Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تعديل التعريب تاو Subcellular كاداه للتحقيق في التعبير عن الجينات المرتبطة بالمرض

Published: December 20, 2019 doi: 10.3791/59988
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Biology, BIO@SNS, Scuola Normale Superiore

Summary

تاو هو بروتين الخلايا العصبية الموجودة علي حد سواء في السيتوبلاسما ، حيث انه يربط الأنابيب الدقيقة ، وفي النواة ، حيث يمارس وظائف غير تقليديه بما في ذلك تحوير الجينات المرتبطة بمرض الزهايمر. هنا ، ونحن وصف طريقه للتحقيق في وظيفة تاو النووية في حين استبعاد اي تدخلات قادمه من السيتوبلازمي تاو.

Abstract

تاو هو بروتين ملزم ميكروتوبولي المعرب عنها في الخلايا العصبية ويرتبط وظيفتها الرئيسية المعروفة للحفاظ علي الاستقرار خلوي. ومع ذلك ، أشارت الادله الاخيره إلى ان تاو موجود أيضا في مقصورات فرعيه أخرى بما في ذلك النواة حيث انها متورطة في حماية الحمض النووي ، في النسخ rRNA ، في حركه الرجعية وفي التنظيم الهيكلي لل نويه. وقد أظهرنا مؤخرا ان تاو النووية تشارك في التعبير عن جين VGluT1 ، مما يوحي بوجود اليه الجزيئية التي يمكن ان تفسر الزيادة المرضية من الإفراج الغلوتامات في المراحل المبكرة من مرض الزهايمر. حتى وقت قريب ، كانت مشاركه تاو النووية في تحوير التعبير عن الجينات المستهدفة غير مؤكده نسبيا وغامضه بسبب القيود التقنية التي منعت استبعاد مساهمه السيتوبلازمية تاو أو تاثير الأخرى عوامل المصب غير المرتبطة بالنووية تاو. للتغلب علي هذا الشك ، قمنا بتطوير طريقه لدراسة التعبير عن الجينات المستهدفة التي يتم تضمينها علي وجه التحديد من قبل بروتين تاو النووي. استخدمنا بروتوكولا ان الأزواج استخدام إشارات التعريب وتجزئه سوبسيلولار ، مما يسمح باستبعاد التدخل من جزيئات تاو سيتوبلازمي. والاهم من ذلك ، ان البروتوكول سهل ويتالف من أساليب كلاسيكية وموثوقه يمكن تطبيقها علي نطاق واسع لدراسة الوظيفة النووية لتاو في أنواع الخلايا الأخرى والظروف الخلوية.

Introduction

وقد اكتسبت وظائف بروتين تاو في النواة اهتماما كبيرا في السنوات الاخيره ، حيث ثبت انها ترتبط ارتباطا وثيقا بالأحماض النووية1،2،3،4،5،6. وفي الواقع ، أظهرت دراسة أجريت مؤخرا علي نطاق الجينوم ان تاو تربط متواليات الحمض النووي الوراثية والجينية في الجسم الحيوي7. وقد اقترح دور في نوكليولار منظمه8و9و10و11. وعلاوة علي ذلك, وقد اقترح تاو لتكون متورطة في حماية الحمض النووي من الاكسده وفرط الضغط المفرط5,10,12,13, في حين تم ربط المتحول تاو إلى عدم استقرار الكروموسوم و صيغه الصبغيه14,15,16.

حتى الآن ، ظلت التحديات في دراسة وظائف تاو في المقصورة النووية دون حل تقريبا بسبب الصعوبات في تشريح مساهمه محدده من تاو النووية من مساهمه السيتوبلازمية تاو. وعلاوة علي ذلك ، فان الوظائف المنسوبة إلى جزيئات تاو في المقصورة النووية ، حتى الآن ، ليست سوي صله نسبيه لأنها تفتقر إلى دليل قاطع علي المشاركة المباشرة لبروتينات تاو النووية. وفي الواقع ، فان مشاركه تاو في التنقل من الرجعية أو في النسخ rrna أو في حماية الحمض النووي11،12،17،18،19 يمكن ان تفسر أيضا من خلال مساهمه الخلوية تاو أو تاثير العوامل الأخرى المصب غير المرتبطة تاو النووية.

هنا ، ونحن نقدم طريقه التي يمكن ان تحل هذه المسالة عن طريق استغلال الإجراءات الكلاسيكية لعزل المقصورة النووية مع استخدام يبني تاو 0N4R الموسومة التعريب النووي (NLS) أو إشارات التصدير النووية (NES). هذا النهج يلغي القضايا المعقدة المتعلقة بالمصنوعات اليدوية المحتملة بسبب امتداد جزيئات تاو من المقصورة السيتوبلازمية. وعلاوة علي ذلك ، فان بناء تاو-NLS و Tau-NES يحفز علي إثراء أو استبعاد جزيئات تاو من المقصورة النووية ، علي التوالي ، مما يوفر ضوابط ايجابيه وسلبيه لاشراك جزيئات تاو النووية في وظيفة محدده. والبروتوكول سهل من الناحية التقنية وهو يتالف من أساليب تقليديه وموثوق بها تنطبق علي نطاق واسع لدراسة الوظيفة النووية لتاو في أنواع الخلايا الأخرى ، المتمايزة ام لا ، مثل الخلايا السرطانية التي تعيد تنشيط تعبير تاو20،21. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تطبيقه أيضا علي البروتينات الأخرى الموجودة في كل من السيتوبلاسما والنواة من أجل تشريح الوظائف البيولوجية المتعلقة بالمقصورات المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ثقافة الخلية

