosfera alla cultura 2-3 volte a settimana.
NOTA: Le neurosfere si formeranno in sospensione entro 3-4 settimane. Dopo aver subcultur per 2-4 volte, confermare lo stelo attraverso il test di diluizione limitante e la ricapitolazione della tumoralità tramite trapianto xenografico in topi immunocompromessi come descritto in precedenza 22.
-
Neurosfere sub-colture
- Quando le sfere si formano e raggiungono un diametro compreso tra 200-500 m, trasferire le neurosfere a un tubo da 15 mL e girare a 110 x g per 5 min.
- Risospendere le neurosfere in 1 mL di soluzione di distacco cellulare preriscaldata.
- Trasferire su un tubo da 1,5 ml e incubare a 37 gradi centigradi per 5 min.
- Impostare una pipetta P200 a 150 l e triturare pipetting su e giù per dissociare le neurosfere.
- Trasferire le cellule dissociate in un tubo da 15 mL. Aggiungere 4 mL di Supporto neurosfera e girare a 300 x g per 5 min.
- Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 5 mL di Neurosfera Media. Prendere 10 l della sospensione cellulare e diluire con 10 l di blu trypan. Contare 10 l delle sospensioni cellulari utilizzando un contatore cellulare automatico o un emocitometro e una piastra ad una densità di 1 x 106 celle/60 mm in un volume finale di 4 mL.
- Aggiornare i supporti 2 volte a settimana e le celle delle impostazioni cultura secondarie in base alle esigenze. Congelare intere neurosfere quando lo si desidera nel supporto basale neuronale w/o vitamina A integrato con 10% DMSO. Le neurosfere possono essere utilizzate per esperimenti dopo P4.
3. Cultura comparata di Rat Dorsal Root Ganglia (DRG), Oligodendrocyti (OPC) e hPC
- Preparazione di piatti di collazione compartimentati
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi nei giorni precedenti la raccolta pianificata dei DRG.- Assemblare piatti di coltura compartimentati.
- Soluzione di scorta di collagene diluito a 500 g/mL in sterile distillato H2O; mescolare accuratamente.
- Con una pipetta di trasferimento sterile, riempire un piatto di coltura 35 mm con 2 mL di soluzione di collagene; rimuovere la soluzione, lasciando dietro una sottile pellicola di collagene e posizionarla nel prossimo piatto da 35 mm. Ripetere questo processo, aggiungendo più soluzione di collagene in base alle esigenze, fino a quando tutti i piatti sono stati rivestiti.
- Una volta che tutte le piastre sono rivestite, posizionare le piastre in un vassoio di coltura 245 mm x 245 mm e posare tre pastiglie di garza da 1 mm x 1 mm al centro del vassoio.
- Per polimerizzare il collagene, si riempiono di garza umida con 1 mL di idrossido di ammonio concentrato e coprire i vassoi per 15 min.
- Rimuovere i cuscinetti di garza e lasciare asciugare i piatti da 35 mm nella cappa di flusso laminare.
- Mentre i piatti si asciugano, caricare la canna dell'applicatore di grasso di siringa con grasso ad alto vuoto. Posizionare le camere compartimentate in una grande bottiglia di supporto bocca riempita con acqua distillata. Sterilizzare sia da autoclaving e lasciare raffreddare.
- Archiviare il punto di un 18-G necessario per fare una punta smussata. Sterilizzare nel 70% di etanolo. Fissare l'ago alla siringa di grasso.
- Sterilizzare il rastrello di spillo immergendosi nel 70% di etanolo; lasciarlo asciugare all'aria nel cofano a flusso laminare.
- Rimuovere il coperchio da un piatto asciutto di collagene rivestito 35 mm. Tenere il piatto tra il pollice e il dito del puntatore. Tenere il rastrello perno con l'altra mano. Applicare una pressione ferma per creare anche 200 graffi larghi m sul centro del piatto.
- Utilizzando una pipetta da pascolo, mettere due gocce di Basale Neuronale Integrato Medio al centro dei graffi.
- Ripetere i passaggi 3.1.10-3.1.11 fino a quando tutti i piatti non sono stati graffiati.
