Summary
Tau, hem mikrotübülleri bağladığı sitoplazmada hem de Alzheimer hastalığına bağlı genlerin modülasyonu da dahil olmak üzere alışılmadık işlevler uyguladığı çekirdekte bulunan nöronal bir proteindir. Burada, sitoplazmik Tau gelen herhangi bir girişim hariç nükleer Tau işlevini araştırmak için bir yöntem açıklar.
Abstract
Tau nöronlarda ifade edilen bir mikrotübül bağlayıcı proteindir ve bilinen ana işlevi sitoskeletal stabilitenin sürdürülmesi ile ilgilidir. Ancak, son kanıtlar Tau'nun DNA koruması, rRNA transkripsiyonunda, retrotranspozonların hareketliliğinde ve nükleolus. Yakın zamanda nükleer Tau'nun VGluT1 geninin ekspresyonunda yer aldığını gösterdik, Alzheimer hastalığının erken evrelerinde glutamat salınımının patolojik artışını açıklayabilecek moleküler bir mekanizma öneriyoruz. Yakın zamana kadar, nükleer Tau'nun hedef genlerin ekspresyonunu modüle etmedeki rolü, sitoplazmik Tau'nun katkısının dışlanmasını veya diğer genlerin etkisini engelleyen teknik sınırlamalar nedeniyle nispeten belirsiz ve belirsiz olmuştur. nükleer Tau ile ilgili olmayan aşağı faktörler. Bu belirsizliğin üstesinden gelmek için, özellikle nükleer Tau proteini tarafından modüle edilen hedef genlerin ekspresyonunu incelemek için bir yöntem geliştirdik. Yerelleştirme sinyallerinive hücre altı fraksiyonlarını çiftlerin sitoplazmik Tau moleküllerinden parazitin dışlanmasını sağlayan bir protokol uyguladık. En önemlisi, protokol kolaydır ve diğer hücre tipleri ve hücresel koşullarda Tau'nun nükleer işlevini incelemek için geniş uygulanabilir klasik ve güvenilir yöntemlerden oluşur.
Introduction
Çekirdekteki Tau proteininin işlevleri son yıllarda önemli bir ilgi kazanmıştır, çünkü nükleik asitler1,2,3,4,5,6ile yakından ilişkili olduğu gösterilmiştir. Nitekim, yeni bir genom çapında çalışma Tau in vivo7jenik ve interjenik DNA dizileri bağlar gösterdi . Nükleolar organizasyonda bir rol8,9,10,11önerilmiştir. Ayrıca, Tau oksidatif ve hipertermik stres e karşı DNA koruması dahil olmak için önerilmiştir5,10,12,13, mutasyona uğramış Tau kromozom istikrarsızlığı ve aneuploidy14bağlantılı ise,15,16.
Şimdiye kadar, nükleer bölmede Tau'nun işlevlerini incelemedeki zorluklar, nükleer Tau'nun sitoplazmik Tau'nun katkısının incelenmesindeki güçlükler nedeniyle neredeyse çözülemedi. Dahası, nükleer bölmedeki Tau moleküllerine atfedilen fonksiyonlar, şimdiye kadar, sadece nükleer Tau proteinlerinin doğrudan tutulumu na dair açık bir gösteri den yoksun oldukları için ilişkilidir. Gerçekten de, retrotranspozons veya rRNA transkripsiyon veya DNA koruması11,12,17,18,19 hareketlilik Tau katılımı da sitoplazmik Tau katkısı veya nükleer Tau ile ilgili olmayan diğer downstream faktörlerin etkisi ile açıklanabilir.