  1. الثقافة SY5Y الخلايا (خط خليه الورم الارومي العصبي البشري ، CRL-2266) في المتوسط الكامل (النسر المعدل دولبيكو المتوسطة: خليط المغذيات F12 [DMEM/F-12] تستكمل مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية ، 2 ملم L-الجلوتامين ، 100 U/mL البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين). الحفاظ علي الخلايا في حاضنه في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2. تنمو الخلايا في لوحات 10 سم والانقسام عند متموج.

2. تمايز الخلايا

  1. لتفريق الخلايا SY5Y ، في اليوم التالي للطلاء ، أضافه 10 μM حمض الريتينويك (RA) لإكمال المتوسطة لمده 5 أيام.
  2. اليوم السادس استبدال المتوسطة مع التمايز المتوسطة: DMEM/F-12 تستكمل مع 50 ng/mL BDNF ، 2 مم L-الجلوتامين. لا تقم باضافه المضادات الحيوية.
  3. تنمو الخلايا في وسط التمايز لمده 3 أيام.

3. تشيريك يبني الاستنساخ

  1. توليد تاو-nls بناء عن طريق الاستنساخ عن طريق الهضم الانزيم تقييد في الإطار في 3 ' نهاية تاو تسلسل 0n4r (383aa) 3xNLS (SV40NLS): 5 '-ccaaaaaaggagaaagaggagaaagaggagaagggatagagاجياغاججاجااجااغاجيغاجيجاغاتاج
    ملاحظه: يتم استنساخ 3xNLS في 3 ' نهاية تاو في البلازما pCMV-تاو للتعبير الثدييات استغلال مواقع تقييد XhoI و BamHI في موقع متعدد الاستنساخ (الاشراف).
  2. توليد تاو-نيس بناء عن طريق الاستنساخ عن طريق الهضم الانزيم تقييد في الإطار في 3 ' نهاية تاو تسلسل 0N4R (383aa) التسلسل نيس: 5 '-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTAAGAGTTTGGATCTCGTACNRTCT.GT1 '.
    ملاحظه: يتم استنساخ NES في 3 ' نهاية تاو في البلازميد pcmv-تاو للتعبير الثدييات استغلال المواقع التقييد ecori و bamhi في الاشراف علي الاشراف الذاتي.
  3. تحويل DH5alpha e. القولونية سلاله مع 100 ng من الحمض النووي من الخطوة 3.1 أو 3.2 وخلايا لوحه علي لوحات LB-أجار مع 100 ملغ/مل ampicillin. دعوانا تنمو بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
  4. اختيار مستعمره واحده وارتفاع الخلايا إلى 5 مل من LB مع الامبيسلين. السماح للخلايا تنمو في 37 درجه مئوية في الانفعالات بين عشيه وضحيها.
  5. استخراج البلازميد مع miniprep الحمض النووي (جدول المواد) وتسلسل للتحقق من الثوابت.
  6. تحويل DH5alpha القولونية سلاله مع ثوابت التحقق من تسلسل وخلايا لوحه علي لوحات LB-أجار مع الامبيسيلين. دعوانا تنمو بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
  7. اختيار مستعمره واحده وارتفاع الخلايا إلى 5 مل من LB مع الامبيسلين. السماح للخلايا تنمو في 37 درجه مئوية في الانفعالات ل 2 ح.
  8. وضع الخلايا من الخطوة 3.7 في 200 مل من LB مع الامبيسلين. دعوانا تنمو بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
  9. بيليه الخلايا في 3,500 x g لمده 10 دقيقه في 4 °c.
  10. استخراج البلازميد مع الحمض النووي maxiprep (جدول المواد).