- Asciugare le camere compartimentate in un cappuccio laminare.
- Con pinze emostatiche sterili, afferrare una camera compartimentata dal divisore centrale. Capovolgere le pinze emostatiche in modo che il fondo della camera sia rivolto verso l'alto.
- Applicare il grasso di silicone alla camera compartimentata, a partire dall'alto. Assicurarsi che il grasso sia posizionato ordinatamente e si sovrapponga a tutti gli angoli.
- Rimuovere il coperchio da un piatto da 35 mm. Invertire il piatto e posizionare i graffi sopra la camera. Toccare delicatamente sul fondo della piastra con un paio di pinze.
- Capovolgere delicatamente la piastra utilizzando le pinze emostatiche. Rilasciare le pinze.
- Posizionare un cuodio di grasso alla base del vano centrale. Riempire ogni camera con Supplemento Neuronal Basal Medium (NB) e verificare la presenza di perdite. Sigillare le perdite con grasso di silicone in base alle esigenze.
- Continuare ad assemblare tutti i piatti di coltura e conservare durante la notte a 37 , 5% CO2.
- Isolamento dei neuroni e della cultura del Rat DRG nella camera compartimentata
- Sacrificare un ratto E16 Sprague-Dawley in gravidanza a tempo per asfissia di CO2 o per sovradosaggio chimico.
- Posizionare l'animale in posizione supina su una superficie pulita; disinfettare l'addome con il 70% di etanolo.
- Afferrare la pelle dell'addome inferiore con pinze e sollevare delicatamente.
- Utilizzando le forbici, fare un 'I" incisione lungo la linea mediana dell'animale, avendo cura di non forare i muscoli della parete addominale.
- Con un paio di pinze pulite, afferrare la parete muscolare e fare un'incisione trasversale con un paio di forbici pulite usando cautela per non forare l'utero o l'intestino.
- Con un paio di pinze smussate, afferrare l'utero e sollevare delicatamente direttamente dalla cavità peritoneale.
- Utilizzando forbici fresche e sterili, agganciare il tessuto connettivo alla base di ogni corno uterino.
- Mettere l'intero utero in un piatto sterile di 100 mm di coltura tissutale.
- Portare l'utero in un cappuccio a flusso laminare per la dissezione.
- Rimuovere gli embrioni dall'utero, uno alla volta, tagliando attraverso il sacco amniotico e stuzzicando delicatamente l'embrione e in un piatto da 60 mm contenente 5 mL di L-15 con 1x pen-strep.
- Con le pinze sottili, mettere 3-4 embrioni in un piatto da 60 mm contenente 5 mL di L-15 con 1x pen-strep.
- Lavorando al microscopio dissecinte e con un embrione alla volta, eutanasia per decapitazione.
- Mentire il lato ventrale dell'embrione verso l'alto e rimuovere gli arti e la coda.
- Con le pinze sottili, fai un'incisione mediana nell'animale.
- Rimuovere gli organi e i tessuti interni per esporre le strutture dorsali, in particolare il midollo spinale che dovrebbe essere visibile al completamento.
- Posizionare una lama di forbici micro-sezionano tra la colonna vertebrale e il canale spinale e tagliare con attenzione la colonna vertebrale per esporre il midollo spinale. Fare attenzione a non tagliare attraverso il midollo spinale.
- Con le pinze sottili, afferrare leggermente l'estremità rostrale del midollo spinale e sollevare lentamente l'embrione. Le DRG saranno attaccate al midollo spinale.
- Trasferire i midollo spinale e le DRG attaccate a un piatto da 35 mm contenente 2 ml di L-15 con 1x pen-strep. Mettere sul ghiaccio.
- Una volta che tutti i midollo spinale sono stati isolati, utilizzare pinze sottili per cogliere singolarmente i DRG dal midollo spinale. Mettere i DRG in un piatto fresco di 35 mm.
- Se le radici nervose sono presenti nei DRG, tagliarle via.