Burada, nükleer lokalizasyon (NLS) veya nükleer ihracat sinyalleri (NES) ile etiketlenmiş 0N4R yapıları ile birlikte nükleer bölmeyi izole etmek için klasik bir prosedürden yararlanarak bu sorunu çözebilecek bir yöntem salıyoruz. Bu yaklaşım, Sitoplazmik bölmeden Tau moleküllerinin dökülmesi nedeniyle olası eserlerile ilgili karmaşık sorunları ortadan kaldırır. Ayrıca, Tau-NLS ve Tau-NES yapıları, nükleer Tau moleküllerinin belirli bir fonksiyonda yer alması için olumlu ve olumsuz kontroller sağlayarak, sırasıyla, nükleer bölmeden Tau moleküllerinin zenginleşmesini veya dışlanmasını sağlar. Protokol teknik olarak kolaydır ve geniş diğer hücre tiplerinde Tau nükleer fonksiyon çalışması için geçerli olan klasik ve güvenilir yöntemlerden oluşur, farklılaşmış ya da değil, Tau ifade yeniden kanser hücreleri gibi20,21. Ayrıca, farklı bölmelerle ilgili biyolojik fonksiyonları incelemek için hem sitoplazmada hem de çekirdekte bulunan diğer proteinlere de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Kültürü
- Kültür SH-SY5Y hücreleri (insan nöroblastom hücre hattı, CRL-2266) tam ortamda (Dulbecco modifiye Kartal orta: besin karışımı F12 [DMEM / F-12] ile birlikte 10% fetal sığır serum [FBS], 2 mM L-glutamin, 100 U / mL penisilin ve 100 μg/mL streptomyc). Hücreleri 37 °C ve %5 CO2'debir kuvözde saklar. Hücreleri 10 cm'lik tabaklarda büyütün ve konca olduğunda bölün.
2. Hücre Farklılaşması
- SH-SY5Y hücrelerini ayırt etmek için, kaplamadan bir gün sonra, 5 gün orta yı tamamlamak için 10 μM retinoik asit (RA) ekleyin.
- Altıncı gün orta ve diferansiyasyon ortamının yerini alır: DMEM/F-12 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-glutamin ile desteklenir. FBS veya antibiyotik eklemeyin.
- Hücreleri 3 gün boyunca farklılaşma ortamı içinde büyütün.
3. Chimeric Klonlama İnşa Eder
- Tau dizisi 0N4R (383aa) 3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAGAAAAGAAAGAAGGAAGGTA-3' 3' sonunda çerçeve içinde restriksiyon enzim sindirim tarafından klonlama tarafından Tau-NLS yapı oluşturun.
NOT: Tau 3 'sonunda 3xNLS multicloning site (MCS) içine XhoI ve BamHI kısıtlama siteleri istismar memeli ifade için pCMV-Tau plazmid içine klonlanır. - Tau dizisi nin 3' sonunda çerçeve içinde restriksiyon enzim sindirim tarafından klonlama tarafından Tau-NES yapı oluşturmak 0N4R (383aa) NES dizisi: 5'-AGTGAGCTGCAGAAGAGCTGGAAGAGTTGGATCTCGTAA-3'.
NOT: Tau'nun 3' sonundaki NES, EcoRI ve BamHI kısıtlama alanlarını MCS'ye sömüren memeli ekspresyonu için pCMV-Tau plazmidine klonlanır. - Adım 3.1 veya 3.2'den 100 ng DNA ile DH5alpha E.coli suşu ve 100 mg/mL ampisilin ile LB-Agar plakaları üzerindeki plaka hücrelerini dönüştürün. 37 °C'de bir gecede büyüsün.
- Tek bir koloni seçin ve ampisilin ile LB 5 mL içine hücreleri başak. Hücreler bir gecede ajitasyon içinde 37 °C'de büyüsünler.
- Bir DNA miniprep ile plazmid ayıklayın(Malzeme Tablosu) ve yapıları doğrulamak için sıra.
- AMPIcillin ile LB-Agar plakaları üzerinde doğrulanmış yapılar ve plaka hücreleri ile DH5alpha E. coli suşu dönüştürün. 37 °C'de bir gecede büyüsün.
- Tek bir koloni seçin ve ampisilin ile LB 5 mL içine hücreleri başak. Hücreler 37 °C'de 2 saat ajitasyon içinde büyüsün.
- Ampisilin ile LB 200 mL adım 3.7 hücreleri koyun. 37 °C'de bir gecede büyüsün.
- 4 °C'de 10 dk için 3.500 x g'deki hücreleri peletleyin.
- Bir DNA maxiprep(Malzeme Tablosu)ile plazmid özü.
4. Hücre Transfeksiyonu
- 6 kuyulu plakalarda 1.1 adımdan 400.000 hücre veya 8 kuyulu bölme slaytlarında 20.000 hücre tohum. Plaka dört örnek: kontrol hücreleri boş bir vektör ile transfected, hücreleri etiketsiz Tau ile transfected, hücreler Tau-NLS ve hücreler Tau-NES ile transfected olmak.