4-الخلية الناقلة

  1. البذور 400,000 الخلايا من الخطوة 1.1 في لوحات 6-حسنا أو 20,000 الخلايا في 8-بئر الشرائح الغرفة. لوحه أربع عينات: خلايا التحكم ليتم نقلها مع ناقل فارغ, الخلايا التي يتم نقلها مع تاو غير الموسومة, الخلايا التي يتم نقلها مع تاو-NLS والخلايا التي يتم نقلها مع تاو-نيس.
  2. اليوم بعد البذر transfect 400 ng من الحمض النووي لكل بئر باستخدام الدهون موجب (جدول المواد) في لوحات6-حسنا أو 200 ng من الحمض النووي لكل بئر لشرائح 8-بئر الغرفة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    1. احتضان الحمض النووي والدهون موجب بشكل منفصل في 250 μl (للوحات 6-حسنا) أو 25 μl (لشرائح 8-بئر الغرفة) من المتوسط مصل مخفضه لمده 5 دقائق في RT. ثم الجمع بينهما لتوليد مجمع الحمض النووي والدهون واحتضان لمده 20 دقيقه.
    2. استبدلت الثقافة وسط مع 2 [مل] (ل [6-وست] لوحات) أو 250 μL (ل [8-ول] غرفه منزلقات) من طازجه ثقافة كامله متوسطه. أضافه مجمع الحمض النووي الدهني إلى الخلايا واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
  3. بدلا من ذلك ، transfect الحمض النووي مع الكاشف موجب بوليثيلينمين (PEI).
    1. اخلط 2 ميكروغرام من الحمض النووي و 6 μL من PEI مع 200 μL من الثقافة الكاملة المتوسطة (لكل بئر في لوحات 6-حسنا) ، أو 1 ميكروغرام من الحمض النووي و 3 μL من PEI مع 100 μL من الثقافة الكاملة المتوسطة (لكل بئر في الشرائح 8-بئر الغرفة) والدوامة واحتضان لمده 10 دقيقه في RT.
    2. أضافه المزيج إلى الخلايا وأضافه 1.8 mL من الثقافة الكاملة المتوسطة في بئر في 6 لوحات جيدا أو 150 μL من الثقافة الكاملة المتوسطة في بئر في 8-بئر الشرائح الغرفة للوصول إلى حجم الطلاء.
  4. تغيير متوسط اليوم بعد التحويل وأضافه وسائط التمايز كما هو موضح في الخطوة 2.2.

5. المناعي

  1. أزاله الثقافة المتوسطة وشطف الخلايا مع 1x تلفزيوني. إصلاح الخلايا مع 100 ٪ الميثانول الجليد الباردة لمده 3 دقائق دون اهتزاز. أزاله حل إصلاح ويغسل لفتره وجيزة مع 1x تلفزيوني.
  2. بيركابايز مع 0.1 ٪ غير الايونيه السطحي في 1x تلفزيوني لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة (RT). لفتره وجيزة ، وغسل مع 1x تلفزيوني ، 3 مرات.
  3. احتضان الخلايا مع حجب العازلة (0.1 ٪ توين 20 و 1 ٪ جيش الصرب البوسنيين في الاذاعه التلفزيونية) لمده 30 دقيقه في RT علي شاكر المدارية.
  4. احتضان مع الأجسام المضادة الاساسيه المناسبة (علي سبيل المثال ، الأجسام المضادة لTau13 الماوس الاحاديه) المخفف 1:500 في حجب العازلة بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية علي شاكر المدارية. أزاله حل الأجسام المضادة ويغسل ، لفتره وجيزة ، مع 1x تلفزيوني.
  5. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق إلى فلوكوفيري (علي سبيل المثال ، الأجسام المضادة لمكافحه الماوس الماعز مترافق إلى اليكسا فلور 633) المخفف 1:500 في حجب العازلة ل 1 ح في RT. أزاله حل الأجسام المضادة ويغسل لفتره وجيزة مع 1x تلفزيوني 3 مرات.
  6. إلى النوى وصمه عار ، احتضان مع DAPI المخفف 1:20000 في حجب العازلة لمده 10 دقيقه في RT. غسل مع 1x تلفزيوني 3 مرات. جبل الشفتين علي شريحة باستخدام اللورن المتوسطة المتصاعدة.

