Summary
Tau är ett neuronala protein som finns både i cytoplasman, där det binder mikrotubuli, och i kärnan, där det utövar okonventionella funktioner, inklusive modulering av Alzheimers sjukdomsrelaterade gener. Här beskriver vi en metod för att undersöka funktionen av nukleära Tau samtidigt utesluta eventuella störningar som kommer från cytoplasmiska Tau.
Abstract
Tau är en mikrotubuli bindande protein uttrycks i nervceller och dess viktigaste kända funktion är relaterad till upprätthållandet av cytoskelettets stabilitet. De senaste bevisen visade dock att Tau förekommer även i andra subcellulära fack, inklusive kärnan där den är inblandad i DNA-skydd, i rRNA-transkription, i rörligheten för retrotransposoner och i den strukturella organisationen av nucleolus. Vi har nyligen visat att Nuclear Tau är involverad i uttrycket av VGluT1 genen, vilket tyder på en molekylär mekanism som kan förklara den patologiska ökningen av glutamat release i de tidiga stadierna av Alzheimers sjukdom. Tills nyligen har inblandning av Nuclear Tau i modulerande uttrycket av målgener varit relativt osäker och tvetydig på grund av tekniska begränsningar som hindrade uteslutandet av bidraget av cytoplasmiska Tau eller effekten av andra nedströms faktorer som inte är relaterade till Nuclear Tau. För att övervinna denna osäkerhet utvecklade vi en metod för att studera uttrycket av målgener som specifikt modulerades av det nukleära Tau-proteinet. Vi använde ett protokoll som par användningen av lokaliseringssignaler och subcellulära fraktionering, vilket gör att utesluta störningar från cytoplasmiska Tau molekyler. Framför allt är protokollet lätt och består av klassiska och pålitliga metoder som i stor utsträckning är tillämpliga för att studera den nukleära funktionen av Tau i andra celltyper och cellulära förhållanden.
Introduction
De funktioner tau protein i kärnan har samlat stort intresse under de senaste åren, eftersom det har visat sig vara nära förknippad med nukleinsyror1,2,3,4,5,6. I själva verket visade en nyligen genomomfattande studie att Tau binder genmodifierade och intergena DNA-sekvenser in vivo7. En roll i nukleolära organisation har föreslagits8,9,10,11. Tau har dessutom föreslagits att vara involverad i DNA-skydd mot oxidativ och Hypertermisk stress5,10,12,13, medan muterade Tau har kopplats till kromosom instabilitet och aneuploidi14,15,16.
Hittills har utmaningarna i att studera funktionerna i Tau i kärnkraft facket förblev nästan olösta på grund av svårigheterna att dissekera det specifika bidraget från Nuclear Tau från bidraget av cytoplasmiska Tau. Dessutom är de funktioner som tillskrivs Tau-molekyler i kärnkrafts facket, fram till nu, endast korrelära eftersom de saknar en entydig demonstration av direkt inblandning av nukleära Tau-proteiner. I själva verket kan Tau i rörligheten för retrotransposoner eller i rRNA transkription eller i DNA-skydd11,12,17,18,19 också förklaras av bidraget av cytoplasmiska Tau eller av effekten av andra nedströms faktorer som inte är relaterade till nukleär Tau.
Här ger vi en metod som kan lösa detta problem genom att utnyttja en klassisk procedur för att isolera kärnkrafts facket kombinerat med användning av Tau konstruktioner 0N4R märkta med nukleär lokalisering (NLS) eller kärnvapen export signaler (NES). Detta tillvägagångssätt eliminerar komplexa problem relaterade till möjliga artefakter på grund av spridnings av Tau molekyler från cytoplasmiska facket. Tau-NLS och Tau-NES-konstruktioner inducerar dessutom berikningen eller uteslutandet av Tau-molekyler från kärnkrafts facket, vilket ger positiva och negativa kontroller för inblandning av nukleära Tau-molekyler i en specifik funktion. Protokollet är tekniskt enkelt och består av klassiska och pålitliga metoder som i stor utsträckning är tillämpliga för att studera den nukleära funktionen i Tau i andra celltyper, differentierade eller inte, såsom cancerceller som reaktiverar Tau-uttrycket20,21. Dessutom kan det tillämpas även på andra proteiner som finns i både cytoplasman och kärnan för att dissekera biologiska funktioner relaterade till olika fack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell odling
- Kultur sh-SY5Y celler (Human neuroblastom cellinjer, CRL-2266) i komplett medium (Dulbecco modifierade Eagle medium: näringsämne blandning F12 [DMEM/F-12] kompletteras med 10% foster bovint serum [FBS], 2 mm L-glutamin, 100 U/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin). Underhålla cellerna i en inkubator vid 37 ° c och 5% CO2. Odla celler i 10 cm plattor och dela upp vid konflytande.