- Üreticinin talimatlarına göre, her kuyu için transfect 400 ng DNA tohumlama dan sonra 6-iyi plakalar veya 8 kuyu oda slaytlar için her kuyu için 200 ng DNA katyonik lipidler(Tablo MalzemelerTablosu) kullanarak.
- DNA ve katyonik lipitleri 250 μL (6 kuyulu plakalar için) veya 25 μL (8 kuyuluk oda slaytları için) halinde ayrı ayrı inkübedin ve 5 dakika boyunca azaltılmış serum ortamıRT'de. Sonra DNA-lipid kompleksi oluşturmak ve 20 dakika kuluçka oluşturmak için bunları birleştirin.
- Kültür ortamını 2 mL (6 kuyulu plakalar için) veya 250 μL (8 kuyulu oda slaytları için) ve taze tam kültür ortamı ile değiştirin. HÜCRELERE DNA-lipid kompleksini ekleyin ve bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Alternatif olarak, katyonik reaktif polietilenin (PEI) ile transfect DNA.
- 2 μg DNA ve 6 μL PEI'yi 200 μL tam kültür ortamı (6 kuyuplakadaki her kuyu için) veya 1 μg DNA ve 3 μL PEI ile 100 μL tam kültür ortamını karıştırın (her kuyu için 8 kuyulu oda slaytlarında) , girdap ve rt 10 dakika kuluçka.
- Karışım hücrelerine ekleyin ve kaplama hacmine ulaşmak için 6 kuyuplakaları veya 8 kuyulu oda slaytlar kuyu başına tam kültür orta 150 μL başına tam kültür orta 1.8 mL ekleyin.
- Transfeksiyondan sonraki gün ortamı değiştirin ve adım 2.2'de açıklandığı gibi farklılaşma ortamını ekleyin.
5. İmmünofluoresans
- Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 1x PBS ile durula. Sallayarak olmadan 3 dakika için% 100 buz gibi metanol ile hücreleri düzeltin. Sabitleme çözeltisini çıkarın ve 1x PBS ile kısa bir süre yıkayın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika (RT) için 1x PBS'de %0,1 non-iyonik yüzey aktif madde ile permeabilize edin. Kısaca, 1x PBS ile yıkayın, 3 kez.
- Bloke tampon ile inkübat hücreleri (0.1% Tween 20 ve 1% BSA PBS) bir orbital shaker RT 30 dakika için.
- Uygun primer antikorlarla (örn. fare monoklonal anti-Tau13 antikoru) 1:500'ü bir orbital shaker üzerinde 4 °C'de bir gecede bloke edici tamponda seyrelttir. Antikor çözeltisini çıkarın ve 1x PBS ile kısa bir süre için yıkayın.
- Florofora konjuge sekonder antikorlar ile inkübat (örneğin, Alexa Fluor 633 konjuge keçi anti-fare antikorları) 1:500 rt 1 saat için tampon engelleme seyreltilmiş.
- Çekirdekleri lekelemek için, DAPI ile inkübasyon 1:20,000 rt 10 dakika için tampon engelleme seyreltilmiş. 1x PBS ile 3 kez yıkayın. Antifade montaj ortamını kullanarak bir slayt üzerine kapakları monte edin.
6. Batı Leke
- Adım 4.4 hücre pelet toplamak için, orta kaldırmak ve PBS ile hücreleri yıkayın. 37 °C'de 4 dk için %0,1 tripsin 500 μL ile kuluçka ya. Tam orta eşit hacim li ve yeniden askıya hücreleri ekleyin.
- 5 dk için 500 x g bir tüp ve santrifüj hücreleri toplayın. Santrifüj sonunda dikkatle supernatant kaldırın. 1 mL PBS, 5 000 x g'de santrifüj ekleyin ve supernatant'ı dikkatlice çıkarın. Hücre peletlerini hemen kullanım için buz üzerinde saklayın veya uzun süreli depolama için -80 °C'de dondurun.
- Toplam protein ekstreleri için, hücre peletini 30 dk likit tampon (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, %10 gliserol, %1 oktilfenoksi poli (etilenoksi)etanol, dallı (Malzeme Tablosu, 10 mM EDTA) proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile takviye edin. Peletboline göre 50 μL ile 100 μL arasında lysis tamponu kullanın.
- 15 dk. 16.000 x g ekstresi santrifüj. 20 μL'lik 4x Laemmli tampon ile 20 μg proteini 20 μL hacimde karıştırarak SDS-PAGE için protein örneklerini hazırlayın ve 100 °C'de 5 dakika kaynatın.
NOT: Numune -20 °C'de saklanabilir.
- 15 dk. 16.000 x g ekstresi santrifüj. 20 μL'lik 4x Laemmli tampon ile 20 μg proteini 20 μL hacimde karıştırarak SDS-PAGE için protein örneklerini hazırlayın ve 100 °C'de 5 dakika kaynatın.
- Hücre altı fraksiyonları için, hücreleri tam ortamda adım 6.2'den uzaklaştırın ve her örnek için 1 x 106 hücre toplayın. Aşağıdaki adımlar için hücre peletleri elde etmek için 10 dakika için 500 x g santrifüj.
- Hücre altı bölmelerini izole etmek için kit özelliklerine göre kesirleyin. Her bir fraksiyonu izole etmek için, hücre peletini 6.4 adımdan ilgili arabellek, santrifüj ile inkübe edin, süpernatant'ı toplayın ve 6.4.1.1-6.4.1.5'te açıklandığı gibi bir sonraki arabelleği pelete ekleyin. Sırayla sitoplazmik ekstraksiyon tampon, membran ekstraksiyon tampon, nükleer ekstraksiyon tampon, nükleer ekstraksiyon tampon 5 mM CaCl2 ve 3 U / μL mikrokokal nükleaz ve sitoskeletal ekstraksiyon tampon ile takviye ekleyin.
NOT: Tüm tamponlar proteaz inhibitörleri ile takviye edilmelidir. Arabellek hacimlerini hücre peletinin hacmine göre ölçeklendirin.- Sitozolik fraksiyonu izole etmek için, 4 °C'de proteaz inhibitörleri ile desteklenen 100 μL buz gibi sitoplazmik ekstraksiyon tamponundaki hücre peletlerini 10 dakika boyunca yumuşak karıştırma ile birlikte 5 dakika 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da inkümlet ve süpernatantı soğutulmuş tüplere aktarın.
- Adım 6.4.1.1'den pelet eprote inhibitörleri ile takviye buz gibi membran ekstraksiyon tampon 100 μL ekleyin ve 4 °C'de 10 dakika. Centrifuge ile 10 dakika.
- Çözünür nükleer fraksiyonu için, adım 6.4.1.2 gelen pelet proteaz inhibitörleri ile desteklenen nükleer ekstraksiyon tampon 50 μL ekleyin, ve girdap. 4 °C'de 30 dakika, santrifüj 5000 x g'de 4 °C'de 5 dk ve supernatant toplayın.
- Çözünmez nükleer fraksiyonu için, proteaz inhibitörleri ile desteklenen nükleer ekstraksiyon tampon 50 μL ekleyin, CaCl2 ve mikrokokal nükleaz adım pelet için 6.4.1.3, ve girdap. 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yat, sonra tekrar girdap. 5 dakika RT 16.000 x g centrifuge ve supernatant toplamak.
- Sitoskelet fraksiyonu için, adım 6.4.1.4 gelen pelet proteaz inhibitörleri ile desteklenen sitoskeletal ekstraksiyon tampon 50 μL ekleyin ve girdap. 10 dk.RT. 5 dk için 16.000 x g'de tüpü ntrifüj edin, süpernatant'ı toplayın ve peleti atın.
NOT: Arabellek hacimlerini, kit protokolünde belirtildiği gibi hücre hacmine göre ölçeklendirin. Kuluçka ve santrifüj süresi ve sıcaklık22,23, 24,25,26,27,28,29hakkında daha fazla bilgi için kit protokolüne bakın. Alternatif olarak, herhangi bir standart yöntemler kullanın30, deterjan kullanarak ve iyonik mukavemet ve santrifüj hızını artırarak, sitosolik ayırır, membran bağlı, sitoskelet ve nükleer fraksiyonları. Standart nükleer ekstraksiyon tamponlarını sömürerek çözünür nükleer fraksiyonu ve çözünmez nükleer fraksiyonu ayırın. Numune -20 °C'de saklanabilir.