6. لطخه الغربية

  1. لجمع بيليه الخلية من الخطوة 4.4 ، وأزاله المتوسطة ، وغسل الخلايا مع تلفزيوني. احتضان مع 500 μL من 0.1 ٪ التربسين لمده 4 دقائق في 37 درجه مئوية. أضافه وحده تخزين متساوية المتوسطة الكاملة وأعاده تعليق الخلايا.
  2. جمع الخلايا في أنبوب والطرد المركزي في 500 x g لمده 5 دقائق. في نهاية طرد أزاله بعناية supernatant. أضافه 1 مل من تلفزيوني ، جهاز الطرد المركزي في 500 x g لمده 5 دقائق وأزاله بعناية supernatant. تخزين كريات الخلايا علي الجليد للاستخدام الفوري أو تجميد في-80 درجه مئوية للتخزين علي المدى الطويل.
  3. لمستخلصات البروتين الكلي ، احتضان بيليه الخلية لمده 30 دقيقه علي الجليد في تحلل العازلة (20 مم تريس-HCl pH 8 ، 20 مم كلوريد الصوديوم ، 10 ٪ الجلسرين ، 1 ٪ اوكتيلفينوكسي بولي (ايثيل نياوكسي) الايثانول ، متفرعه (جدول المواد) ، 10 مم أدتا) تكمله مع الانزيم البروتيني ومثبطات الفوسفاتيز. وفقا لوفره من بيليه ، استخدم 50 μL إلى 100 μL من المخزن المؤقت تحلل.
    1. الطرد المركزي استخراج في 16,000 x g لمده 15 دقيقه جمع ماده طافي وتحديد تركيز البروتين من قبل اي فحص القياس الكمي القياسية. اعداد عينات البروتين لل SDS-PAGE عن طريق خلط 20 ميكروغرام من البروتينات مع 5 μL من 4x العازلة Laemmli في حجم إجمالي من 20 μL ويغلي عند 100 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
      ملاحظه: يمكن تخزين العينة عند-20 درجه مئوية.
  4. بالنسبة لعمليات التجزئة الفرعية ، أعاده تعليق الخلايا من الخطوة 6.2 في وسط كامل ، وجمع 1 × 106 خلايا لكل عينه. جهاز الطرد المركزي في 500 x g ل 10 دقيقه للحصول علي كريات الخلية للخطوات التالية.
    1. لعزل المقصورات شبه الخلوية ، فرااكتينات وفقا لمواصفات عده. لعزل كل كسر ، احتضان الخلية بيليه من الخطوة 6.4 مع العازلة المقابلة ، الطرد المركزي ، وجمع ماده طافي وأضافه المخزن المؤقت التالي إلى بيليه كما هو موضح في 6.4.1.1-6.4.1.5. أضافه في النظام العازلة استخراج سيتوبلازمي ، غشاء العازلة استخراج ، العازلة النووية استخراج ، المخزن المؤقت استخراج النووية تستكمل مع 5 مم cacl2 و 3 U/μl ميكروكوككال النيوداز و خلوي استخراج العازلة.
      ملاحظه: يجب ان تستكمل جميع المخازن المؤقتة مع مثبطات الانزيم البروتيني. حجم وحدات تخزين المخزن المؤقت وفقا لحجم الخلية بيليه.
      1. لعزل الكسر السيتووليك ، الكريات الخلية حضن في 100 μl من الجليد الباردة العازلة استخراج سيتوبلازمي تستكمل مع مثبطات الانزيم البروتيني في 4 درجه مئوية مع خلط لطيف لمده 10 دقيقه. الطرد المركزي في 500 x g في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق ونقل ماده طافي لأنابيب ما قبل المبردة.
      2. أضافه 100 μL من المخزن المؤقت استخراج غشاء الجليد الباردة تستكمل مع مثبطات الانزيم البروتيني لبيليه من الخطوة 6.4.1.1 ، واحتضان في 4 درجه مئوية مع خلط لطيف لمده 10 دقيقه. أجهزه الطرد المركزي في 3,000 x g في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق وجمع supernatant.
      3. لكسر النووية القابلة للذوبان ، أضافه 50 μL من العازلة استخراج النووية تستكمل مع مثبطات الانزيم البروتيني لبيليه من الخطوة 6.4.1.2 ، ودوامه. احتضان في 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه ، جهاز الطرد المركزي في 5,000 x g في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، وجمع supernatant.
      4. لكسر النووية غير قابله للذوبان ، أضافه 50 μL من العازلة استخراج النووية تستكمل مع مثبطات البروتياز ، CaCl2 و micrococcal النيوداز إلى بيليه من الخطوة 6.4.1.3 ، ودوامه. احتضان في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، ومن ثم دوامه مره أخرى. جهاز الطرد المركزي في 16,000 x g في RT لمده 5 دقائق وجمع supernatant.
      5. لكسر خلوي ، أضافه 50 μl من العازلة استخراج خلوي تستكمل مع مثبطات الانزيم البروتيني لبيليه من الخطوة 6.4.1.4 ، ودوامه. احتضان 10 دقيقه في RT. الطرد المركزي أنبوب في 16,000 x g لمده 5 دقائق ، وجمع ماده طافي وتجاهل بيليه.
        ملاحظه: حجم وحدات تخزين المخزن المؤقت وفقا لحجم الخلية ، كما هو موضح في بروتوكول مجموعه الاداات. الرجوع إلى بروتوكول عده للحصول علي مزيد من التفاصيل حول الحضانة و طرد الوقت ودرجه الحرارة22،23،24،25،26،27،28،29. بدلا من ذلك ، استخدم اي من الطرق القياسية30 التي ، باستخدام المنظفات وزيادة القوه الايونيه وسرعه طرد ، يفصل السيتووليك ، الغشاء المنضم ، السيتوكيلميتال والكسور النووية. الفصل بين الكسر النووي القابل للذوبان والكسر النووي الذي لا يمكن ذوبانه عن طريق استغلال مخازن الاستخراج النووي القياسية. يمكن تخزين العينة عند-20 درجه مئوية.
    2. ل SDS-الصفحة ، أضافه 7 μL من 4x العازلة Laemmli إلى 20 μL من الكسور الخلوية التي تم الحصول عليها من الخطوات 6.4.1.1 − 6.4.1.5 ، يغلي عند 100 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
  5. تحميل عينات علي هلام اكريلاميد وأداء الكهربائي في الجهد المستمر من 120 V. نقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز في 250 mA لمده 90 دقيقه.
  6. تحقق السليم الكهربائية هلام البروتين والناجحة التنقيط من خلال احتضان الغشاء لمده 5 دقائق في الحل بونسو تلطيخ. شطف الغشاء في الماء المقطر حتى الخلفية نظيفه. أزاله وصمه عار من خلال مواصله الغسيل مع تريس المالحة مخزنه مع توين 20 (TWEEN) لمده 10 دقيقه علي شاكر.
  7. احتضان الغشاء مع حل الحجب (5 ٪ الحليب في TBST) لمده 1 ساعة في RT علي شاكر. اغسل 3 مرات مع TBST لمده 5 دقائق.
  8. تهجين الغشاء مع الأجسام المضادة الاساسيه في محلول الحجب (1 ٪ حليب في TBST) بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية. اغسل 3 مرات مع TBST لمده 5 دقائق.
  9. تهجين الغشاء مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع الشكل في المحلول المانع لمده 1 ساعة في RT. اغسل 3 مرات مع TBST لمده 5 دقائق.
  10. الكشف عن الشريط البروتين باستخدام التلالؤ الكيميائي. قياس كثافة الشرائط الغربية لطخه من قبل ImageJ. تطبيع التعبير البروتين علي المنتج من الجينات التدبير المنزلي: هيستون H2B لكسر النووية القابلة للذوبان وغير قابله للذوبان ، جابده لكسر سيتوبلاسولي والمقتطفات الاجماليه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد تم تصوير الاستراتيجية المستخدمة لتشريح تاثير النووية تاو في التعبير الجيني تجنب مساهمه بروتينات تاو السيتوبلازمي في الشكل 1. لفتره وجيزة ، يتم تجميع البروتينات تاو الموسومة NLS أو NES في أو مستبعده من المقصورة النووية ، علي التوالي. والأثر الوظيفي لهذا العدم التوازن هو تغيير التعبير الجيني مقيسا كنتاج لجين VGluT1.

