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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

등쪽 뿌리 신경절 축삭-올리고젠드로시트 공동 배양에 대한 인간 신경교종 세포 이동의 실시간 모니터링

Published: December 13, 2019 doi: 10.3791/59744
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Molecular Neuro-oncology Laboratory, Brown University, Rhode Island Hospital, 2University of Minnesota, College of Veterinary Medicine, 3Department of Neurosurgery, Brown University

Summary

여기서 우리는 인간 신경교종 세포(hGC) 이동을 실시간으로 연구하기 위한 전 생체내 혼합 단층 배양 시스템을 제시한다. 이 모형은 구획화된 약실 내의 hGCs와 myelinated 및 비 myelinated 축색둘다 사이 상호 작용을 관찰하는 기능을 제공합니다.

Abstract

교모 세포종은 광범위한 세포 이질성과 hGCs의 이동 특성으로 인해 가장 공격적인 인간 암 중 하나입니다. 신경교종 세포 이동의 근본적인 분자 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해서는 종양 미세 환경 내의 hGCs와 축사 간의 상호 작용을 연구하는 능력이 필수적입니다. 이 세포 상호 작용을 모델링하기 위해, 우리는 hGCs와 등쪽 뿌리 중추 (DRG) 축 - 올리고 덴드로 시트 공동 배양으로 구성된 혼합 배양 시스템을 개발했습니다. DRG 배양은 효율적으로 격리될 수 있고 이러한 특성의 마이그레이션 연구에 이상적인 길고 광범위한 프로젝션을 형성할 수 있기 때문에 선택되었습니다. 정제된 래트 올리고덴드로시테는 정제된 래트 DRG 축삭에 첨가하고 myelinate로 유도하였다. 컴팩트 한 myelin의 형성을 확인한 후, hGCs는 마침내 공동 배양에 추가되었고 DRG 축삭 및 올리고덴드로시트와의 상호 작용은 타임랩스 현미경을 사용하여 실시간으로 모니터링되었습니다. 이러한 조건하에서 hGCs는 GFAP 및 Ki67을 발현하는 종양과 같은 골집합 구조를 형성하고, 골수 및 비 골수성 축사 트랙을 따라 이동하고 의사 포디아의 형성을 통해 이러한 축색과 상호 작용합니다. 우리의 생체 내 공동 배양 시스템은 hGC 이동의 새로운 세포 및 분자 메커니즘을 식별하는 데 사용할 수 있으며 잠재적으로 시험관 내 약물 효능 테스트에 사용될 수 있습니다.

Introduction

아교 모세포종은 인간의 뇌의 가장 공격적이고 치명적인 종양 중 하나입니다. 치료의 현재 표준은 방사선 에 이어 종양의 외과절제술을 포함 1 플러스 temozolomide의 보조 및 보조 투여2. 이 다중 치료 접근법으로도 종양 재발은불가피합니다 3. 이것은 부분적으로 종양 세포의 광대한 철새 특성 때문입니다, 이는 뇌 의 여러 손가락 같은 프로젝션을 만드는 뇌 의 실조를 침략4 그 가능성이 완전한 절제.

최근 몇 년 동안, 교모세포종의 공격성은 부분적으로 종양 질량5,6,높은 철새 전위 7,8,화학 요법 및방사선에대한 저항성 및 이차 종양을 형성하는능력(11)내의 암 줄기 세포의 집단의 존재에 기인한다는 것이 명백해지고 있다. GSCs는 누드 마우스5에이종이식할 때 원래의 다각형 종양을 되풀이할 수 있다.

교모 세포종의 유전 적 배경에 관한 풍부한 지식에도 불구하고, 신경교종 세포 (GC) 이동에 대한 연구는 현재 시험관 내 또는 생체 내 이동 모델의 효율적인 부족에 의해 방해된다. 특히, 세포-축색상호작용이 세포및 환경적 요인에 의해 변조되는 동안 신경교종 침입의 핵심 구성 요소는 있지만, 우리의 지식에는 현재 이러한 상호작용12,13,14를모델링할 수 있는 실험 시스템이 없다. 이 결핍을 해결하기 위하여, 우리는 분화한 종양 마커의 높은 표현 귀착되는 정제된 DRG 축삭-oligodendrocytes를 가진 1 차적인 hGCs의 생체 배양 시스템을 개발했습니다 뿐만 아니라 myelined 및 비 골수성 섬유와 hGCs의 광범위한 이동 그리고 상호 작용 귀착됩니다. 구획화 된 레이아웃으로 인해이 생체 내 플랫폼은 hGC 마이그레이션 패턴에 대한 새로운 치료법의 효과를 테스트하는 데 적합합니다.,