- Togliere i piatti preparati da 35 mm dall'incubatrice di 37 gradi centigradi, 5% CO2. Rimuovere il supporto dal giorno precedente. Collocare 80 l di Supporti Neuronal Basal Supplementari (NBF) contenenti 10 M 5-Fluoro-2'-deossiuridina (FUDR) nel vano centrale e 250 - L di supporti in ogni vano esterno.
- Mettere 2 gangli in ogni vano centrale. Riportare i piatti all'incubatore di CO2 del 5% .
- Il giorno successivo aggiungere 2,5 mL di NBF.
- Inserire le impostazioni cultura seguendo la pianificazione nella tabella 1,modificando la pianificazione in base al giorno scelto per iniziare la preparazione DRG.
- Il giorno 21 (o quando gli assoni raggiungono la fine dei compartimenti distale), o colture di semi con una neurosfera GBM (Procedi al passo 3.2.26) e immagine dal vivo o mielinate le culture con oligodendrocelli (Procedere al passaggio 3.3) e poi seme con una neurosfera GBM dopo la mielinazione.
- Sostituire Supplemento NB Medium in ogni camera compartimentata distale che verrà seminata con una neurosfera GBM con Supplementato NB Medium contenente 10% FBS.
- Con una pipetta P20 impostata su 10 , rimuovere una neurosfera GBM dal piatto di coltura. La neurosfera GBM dovrebbe misurare circa 200 micron di dimensioni.
- Posizionare la punta della pipetta nella camera distale ed espellere lentamente la neurosfera GBM in modo che cada delicatamente sugli assoni nella porzione della camera distale più vicina alla camera centrale, sopra gli assoni vicino alla camera centrale. Fare attenzione a non lasciare che la punta della pipetta interrompa gli assoni.
- Lasciare la coltura nell'armadietto della biosicurezza per 1 h a temperatura ambiente per consentire alla neurosfera GBM di attaccarsi.
- Una volta che la neurosfera ha attaccato, sostituire con molta attenzione i media nel compartimento distale con Supplementato NB Medium.
- Colture di immagini dal vivo per 3-7 giorni, aggiungendo i media in base alle esigenze. In questo caso, è stato utilizzato un recinto controllato a CELLE vive DI CO2 collegato al microscopio (ad esempio, Axiovert) per monitorare continuamente la migrazione delle cellule per 7 giorni utilizzando un campo luminoso. Le immagini sono state acquisite ogni 10 min utilizzando il software associato. Ripetere lo stesso protocollo utilizzando hGC che sono stati stabilmente trasfettati per esprimere GFP e le immagini sono state catturate utilizzando una combinazione di brightfield e laser 488 nm.
NOTA: Le neurosfere possono essere trasdotte con lentivirus o trasfettate con plasmidi o siRNA. I compartimenti possono anche essere trattati con inibitori di piccole molecole desiderati per studiare la migrazione.
- Mielinazione degli assoni DRG con Oligodendrociti
- Il giorno prima dell'isolamento degli oligodendrociti, sostituire il NB Medium nei DRG con C-Medium.
- Prima della dissezione, mettere 10 mL di Papain Buffer in un piatto da 60 mm nell'incubatrice per esaldificare.
- In un cappuccio laminare a flusso, riempire un piatto da 100 mm e un piatto da 60 mm con HBSS ghiacciato. Mettere sul ghiaccio.
- Sacrifica un cucciolo di topo P2 decapitando. Rimuovere la pelle con un paio di forbici. Dopo aver rimosso la pelle, tagliare il cranio lungo la linea mediana con un paio di forbici sottili.
- Rimuovere delicatamente il cranio con pinze sottili. Utilizzando una spatola, raccogliere delicatamente il cervello dal fondo del cranio e trasferire a un coperchio piastra di coltura tessuto invertito.
- Rimuovere il cervelletto e dividere il cervello in due emisferi cerebrali. Rimuovere i bulbi olfattivi, l'ippocampo e i gangli basali sotto la corteccia cerebrale di ogni emisfero. Collocare la corteccia cerebrale nel piatto da 100 mm contenente HBSS. Ripetere i passaggi da 3.3.4-3.3.6 per gli animali rimanenti.
- Lavorando con una corteccia alla volta, rimuovere le meningi con pinze Dumont fini. Mettere tutte le cortici senza meningi in piatti freschi da 60 mm con HBSS.
- Tagliare a dadini il tessuto corticale in 1 mm3 pezzi. Mettere sul ghiaccio.
- Mettere Papain Buffer equilibrato in un tubo da 15 mL. Aggiungere 200 unità di papaina e 2 mg di L-cisteina. Filtrare sterilizzare e aggiungere 200 L di sterile DNase I.
- Rimuovere HBSS dal tessuto cerebrale a dadini e sostituirlo con Papain Buffer da 3.3.2. Mettere il piatto in 37 gradi centigradi, 5% CO2 incubatrice per 80 min, agitando delicatamente ogni 15 min.
- Trasferire il tessuto digerito in un tubo da 50 mL e aggiungere 2 mL di M-medium.
- Triturare con una pipetta sierologica da 5 mL per dissociare il tessuto; lasciare che pezzi più grandi di tessuto si stabilizzino. Rimuovere il supernatante e metterlo in uno sterile tubo da 15 mL.
- Aggiungere 2 mL di C-Medium e ripetere la triturazione con una pipetta sierologica da 5 mL ancora una volta. Passare a una punta pipetta da 1 mL e triturare fino a completa dissociazione del tessuto. Trasferire al tubo da 15 mL.
- Girare il tessuto triturato a 300 x g per 15 min. rimuovere con attenzione il supernatante e resospendere il pellet in 8 mL di DMEM-ITS-G Medium.
- Pre-bagnato di un colino sterile da 30 m con 2 mL di buffer PB. Posizionare il colino cellulare su un tubo da 50 mL e filtrare la sospensione della cella 1 mL alla volta. Risciacquare il filtro con 5 mL di buffer PB.
- Trasferire la sospensione cellulare in una piastra batteriologica da 100 mm; incubare per 15 min in un'incubatrice a 37 gradi, 5% di CO2 per consentire l'attacco della microglia.
- Rimuovere il supporto e mettere in un tubo da 15 mL. Sciacquare delicatamente la piastra con 2 mL di mezzo DMEM-ITS-G e trasferirla al tubo da 15 mL.
- Risospendere delicatamente la sospensione cellulare. Prendere 10 l della sospensione cellulare e diluire con 10 l di blu trypan. Contare 10 l della sospensione cellulare utilizzando un contatore cellulare automatizzato o un emocitometro.
- Girare la sospensione cellulare a 300 x g per 10 min.
- Aspirati supernatante completamente e resospendere le cellule in 70 L di PB Buffer per ogni 1 x 107 celle. Mescolare bene e incubare a 4 gradi centigradi per 10 min.
- Aggiungere 20 l di microsfere anti-A2B5 per ogni 1 x 107 cellule. Mescolare bene e incubare a 4 gradi centigradi.
- Aggiungere 1-2 mL di buffer PB ogni 1 x 107 cellule e centrifugare a 300 x g per 10 min in una centrifuga di 4 gradi centigradi.
- Aspiratore completamente. Risospendere fino a un totale di 108 celle in 500 luna di PB Buffer. Tieniti sul ghiaccio.
- Posizionare una colonna magnetica di perline nel campo magnetico di un separatore.
- Preparare la colonna risciacquandocono con 500 l- di PB Buffer. Applicare la sospensione della cella alla colonna. Scartare il flow-through in un contenitore di rifiuti (contiene celle senza etichetta).
- Lavare la colonna con 500 luna di PB Buffer 3 volte. Scartare il flow-through.
- Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e posizionarla in un tubo di raccolta.
- Pipetta 1 mL di buffer PB nella colonna. Sciacquare le celle etichettate magneticamente spingendo saldamente lo stantuffo nella colonna.
- Aggiungere 4 mL di C-Medium alla frazione di cella e ruotare a 300 x g per 10 min.
- Rimuovere supernatante e risospendere in 5 mL di N2B2 Medium. Prendere 10 l della sospensione cellulare e diluire con 10 l di blu trypan. Contare 10 l della sospensione cellulare utilizzando un contatore cellulare automatizzato o un emocitometro.
- Piastra oligodendrociti ad una concentrazione di 150.000 cellule per camera compartimentata contenente un DRG con assoni completamente estesi.
- Il giorno seguente cambiare il supporto nella camera compartimentata in N2B2 per consentire la mielinazione. Sostituire i supporti ogni 2-3 giorni. La mielinazione sarà completa tra 14 giorni.
- Il giorno 14, cultura dei semi con una neurosfera GBM come in 3.2.26-3.2.32. Mantenere le colture mielinate in N2B2 Medium per la durata di qualsiasi esperimento.
NOTA: il protocollo viene presentato come schema del diagramma di flusso nella Figura 1.
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Representative Results
Per studiare l'interazione degli hGC con gli assoni, abbiamo generato assoni DRG purificati come descritto in precedenza15,16,17,18. Questi assoni DRG purificati sono stati poi seminati con hCC, che formavano strutture simili a tumori GFAP/Ki67 integrate all'interno della rete assonale, mentre i singoli HMC migrarono in associazione o tra gli assoni (Figura 2). Per determinare il modo in cui gli HGC interagiscono con gli assoni mielinati, abbiamo seminato colture assonali DRG con oligodendrociti purificati e mielinizzare indotta come descritto in precedenza19,20,21. L'aggiunta di hGC sulle coculture MIelinated DRG-oligodendrocyte ha mostrato che hGC migrano in associazione con gli assoni mielinati e lontano dalla massa tumorale attraverso la formazione di pseudopodi, come mostrato nel nostro recente articolo (Figura 3)22. La mielinazione oligodendrocita può essere determinata utilizzando la colorazione delle colture mielina di base (MBP). Per quantificare la migrazione degli HGC in queste culture abbiamo misurato l'area totale della cultura occupata dai hGC di migrazione utilizzando il software Image J22.
| Lunedì | Mercoledì | Venerdì | |
| GIORNO 1 | Nbf | ||
| SETTIMANA 1 | Nb | Nbf | Nb |
| SETTIMANA 2 | Nbf | Nb | Nb |
| SETTIMANA 3 | Nb | Nb |
Tabella 1: Programma di alimentazione delle colture DRG.
Figura 1: Riepilogo schematico del protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: hCC formano strutture simili a tumori in co-cultura con assoni DRG. La coltura è stata fissa e macchiata per i marcatori tumorali GFAP (rosso) e Ki67 (verde), mentre gli assoni sono stati macchiati con Neurofilament (blu). Barra della scala: 200 m. Questa cifra è stata modificata dal nostro articolo22pubblicato di recente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: hGC migrano lungo tracce assonali mielinate. hGC che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) migrano lungo tracce assonali mielinate colorate di rosso per MBP nel sistema di coltura hGC-DRG-oligodendrocyte. Barra della scala: 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli studi di migrazione per hGC possono essere eseguiti utilizzando sistemi camera Boyden o saggi scratch. Tuttavia, mentre questi esperimenti non riescono a fornire alcuna informazione per quanto riguarda le interazioni delle cellule tumorali con altri tessuti circostanti, l'attuale sistema può ricapitolare le interazioni GC con fibre mielinate e non mielinate. Inoltre, per studiare la formazione tumorale e la migrazione all'estremità, le colture di fette organotipiche del cervello dei roditori o l'impianto in vivo di cellule glioma nel cervello o nel fianco del roditore sono state precedentemente utilizzate23,24,25. Gli sforzi più recenti sulla modellazione tridimensionale di cellule di glioma hanno utilizzato sistemi come strati di collagene26,27,28, scaffold a base di astrociti29,30, strati di matrice extracellulari31, nanofibre elettrospun32e idrogel33. Sebbene questi esperimenti producano risultati soddisfacenti per quanto riguarda la migrazione, non hanno la capacità di essere studiati in tempo reale mediante microscopia ad alta risoluzione.
Qui, abbiamo dimostrato un nuovo approccio per studiare la migrazione degli HGC preparando una co-cultura DRG in una camera compartimentata. Se è disponibile l'accesso al tessuto GBM fresco, gli HGC possono essere isolati e coltivati in modo affidabile. Anche se gli HCC richiedono molto tempo per formare le neurosfere inizialmente, le culture sono facili da mantenere e sottocultura una volta che le sfere si formano. Per garantire il successo della coltura hGC, il tessuto deve essere elaborato il più rapidamente possibile. Il tempo che intercorre tra la resezione e la lavorazione deve essere ridotto al minimo possibile e i campioni devono sempre essere trasportati sul ghiaccio.
Il DRG è anche facile da isolare, estende i suoi assoni più a lungo dei neuroni corticali e può essere facilmente mielinato in coltura con oligodendrociti. hLe neurosfere hGC o hGC dissociati sono co-coltivate nei compartimenti distale delle camere, consentendo l'imaging delle cellule vive e la quantificazione in tempo reale delle interazioni cellulari con assoni e fibre mielinate. Inoltre, questo protocollo non è limitato solo alle colture DRG, come neuroni corticali possono anche essere isolati e mielinati con poche modifiche a questo protocollo. Questo modello può essere utilizzato anche per studiare altre forme di cancro al cervello.
Mentre il DRG è relativamente semplice da isolare e mantenere, l'aggiunta della camera in compartimento richiede molto tempo e crea una moltitudine di limitazioni tecniche che richiedono formazione e pratica per avere successo. Critico per il successo di questo protocollo è rivestimento uniforme collagene e graffi dei piatti di coltura perché collagene irregolare o eccessivamente spessa tende a sbucciare. Prestare estrema attenzione anche durante il posizionamento del grasso di silicone sulle camere compartimentate. Se la pressione uniforme non viene utilizzata durante l'erogazione del grasso di silicone, ci saranno lacune lungo il fondo della camera compartimentata che richiederanno la tenuta con grasso in eccesso per evitare perdite di supporti. Inoltre, la pressione minima deve essere utilizzata quando si aderisce le camere compartimentate al pavimento del piatto di coltura. Se gli assoni non riescono ad uscire dal vano centrale dopo la prima settimana e il DRG sembra altrimenti sano, è probabile che sia stata applicata troppa pressione quando si posiziona la camera compartimentata o è stata utilizzata una quantità in eccesso di grasso.
hLAge migrazione lungo tratti assonali mielinati e non mielinati nel cervello non è stata ben descritta a causa della mancanza di modelli ex vivo efficienti e riproducibili. In questo caso viene descritto lo sviluppo di un innovativo sistema di coltura ex vivo per studiare come le cellule glioma migrano migrano lungo assoni e mielina, una componente cruciale nello sviluppo di nuovi trattamenti che colpiscono specificamente la migrazione delle cellule tumorali. Il nostro sistema di coltura è versatile in quanto c'è un isolamento fluido tra i compartimenti, facilitando la capacità di studiare vari nuovi trattamenti o diverse concentrazioni di sostanze che influenzano la migrazione delle cellule glioma. Un ulteriore vantaggio del nostro sistema di cocultura è la capacità di monitorare la migrazione hGC e gli effetti dei vari trattamenti in tempo reale. Il protocollo qui descritto è attualmente utilizzato come base per lo sviluppo di sistemi ex-vivo biomimetici più sofisticati utilizzando esclusivamente componenti cellulari umani che potrebbero essere utilizzati per valutare la tossicologia e l'efficacia di nuovi farmaci.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da fondi interni del Dipartimento di Neurochirurgia, Brown University a N.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
| 60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
| Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
| AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
| Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
| Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| D-Glucose | Sigma | G5146 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
| DNase I | Sigma | D7291 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
| E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
| EBSS | Sigma | E7510 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
| HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
| Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
| Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
| Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
| Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
| NAC | Sigma | A8199 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
| Ordinary forceps | |||
| P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
| Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
| Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Uridine | Sigma | U3003 |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
- Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Visvader, J. E.
- Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
- Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
- Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).
- Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U. Glioblastoma. De Vleeschouwer, S. , (2017).
- Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
- Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
- Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
- Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
- Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
- Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
- Chen, H. C.
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
- Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
- Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
- Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
- Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
- Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
- Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).