بعد وصف البروتوكول ، تم التعامل مع الخلايا SY5Y مع RA لمده 5 أيام ومن ثم مع BDNF لمده 3 أيام من أجل الحصول علي ما بعد الخلايا العصبية مثل الخلية (الشكل 2). في غياب RA و BDNF ، تفترض الخلايا SY5Y غير المتمايزة شكل مستدير وكتل خلايا النموذج. كما هو متوقع ، بدء بروتوكول التمايز ، كتل الاسترخاء والخلايا تنتشر خارج العصب. في نهاية التمايز ، يتم توزيع الخلايا بشكل موحد ومترابطة عبر شبكه من العصب المتفرع.

اليوم بعد البذر ، وقد تم نقل الخلايا مع تاو-nls أو تاو-نيس البلازميدات (القسم 4.2) مع الدهون موجب. بالنسبة للخلايا التي تعبر عن ثوابت تاو-NLS أو تاو-نيس ، يمكن الكشف عن التعريب الخلوي الفرعي تاو بواسطة المناعي مع الأجسام المضادة لمكافحه تاو. اعتمادا علي كفاءه التحويل ، تعرض الخلايا تلطيخا نوويا قويا يدمج مع اشاره DAPI أو تلطيخ سيتوبلازمي مع نوى فارغه إذا تم تحويلها بنجاح مع تاو-NLS أو تاو-نيس ، علي التوالي (الشكل 3). ويشير نقص هذه الإشارات المحددة إلى عدم كفاءه النقل.

لتحليل البروتينات المخصبة في حجره فرعيه مختلفه ، تم جمع الخلايا وحسابها من أجل معالجه كميات متساوية من الخلايا لكل عينه. اي أسلوب تجزئه القياسية التي يستغل زيادة المنظفات والقوه الايونيه وزيادة سرعه طرد يمكن استخدامها لفصل المقصورات الخلوية من بعضها البعض ، التالي عزل السيتووليك ، والغشاء المنضم ، و خلوي والكسور النووية.

وبمجرد ان تكون النوى معزولة ، تم فصل الكسر القابل للذوبان النووي والجزء المنضم الكروماتين باضافه 3 U/μL من النيوكوكال النونوداز و 5 مم CaCl2.

لتحليل لطخه الغربية ، وقد تم تحميل كميات متساوية من الكسور الخلوية والاغشيه ونصف كميات من الكسور الأخرى علي هلام اكريلاميد المتدرج الجاهزة ، لتصحيح لكميه مختلفه من العازلة المضافة في كل خطوه.

للتحقق من الفصل الفعال لكسور مختلفه ، تم تنفيذ لطخه الغربية استغلال الأجسام المضادة التالية: المضادة--gadph (الحاضر في جميع الكسور باستثناء خلوي والمخصب بشكل خاص في الجزء السيتوبلازمي) ؛ المضادة لل actin (المخصب بشكل خاص في كسر خلوي) ؛ المضادة للأنابيب (المخصب بشكل خاص في الكسور السيتوبلازمية والخلايا السيتوكيلميتال) ؛ المضادة لH2B (المخصب في الكسور النووية) (الشكل 4).