- SDS-PAGE için, 6.4.1.1−6.4.1.5 adımlarından elde edilen hücre altı fraksiyonlarının 20°L'sine 7 μL 4x Laemmli tampon ekleyin, 100 °C'de 5 dk kaynatın.
- Hücre altı bölmelerini izole etmek için kit özelliklerine göre kesirleyin. Her bir fraksiyonu izole etmek için, hücre peletini 6.4 adımdan ilgili arabellek, santrifüj ile inkübe edin, süpernatant'ı toplayın ve 6.4.1.1-6.4.1.5'te açıklandığı gibi bir sonraki arabelleği pelete ekleyin. Sırayla sitoplazmik ekstraksiyon tampon, membran ekstraksiyon tampon, nükleer ekstraksiyon tampon, nükleer ekstraksiyon tampon 5 mM CaCl2 ve 3 U / μL mikrokokal nükleaz ve sitoskeletal ekstraksiyon tampon ile takviye ekleyin.
- Örnekleri akrilamid jelüzerine yükleyin ve 120 V. Proteinleri 90 dk boyunca 250 mA'da nitroselüloz membrana aktarın.
- Ponceau boyama çözeltisi 5 dakika için membran kuluçka tarafından uygun protein jel elektroforez ve başarılı lekekontrol edin. Arka plan temiz olana kadar membranı distile suda durulayın. Bir shaker üzerinde 10 dakika için Tween 20 (TBST) ile Tris tamponlu tuzlu ile yıkama devam ederek leke çıkarın.
- Membranı bloklama çözeltisi ile (TBST'de %5 süt) 1 saat boyunca RT'de çalkalayıcıya inkübe edin. 5 dakika TBST ile 3 kez yıkayın.
- Membranı bloklama çözeltisinde birincil antikorla melezleştirin (TBST'de %1 süt) bir gecede 4 °C'de. 5 dakika TBST ile 3 kez yıkayın.
- MEMBRANI RT'de 1 saat boyunca bloke çözeltisinde HRP konjuge sekonder antikor ile melezleştirin.
- Kemilüminesans kullanarak protein bandını tespit edin. ImageJ ile Western Blot bantlarının yoğunluğunu ölçün. Bir temizlik geninin ürününe protein ekspresyonunu normalleştirin: nükleer çözünür ve çözünmez fraksiyon için histon H2B, sitoplazmik fraksiyon için GAPDH ve toplam özler için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sitoplazmik Tau proteinlerinin katkısından kaçınarak nükleer Tau'nun gen ekspresyonundaki etkisini incelemek için kullanılan strateji Şekil 1'degösterilmiştir. Kısaca, TAU proteinleri NLS veya NES ile etiketlenmiş veya nükleer bölme dışında, sırasıyla birikir. Bu dengesizliğin fonksiyonel etkisi VGluT1 geninin ürünü olarak ölçülen gen ekspresyonunun değiştirilmesidir.
Protokol açıklamasının ardından SH-SY5Y hücreleri post-mitotik nöron benzeri hücreleri elde etmek için 5 gün, sonra BDNF ile 3 gün boyunca RA ile tedavi edildi(Şekil 2). RA ve BDNF yokluğunda, farklılaşmamış SH-SY5Y hücreleri yuvarlak morfolojisi varsayar ve hücre kümeleri oluşturur. Beklendiği gibi, farklılaşma protokolü başlatılarak, kümeler gevşemek ve hücreler nöritler yayılır; farklılaşma sonunda, hücreler düzgün dağıtılır ve dallı nöritler bir ağ üzerinden birbirine bağlıdır.
Tohumlamadan bir gün sonra hücreler Tau-NLS veya Tau-NES plazmidleri (bölüm 4.2) ile katyonik lipidler ile transfeced edilmiştir. Tau-NLS veya Tau-NES yapılarını ifade eden hücreler için, Tau hücre altı lokalizasyonu anti-Tau antikorları ile immünoresans ile tespit edilebilir. Transfeksiyonun etkinliğine bağlı olarak, hücreler sırasıyla Tau-NLS veya Tau-NES ile başarılı bir şekilde transfeced ise, DAPI sinyali veya boş çekirdekleri ile sitoplazmik boyama ile birleşen güçlü bir nükleer boyama görüntüler (Şekil 3). Bu özel sinyallerin eksikliği verimsiz bir transfection gösterir.