2. cell differentiering
- För att skilja SH-SY5Y celler, dagen efter pläteringen, tillsätt 10 μM retinoinsyra (RA) till komplett medium för 5 dagar.
- Den sjätte dagen ersätta medium med differentiering medium: DMEM/F-12 kompletteras med 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-glutamin. Tillsätt inte FBS eller antibiotika.
- Odla cellerna i differentiering medium för 3 dagar.
3. chimeric konstruerar kloning
- Generera Tau-NLS konstruera genom kloning genom begränsning enzym nedbrytning i ramen vid 3 ' slutet av Tau sekvens 0N4R (383aa) den 3xNLS (SV40NLS): 5 '-CCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA-3 '.
Anmärkning: 3xNLS vid 3 ' slutet av Tau är klonade i pCMV-Tau plasmid för däggdjurs uttryck utnyttja XhoI och BamHI restriktioner platser i multikloning webbplats (MCS). - Generera Tau-NES konstruera genom kloning genom begränsning enzym nedbrytning i ramen vid 3 ' slutet av Tau sekvens 0N4R (383aa) NES sekvens: 5 '-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATCTGGACTCGTACAA-3 '.
Anmärkning: NES vid 3 ' slutet av Tau är klonade i pCMV-Tau plasmid för däggdjurs uttryck utnyttja EcoRI och BamHI restriktioner platser i MCS. - Omvandla DH5alpha E. coli stam med 100 ng av DNA från steg 3,1 eller 3,2 och plattan celler på lb-agar plattor med 100 mg/ml ampicillin. Låt växa över natten vid 37 ° c.
- Välj en enda koloni och Spike cellerna i 5 mL LB med ampicillin. Låt cellerna växa vid 37 ° c i agitation över natten.
- Extrahera Plasmid med en DNA miniprep (tabell över material) och sekvens för att kontrollera konstruktioner.
- Omvandla DH5alpha E. coli -stam med sekvensen kontrollerade konstruktioner och plattceller på lb-agar plattor med ampicillin. Låt växa över natten vid 37 ° c.
- Välj en enda koloni och Spike cellerna i 5 mL LB med ampicillin. Låt cellerna växa vid 37 ° c i agitation för 2 h.
- Sätt cellerna från steg 3,7 i 200 mL LB med ampicillin. Låt växa över natten vid 37 ° c.
- Pelleten cellerna vid 3 500 x g i 10 min vid 4 ° c.
- Extrahera Plasmid med en DNA maxiprep (tabell över material).
4. cell transfektion
- Utsäde 400 000 celler från steg 1,1 i 6-well plattor eller 20 000 celler i 8-well kammar bilder. Tallrik fyra prover: kontrollceller som skall transfekterade med en tom vektor, celler som skall transfekterade med omärkta Tau, celler som skall transfekterade med Tau-nls och celler som skall transfekterade med Tau-NES.
- Dagen efter sådd transfect 400 ng av DNA för varje brunn med hjälp av katjoniska lipider (tabell över material) i 6-well tallrikar eller 200 ng av DNA för varje brunn för 8-brunn kammare diabilder, enligt tillverkarens anvisningar.
- Inkubera DNA och katjoniska lipider separat i 250 μL (för 6-well plattor) eller 25 μL (för 8-brunn kammare diabilder) av reducerat serum medium för 5 min vid RT. Sedan kombinera dem för att generera DNA-lipidkomplexet och inkubera i 20 min.
- Ersätt odlingsmediet med 2 mL (för 6-well plattor) eller 250 μL (för 8-well kammar glas) av färskt komplett odlingssubstrat. Tillsätt DNA-lipidkomplexet till cellerna och inkubera vid 37 ° c över natten.
- Alternativt, transfect DNA med katjonreagens polyetylenimin (PEI).
- Blanda 2 μg DNA och 6 μL av PEI med 200 μL av hela odlingsmediet (för varje brunn i 6-brunn plattor), eller 1 μg DNA och 3 μL av PEI med 100 μL av hela odlingssubstrat (för varje brunn i 8-brunn kammare diabilder) , Vortex och inkubera i 10 minuter vid RT.
- Tillsätt blandningen till cellerna och tillsätt 1,8 mL komplett odlingssubstrat per brunn i 6-brunn plattor eller 150 μL av hela odlingsmediet per brunn i 8-brunn kammar glas för att nå pläteringsvolym.
- Ändra mediet dagen efter transfektion och lägga till differentierings mediet som beskrivs i steg 2,2.
5. immunofluorescens
- Ta bort odlingsmediet och skölj cellerna med 1x PBS. Fix celler med 100% iskall metanol i 3 min utan att skaka. Ta bort fixlösningen och tvätta kort med 1x PBS.
- Permeabilize med 0,1% nonjontensid i 1x PBS i 5 min vid rumstemperatur (RT). Kort, tvätta med 1x PBS, 3 gånger.
- Inkubera celler med blockerande buffert (0,1% Tween 20 och 1% BSA i PBS) för 30 min vid RT på en orbitalshaker.
- Inkubera med lämpliga primära antikroppar (t. ex. mus monoklonal anti-Tau13 antikropp) utspädd 1:500 i blockerande buffert över natten vid 4 ° c i orbitalskak. Ta bort antikroppslösningen och tvätta, kort, med 1x PBS.
- Inkubera med sekundära antikroppar konjugerade med fluorophore (t. ex. get anti-Mouse-antikroppar konjugerat till Alexa fluor 633) utspädd 1:500 i blockeringsbuffert för 1 h vid RT. ta bort antikroppslösningen och tvätta kort med 1x PBS 3 gånger.
- För att fläcka kärnor, inkubera med DAPI utspädd 1:20000 i blockerande buffert för 10 min vid RT. Tvätta med 1x PBS 3 gånger. Montera täckglas på en bild med hjälp av AntiFade monteringsmedium.
6. västlig blot
- För att samla in cellpelleten från steg 4,4, ta bort mediet och tvätta celler med PBS. Inkubera med 500 μL av 0,1% trypsin i 4 min vid 37 ° c. Lägg till en lika stor volym med kompletta medel-och Omsuspendera celler.
- Samla in celler i ett rör och centrifugera vid 500 x g i 5 min. Vid slutet av centrifugering försiktigt bort supernatanten. Tillsätt 1 mL PBS, Centrifugera vid 500 x g i 5 minuter och ta försiktigt bort supernatanten. Förvara cell pellets på is för omedelbar användning eller frys vid-80 ° c för långtidsförvaring.
- För totalt proteinextrakt, inkubera cellpelleten i 30 min på is i lyseringsbuffert (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% glycerol, 1% oktylfenoxi poly (etylenoxi) etanol, Grenade (tabell över material), 10 mm EDTA) kompletterad med proteas och fosfatashämmare. Enligt överflödet av pelleten, Använd 50 μL till 100 μL av lyseringsbufferten.
- Centrifugera extraktet vid 16 000 x g i 15 min. samla in supernatanten och kvantifiera protein koncentrationen med en standardiserad kvantifieringsanalys. Bered proteinproverna för SDS-sidan genom att blanda 20 μg proteiner med 5 μL 4x Laemmli-buffert i en total volym av 20 μL och koka vid 100 ° c i 5 min.
Anmärkning: Provet kan förvaras vid-20 ° c.
- Centrifugera extraktet vid 16 000 x g i 15 min. samla in supernatanten och kvantifiera protein koncentrationen med en standardiserad kvantifieringsanalys. Bered proteinproverna för SDS-sidan genom att blanda 20 μg proteiner med 5 μL 4x Laemmli-buffert i en total volym av 20 μL och koka vid 100 ° c i 5 min.
- För subcellulära fraktioneringar, Omsuspendera celler från steg 6,2 i komplett medium, och samla 1 x 106 celler per prov. Centrifugera vid 500 x g i 10 minuter för att få cell pellets för följande steg.
- För att isolera subcellulära fack, fraktionera enligt kit specifikationer. För att isolera varje fraktion, inkubera cellpelleten från steg 6,4 med motsvarande buffert, Centrifugera, samla upp supernatanten och tillsätt nästa buffert till pelleten enligt beskrivningen i 6.4.1.1-6.4.1.5. Lägg i ordning cytoplasmiska extraktion buffert, membran extraktion buffert, nukleär extraktion buffert, nukleär extraktion buffert kompletteras med 5 mM CaCl2 och 3 U/μl micrococcal Nuclease och cytoskelett extraktion buffert.
Anmärkning: Alla buffertar måste kompletteras med proteashämmare. Skala buffertvolymer enligt volymen av cellpelleten.- För att isolera cytosoliska fraktionen, inkubera cell pellets i 100 μl av iskall cytoplasmiska extraktionsbuffert kompletterad med proteashämmare vid 4 ° c med mild blandning i 10 min. Centrifugera vid 500 x g vid 4 ° c i 5 min och överför supernatanten till förkylda rör.
- Tillsätt 100 μL iskall membran extraktionsbuffert kompletterad med proteashämmare till pelleten från steg 6.4.1.1, och inkubera vid 4 ° c med skonsam blandning i 10 min. Centrifugera vid 3 000 x g vid 4 ° c i 5 min och samla upp supernatanten.
- För den lösliga nukleära fraktionen, tillsätt 50 μL av nukleär extraktionsbuffert kompletterad med proteashämmare till pelleten från steg 6.4.1.2, och Vortex. Inkubera vid 4 ° c i 30 min, Centrifugera vid 5 000 x g vid 4 ° c i 5 min, och samla supernatanten.
- För den olösliga nukleära fraktionen, tillsätt 50 μL nukleär extraktionsbuffert kompletterad med proteashämmare, CaCl2 och micrococcal Nuclease till pelleten från steg 6.4.1.3, och Vortex. Inkubera vid 37 ° c i 5 min, och sedan virvel igen. Centrifugera vid 16 000 x g vid RT i 5 min och samla supernatanten.
- För cytoskeletala fraktionen, tillsätt 50 μl överföring extraktion buffert kompletteras med proteashämmare till pelleten från steg 6.4.1.4, och Vortex. Inkubera 10 minuter vid RT. Centrifugera röret vid 16 000 x g i 5 min, samla supernatanten och kassera pelleten.
Anmärkning: Skala buffertvolymer enligt cell volymen, som anges i kit-protokollet. Se kit-protokollet för ytterligare information om inkubering och centrifugering tid och temperatur22,23,24,25,26,27,28,29. Alternativt kan du använda alla standardmetoder30 som genom att använda rengöringsmedel och genom att öka Jon hållfastheten och centrifugeringshastigheten, separerar cytosolic, membran bundet, cytoskelett och kärn fraktioner. Separera den lösliga kärn fraktionen och den olösliga kärn fraktionen genom att utnyttja standardbuffertar för kärn utvinning. Provet kan förvaras vid-20 ° c.
- För SDS-sidan, tillsätt 7 μL 4x Laemmli buffert till 20 μL subcellulära fraktioner som erhållits från steg 6.4.1.1 − 6.4.1.5, koka vid 100 ° c i 5 min.
- För att isolera subcellulära fack, fraktionera enligt kit specifikationer. För att isolera varje fraktion, inkubera cellpelleten från steg 6,4 med motsvarande buffert, Centrifugera, samla upp supernatanten och tillsätt nästa buffert till pelleten enligt beskrivningen i 6.4.1.1-6.4.1.5. Lägg i ordning cytoplasmiska extraktion buffert, membran extraktion buffert, nukleär extraktion buffert, nukleär extraktion buffert kompletteras med 5 mM CaCl2 och 3 U/μl micrococcal Nuclease och cytoskelett extraktion buffert.
- Fyll på prover på en akrylamidgel och utför elektrofores vid en konstant spänning på 120 V. överför proteiner till nitrocellulosa membran på 250 mA för 90 min.
- Kontrollera korrekt protein gel elektrofores och framgångsrik blotting genom inkuberande membranet för 5 min i Ponceau färgning lösning. Skölj membranet i destillerat vatten tills bakgrunden är ren. Ta bort fläcken genom fortsatt tvättning med Tris buffrad saltlösning med Tween 20 (TBST) i 10 minuter på en shaker.
- Inkubera membranet med blockerande lösning (5% mjölk i TBST) för 1 h vid RT på shaker. Tvätta 3 gånger med TBST i 5 min.
- Hybridisera membranet med den primära antikroppen i blockerande lösning (1% mjölk i TBST) över natten vid 4 ° c. Tvätta 3 gånger med TBST i 5 min.
- Hybridisera membranet med HRP-konjugerad sekundär antikropp i blockerande lösning för 1 h vid RT. Tvätta 3 gånger med TBST i 5 min.
- Identifiera protein bandet med hjälp av kemiluminiscensen. Kvantifiera intensiteten av Western blot band av ImageJ. Normalisera protein uttrycket på produkten av en städ-gen: Histon H2B för den nukleära lösliga och olösliga fraktionen, GAPDH för cytoplasmiska fraktionen och för totala extrakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den strategi som används för att dissekera effekterna av nukleära Tau i genuttryck undvika bidraget av cytoplasmiska Tau proteiner har skildrats i figur 1. Kort, Tau proteiner märkta med NLS eller NES ackumuleras i eller uteslutas från kärnkrafts facket, respektive. Den funktionella effekten av denna obalans är förändringen av genuttrycket mätt som produkten av VGluT1 genen.
Efter protokollet beskrivning, SH-SY5Y celler behandlades med RA i 5 dagar och sedan med BDNF för 3 dagar för att få post-mitotiska neuron-liknande celler (figur 2). I avsaknad av RA och BDNF, odifferentierade SH-SY5Y celler antar en rundare morfologi och bilda cell klumpar. Som förväntat, start av differentiering protokollet, klumpar varva ner och celler utspridda neuriter; i slutet av differentieringen, celler är jämnt fördelade och sammankopplade via ett nätverk av förgrenade neuriter.
Dagen efter sådd, celler har transfekterade med Tau-nls eller Tau-NES plasmider (avsnitt 4,2) med katjoniska lipider. För celler som uttrycker Tau-NLS eller Tau-NES konstruktioner, Tau subcellulära lokalisering kan upptäckas genom immunofluorescens med anti-Tau antikroppar. Beroende på effektiviteten av transfektion, celler visar en stark nukleär färgning sammanslagning med DAPI signalen eller en cytoplasmisk färgning med tomma kärnor om de framgångsrikt transfekterade med Tau-nls eller Tau-NES, respektive (figur 3). Avsaknaden av dessa specifika signaler indikerar en ineffektiv transfektion.
För att analysera proteinerna anrikade i olika subcellulära kupé celler samlades och räknades för att bearbeta lika mängder celler per prov. Alla vanliga fraktioneringsmetoder som utnyttjar ökande diskmedel och jonstyrka och ökar centrifugeringshastigheten kan användas för att separera de cellulära kupéer från varandra och på så sätt isolera cytosolic, membranbundna, cytoskeletala och kärn fraktioner.
När atomkärnor har isolerats, var den nukleära lösliga fraktionen och kromatin bundna fraktionen separeras genom att tillsätta 3 U/μL av micrococcal Nuclease och 5 mM CaCl2.
För Western blot-analys, lika volymer av cytoplasmiska och membran fraktioner och hälften av de andra fraktionerna har laddats på en gradient förtillverkade akrylamid gel, att korrigera för olika mängd buffert läggas vid varje steg.
För att kontrollera den effektiva separationen mellan olika fraktioner har den västerländska blot som utnyttjar följande antikroppar utförts: anti-GADPH (förekommer i alla fraktioner utom cytoskelettet och särskilt berikat i cytoplasmiska fraktionen); anti-Actin (särskilt anrikad i cytoskeletala fraktionen); anti-tubulin (särskilt anrikad i cytoplasmiska och cytoskeletala fraktioner); anti-H2B (anrikat i kärn fraktioner) (figur 4).
En berikning av dessa markörer i olika subcellulära fraktioner indikerar att fraktioneringen inte är väl utfört. Det måste noteras att varje protokoll för subcellulär fraktionering kan utgöra en 10-15% av kontaminering mellan fraktioner.
När den lyckade fraktioneringen av provet har verifierats har Western blot utförts för att kontrollera signalen från Tau i kärnkrafts facket och VGluT1 signalen i det totala extraktet (figur 5). Medan otaggade Tau är detekterbar i alla fraktioner, Tau-NLS är starkt berikas i kärnkrafts facket och det är dåligt detekterbar i cytoplasmiska fraktionen. Tvärtom, Tau-NES är berikad i cytoplasmiska fraktionen och det är mindre detekterbar i den nukleära fraktionen. Närvaron av en liten mängd Tau-NES i den lösliga nukleära fraktionen måste förväntas eftersom, liksom den endogena Tau, det är placerad i kärnan och en gång i kärnkraft facket den nukleära export signalen tillåter dess flyttning till cytoplasman. Upptäckten av en annan berikning för dessa två fusions proteiner kan tyda på ett problem i verkningsgraden för transfektion eller vid kloning av konstruktioner eller fraktionering.
Kvantitativ analys av Western blot kan göras med ImageJ. Värden är normaliserade för den städ-gen som är specifik för varje fraktion (GAPDH för cytoplasmiska fraktion; Histon H2B för lösliga nukleära och kromatin-bundna fraktioner).
Grafen i figur 5B redovisar förhållandet mellan Tau i den lösliga nukleära fraktionen och cytoplasmiska fraktionen för att belysa att Tau-nls är mycket anrikad i den lösliga kärn fraktion (SNF) medan Tau-NES minskar. Dessutom är Tau-NLS berikas i den kromatin-bundna fraktionen (CBF) med avseende på cytoplasmiska fraktionen (CF) medan Tau-NES minskar. SNF/CF = 1 och CBF/CF = 1 motsvarar Tau-kvoten i kontroll cellerna. Den endogena Tau är svagt detekterbar i alla fraktioner som förväntat. Grafen i figur 5C redovisar kvantifieringen av VGluT1 uttrycket i de totala extrakten av prover som uttrycker olika mängd nukleärt Tau. I celler som uttrycker Tau-NES är VGluT1 uttryck jämförbart med baslinje uttrycket i kontroll cellerna. Tvärtom, i celler som uttrycker otaggade Tau eller Tau-NLS, uttrycket av VGluT1 är mer än fördubblats.
Figur 1: grafisk representation av den strategi som används för att möjliggöra en nukleär eller cytoplasmisk ackumulering av Tau. Tau-NLS ackumuleras i kärn rummet medan Tau-NES är utesluten. Den experimentella avläsning är moduleringen av VGluT1 uttrycket. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativ odifferentierad och differentierad cellkultur. Avbilda av undifferentierad SH-SY5Y (lämnat), celler som göras åtskillnad mellan vid RA (en mitt) och göras åtskillnad mellan vid RA och BDNF (rätten). Scale bar = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativ bild av Tau subcellulär berikning genom immunofluorescens. Bild av celler som inte är transfected eller uttrycker omärkta Tau, Tau-NES eller Tau-NLS konstruktioner. Tau signal har erhållits genom immunofluorescens (röd), kärnor signal har erhållits genom DAPI färgning (blå), sammanslagna bilder rapporteras. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativ detektion av proteiner berikade i subcellulära fraktioner av Western blot. Western blot av subcellulära fraktioner från SH-SY5Y celler. CF = cytoplasmiska fraktion; MF = membran fraktion; SNF = löslig kärn fraktion; CBF = den bundna fraktionen för kromatin; CKF = cytoskeletala fraktionen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativ detektion av nukleära Tau-och VGluT1-proteiner. A) västra blot av tau-protein som upptäckts i de nukleära och cytoplasmiska fraktionerna. (B) grafen rapporterar förhållandet mellan Tau i de nukleära fraktioner och cytoplasmiska fraktion. Värdena har normaliserats på endogena Tau. SNF/CF = 1 och CBF/CF = 1 motsvarar endogena Tau-kvoten i kontroll cellerna. C) Western blot av VGluT1 protein. (D) grafen redovisar kvantifieringen av VGluT1 uttrycket i det totala extrakt av prover som uttrycker olika mängd nukleärt Tau. Kruskal-Wallis ANOVA och Mann-Whitney test; p < 0,001, * * * * p < 0,0001, ns p > 0,05. Alla resultat visas som medelvärdet ± SEM från minst tre oberoende experiment. Denna representativa siffra har ändrats från Siano et al.31. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en metod för att mäta effekten av nukleärt tau-protein på genuttryck. Med detta protokoll bidraget av cytoplasmiska Tau är starkt begränsad. Kritiska steg i detta protokoll är följande: differentieringen av humana neuroblastom sh-SY5Y-celler, den subcellulära fraktioneringen och lokaliseringen av tau-protein i kärnkrafts facket.
Först, som visas i representativa resultat avsnitt, differentiering av SH-SY5Y celler genom att lägga till RA och BDNF är avgörande för att få en bra beredning av neuron-liknande celler i kulturen. Tätheten av celler seedade är särskilt viktigt eftersom en lägre densitet kan påverka cellproliferation. Dessutom, för experiment som behöver ett stort antal celler, som cellulära fraktionering och Western blot, är det viktigt att notera att BDNF differentiering steg blockerar cellulär proliferation att tillåta Terminal differentiering, vilket begränsar antalet celler i kulturen. Alternativa differentiering protokoll använder endast RA eller NGF i stället för BDNF. Men medan du lägger BDNF efter ra gör det möjligt att nå en bättre morfologisk differentiering32,33, inducerar NGF en svagare neurit utväxt i sh-SY5Y celler34. Dessutom har det visats i stor utsträckning att kombinationen av RA och BDNF gör det möjligt att få en homogen neuronala population med uttryck för neuronala markörer och minskad proliferation35. Av denna anledning, differentiering protokollet utnyttjas här kombinerar RA och BDNF.
Emellertid, det förfarande som rapporteras att dissekera roll Tau i olika subcellulära fack kan användas också för odifferentierade celler eller för olika celltyper.
Den subcellulära fraktionering är ett mycket kritiskt steg ochDet är avgörande för att ha tillräckligt med utgångsmaterial: en kommersiell kit kräver endast 1 x 106 celler, medan andra förfaranden kan behöva en mycket högre startkvantitet. Dessutom garanterar användningen av ett kit med standardbuffertar och steg reproducerbarheten av experimentet som är oundvikligt och nödvändigt. Men eftersom sammansättningen av buffertar ofta är patentskyddad, kan de innehålla rengöringsmedel som kan förändra funktionen av proteinet av intresse och det kan vara svårt att optimera isoleringen av fraktioner. Dessutom, även i bästa skick, det kan finnas en 10-15% av kontaminering mellan fraktioner. En dålig avkastning från varje fraktion kan övervinnas genom att öka inkubationstiden i extraktionsbuffertar av specifika fraktioner.
Eftersom funktionerna i Nuclear Tau har vunnit stort intresse under de senaste åren, är det särskilt viktigt att ge en tillförlitlig metod för att dissekera funktionen av Tau i olika cellulära fack. Koppling den subcellulära fraktionering, med uttrycket av Tau konstruktioner specifikt riktade eller uteslutas från kärnan, tillåter en att finjustera mängden Tau i olika fack.
Ett kritiskt steg i denna del av protokollet är kloningen av Tau som märkts med nukleär lokaliserings signal eller med kärnvapen export signalen. Effektiviteten av NLS garanteras av närvaron av en 3XNLS konsensus sekvens från SV40 viruset. Den nukleära transplaceringen av proteinet kan lätt kontrolleras genom immunofluorescens, och avsaknaden av signal i kärnan kan bero på en felaktig kloning eller en ineffektiv transfektion. Tvärtom garanteras kärn exporten av NES-samförståndssekvens. I detta fall, den immunofluorescens tillåter kontroll av exporten av Tau från kärnan. En svag nukleär signal ska dock inte uteslutas sedan Tau-NES-proteinet kommer in i kärnan och sedan, på grund av NES-sekvensen, exporteras den till cytosolen.
Hittills har funktionen av Nuclear Tau undersökts endast av korrelativa metoder som inte garanterar dess direkta inblandning. Protokollet här beskrev, ger den första metoden gör det möjligt att tydligt diskriminera den särskilda funktionen av Tau i kärnkrafts facket. Som tidigare visats påverkar det endogena Tau inte de resultat som erhålls genom detta protokoll. Faktum är att samma experiment utförs i icke-neuronala celler som inte uttrycker endogena Tau, leder till VGluT1 förändrat uttryck. Vi tillämpade detta protokoll för att studera uttrycket av sjukdomsrelaterade gener31. Hur som helst, det kan utnyttjas också för att undersöka andra nukleära Tau funktioner, såsom inblandning i DNA-skador, samspelet med kärn-kofaktorer eller med kromatin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Scuola normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10,000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10,000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15,000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5,000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH = 8, 0.5 M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1,000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
References
- Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
- Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
- Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
- Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
- Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
- Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
- Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
- Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
- Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J.
- Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
- Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
- Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
- Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
- Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
- Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
- Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
- Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
- Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
- Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
- Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
- Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
- Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
- Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
- Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
- Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
- Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
- Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
- ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , Intechopen. (2012).
- Siano, G., et al.
- Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells? Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
- Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
- Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
- Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).