ويشير إثراء هذه العلامات في كسور الخلايا الفرعية المختلفة إلى ان التجزئة لا يتم تنفيذها بشكل جيد. ولا بد من الاشاره إلى ان اي بروتوكول لتجزئه الخلايا الفرعية قد يقدم 10-15% من التلوث بين الكسور.

وبمجرد التحقق من تجزئه العينة بنجاح ، تم اجراء اللطخه الغربية للتحقق من اشاره تاو في المقصورة النووية واشاره VGluT1 في المقتطف الإجمالي (الشكل 5). في حين غير الموسومة تاو هو قابل للكشف في جميع الكسور, تاو-NLS هو المخصب بقوة في المقصورة النووية وانها غير قابله للكشف في الجزء السيتوبلازمي. وعلي العكس من ذلك ، فان تاو-نيس مخصب في الجزء السيتوبلازمي وهو اقل اكتشافا في الكسر النووي. وجود كميه صغيره من تاو-نيس في كسر النووية القابلة للذوبان يجب ان يكون متوقعا منذ ، مثل تاو الذاتية ، فانه يتم نقلها إلى النواة ومره واحده في المقصورة النووية اشاره التصدير النووي يسمح لها ينتقل إلى السيتوبلاسما. الكشف عن إثراء مختلفه لهذه البروتينات الانصهار اثنين قد تشير إلى وجود مشكله في كفاءه النقل أو في استنساخ الثوابت أو في تجزئه.

يمكن اجراء التحليل الكمي للطخه الغربية باستخدام ImageJ. يتم تطبيع القيم لجين التدبير المنزلي محدده لكل كسر (جابده لكسر السيتوبلازمية ؛ هيستون H2B للذوبان النووية والكسور المرتبطة الكروماتين).

ويبلغ الرسم البياني في الشكل 5(ب ) نسبه تاو في الكسر النووي القابل للذوبان والكسر السيتوبلازمي لتسليط الضوء علي ان تاو-nls غني جدا في الكسر النووي القابل للذوبان (snf) في حين انخفض تاو-نيس. وعلاوة علي ذلك ، يتم إثراء تاو-NLS في الجزء المرتبط بلون الكروماتين (CBF) فيما يتعلق بالجزء السيتوبلازمي (CF) في حين ينخفض تاو-نيس. SNF/CF = 1 و CBF/CF = 1 تتوافق مع نسبه تاو في خلايا التحكم. [تاو] محليه قابل للكشف ضعيفه في كل كسور بما ان يتوقع. ويفيد الرسم البياني في الشكل 5جيم بالتقدير الكمي للتعبير الVGluT1 في مجموع مقتطفات العينات التي تعبر عن كميه مختلفه من الاسلحه النووية تاو. في الخلايا التي تعبر عن تاو-نيس ، تعبير VGluT1 مشابه للتعبير الأساسي في خلايا التحكم. علي العكس من ذلك ، في الخلايا التي تعبر عن تاو أو تاو-NLS غير الموسومة ، والتعبير عن VGluT1 هو أكثر من الضعف.

Figure 1
الشكل 1: التمثيل الرسومي للاستراتيجية المستخدمة للسماح بالتراكم النووي أو السيتوبلازمي الخلوي لل تاو. [تاو-نلس] كدست في المقصورة نوويه بينما [تاو-نيس] استثنيت. القراءة تجريبية التشكيل من ال [VGluT1] تعبير. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: ثقافة الخلية التمثيلية غير المتمايزة والمتمايزة. صوره من SY5Y غير متمايزة (اليسار) ، والخلايا التي تميزت RA (الأوسط) والمتمايزة من قبل RA و BDNF (اليمين). شريط مقياس = 100 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الصورة التمثيلية لإثراء الخلية الفرعية تاو بواسطة المناعة. صوره الخلايا غير المحولة أو التي تعبر عن الثوابت تاو أو تاو أو تاو-NLS الغير موسومة. تم الحصول علي اشاره تاو من قبل المناعي (الأحمر) ، وقد تم الحصول علي اشاره نوى من قبل تلطيخ DAPI (الأزرق) ، يتم الإبلاغ عن الصور المدمجة. شريط مقياس = 10 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الكشف التمثيلي للبروتينات المخصبة في الكسور الخلوية بواسطة لطخه الغربية. لطخه غربيه من كسور [سوبخلوي] من [ش-SY5Y] خلايا. CF = الكسر السيتوبلازمي ؛ MF = كسر غشاء; SNF = الكسر النووي القابل للذوبان ؛ CBF = الجزء المرتبط الكروماتين; Ckf = كسر خلوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الكشف التمثيلي للبروتينات النووية تاو وVGluT1. (ا) الوصمة الغربية لبروتين تاو المكتشفة في الكسور النووية والجزيئات السيتوبلازمية. (ب) ويبلغ الرسم البياني نسبه تاو في الكسور النووية والكسر السيتوبلازمي. وقد تم تطبيع القيم علي تاو الذاتية. SNF/CF = 1 و CBF/CF = 1 يتوافق مع نسبه تاو الذاتية في خلايا التحكم. (ج) وصمه عار الغربية من بروتين VGluT1. (د) ويفيد الرسم البياني بالتقدير الكمي لتعبير VGluT1 في مجموع مقتطفات العينات التي تعبر عن كميه مختلفه من الاسلحه النووية تاو. كروكال واليس ANOVA واختبار مان ويتني; p < 0.001 ، * * * * p < 0.0001 ، نوفاسكوتيا p > 0.05. وتظهر جميع النتائج كما يعني ± SEM من ثلاث تجارب مستقله علي الأقل. وقد عدل هذا الرقم التمثيلي من Siano et al.31. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ونحن نوضح طريقه لقياس تاثير بروتين تاو النووي علي التعبير الجيني. مع هذا بروتوكول المساهمة من [سيتوميك] [تاو] بقوة محدوده. الخطوات الهامه لهذا البروتوكول هي التالية: التفريق بين خلايا الورم الارومي العصبي البشري SY5Y ، والتجزئة تحت الخلوي وتوطين بروتين تاو في المقصورة النووية.