Farklı hücre altı bölmesinde zenginleştirilmiş proteinleri analiz etmek için hücreler toplanmış ve numune başına eşit miktarda hücre işlemek için sayılmıştır. Artan deterjan ve iyonik mukavemetve artan santrifüj hızını kullanan herhangi bir standart fraksiyon yöntemi hücresel bölmeleri birbirinden ayırmak ve böylece sitosolik, membrana bağlı, sitoskeletal ve nükleer kesirler.
Çekirdekler izole edildikten sonra, nükleer çözünür fraksiyonu ve kromatin bağlı fraksiyonu mikrokokal nükleaz 3 U /μL ve 5 mM CaCl2eklenerek ayrılmıştır.
Batı leke analizi için, sitoplazmik ve membran fraksiyonları eşit hacimli ve diğer kesirlerin yarım hacimleri bir degrade prekast akrilamid jel üzerine yüklenmiş, tampon farklı miktarda her adımda eklenen düzeltmek için.
Farklı fraksiyonların verimli ayrıştırıldığını doğrulamak için, aşağıdaki antikorları kullanan Batı lekesi yapılmıştır: anti-GADPH (sitoiskelet hariç tüm fraksiyonlarda mevcut ve özellikle sitoplazmik fraksiyonda zenginleştirilmiş); anti-aktin (özellikle sitoskeletfraksiyonu zenginleştirilmiş); anti-tubulin (özellikle Sitoplazmik ve sitoskeletal fraksiyonlarda zenginleştirilmiş); anti-H2B (nükleer kesirlerle zenginleştirilmiştir) (Şekil 4).
Bu belirteçlerin farklı hücre altı fraksiyonlarında zenginleştirilmesi, kesirasyonun iyi yapılmadığını gösterir. Hücre altı fraksiyonlarına yönelik herhangi bir protokolün fraksiyonlar arasındaki kontaminasyonun %10-15'ini sunabileceği unutulmamalıdır.
Numunenin başarılı fraksiyonu doğrulandıktan sonra, Batı lekesi nükleer bölmedeki Tau sinyalini ve toplam ekstredeki VGluT1 sinyalini kontrol etmek için yapılmıştır (Şekil 5). Etiketsiz Tau tüm fraksiyonlarda tespit edilebilir iken, Tau-NLS güçlü nükleer bölmede zenginleştirilmiş ve kötü sitoplazmik fraksiyonu tespit edilebilir. Aksine, Tau-NES sitoplazmik fraksiyonu zenginleştirilmiş ve nükleer fraksiyonu daha az tespit edilebilir. Çözünür nükleer fraksiyona az miktarda Tau-NES'in bulunması beklenebilir, çünkü endojen Tau gibi, çekirdeğe aktarılır ve nükleer bölmeye bir kez nükleer ihracat sinyali sitoplazmaya taşınmasını sağlar. Bu iki füzyon proteini için farklı bir zenginleştirmenin saptanması transfeksiyonun verimliliğinde veya konstrüksiyonların klonlanmasında veya fraksiyonunda bir soruna işaret edebilir.
Batı lekelerinin kantitatif analizi ImageJ kullanılarak yapılabilir. Her fraksiyona özgü temizlik geni için değerler normale döner (sitoplazmik fraksiyon için GAPDH; çözünür nükleer ve kromatine bağlı fraksiyonlar için histon H2B).
Şekil 5B'deki grafik, Tau-NLS'nin çözünür nükleer fraksiyon (SNF) ile yüksek oranda zenginleştirilmiş olduğunu vurgulamak için çözünür nükleer fraksiyon ve sitoplazmik fraksiyondaki Tau'nun oranını rapor eder. Ayrıca, Tau-NLS sitoplazmik fraksiyonu (CF) ile ilgili olarak kromatin bağlı fraksiyonu (CBF) zenginleştirilmiş ise Tau-NES azalır. SNF/CF = 1 ve CBF/CF = 1 kontrol hücrelerinde Tau oranına karşılık gelir. Endojen Tau beklendiği gibi tüm kesirlerde zayıf saptanabilir. Şekil 5C'deki grafik, farklı miktarda nükleer Tau ifade eden örneklerin toplam özlerinde VGluT1 ifadesinin niceliğini rapor eder. Tau-NES ifade eden hücrelerde VGluT1 ifadesi kontrol hücrelerindeki temel ifadeyle karşılaştırılabilir. Aksine, etiketsiz Tau veya Tau-NLS ifade hücrelerde, VGluT1 ifadesi fazla iki katına çıkar.
Şekil 1: Tau'nun nükleer veya sitoplazmik birikimine izin vermek için kullanılan stratejinin grafiksel gösterimi. Tau-NES hariç iken Tau-NLS nükleer bölmede birikir. Deneysel okuma VGluT1 ifadesinin modülasyonudur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farklılaşmamış ve farklılaşmış hücre kültürünü temsil eder. Farklılaşmamış SH-SY5Y (solda), RA (orta) ile ayırt edilen ve RA ve BDNF (sağda) ile farklılaşan hücrelerin görüntüsü. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Immünoresans ile Tau hücre altı zenginleştirme temsili görüntü. Etiketlenmemiş Tau, Tau-NES veya Tau-NLS yapılamayan hücrelerin görüntüsü. Tau sinyalinin immünoresans (kırmızı), çekirdek sinyali DAPI boyama (mavi) ile elde edildiği, birleştirilmiş görüntülerin elde edildiği bildirilmiştir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Batı lekeleri ile hücre altı fraksiyonlarında zenginleştirilmiş proteinlerin temsili tespiti. SH-SY5Y hücrelerinden hücre altı fraksiyonlarının batı bölünmesi. CF = sitoplazmik fraksiyon; MF = membran fraksiyonu; SNF = çözünür nükleer fraksiyonu; CBF = kromatin bağlı fraksiyonu; CKF = sitoskelet fraksiyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Nükleer Tau ve VGluT1 proteinlerinin temsili tespiti. (A) Nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlarda saptanan Tau proteininin batı daki lekesi. (B) Grafik, tau'nun nükleer fraksiyonlar ve sitoplazmik fraksiyondaki oranını bildirir. Endojen Tau'da değerler normalleştirildi. SNF/CF = 1 ve CBF/CF = 1 kontrol hücrelerinde endojen Tau oranına karşılık gelir. (C) VGluT1 proteininin batı lekesi. (D) Grafik, farklı miktarda nükleer Tau ifade eden örneklerin toplam özlerinde VGluT1 ifadesinin niceliğini bildirir. Kruskal-Wallis ANOVA ve Mann-Whitney testi; p < 0.001, **** p < 0.0001, n.s. p > 0.05. Tüm sonuçlar en az üç bağımsız deneyden ortalama ± SEM olarak gösterilir. Bu temsili rakam Siano ve ark.31değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nükleer Tau proteininin gen ekspresyonu üzerindeki etkisini ölçmek için bir yöntem tanımladık. Bu protokol ile sitoplazmik Tau'nun katkısı kuvvetle sınırlıdır. Bu protokolün kritik adımları şunlardır: insan nöroblastom SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşması, subsellüler fraksiyonu ve nükleer bölmede Tau proteinlokalizasyonu.
İlk olarak, temsili sonuçlar bölümünde gösterildiği gibi, SH-SY5Y hücrelerinin RA ve BDNF ekleyerek farklılaşması kültürde nöron benzeri hücrelerin iyi bir hazırlık elde etmek için çok önemlidir. Daha düşük bir yoğunluk hücre çoğalmasını etkileyebileceğinden, tohumlanan hücrelerin yoğunluğu özellikle önemlidir. Ayrıca, hücresel fraksiyon ve Batı blot gibi çok sayıda hücreye ihtiyaç duyan deneylerde, BDNF farklılaştırma adımının hücresel çoğalmayı bloke ederek terminal farklılaşmasına izin vererek kültürdeki hücre sayısını sınırlandırdığını belirtmek önemlidir. Alternatif farklılaşma protokolleri BDNF yerine yalnızca RA veya NGF kullanır. Ancak, RA sonra BDNF eklerken daha iyi bir morfolojik farklılaşma ulaşmak için izin verir32,33, NGF SH-SY5Y hücrelerinde zayıf bir nötrit büyüme neden olur34. Ayrıca, yaygın RA ve BDNF kombinasyonu nöronal belirteçleri ekspresyonu ile homojen bir nöronal popülasyon elde etmek için izin verdiği gösterilmiştir ve azalmış proliferasyon35. Bu nedenle, burada yararlanılan ayırt durum protokolü RA ve BDNF'yi birleştirir.
Ancak, farklı hücre altı bölmelerinde Tau rolünü incelemek için bildirilen prosedür farklılaşmamış hücreler için veya farklı hücre tipleri için de kullanılabilir.
Hücre altı fraksiyonu çok kritik bir adımdır ve yeterli başlangıç materyaline sahip olmak çok önemlidir: ticari bir kit sadece 1 x 106 hücre gerektirir, diğer işlemler ise çok daha yüksek bir başlangıç miktarına ihtiyaç duyabilir. Ayrıca, standart arabellek ve adımlar içeren bir kitin kullanılması, denemenin kaçınılmaz ve gerekli olan tekrarlanabilirliğini garanti eder. Ancak, tamponbileşimi genellikle tescilli olduğundan, ilgi proteininin işlevini değiştirebilir ve kesirlerin izolasyonunu optimize etmek zor olabilir deterjanlar içerebilir. Ayrıca, en iyi durumda bile, fraksiyonları arasında kontaminasyon% 10-15 olabilir. Her bir kesirden alınan düşük verim, belirli kesirlerin ekstraksiyon tamponlarında kuluçka süresini artırarak aşılabilir.
Nükleer Tau fonksiyonları son yıllarda önemli ilgi kazanmıştır bu yana, farklı hücresel bölmelerde Tau işlevini incelemek için güvenilir bir yöntem sağlamak için özellikle önemlidir. Subcellular fraksiyonu kaplin, Tau ifade ile özellikle yönlendirilmiş veya çekirdekten dışlanmış yapıları, bir ince farklı bölmelerde Tau miktarını ayarlamak için izin verir.
Protokolün bu bölümünde kritik bir adım tau nükleer yerelleştirme sinyali veya nükleer ihracat sinyali ile etiketli klonlama olduğunu. NLS verimliliği SV40 virüsü bir 3XNLS konsensüs dizisi varlığı ile garanti edilir. Proteinin nükleer translokasyonu immünoresans tarafından kolayca kontrol edilebilir ve çekirdeğe sinyal eksikliği yanlış bir klonlama veya verimsiz transfeksiyon nedeniyle olabilir. Tam tersine, nükleer ihracat NES konsensüs sırası ile garanti altına alınmıştır. Bu durumda, immünofloresans çekirdekten Tau ihracatıkontrol sağlar. Ancak, Tau-NES proteini çekirdeğe girdiğinden ve NES dizisi nedeniyle sitosola ihraç edildiği için zayıf bir nükleer sinyal dışlanmamalıdır.
Şimdiye kadar, nükleer Tau işlevi doğrudan katılımı nı garanti etmez sadece korelasyonlu yaklaşımlar tarafından incelenmiştir. Buradaki protokol, Tau'nun özel işlevini nükleer bölmeye açıkça ayırmaya izin veren ilk yaklaşımı sağlıyor. Daha önce de gösterildiği gibi, endojen Tau bu protokol tarafından elde edilen sonuçları etkilemez. Gerçekten de, endojen Tau ifade etmeyen non-nöronal hücrelerde yapılan aynı deney, VGluT1 değiştirilmiş ifade yol açar. Bu protokolü hastalıkla ilgili genlerin ekspresyonunu incelemek için uyguladık31. Her neyse, dna hasarı, nükleer kofaktörler le etkileşim veya kromatin ile etkileşim gibi diğer nükleer Tau fonksiyonlarını araştırmak için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10,000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10,000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15,000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5,000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH = 8, 0.5 M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1,000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
References
- Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
- Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
- Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
- Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
- Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
- Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
- Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
- Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
- Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J.
- Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
- Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
- Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
- Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
- Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
- Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
- Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
- Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
- Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
- Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
- Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
- Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
- Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
- Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
- Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
- Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
- Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
- Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
- ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , Intechopen. (2012).
- Siano, G., et al.
- Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells? Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
- Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
- Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
- Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).