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Protocol

환자 유래 인간 신경교종 세포의 수집, 격리 및 전파에 대한 프로토콜은 로드 아일랜드 병원의 IRB 위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 동물은 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 NIH 가이드에 따라 유지되었습니다. 모든 동물 사용 프로토콜은 로드 아일랜드 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 미디어 및 버퍼 준비

  1. 신경구 배지 50 mL 준비: 1x 뉴런 기저 배지 와 비타민 A, 1x 혈청 무료 보충제 와 비타민 A, 2mML 글루타민, 20 ng/mL 표피 성장 인자 (EGF), 20 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 2 μg/mL 헤파린, 1x 항생제 항미성 항미제(항균제).
  2. 준비 50 보충 된 신경 기초 매체의 mL: 1 x 신경 기초 매체, 1 x 혈 청 무료 보충, 4 g/L D-포도 당, 2 mM L-글루타민, 그리고 50 ng/mL 신경 성장 인자 (NGF).
  3. N2B2 배지 500 mL 준비: 1:1 덜베코의 수정된 독수리 미디엄 햄의 F12 영양소 혼합물(DMEM-F12), 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS-G), 66 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA), 0.1 mg/mL 트랜스트랜스린, 0.01 mg/mL 비오틴, 6.29 mg/mL 프로게스테론, 5 μg/mL N-아세틸-L-시스틴 (NAC), 및 1 mM의 퍼트리신. 알리쿼트 및 -20°C에서 동결.
  4. C-Medium 500 mL: 1x 최소 필수 매체(MEM), D-글루코스(최종 4 g/L), 10% 태아 소 혈청(FBS), 2 mM L-글루타민을 준비합니다. 알리쿼트 및 -20°C에서 동결. 신경 성장 인자 (NGF)를 사용하기 전에 신선하게 추가하십시오 (50 ng / mL).
  5. 파파인 버퍼 200 mL 준비: 1x 얼의 균형 잡힌 소금 용액 (EBSS), 100 mM Mg2SO4,30% 포도당, 0.25 M EGTA, 1 M NaHCO3.
  6. DMEM-ITS-G 미디엄 10mL 준비: 1x DMEM, 0.5% BSA 및 1x ITS-G.
  7. PB 버퍼 200 mL 준비: Ca2+ 및 Mg2+ 및 0.5% BSA없이 1x 덜베코의 인산 완충 식염수 (DPBS). 사용하기 전에 버퍼를 탈기하고 얼음을 유지하십시오.

2. 신경교종 줄기 세포 신경구의 격리 및 배양

  1. 신경구의 격리
    1. IRB를 승인하고 환자가 수술실에서 신선한 인간 교모세포종(GBM) 조직을 승인한 것을 수집한다. BL2 인증 생물학적 안전 캐비닛에 2x 안티를 포함하는 DPBS의 얼음에 GBM 샘플을 전송합니다.
    2. 최소한의 괴사 또는 적혈구 오염으로 1 cm3 GBM 샘플을 60mm 플레이트로 옮기고 1mm3 조각으로 잘라냅니다. 여분의 DPBS를 제거하십시오.
    3. 37°C에서 30분 동안 콜라게나제/디스파스(1 mg/mL)의 5 mL로 조직을 소화하고 5-10분마다 접시를 부드럽게 소용돌이치세요.
    4. 소화된 단편을 50 mL 튜브로 옮기고 조직을 해리하기 위해 10 mL 파이펫으로 여러 번 파이펫팅하여 삼중화한다.
    5. 신경 구액 매체의 동등한 양을 추가하고 다시 조직을 삼중화; 큰 조각이 정착할 수 있도록 합니다.
    6. 조직 단편없이 매체를 제거하고 신선한 50 mL 튜브 위에 놓인 70 μM 세포 스트레이너를 천천히 통과합니다.
    7. 모든 조직이 해리 될 때까지 2.1.5-2.1.6 단계를 반복하여 필요에 따라 세포 여과기를 변경합니다.
    8. 셀 서스펜션을 110 x g에서 10분 동안 회전시면 됩니다.
    9. 상판액을 제거하고 적혈구 오염을 제거하기 위해 ACK 라싱 버퍼의 10 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
    10. 셀 서스펜션을 110 x g에서 5분 동안 회전시면 됩니다.
    11. 신경구 미디어의 10 mL에서 상류층을 제거하고 세포를 다시 일시 중단합니다. 셀 현탁액 의 10 μL을 가지고 10 μL의 트리판 블루로 희석하십시오. 100 mm 서스펜션 배양 플레이트에서 3 x 106 세포의 밀도로 신경구 배지의 10 mL에서 자동 세포 카운터 또는 혈세포계 및 플레이트를 사용하여 세포 현탁액의 10 μL을 계산한다.
    12. 일주일에 2-3회 신선한 신경구 배지 2 mL를 배양합니다.
      참고: 신경구는 3-4주 이내에 현탁액으로 형성됩니다. 2-4회 동안 배양한 후, 앞서 설명한 바와같이 면역손상마우스에서 의외로 이식을 통한 제한적인 희석 분석 및 종양 재캡을 통해 줄기를 확인한다.
  2. 하위 배양 신경구
    1. 구체가 200-500 μm 사이의 직경을 형성하고 도달하면 신경 구를 15 mL 튜브로 옮기고 110 x g에서 5 분 동안 회전합니다.
    2. 미리 데운 세포 분리 용액의 1 mL에서 신경 구를 다시 중단하십시오.
    3. 1.5 mL 튜브로 옮기고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
    4. P200 파이펫을 150 μL로 설정하고 신경구를 해리하기 위해 위아래로 파이펫팅하여 삼중화합니다.
    5. 해리된 세포를 15 mL 튜브로 옮김을 전달합니다. 신경구 미디어 4mL를 추가하고 5분 동안 300 x g으로 돌릴 수 있습니다.
    6. 신경구 미디어의 5 mL에서 상류층을 제거하고 세포를 다시 일시 중단합니다. 셀 현탁액 의 10 μL을 가지고 10 μL의 트리판 블루로 희석하십시오. 4 mL의 최종 부피에서 1 x 106 셀 / 60mm 접시의 밀도로 자동 셀 카운터 또는 혈세포 계 및 플레이트를 사용하여 셀 현탁액의 10 μL을 계산합니다.
    7. 필요에 따라 주 2회 배지와 하위 배양 세포를 새로 고칩니다. 10% DMSO로 보충된 비타민 A와 함께 뉴런 기저 매체에서 원하는 경우 전체 신경구를 동결시. 신경구는 P4 후 실험에 사용될 수 있다.

3. 쥐 등쪽 뿌리 간경 (DRGs), 올리고덴드로시테스 (OPC) 및 hGCs의 구획 문화

  1. 구획 문화 요리의 준비
    참고: DRG의 계획된 수확 전날에 다음 단계를 수행합니다.
    1. 구획 된 문화 요리를 조립합니다.
    2. 멸균 된H2O에서 500 μg / mL에 콜라겐 스톡 용액을 희석; 철저히 혼합하십시오.
    3. 멸균 전달 파이펫으로 35mm 배양 접시에 2 mL의 콜라겐 용액을 채웁니다. 용액을 제거하고 콜라겐의 얇은 막을 뒤에 두고 다음 35mm 접시에 넣습니다. 모든 요리가 코팅될 때까지 필요에 따라 콜라겐 용액을 더 추가하여 이 과정을 반복하십시오.
    4. 모든 플레이트가 코팅되면 플레이트를 245mm x 245mm 배양 트레이에 놓고 트레이 중앙에 1mm x 1mm 거즈 패드 3개를 놓습니다.
    5. 콜라겐을 중합하기 위해 농축 된 암모늄 수산화 암모늄 1 mL로 젖은 거즈 패드를 15 분 동안 트레이를 덮습니다.
    6. 거즈 패드를 제거하고 35mm 접시가 층류 후드에서 건조되도록 하십시오.
    7. 접시가 건조되는 동안 주사기 그리스 어플리케이터의 배럴을 고진공 그리스로 적재하십시오. 구획 된 챔버를 증류수로 채워진 큰 입 매체 병에 놓습니다. 오토클레이브를 사용하여 둘 다 살균하고 식힙니다.
    8. 무딘 팁을 만들기 위해 18-G 의 지점에서 파일. 70% 에탄올로 살균하십시오. 바늘을 그리스 주사기에 부착합니다.
    9. 70% 에탄올에 담가 핀 레이크를 살균; 층류 후드에서 공기 건조할 수 있습니다.
    10. 건조하고 콜라겐 코팅 된 35mm 접시에서 뚜껑을 제거합니다. 엄지손가락과 포인터 손가락 사이에 접시를 잡습니다. 다른 손으로 핀 레이크를 잡습니다. 단단한 압력을 가하여 접시 중앙에 200 μM 의 넓은 스크래치도 만듭니다.
    11. 목초지 파이펫을 사용하여, 스크래치의 중앙에 보충 신경 기저 매체의 두 방울을 배치합니다.
    12. 모든 요리가 긁히때까지 3.1.10-3.11 단계를 반복합니다.
    13. 층류 후드에 구획 된 챔버를 건조.
    14. 멸균 지혈 집게로 중앙 칸막이에 의해 하나의 구획 챔버를 잡습니다. 지혈성 집게를 뒤집어 챔버의 바닥이 위를 향하도록 합니다.
    15. 실리콘 그리스를 구획 된 챔버에 적용하여 상단부터 시작하십시오. 그리스가 깔끔하게 배치되고 모든 모서리에 겹치는지 확인하십시오.
    16. 35mm 접시에서 뚜껑을 분리합니다. 접시를 뒤집어 챔버 위에 긁힌 자국을 놓습니다. 한 쌍의 집게로 플레이트 바닥을 부드럽게 누릅니다.
    17. 지혈식 집게를 사용하여 플레이트를 부드럽게 뒤집습니다. 집게를 놓습니다.
    18. 중앙 구획의 바닥에 기름 더미를 놓습니다. 각 챔버에 보충된 신경 기저 미수(NB)를 채우고 누출여부를 확인합니다. 필요에 따라 실리콘 그리스로 누출을 밀봉합니다.
    19. 모든 문화 요리를 계속 조립하고 37 °, 5 %CO2에서하룻밤 보관하십시오.
  2. 구획 된 챔버에서 쥐 DRG 뉴런과 문화의 격리
    1. CO2 질식 또는 화학 적 과다 복용으로 시간 적 임신 한 E16 Sprague-Dawley 쥐를 희생하십시오.
    2. 동물을 깨끗한 표면에 척추 위치에 놓는다. 70 % 에탄올로 복부를 소독하십시오.
    3. 집게로 하복부의 피부를 잡고 부드럽게 들어 올립니다.
    4. 가위를 사용하여 동물의 중간선을 따라 "I"절개를하고 복벽의 근육에 구멍을 뚫지 않도록주의하십시오.
    5. 깨끗한 집게 한 쌍으로 근육 벽을 잡고 자궁이나 내장에 구멍을 뚫지 않도록주의를 기울여 깨끗한 가위로 가로 절개를하십시오.
    6. 무딘 집게 한 쌍으로 자궁을 잡고 복막 강에서 부드럽게 들어 올립니다.
    7. 신선한 멸균 가위를 사용하여 각 자궁 경적의 바닥에 결합 조직을 끼우습니다.
    8. 자궁 전체를 멸균 된 100mm 조직 배양 접시에 놓습니다.
    9. 해부를 위한 층류 후드에 자궁을 운반하십시오.
    10. 자궁에서 배아를 제거, 한 번에 하나씩, 양수 낭을 통해 클리핑하고 부드럽게 배아를 괴롭히고 1 x 펜 스트렙으로 L-15의 5 mL을 포함하는 60mm 접시로.
    11. 미세 한 집게로, 1 x 펜 스트렙과 L-15의 5 mL을 포함하는 60mm 접시에 3-4 배아를 배치합니다.
    12. 해부 현미경으로 한 번에 하나의 배아로 작업, 참수에 의해 안락사.
    13. 배아 복부 쪽을 위로 눕고 사지와 꼬리를 제거하십시오.
    14. 미세 집게로 동물의 중간 절개를하십시오.
    15. 등뼈 구조, 특히 완료 시 볼 수 있어야 척수를 노출하는 내부 장기와 조직을 제거합니다.
    16. 척추통과 척추관 사이에 미세 해부 가위 한 잎을 놓고 척추를 조심스럽게 잘라 척수를 노출시다. 척수를 잘라내지 않도록 주의하십시오.
    17. 미세 한 집게로 척수의 장밋끝을 가볍게 잡고 배아에서 천천히 들어 올립니다. DRG는 척수에 부착됩니다.
    18. 척수와 부착된 DRG를 1x 펜 스트렙으로 L-15 2 ml가 들어있는 35mm 접시에 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 담습니다. 얼음 위에 놓습니다.
    19. 모든 척수를 분리한 후에는 미세 한 집게를 사용하여 척수에서 DRG를 개별적으로 뽑습니다. DRG를 신선한 35mm 접시에 넣습니다.
    20. DRGs에 신경 뿌리가 있는 경우, 신경 뿌리를 잘라냅니다.
    21. 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 제조된 35 mm 접시를 제거한다. 전날의 미디어를 제거합니다. 80 μL의 보충된 신경 기저 부(NBF)를 중앙 구획에 10 μM 5-플루오로-2'-데옥시우리딘(FUDR)을 함유하고 각 외부 구획에 250 μL의 용지를 놓습니다.
    22. 각 중앙 칸에 2개의 중추를 놓습니다. 접시를 37°C, 5%CO2 인큐베이터로 되돌려 보라고 합니다.
    23. 다음 날 NBF의 2.5 mL를 추가합니다.
    24. 표 1의일정에 따라 문화권에 피드를 공급하여 DRG 준비를 시작하도록 선택한 날에 따라 일정을 변경합니다.
    25. 21일(또는 축삭이 말단 구획의 끝에 도달할 때), GBM 신경구를 가진 종자 배양(단계 3.2.26)을 가진 종자 배양및 살아있는 이미지 또는 올리고델로시테스 문화를 가진 배양을 myelinate (단계 3.3로 진행) 다음 GBM 신경구로 종자 myelination 후.
    26. 10% FBS를 함유하는 보충 된 NB 배지와 GBM 신경구로 시드 될 각 말단 구획 챔버에서 보충 된 NB 배지를 대체하십시오.
    27. P20 파이펫을 10 μL로 설정하면 배양 접시에서 GBM 신경구 1개를 제거합니다. GBM 신경구는 약 200 미크론의 크기를 측정해야합니다.
    28. 피펫의 끝을 말단 챔버에 놓고 GBM 신경구를 천천히 추방하여 중앙 챔버에 가장 가까운 말단 챔버 부분의 축삭에 부드럽게 떨어지도록 하십시오. 파이펫 팁이 축색을 방해하지 않도록 주의하십시오.
    29. GBM 신경구가 부착될 수 있도록 실온에서 1시간 동안 생물안전성 캐비닛에 배양합니다.
    30. 신경구가 부착되면, 매우 신중하게 보충 NB 매체와 말단 구획의 미디어를 교체.
    31. 필요에 따라 미디어를 추가하여 3-7일 동안 라이브 이미지 문화. 이 경우, 현미경에 부착된 제어된CO2 라이브 셀 인클로저(예를 들어, 자이스 액시오버트)를 사용하여 7일 동안 광시야를 사용하여 세포 이동을 지속적으로 모니터링하는 데 사용되었다. 관련 소프트웨어를 사용하여 10분마다 이미지를 수집했습니다. GFP를 발현하기 위해 안정적으로 형질감염된 hGCs를 사용하여 동일한 프로토콜을 반복하고 이미지는 브라이트필드와 488 nm 레이저의 조합을 사용하여 캡처되었습니다.
      참고: 신경구는 렌티바이러스로 변환되거나 플라스미드 또는 siRNAs로 형질전환될 수 있습니다. 구획은 또한 이동을 연구하기 위해 원하는 소분자 억제물로 치료될 수 있다.
  3. 올리고덴드로시테를 함유한 DRG 축삭의 수초화
    1. 올리고덴드로시테 격리 전날, DRG의 NB 배지를 C-Medium으로 대체합니다.
    2. 해부하기 전에, 파파인 버퍼 10 mL을 인큐베이터에 60mm 접시에 넣고 평형화하십시오.
    3. 라미나 흐름 후드에 100mm 접시 와 얼음 차가운 HBSS로 60mm 접시 하나를 채웁니다. 얼음 위에 놓습니다.
    4. 참수에 의해 P2 쥐 새끼를 희생. 가위를 사용하여 피부를 제거합니다. 피부가 제거된 후, 한 쌍의 미세 한 가위로 중간선을 따라 두개골을 자른다.
    5. 미세한 집게로 두개골을 부드럽게 제거합니다. 주걱을 사용하여 두개골 바닥에서 뇌를 부드럽게 떠서 뒤집힌 조직 배양 판 뚜껑으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 제거합니다.
    6. 소뇌를 제거하고 두 개의 대뇌 반구로 뇌를 분할. 각 반구의 대뇌 피질 아래 후각 전구, 해마 및 기저 중추를 제거합니다. HBSS를 포함하는 100 mm 접시에 대뇌 피질을 놓습니다. 나머지 동물에 대해 3.3.4-3.6 단계를 반복합니다.
    7. 한 번에 하나의 피질로 작업, 미세 듀몬트 집게와 수막을 제거. 모든 수막이 없는 코르티를 HBSS로 신선한 60mm 요리에 넣습니다.
    8. 피질 조직을 1mm3 개로 주사위하십시오. 얼음 위에 놓습니다.
    9. 15 mL 튜브에 평형 파파인 버퍼를 넣습니다. 추가 200 파파인 의 단위 와 2 mg L-시스테인. 필터 살균 및 멸균 DNase I의 200 μL을 추가합니다.
    10. 다진 뇌 조직에서 HBSS를 제거하고 3.3.2에서 파파인 버퍼로 대체하십시오. 접시를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 80분 동안 놓고 15분마다 부드럽게 흔들어 주세요.
    11. 소화된 조직을 50 mL 튜브로 옮기고 C-배지 2 mL를 추가합니다.
    12. 조직을 해리하는 5 mL 혈청학적 피펫과 삼투염; 더 큰 조직 조각이 정착할 수 있도록 하십시오. 상급을 제거하고 멸균 된 15 mL 튜브에 넣습니다.
    13. C-미디엄 2mL를 추가하고 5 mL의 세월학적 파이펫으로 삼조를 다시 한 번 반복합니다. 1 mL 파이펫 팁으로 전환하고 조직이 완전히 해리 될 때까지 삼중화. 15 mL 튜브로 옮김.
    14. 삼중 조직을 300 x g에서 15 분 동안 돌리십시오. 조심스럽게 상류를 제거하고 DMEM-ITS-G 매체의 8 mL에서 펠릿을 다시 놓습니다.
    15. 멸균 된 30 μM 세포 스트레이너를 2 mL의 PB 버퍼로 미리 적시다. 50 mL 튜브 위에 세포 스트레이너를 놓고 한 번에 셀 현탁액 1 mL을 필터링합니다. PB 버퍼의 5 mL로 필터를 헹구는 다.
    16. 세포 현탁액을 100 mm 세균성 판으로 옮기고; 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 15분 동안 배양하여 마이크로글리아가 부착될 수 있도록 하였다.
    17. 용지를 제거하고 15mL 튜브에 넣습니다. DMEM-ITS-G 배지 2mL로 플레이트를 부드럽게 헹구고 15 mL 튜브로 옮긴다.
    18. 셀 서스펜션을 부드럽게 다시 일시 중단합니다. 셀 현탁액의 10 μL을 취하고 10 μl의 트리판 블루로 희석하십시오. 자동화된 세포 카운터 또는 혈세포계를 사용하여 셀 현탁액의 10 μl을 계산합니다.
    19. 셀 서스펜션을 300 x g에서 10분 동안 회전시다.
    20. 흡위제는 1 x 107 셀마다 PB 버퍼의 70 μL에서 세포를 완전히 재중단시된다. 잘 섞고 4°C에서 10분 동안 배양합니다.
    21. 1 x 10x 7 셀마다 항 A2B5 마이크로 비드 20 μl을 추가하십시오. 잘 섞고 4 °C에서 배양하십시오.
    22. 4°C 원심분리기에서 10분 동안 1 x 10x 7 셀및 원심분리기마다 1-2 mL의 PB 버퍼를 넣고 300 x g에 원심분리기를 넣습니다.
    23. 완전히 흡인 상피. PB 버퍼의 500 μL에서 총 10개의 8 셀까지 재중단하십시오. 얼음에 보관하십시오.
    24. 분리기의 자기장에 자기 비드 컬럼을 배치합니다.
    25. PB 버퍼의 500 μL로 헹구어 컬럼을 준비합니다. 셀 서스펜션을 열에 적용합니다. 폐기물 용기에서 흐름을 통해 폐기합니다(레이블이 지정되지 않은 셀이 포함됨).
    26. PB 버퍼의 500 μL로 컬럼을 3회 세척합니다. 흐름을 통해 폐기합니다.
    27. 마그네틱 분리기에서 컬럼을 제거하고 수집 튜브에 놓습니다.
    28. 열에 PB 버퍼의 피펫 1 mL. 플런저를 컬럼에 단단히 밀어 자기 라벨이 부착된 셀을 플러시합니다.
    29. 셀 분수에 C-Medium 4 mL을 추가하고 10 분 동안 300 x g에서 회전하십시오.
    30. N2B2 미디엄 의 5 mL에서 상류를 제거하고 다시 일시 중단하십시오. 셀 현탁액 의 10 μL을 가지고 10 μL의 트리판 블루로 희석하십시오. 자동화된 세포 카운터 또는 혈세포계를 사용하여 셀 현탁액의 10 μL을 계산합니다.
    31. 완전히 확장된 축삭을 가진 DRG를 포함하는 구획된 챔버 당 150,000개의 세포의 농도에서 플레이트 올리고덴드로시테.
    32. 다음날 구획된 챔버내의 미디어를 N2B2로 변경하여 수분화할 수 있도록 한다. 2-3일마다 미디어를 교체하십시오. 14일 만에 완료됩니다.
    33. 14일째에, GBM 신경구를 가진 종자 배양은 3.2.26-3.2.32에서와 같이. 임의의 실험 기간 동안 N2B2 배지에서 골수배양체를 유지한다.
      참고: 프로토콜은 그림 1의순서도 회로도로 표시됩니다.

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Representative Results

축축과 hGCs의 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 앞서 설명한 대로 정제 된 DRG 축을 생성15,16,17,18. 이 정제된 DRG 축색은 hGCs로 시드되었고, 이는 축축네트워크 내에 통합된 GFAP+/Ki67+ 종양유사 구조를 형성하고, 개별 hGCs는 연관 또는 축사 사이를 이동하였다(그림2). hGCs가 myelinated 축삭과 상호 작용하는 방법을 결정하기 위해, 우리는 앞서 설명한 바와 같이 정제 된 쥐 oligodendrocytes와 DRG 축삭 배양을 씨앗 과 유도myelination 19,20,21. myelinated DRG-oligodendrocyte 공동 배양에 hGCs의 추가는 hGCs가 우리의 최근 논문에 도시된 바와 같이 가성포디아의 형성을 통해 myelined 축삭과 연관되어 이동하고 종양 덩어리로부터 멀리 이동하는 것으로 나타났다(그림 3)22. 올리고벤드로시테 근초화는 배양물의 미엘린 기본 단백질(MBP) 염색을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 문화권에서 hG의 마이그레이션을 정량화하기 위해 이미지 J 소프트웨어22를사용하여 마이그레이션hGCs가 차지하는 배양의 전체 면적을 측정했습니다.

월요일 수요일 금요일
1일차 Nbf
첫째 주 Nb Nbf Nb
2주차 Nbf Nb Nb
3주차 Nb Nb

표 1: DRG 배양의 공급 일정입니다.

Figure 1
그림 1: 프로토콜의 개략적 요약. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: hGCs는 DRG 축색과 공동 배양에서 종양과 같은 구조를 형성합니다. 배양액은 GFAP(적색) 및 Ki67(녹색)에 대해 고정및 염색되었고, 축색은 뉴로필라멘트(청색)로 염색되었다. 스케일 바: 200 μm. 이 수치는 최근에 발표된 논문22에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: hGCs는 myelinated 축색 트랙을 따라 마이그레이션합니다. 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 hGC는 hGC-DRG-올리고덴드로시트 배양 시스템에서 MBP에 대해 적색으로 염색된 골수성 축삭 트랙을 따라 이동한다. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

hGCs에 대한 마이그레이션 연구는 Boyden 챔버 시스템 또는 스크래치 검정을 사용하여 수행 될 수있다. 그러나, 이러한 실험은 다른 주변 조직과 종양 세포의 상호 작용에 관한 어떠한 정보도 제공하지 못하는 반면, 본 시스템은 골수및 비골수제 섬유와의 GC 상호작용을 재현할 수 있다. 더욱이, 종양 형성 및 종점 이동을 연구하기 위해, 설치류 뇌의 오르노티픽 슬라이스 배양또는 설치류 뇌 또는 측면에 신경교종 세포의 생체 내 이식은 이전에23,24,25를활용하였다. 신경교종 세포의 3차원 모델링에 대한 최근의 노력은 콜라겐 층26,27,28,성상세포계 스캐폴드29,30,세포외 매트릭스 층31,일렉트스펀 나노섬유32,하이드로겔33과같은 시스템을 활용하였다. 이러한 실험은 마이그레이션과 관련하여 만족스러운 종점 결과를 생성하지만 고해상도 현미경으로 실시간으로 연구할 수 있는 능력이 부족합니다.

여기에서는 구획된 챔버에서 DRG 공동 배양을 준비하여 hG의 마이그레이션을 연구하는 새로운 접근 방식을 시연했습니다. 신선한 GBM 조직에 대한 액세스를 사용할 수 있는 경우 hGCs를 격리하고 안정적으로 배양할 수 있습니다. hGCs는 처음에 신경구를 형성하는 데 시간이 오래 걸리지만, 일단 구체가 형성되면 배양및 하위 배양이 용이합니다. hGC 배양의 성공을 보장하기 위해 조직은 가능한 한 빨리 처리되어야합니다. 절제술과 가공 사이의 시간을 가능한 한 최소화해야 하며, 시료는 항상 얼음 위에 운반되어야 합니다.

DRG는 또한 쉽게 분리할 수 있고, 피질 뉴런보다 축삭을 더 오래 확장하며, 올리고덴드로시테를 함유한 배양물에서 쉽게 골수조를 할 수 있습니다. hGC 신경구 또는 해리된 hGCs는 챔버의 말단 구획에서 공동 배양되어, 살아있는 세포 이미징및 축세포 및 골수성 섬유와의 세포 상호 작용의 실시간 정량화를 허용합니다. 추가적으로, 이 프로토콜은 피질 뉴런이 또한 이 프로토콜에 대한 몇 가지 수정으로 분리되고 myelinated 될 수 있기 때문에, 단지 DRG 문화에 한정되지 않습니다. 이 모형은 또한 뇌암의 그밖 양식을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.

DRG는 분리 및 유지 관리가 비교적 간단하지만 구획 된 챔버를 추가하는 것은 시간이 많이 걸리며 성공하기 위해 교육과 연습이 필요한 수많은 기술적 한계를 만듭니다. 이 프로토콜의 성공에 중요한 것은 균일한 콜라겐 코팅과 배양 요리의 긁힘은 고르지 않거나 지나치게 두꺼운 콜라겐이 벗겨지는 경향이 있기 때문이다. 구획 된 챔버에 실리콘 그리스를 배치하는 동안 극단적 인주의를 기울여야합니다. 실리콘 그리스를 분배하는 동안 압력도 사용하지 않으면 구획 된 챔버의 바닥을 따라 틈이 있을 것이며, 이는 매체 누출을 방지하기 위해 과도한 그리스로 밀봉해야합니다. 또한, 배양 접시 바닥에 구획 챔버를 준수 할 때 최소 압력을 사용해야합니다. 도끼가 1 주 후에 중간 구획에서 교차하지 못하고 DRG가 그렇지 않으면 건강해 보이는 경우에, 구획된 챔버 또는 그리스의 과잉 양을 배치할 때 너무 많은 압력이 가해졌을 가능성이 높습니다.

뇌에서 골수및 비골수조 축삭을 따라 hGC 이동은 효율적이고 재현 가능한 ex vivo 모델의 부족으로 인해 잘 설명되지 않았다. 우리는 여기에서 신경교종 세포가 특히 종양 세포 이동을 표적으로 하는 새로운 처리 개발에 있는 결정적인 분대 인 축삭과 myelin를 따라 이동하는 방법을 연구하는 혁신적인 ex vivo 문화 시스템의 발달을 기술합니다. 우리의 배양 시스템은 구획 사이에 유동적인 격리가 있기 때문에 다양하며, 다양한 새로운 치료법이나 신경교종 세포 이동에 영향을 미치는 물질의 농도를 연구할 수 있는 능력을 촉진합니다. 우리의 공동 문화 시스템의 추가 장점은 실시간으로 hGC 마이그레이션 및 다양한 치료의 효과를 모니터링 할 수있는 기능입니다. 여기서 설명된 프로토콜은 현재 새로운 약물의 독성 및 효능을 평가하는 데 사용될 수 있는 독점적인 인간 세포 성분을 사용하여 보다 정교한 생체모방 3차원 생체 내 생체 시스템의 개발을 위한 기초로 사용되고 있다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 신경 외과의 부서의 내부 기금에 의해 지원되었다, N.T에 브라운 대학.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Suspension Culture Dish Corning 430591
2.5S NGF ENVIGO B.5025
60 mm Suspension Culture Dish Corning 430589
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher A1049201
Ammonium Hydroxide Solution Fisher Scientific A669-500 Concentrated
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech AF-100-18B
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat Miltenyi Biotec 130-093-392
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher 15240062
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) Miltenyi Biotec 130-091-222
B27 Supplement Thermo Fisher 17504044
B27 Supplement, minus vitamin A Thermo Fisher 12587001
Bacteriological Plate BD Falcon 351029
Biotin Sigma B4639
BSA Sigma A9418
Campenot Chamber Tyler Research CAMP-10
Cell Culture Dish Corning 430165 35mm X 10mm
Cell Strainer BD Falcon 352350 70 uM, Nylon
Cell Strainer BD Falcon 352340 30 uM, Nylon
Collagenase/Dispase Roche 11097113001
Cultrex Rat Collagen I Trevigen 3440-100-01
D-Glucose Sigma G5146
DMEM Thermo Fisher 10313021
DNase I Sigma D7291
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Scientific 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5045
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat
EBSS Sigma E7510
EGTA Sigma E3889
FBS Hyclone SH30070.02
FUDR Sigma F0503
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35050061
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher 11765054
HBSS Thermo Fisher 14175095
Hemostatic Forceps Roboz RS-7035
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS Stem Cell Technologies 07980
Hypodermic Needle, 18G BD 511097
Insulin-Transferrin-Selenium G Thermo Fisher 41400045
L-Cysteine Sigma C7477
L-Glutamine Thermo Fisher 25030081
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MEM Thermo Fisher 1190081
Mg2SO4 Sigma M2643
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MS Columns plus tubes Miltenyi Biotec 130-041-301
NAC Sigma A8199
NaHCO3 Sigma S5761
Neurobasal Medium Thermo Fisher 21103049
Neurobasal-A Medium Thermo Fisher 10888022
Ordinary forceps
P2 Sprague Dawley Rat Pups
Papain Worthington LS003126
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140148
Pin Rake Tyler Research CAMP-PR
Progesterone Sigma P8783
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher A1110501
Syrine Grease Applicator Tyler Research CAMP-GLSS
Transferrin Sigma T2036
Uridine Sigma U3003

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References

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암 연구 문제 154 신경교종 줄기 세포 이동 ex vivo 모델 공동 배양 DRG 축삭 미엘린
등쪽 뿌리 신경절 축삭-올리고젠드로시트 공동 배양에 대한 인간 신경교종 세포 이동의 실시간 모니터링
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Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Tapinos, N. Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures. J. Vis. Exp. (154), e59744, doi:10.3791/59744 (2019).

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