أولا ، كما هو مبين في قسم النتائج التمثيلية ، فان التفريق بين خلايا SY5Y عن طريق أضافه RA و BDNF أمر حاسم للحصول علي اعداد جيد للخلايا الشبيهة بالخلايا العصبية في الثقافة. كثافة الخلايا المصنفة مهمة بشكل خاص لان الكثافة المنخفضة قد تؤثر علي انتشار الخلايا. وعلاوة علي ذلك ، للتجارب التي تحتاج إلى عدد كبير من الخلايا ، مثل التجزئة الخلوية ولطخه الغربية ، من المهم ان نلاحظ ان الخطوة التمايز BDNF كتل انتشار الخلوية للسماح التمايز الطرفية ، التالي الحد من عدد الخلايا في الثقافة. تستخدم بروتوكولات التفريق البديلة RA أو NGF فقط بدلا من BDNF. ومع ذلك ، في حين أضافه bdnf بعد RA يسمح للوصول إلى التمايز المورفولوجية أفضل32،33، ngf يحث علي ضعف العصب العصبي في خلايا SY5Y34. وعلاوة علي ذلك ، فقد ثبت علي نطاق واسع ان الجمع بين RA و BDNF يسمح للحصول علي السكان العصبية متجانسة مع التعبير عن علامات الخلايا العصبية وانخفاض الانتشار35. ولهذا السبب ، فان بروتوكول التمايز المستغل هنا يجمع بين RA و BDNF.

ومع ذلك ، يمكن استخدام الاجراء المبلغ عنه لتشريح دور تاو في مقصورات فرعيه مختلفه أيضا للخلايا غير المتمايزة أو لأنواع الخلايا المختلفة.

التجزئة سوبسيلولار هو خطوه حرجه جدا وان أمر حاسم ان يكون ما يكفي من مواد البداية: مجموعه تجاريه يتطلب سوي 1 × 106 خلايا ، في حين ان الإجراءات الأخرى قد تحتاج إلى كميه اعلي بكثير بدءا. وعلاوة علي ذلك ، فان استخدام مجموعه من المواد ذات المخازن المؤقتة والخطوات القياسية يضمن استنساخ التجربة التي لا مفر منها وضرورية. ومع ذلك ، منذ تكوين المخازن المؤقتة في كثير من الأحيان الملكية ، فانها قد تحتوي علي المنظفات التي قد تغير وظيفة البروتين من الفائدة وانه قد يكون من الصعب تحسين عزل الكسور. وعلاوة علي ذلك ، حتى في أفضل حاله ، قد يكون هناك 10-15 ٪ من التلوث بين الكسور. ويمكن التغلب علي الغلة الهزيلة من كل كسر عن طريق زيادة وقت الحضانة في المخازن المؤقتة الاستخراج من كسور محدده.

نظرا لان وظائف النووية تاو قد اكتسبت اهتماما كبيرا في السنوات الاخيره ، فمن المهم بشكل خاص لتوفير طريقه موثوق بها لتشريح وظيفة تاو في المقصورات الخلوية المختلفة. اقتران التجزئة تحت الخلوي ، مع التعبير عن يبني تاو موجهه علي وجه التحديد أو مستبعده من النواة ، يسمح للمرء ان لحن بدقه كميه تاو في مقصورات مختلفه.

ومن الخطوات الحاسمة في هذا الجزء من البروتوكول استنساخ تاو الموسوم باشاره التعريب النووي أو باشاره التصدير النووية. ويضمن كفاءه NLS بوجود تسلسل توافق الآراء 3XNLS من فيروس SV40. ويمكن التحقق بسهوله من النقل النووي للبروتين بواسطة المناعي ، وعدم وجود اشاره في النواة قد يكون بسبب الاستنساخ غير صحيحه أو لتحويل غير فعال. وعلي النقيض من ذلك ، فان التصدير النووي مكفول بالتسلسل التوافقي لاتفاق نيس. في هذه الحالة ، يسمح المناعي التحقق من تصدير تاو من النواة. مهما, اشاره ضعيفه نوويه لا ان يكون استثنيت بما ان [تاو-نيس] بروتين يدخل النواة وبعد ذلك, واجبه إلى ال [نس] تسلسل, هو يكون يصدر داخل ال [cytosol].

حتى الآن ، لم يتم دراسة وظيفة النووية تاو الا عن طريق نهج النسبية التي لا تضمن مشاركتها المباشرة. وينص البروتوكول الوارد هنا علي النهج الأول الذي يسمح بالتمييز بوضوح بين وظيفة تاو المحددة والمقصورة النووية. كما هو موضح سابقا ، لا يؤثر تاو الذاتية علي النتائج التي تم الحصول عليها بواسطة هذا البروتوكول. وفي الواقع ، فان نفس التجربة التي أجريت في الخلايا غير العصبية التي لا تعبر عن تاو الذاتية ، يؤدي إلى تغيير VGluT1 التعبير. قمنا بتطبيق هذا البروتوكول لدراسة التعبير عن الجينات المرتبطة بالامراض31. علي اي حال, هو استطاع كنت استغلت أيضا ان يتحرى أخرى نوويه [تاو] اعمال, مثل المشاركة علي [دنا] اتلاف, التفاعل مع [ك] عاملات نوويه أو مع [كروماتين].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

وقد حظي هذا العمل بدعم من المنح المقدمة من "سكوولا نورمالي سوبريوري" (SNS14_B_DIPRIMIO ؛ SNS16_B_DIPRIMIO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG Life Technologies A21050 IF 1:500
anti Actin Antibody BETHYL LABORATORIE A300-485A anti-rabbit WB 1:10,000
anti GAPDH Antibody Fitzgerald Industries International 10R-G109a anti-mouse WB 1:10,000
anti H2B Antibody Abcam ab1790 anti-rabbit WB 1:15,000
anti Tau-13 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-21796 anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500
anti Tubulin alpha Antibody Thermo Fisher Scientific PA5-16891 anti-mouse WB 1:5,000
anti VGluT1 Antibody Sigma-Aldrich AMAb91041 anti-mouse WB 1:500
BCA Protein Assay Kit Euroclone EMPO14500
BDNF Alomone Labs B-250
Blotting-Grade Blocker Biorad 1706404 Non-fat dry milk
BOVIN SERUM ALBUMIN Sigma-Aldrich A4503-50g
cOmplete Mini Roche 11836170001 protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well Biorad 5678093
DAPI Thermo Fisher Scientific 62247
DMEM/F-12 GIBCO 21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose Euroclone ECM0060L
EDTA Sigma-Aldrich 0390-100ml pH = 8, 0.5 M
Foetal Bovine Serum Euroclone EC50182L
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2005 WB 1:1,000
Goat anti-rabbit IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2004 WB 1:1,000
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ml Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon Western MERCK WBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide nunc 177402
L-glutamine Euroclone ECB3000D 100X
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific 12566014 cationic lipid
Methanol Sigma-Aldrich 322415-6X1L
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266-100G
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1kg
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
PEI Sigma-Aldrich 40,872-7
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/mL, 100 mL
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) OXOID BR0014G
PhosStop Roche 4906837001 phosphatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163 Step 3.10
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-100mg
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells Thermo Fisher Scientific 78840
Supported Nitrocellulose membrane Biorad 1620097
TC-Plate 6well SARSTEDT 833,920
TCS SP2 laser scanning confocal microscope Leica N/A
Triton x-100 Sigma-Aldrich X100-500ml Non-ionic surfactant
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 15400054 0.50%
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ml
VECTASHIELD antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems Promega A1330 Step 3.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
  2. Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
  3. Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
  4. Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
  5. Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
  6. Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  7. Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
  8. Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
  9. Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
  10. Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
  11. Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
  12. Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
  13. Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
  14. Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
  15. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
  16. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
  17. Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
  18. Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
  19. Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
  20. Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
  21. Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
  22. Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
  23. Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
  24. Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
  25. Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
  26. Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
  27. Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
  28. Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
  29. Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
  30. ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , Intechopen. (2012).
  31. Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
  32. Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells? Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
  33. Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
  34. Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
  35. Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).

Tags

علم الوراثة ، العدد 154 ، النووية تاو ، المتمايزة SY5Y ، الكسور النووية ، إشارات التعريب ، تجزئه سوبسيلولار ، وصمه عار الغربية
تعديل التعريب تاو Subcellular كاداه للتحقيق في التعبير عن الجينات المرتبطة بالمرض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco,… More

Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco, M., Calvello, M., Quercioli, V., Cattaneo, A., Di Primio, C. Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes. J. Vis. Exp. (154), e59988, doi:10.3791/59988 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter