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Génération de cardiomyocytes dérivés de HiPSC ventriculaires et de préparations cellulaires de haute qualité pour la caractérisation de la manipulation du calcium

Published: January 17, 2020 doi: 10.3791/60135
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Ici nous décrivons et validons une méthode pour générer uniformément les cardiomyocytes pluripotents pluripotents de cellules souches induits par l'homme robustes et caractériser leur fonction. Ces techniques peuvent aider à développer un aperçu mécaniste des voies de signalisation, fournir une plate-forme pour le dépistage à grande échelle des médicaments, et modéliser de façon fiable les maladies cardiaques.

Abstract

Les cardiomyocytes pluripotents induits par l'homme (iPSC-CM) fournissent une source humaine précieuse pour l'étude de la science fondamentale du calcium (Ca2)des voies de manipulation et de signalisation ainsi que des tests de dépistage et de toxicité des médicaments à haut débit. Ici, nous fournissons une description détaillée des méthodologies utilisées pour générer des iPSC-CM de haute qualité qui peuvent reproduire de façon cohérente des caractéristiques moléculaires et fonctionnelles à travers différentes lignées cellulaires. En outre, une méthode est décrite pour évaluer de façon fiable leur caractérisation fonctionnelle par l'évaluation des propriétés de manutention Ca2. Les conditions à faible teneur en oxygène (O2), la sélection du lactate et le temps prolongé en culture produisent des cardiomyocytes ventriculaires de haute pureté et de haute qualité. Semblable aux cardiomyocytes adultes isolés de rat (ARCMs), les iPSC-CM de 3 mois présentent l'amplitude plus élevée de Ca2, le taux plus rapide de reuptake de Ca2MD (decay-tau), et une réponse lusitrope positive à la stimulation adrénergique de l'adrénergique par rapport au jour 30 iPSC-CM. La stratégie est techniquement simple, rentable et reproductible. Il fournit une plate-forme robuste pour modéliser les maladies cardiaques et pour le dépistage à grande échelle des médicaments pour cibler les protéines de manipulation Ca2.

Introduction

Les cardiomyocytes pluripotents induits par l'homme (iPSC-CM) sont une plate-forme humaine attrayante pour modéliser une grande variété de maladies cardiaques in vitro1,2,3,4,5,6,7,8. En outre, iPSC-CMs peut être utilisé pour la prédiction des réponses des patients à des médicaments nouveaux ou existants, pour dépister les composés touchés, et de développer de nouveaux médicaments personnalisés9,10. Cependant, malgré des progrès significatifs, plusieurs limitations et défis doivent être pris en considération lors de l'utilisation de l'iPSC-CMs11. Par conséquent, les méthodes visant à améliorer les protocoles de différenciation cardiaque, à améliorer l'efficacité et la maturation des iPSC-CM, et à générer des sous-types spécifiques de cardiomyocytes (ventriculaire, auriculaire et nodal) ont été intensément étudiées et ont déjà conduit à de nombreuses stratégies culturelles pour surmonter ces obstacles12,13,14,15.

Malgré la robustesse de ces protocoles, une préoccupation majeure pour l'utilisation des iPSC-CM est la reproductibilité des procédures longues et complexes pour obtenir des cardiomyocytes de haute qualité qui peuvent assurer les mêmes performances et les résultats reproductibles. La reproductibilité est essentielle non seulement pour comparer les lignées cellulaires ayant des antécédents génétiques différents, mais aussi pour répéter les comparaisons cellulaires et moléculaires d'une même lignée cellulaire. La variabilité cellulaire, comme les différences de bien-à-puits dans la densité des iPSC, peut affecter la différenciation cardiaque, générant un faible rendement et des cardiomyocytes de mauvaise qualité. Ces cellules pourraient encore être utilisées pour effectuer des expériences qui ne nécessitent pas une population pure de CM (p. ex., lors de l'exécution de mesures transitoires Ca2MD). En effet, lors de l'analyse électrophysiologique, les non-CM ne battront pas, ni spontanément ni sous stimulation électrique, il sera donc facile de les exclure de l'analyse. Cependant, en raison de la mauvaise qualité, les iPSC-CM peuvent présenter des caractéristiques électrophysiologiques altérées (p. ex., transitoires Ca2, faible amplitude Ca2) qui ne sont pas dues à leur constitution génétique. Par conséquent, particulièrement en utilisant l'iPSC-CMs pour modéliser la maladie cardiaque, il est important de ne pas confondre les résultats d'un CM de mauvaise qualité avec le phénotype de la maladie. Des processus de dépistage et d'exclusion minutieux sont nécessaires avant de procéder à des études électrophysiologiques.

Cette méthode comprend des protocoles optimisés pour générer des cardiomyocytes de haute pureté et de haute qualité et pour évaluer leur fonction en effectuant des mesures transitoires Ca2 à l'aide d'un système d'acquisition et d'analyse de calcium et de contractilité. Cette technique est un moyen simple, mais puissant, de distinguer entre les préparations iPSC-CM à haut rendement et de faible efficacité et de fournir une caractérisation plus pertinente sur le plan physiologique des iPSC-CM humaines.

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Protocol

Les expériences utilisant des cardiomyocytes de rat adultes dans cette étude ont été menées avec les protocoles approuvés du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'École de médecine Icahn à Mount Sinai. Les cardiomyocytes adultes de rat ont été isolés des coeurs de rat de Sprague Dawley par la méthode Langendorff-basée comme précédemment décrit16.

1. Préparation des médias

  1. Préparer les médias hiPSC.
    1. Équilibrez le supplément et la température moyenne à ambiante (RT) basale. Assurez-vous que le supplément a complètement décongelé. Mélanger 400 ml du milieu basal et 100 ml du supplément et filtrer à l'aide d'un filtre sous vide de 0,22 m. Conserver à 4 oC et réajuster à RT avant utilisation.
  2. Préparer l'IMRP et le B27.
    1. Équilibrez le supplément B27 et le milieu basal (RPMI 1640) à RT. Assurez-vous que le supplément a complètement décongelé. Mélanger 490 ml du milieu basal et 10 ml du supplément 50x et filtrer à l'aide d'un filtre sous vide de 0,22 m. Conserver à 4 oC et réajuster à RT avant utilisation.
  3. Préparer l'insuline RPMI et B27 (-)
    1. Équilibrez le supplément d'insuline B27 (-) et le milieu basal (RPMI 1640) à RT. Assurez-vous que le supplément a décongelé complètement. Mélanger 490 ml du milieu basal et 10 ml du supplément 50x et filtrer à l'aide d'un filtre sous vide de 0,22 m. Conserver à 4 oC et réajuster à RT avant utilisation.
  4. Préparer les supports de sélection (RPMI (-) glucose et B27 et lactate).
    1. Équilibrez le supplément B27 et le milieu basal (RPMI 1640 (-) glucose) à RT. Assurez-vous que le supplément a décongelé complètement. Mélanger 490 ml du milieu basal et 10 ml du supplément 50x, ajouter 4 mM de lactate de sodium constituée dans de l'eau stérile et filtrer à l'aide d'un filtre à vide de 0,22 m. Conserver à 4 oC et réajuster à RT avant utilisation.
  5. Préparer RPMI 20.
    1. Équilibrez le milieu basal (RPMI 1640) pour synthétiser le sérum bovin fœtal (FBS) (20% de concentration finale) et le RPMI. Filtrer à l'aide d'un filtre à vide de 0,22 m et conserver à 4 oC. Équilibrez à RT avant utilisation.
  6. Préparer les supports de passage en ajoutant à hiPSC des supports à bobine enroulée et à bobines de rhosoliens contenant de la kinase protéique (ROCK).
  7. Préparer les médias D0 en ajoutant l'inhibiteur GSK-3, CHIR 99021 à RPMI - B27 (-) milieu xinsuline (10 m final).
  8. Préparer les médias D3 et D4 en mélangeant les supports d'insuline RPMI et B27 (-) avec iWR-1 (5 m final).
    REMARQUE : Les milieux D1 et D5 sont constitués d'insuline RPMI et B27 (-) Les médias D7 sont constitués de RPMI et B27.
  9. Préparer le tampon de blocage (2 % d'albumine de sérum bovin [BSA], 2 % de FBS, 0,05 % de NP-40 en saline tamponnée en phosphate [PBS]) : Dans un tube conique de 50 ml, ajouter 1 g de BSA, 1 ml de FBS, 49 ml de PBS et 250 oL de NP-40. Mélanger jusqu'à dissolution complète.

2. Préparation de cellules souches embryonnaires humaines (HESC) qualifiées Plaques et plaques de couverture

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes sous une hotte stérilisée de culture de tissu.

  1. Décongeler la solution de stock de matrice qualifiée par hESC pendant la nuit sur la glace à 4 oC. Reportez-vous à la feuille de spécification du produit pour déterminer les volumes d'aliquot appropriés, car cela peut varier en fonction du stock. Entreposer ces aliquots à -20 oC dans des tubes microcentrifuges de 1,5 ml.
  2. Afin d'utiliser la matrice pour les plaques de revêtement ou les couvercles en verre, décongelez d'abord un aliquot de matrice hESC-qualifiée à 4 oC pendant 30 min.
  3. Aliquot 24 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) : mélange nutritif F-12 (DMEM/F:12) dans un tube conique de 50 ml.
  4. Mélanger le média froid DMEM/F:12 avec une pipette en verre de 2 ml afin de refroidir la surface de la pipette.
  5. À l'aide de la même pipette, prendre environ 500 à 700 l de DMEM/F:12 froid et mélanger avec l'aliquot de matrice hESC-qualifié dans le tube de microcentrifuge lui-même.
  6. Une fois correctement mélangé, transférer la solution dans le tube conique de 50 ml contenant le DMEM/F:12 froid et mélanger à nouveau.
  7. Pour une assiette standard de 6 puits, ajouter 1 ml de ce mélange à chaque puits. Assurez-vous que le puits est entièrement couvert. Laissez les plaques à RT sous le capot de culture de tissu pendant au moins 30 min. Si vous le souhaitez, conserver à 4 oC immédiatement après le placage jusqu'à 1 semaine et réquilibrer à RT pendant 30 minutes avant l'utilisation.
  8. Afin d'utiliser les plaques, aspirer la matrice et remplacer par des supports appropriés. Utilisez immédiatement.
  9. Entreposez les couvercles en verre dans un environnement stérile (p. ex., à l'intérieur d'une hotte stérile de culture tissulaire).
  10. Avant d'enrober, essuyez chaque bordereau individuel avec 70 % d'éthanol. Une fois que le bordereau est sec, placez-le à l'intérieur d'un puits d'une plaque stérile de 6 puits.
  11. Prenez 250 à 300 l de la solution de matrice qualifiée par le HESC et distribuez-la soigneusement directement sur le centre de la glissière en verre. Laissez les couvertures à RT sous le capot de culture de tissu pendant au moins 30 min avant utilisation.

3. Préparation de petites molécules

REMARQUE : Reconstituer toutes les petites molécules et modulateurs Wnt dans DMSO sauf indication contraire.

  1. Préparer 10 mM d'aliquots de 25 L chacun de IWR-1 et CHIR 99021 et stocker à -20 oC.
  2. Reconstituer 10 mM d'aliquots de 50 OL chacun de Thiazovivin (inhibiteur de ROCK) et stocker à -20 oC.

4. Entretien et passage des iPSC

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes sous une hotte stérile de culture de tissu.

  1. Maintenir les iPSC dans les plaques de puits standard 6 et effectuer toutes les étapes dans des conditions stériles. Maintenir les cellules avec 2 ml de support hiPSC par puits. Changer les médias tous les deux jours. Maintenir les cellules à 37 oC, 6 % O2, 5 % CO2. Passer les cellules lorsqu'elles sont entre 70 et 80% de confluents.
  2. Equilibrate PBS sans Ca2 et Mg2 à RT.
  3. Pour commencer le processus de passaging, ajouter 1 mL de PBS sans Ca2 et Mg2 'au puits qui doit être passé. Incuber à RT pendant 7 à 10 min. Vérifier les cellules sous le microscope pour s'assurer que le traitement PBS n'a pas entraîné une dissociation complète de la monocouche.
  4. Retirez le PBS et remplacez-le par 1 ml de support de passage. Utilisez un élévateur cellulaire pour gratter doucement et soulever les cellules de la surface du puits.
  5. Dissocier mécaniquement les cellules à l'aide d'une pipette stérile en verre de 2 ml. Répétez l'opération jusqu'à ce que les cellules soient bien dissociées uniformément en petites colonies lorsqu'elles sont observées au microscope.
  6. Une fois que les cellules ont été suffisamment dissociées, ajouter 5 ml de support de passage pour diviser les cellules 1:6. Ajuster le nombre de supports de passage à ajouter pour correspondre au ratio de fractionnement préféré.
  7. Aspirez la matrice hESC-qualifiée de la plaque hESC-enduite de matrice et remplacez par 1 ml de support de passage par puits. Ajouter 1 ml de cellules dissociées par puits.

5. Différenciation cardiomyocyte

  1. Utilisez des lignes hiPSC bien établies (plus de 20 passages) et présentez une morphologie homogène avant de commencer la différenciation cardiaque.
  2. Assurez-vous que les iPSC sont environ 70-80% confluents.
  3. Laver les cellules 1x en PBS sans Ca2 et Mg2 .
  4. Ajouter 2 ml de support D0 (étape 1,7) par puits et transférer les cellules à l'incubateur.
  5. Après 24 h, remplacer par 3 ml de support D1 par puits pendant 48 h.
  6. Le jour 3, remplacez les médias par 2 ml de médias D3 par puits. Répétez avec les médias D4 le jour 4.
  7. Le jour 5, remplacez les médias par 3 ml de dj. Par puits.
  8. Le jour 7, remplacer les supports par 3 ml de support D7 par puits et transférer dans un incubateur avec 37 oC, 5% CO2, et la concentration normale o2. Remplacez les supports D7 (RPMI et B27) tous les 2 jours.

6. Procédure de sélection et dissociation iPSC-CM

  1. Dix jours avant d'effectuer les mesures transitoires Ca2 ou toute analyse fonctionnelle, remplacez le support RPMI B27 par 3 ml de support de sélection par puits pendant 48 h.
  2. Remplacer les médias par 3 ml de supports de sélection pour un autre 48 h.
  3. Remplacer les médias par 2 ml de support RPMI et B27 par puits pendant 24 h.
  4. Manteau standard 6 plaques de puits telles que décrites à la section 2.
  5. Ajouter 1 ml de trypsine stérile de 0,25% avec EDTA à chaque puits. Incuber la plaque à 37 oC pendant 5 min.
  6. À l'aide d'une pipette de 1 000 l, dissocier mécaniquement les cellules afin que les cellules individuelles puissent être observées au microscope.
  7. Transférer les cellules dans un tube conique stérile de 15 ml et ajouter 2 ml de RPMI 20 milieux par puits. Centrifugeuse de 5 min à 800 x g.
  8. Aspirez le supernatant et suspendez les cellules dans les médias RPMI et B27. Aspirez la matrice hESC-qualifiée des plaques et remplacez-la par 1 mL de support RPMI et B27.
  9. À l'aide d'une pointe de pipette de 1 000 ml, dissocier mécaniquement le granule cellulaire jusqu'à ce que la solution semble homogène.
  10. Transférer environ 500 000 cellules à chaque puits. Transférer à l'incubateur pendant 24 h.
  11. Remplacer les médias par 3 ml de média de sélection par puits pendant 48 h.
  12. Remplacer les supports par 3 ml de RPMI et B27 par puits. Maintenir les cellules dans les médias D7 (RPMI et B2 changeant les médias tous les 2 jours jusqu'à ce qu'ils soient prêts pour une analyse fonctionnelle.

7. Préparation des iPSC-CM s'adressent à Flow Cytometry

  1. Une fois que les cellules sont de l'âge désiré et ont subi la sélection métabolique (section 6), lavez les cellules avec PBS sans Ca2 et Mg2.
  2. Ajouter 1 ml par puits de trypsine 0,25% et incuber de 5 à 7 min à 37 oC.
  3. Pipette le mélange 5-10x avec une pointe P1000 pour singulariser les cellules, et transférer dans un tube de 15 ml contenant 2 ml de RPMI 20.
  4. Faire tourner les cellules à 600 x g pendant 5 min.
  5. Ajouter 100 l de solution de fixation (4% PFA) à la pastille cellulaire. Ajouter la solution dans le sens goutte avec un vortex continu et doux, puis mettre sur la glace pendant 15 min.
  6. Ajouter 1,5 ml de PBS. Recueillir les cellules par centrifugation et aspirer le supernatant.
  7. Pour chaque expérience, inclure un contrôle non taché par condition de fixation/perméabilisation.
  8. Resuspendre les cellules dans 500 l de la solution de blocage (2% FBS/2% BSA en PBS avec 0.1% NP-40) pendant 30 min à RT.
  9. Sans enlever la solution de blocage, ajouter l'anticorps primaire MLC2V/MLC2A (5 mg/mL), et couver 45 min à RT.
  10. Laver avec un tampon de blocage. Recueillir les cellules par centrifugation et solution d'aspiration.
  11. Ajouter l'anticorps secondaire Alexa Fluor 555/488(1:750) dilué dans le tampon de blocage pendant 45 min à RT ou pendant la nuit à 4 oC.
  12. Ajouter 1,5 ml de PBS. Recueillir les cellules par centrifugation et solution d'aspiration.
  13. Resuspendre les cellules dans 250 à 300 oL de PBS. Utilisez une pipette P1000 pour désagréger les cellules.
  14. Préparer les tubes à fond ronds avec un capuchon de passoire à cellules en nylon de 35 m. Prémouiller la passoire cellulaire avec 50 L de PBS et régler le tube sur la glace.
  15. Transférer la solution avec les cellules désagrégées aux tubes de fond ronds avec les bouchons de passoire de cellules. Laissez la solution cellulaire s'écouler naturellement ou appuyez sur le fond du tube contre une surface plane, au besoin, afin d'assurer un drainage complet et la collecte des cellules dans le tube. Assurez-vous de remettre le tube sur la glace dès que possible.
  16. Rincer la passoire cellulaire avec 250 L de PBS pour récupérer les cellules résiduelles.
  17. Maintenir les tubes sur la glace et recouvrir de papier d'aluminium jusqu'à l'analyse de cytométrie du débit.

8. Platage Cardiomyocytes sur des couvertures en verre

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un environnement stérile.

  1. Préparer les couvercles en verre tels que décrits dans les étapes 2.10 et 2.11.
  2. Une fois que les iPSC-CM ont été sélectionnés et sont de l'âge désiré, suivez les étapes 6,5 à 6,7 pour dissocier les iPSC-CM.
  3. Aspirez le supernatant et resuspendez les cellules dans une quantité suffisante de rpMI 20 médias pour avoir environ 300.000 cellules par 250 'L.
  4. À l'aide d'une pipette en verre de 2 ml, dissocier mécaniquement la pastille cellulaire jusqu'à ce que la solution semble homogène.
  5. Aspirez la matrice hESC-qualifiée des couvertures.
  6. À l'aide d'une pipette de 1000 l, mélanger et tirer 250 l de la solution à partir du tube conique de 15 ml.
  7. Distribuez lentement les 250 L de la solution sur les couvercles en verre, en prenant le soin supplémentaire de ne faire qu'ajouter à la zone où le revêtement de matrice qualifié par le HESC est présent.
  8. Transférer soigneusement à l'incubateur et laisser la nuit, en prenant soin de ne pas secouer ou répandre les cellules sur les couvertures. Le lendemain matin, ajouter délicatement 2 mL de milieux D7 (RPMI et B27) à chaque puits avec le bordereau. Changer les médias après 24 h et tous les 2 jours après cela.

9. Fixation des cellules

  1. Assurez-vous qu'une quantité suffisante de PBS avec Ca2 et Mg2 est liboudrée à 4 oC.
  2. Préparer une solution de paraformaldéhyde (PFA) diluée à 4 % en PBS avec Ca2 et Mg2 et alquer à 4 oC.
  3. Une fois que les iPSC-CM sont d'âge approprié, ont subi une sélection métabolique (section 6), et ont été plaqués sur des couvertures (section 8), laver les cellules 3x avec 1 ml de PBS froid avec Ca2 et Mg2 par puits.
  4. Ajouter 1 ml de PFA froid de 4% et laisser les cellules à RT sous le capot pendant 15 min.
  5. Laver les cellules avec du PBS froid pour éliminer l'excès de PFA.
  6. Ajouter 2 ml de PBS avec Ca2 et Mg2 et conserver à 4 oC.

10. Staining immunofluorescence

  1. Retirez le PBS des cellules fixes et ajoutez 1 ml de tampon de blocage. Incuber pour 1 h à RT.
  2. Retirez le tampon de blocage et ajoutez l'anticorps primaire (5 mg/mL) dilué dans le tampon de blocage. Incuber toute la nuit à 4 oC.
  3. Laver 3x en PBS avec Ca2 et Mg2 pendant 5 min chacun.
  4. Ajouter l'anticorps secondaire dilué dans le tampon de blocage 1:1,000.
  5. Couvrir la plaque de papier d'aluminium pour la protéger de la lumière et incuber pendant 45 min à RT. Gardez le papier d'aluminium pour les étapes suivantes.
  6. Laver 3x en PBS avec Ca2 et Mg2,5 min chacun.
  7. Ajoutez une quantité suffisante de solution de travail DAPI pour couvrir complètement les cellules et incuber à RT pendant 10 min.
  8. Laver l'échantillon à fond avec du PBS avec Ca2 et Mg2 pour éliminer l'excès de DAPI.
  9. Prenez de nouveaux toboggans en verre et ajoutez une goutte de support de montage au milieu. Utilisez le goutte-à-goutte pour répartir uniformément les supports de montage. Placez les couvertures avec les cellules face vers le bas sur les diapositives.
    REMARQUE : Les cellules peuvent être stockées pendant 30 jours si elles sont protégées de la lumière.

11. Évaluation des passagers intracellulaires Ca2

  1. Une fois que les iPSC-CM sont au moins 3 mois, ont subi une sélection métabolique (section 6), et ont été plaqués sur des couvertures, les traiter avec 2 'L de Fura-2, AM (concentration finale: 1 'M) et incuber à 37 oC pendant 10 min.
    REMARQUE : Fura-2 est sensible à la lumière. Effectuez toutes les procédures de chargement et les expériences dans l'obscurité.
  2. Préparer le système d'acquisition et d'analyse du calcium et de la passialité.
    1. Alimenter le système en veillant à ce que la lampe à arc soit lancée (Figure 1B).
    2. Placez la chambre sur le système et connectez les tubes de la pompe à l'entonne et aux prises appropriées et au fil électrique du stimulateur à la chambre comme le montre la figure 1C.
    3. Remplissez le tube de perfusion qui traverse le chauffe-eau en ligne fluide avec la solution de Tyrode préchauffée à 37 oC.
    4. Ajuster la caméra et encadrer les dimensions de l'ouverture pour minimiser la surface de fond.
  3. Montez un couvercle en verre avec iPSC-CMs dans la chambre et attachez-vous.
  4. Ajoutez 500 l l de la solution de Tyrode directement sur le dessus de la glissière en verre attaché doucement et commencez à perser la chambre (1,5 mL/min) avec la solution de Tyrode.
  5. Pace iPSC-CMs avec 1 Hz stimulation de champ à l'aide du stimulateur électrique (10 V, 4 ms).
  6. Incuber les iPSC-CM dans la chambre avec stimulation pendant au moins 3 à 5 min pour que les cellules lavent le colorant Fura-2 et s'adaptent à l'environnement et la tordent.
  7. Ajustez la fenêtre d'observation à la partie supérieure gauche de la glissière de verre.
  8. Commencez à enregistrer.
  9. Après avoir recueilli un flux cohérent de 5 à 10 pics, cliquez sur Pause pour arrêter temporairement l'enregistrement.
  10. S'assurer que ni la mise au point ni les dimensions de la fenêtre d'observation ne sont modifiées, déplacer la scène du microscope vers la zone adjacente, se déplacer vers l'extrémité opposée, et reprendre l'enregistrement.
  11. Répétez les étapes 11.9 et 11.10 pour scanner à travers le bordereau de couverture, d'abord se déplaçant vers la gauche, puis vers le bas d'une manière zig-zag pour couvrir toute la zone de couverture. Il s'agit de 80 à 100 mesures par bordereau de couverture.
    REMARQUE : Limitez le temps de mesure total à 10 min, car les facteurs secondaires entraînent une diminution du taux transitoire Ca2.
  12. Une fois les transitoires Ca2MD acquises, analysez les données avec le logiciel d'analyse des traces de fluorescence selon les instructions du fabricant.

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Representative Results

Le protocole décrit dans la figure 1A a généré des cardiomyocytes très purs qui acquièrent un phénotype ventriculaire/adulte avec le temps dans la culture. Évalué par la coloration immunofluorescence pour les isoformes de la chaîne de lumière régulatrice de myosine auriculaire et ventriculaire 2 isoformes (MLC2A et MLC2V, respectivement), la majorité des cellules générées par ce protocole étaient MLC2A-positives au jour 30 après induction de la différenciation cardiaque, tandis que MLC2V a été exprimée en quantités beaucoup plus faibles en même temps (figure 2A, panneaux supérieurs). Au fur et à mesure que le temps de culture augmentait (jour 60 et 90), on observait un changement complet d'isoformes MLC2 (MLC2A à MLC2V)(figure 2A, panneaux inférieurs). Afin de quantifier les cellules MLC2A et MLC2V-positives, l'analyse de cytométrie de flux a été exécutée. Conformément aux résultats de l'immunofluorescence, les données de cytométrie de flux ont démontré un stade précoce (jour 30) iPSC-CM exprimant principalement MLC2A (29,8% MLC2A - vs. 1,9 % MLC2V)) (voir figure 2B, panneau gauche), par rapport à l'étape tardive (jour 90) iPSC-CM, qui exprimait principalement MLC2V (41,3 % MLC2V - contre 16,7 % MLC2A) (voir figure 2B, panneau droit). Puisque le modèle d'expression de MLC2A et de MLC2V est connu pour être une marque de la différenciation et de la maturation cardiaques, ces résultats suggèrent que le temps prolongé de culture augmente la maturation des iPSC-CMs et que la majorité des cellules semblent être attachées au phénotype ventriculaire. Nous avons ensuite évalué la dépendance temporelle de la maturation de la manipulation Ca2. Le transitoire Ca2 a été mesuré chez les iPSC-CM aux trois périodes de différenciation (jour 30, 60 et 90), et comparé aux cardiomyocytes adultes isolés de rat (ARCM). L'amplitude Ca2 a été considérablement augmentée dans les cCM-iPS au jour 90 et était semblable aux ARCM(figure 3A,B). Le taux de reprise de Ca2MD (décay-tau) au jour 90 était beaucoup plus rapide par rapport au jour 30 iPSC-CM, et plus proche des ARCM (figure 3C). L'effet de la stimulation adrénergique sur les transitoires Ca2 a été évalué en traitant les cellules avec 10 nM d'isoproténol (ISO) pendant 10 min à 37 oC. Comme on l'a observé dans les ARCM, l'ISO a considérablement augmenté le taux de cabanon ca2 et accéléré le taux de reuptake Ca2au jour 90 iPSC-CM. Aucun changement n'a été observé au cours du 30e jour iPSC-CM(figure 3D-F). Fait intéressant, les iPSC-CM du jour 90 ont pu suivre l'augmentation de la stimulation électrique (de 0,5 à 3 Hz), de la même manière que celle observée dans les ARCM(figure 4B). Pris ensemble, ces résultats montrent que les iPSC-CM dérivés de cette méthode ont des caractéristiques similaires à celles observées dans les CM indigènes, en particulier les phénotypes ventriculaires, les propriétés matures de manipulation Ca2M, et les réponses positives de l'adrénergique.

La contamination des cellules non cardiaques peut influencer la maturation fonctionnelle des iPSC-CM humains pendant la différenciation17. La figure 4A montre une comparaison entre les cellules de 3 mois obtenues à partir de différenciations à haut rendement (panneaux supérieurs, vidéo 1),exprimant solidement le marqueur ventriculaire spécifique (MLC2V), et les cellules de 3 mois obtenues à partir de différenciations à faible efficacité (panneaux inférieurs, vidéo 2), montrant iPSC-MC mélangés à des cellules alpha-lisses de muscle (SMA). Fait intéressant, l'analyse fonctionnelle a démontré une altération des transitoires Ca2MD dans la préparation mixte iPSC-CM/non-CM par rapport aux iPSC-CM de la différenciation à haut rendement. En particulier, les cellules obtenues à partir de différenciations à faible efficacité présentaient une très petite amplitude et une automatisme Ca2 (figure 4B, panneau moyen) par rapport aux iPSC-CM purs(figure 4B, panneau supérieur) et ARVCs (Figure 4B, panneau inférieur). De plus, les cellules issues de différenciations à faible efficacité présentaient des schémas arythmiques(figure 4C).

Il est important de noter que les iPSC-CM indiqués dans le panneau supérieur de la figure 4A ont également subi une sélection métabolique, ce qui est une étape importante pour enrichir davantage une population d'iPSC-CM qui est déjà dérivée d'une différenciation très efficace. Ces données indiquent que les protocoles de différenciation cardiaque à haut rendement qui génèrent des MC de haute qualité sont nécessaires pour récapituler avec précision un phénotype cardiaque in vitro.

La figure 5 montre la variabilité de l'amplitude Ca2 dans différentes zones de la monocouche cMs, tracée sur un parcours temporel de 1 200 s. Les amplitudes Ca2 mesurées au début d'une fréquence de stimulation de 1 Hz (200 s) étaient très variables et sont devenues plus constantes au fur et à mesure que la stimulation se poursuivait (200-900 s). Cependant, après une période de temps de 900 s, l'amplitude Ca2 a été considérablement réduite. Ces données indiquent que, lors de l'enregistrement des transitoires Ca2 dans les iPSC-CM, il est nécessaire de laisser les cellules se stabiliser à 37 oC sous stimulation constante pendant au moins 200 s. En outre, les enregistrements doivent être limités à une fenêtre de temps spécifique (200 à 900 s) pour assurer des résultats reproductibles.

Figure 1
Figure 1 : Schéma général de préparation iPCS-CM et instruments transitoires Ca2MD. (A) Schématique du protocole de différenciation cardiaque montrant les étapes développementales des iPSC différenciants. Barre d'échelle de 50 m. (B) Le système d'acquisition et d'analyse du calcium et de la passialité. a) Pompe péristalitique b) Microscope inversé c) Source d'alimentation pour l'appareil photo numérique d) Stimulateur électrique e) Interface du système de fluorescence f) Contrôleur de roue de filtre (C) Chambre système. a) Corps de chambre de système. b) Inlet liquide. c) Sortie de liquide. d) Chauffe-solution en ligne fluide. f) Électrodes reliant la chambre système au stimulateur électrique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Comparaison de l'expression MLC2A et MLC2V dans les iPSC-CM à différents jours de différenciation. (A) Coloration immunofluorescence des iPSC-CM au jour 30, 60, et 90 après induction de différenciation pour MLC2A et MLC2V. Barre d'échelle de 20 m. (B) Analyse de cytométrie de flux d'iPSC-CMs pour MLC2V et MLC2A à 1 mois et 3 mois après différenciation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Comparaison des propriétés iPSC-CM à différents jours de différenciation. (A) Représentant Ca2 traces transitoires à différents jours de différenciation. (B-C) L'amplitude moyenne de Ca2 et la carie ca2 ' ont été obtenues pendant la stimulation à 1 Hz. (D-F) Effet du traitement isoprotérénol (ISO, 10 nM) dans les iPSC-CM à différents jours de différenciation. Les ARCM indiquent des cardiomyocytes adultes isolés de rat. N ' 70 à 100 zones; lt; 0,05; p lt; 0,001, tel que déterminé par l'étudiant t-test. Les données sont représentées comme moyenne - S.E.M. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Comparaison entre les différenciations à haut rendement et à faible efficacité des iPSC-CM. (A) Coloration immunofluorescence de l'iPSC-MC pour l'AMS et le MLC2V. Barre d'échelle de 20 m. (B) Traces représentatives montrant des transitoires Ca2 degrés provenant de différenciations à haut rendement (ci-dessus) et à faible efficacité (milieu) et de cardiomyocytes adultes de rats isolés (ci-dessous). Les myocytes ont été stimulés à 0,5 Hz, 1 Hz, 1,5 Hz, 2 Hz, et 3 Hz. (C) Trace représentative montrant un modèle arythmique d'une mauvaise différenciation. Les flèches indiquent le rythme de point. Les ARCM indiquent des cardiomyocytes adultes isolés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Amplitude Ca2MD dépendante du temps à partir d'un seul bordereau. Les amplitudes Ca2mD de différentes zones dans un bordereau ont été tracées d'une manière dépendante du temps. Les périodes de temps non recommandées pour mesurer le passage Ca2Sont sont indiquées dans les zones en pointillés (lt;200 s ou '900 s). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Video 1
Vidéo 1 : Vidéo représentative montrant un exemple de différenciation à haut rendement. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Video 2
Vidéo 2 : Vidéo représentative montrant un exemple de différenciation à faible efficacité. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Video 3
Vidéo 3 : Vidéo représentative montrant un exemple d'une distribution homogène de monocouches d'iPSC-CM s'est glissée sur une couverture en verre. Cette vidéo montre la densité cellulaire recommandée à utiliser pour l'analyse fonctionnelle. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Video 4
Vidéo 4 : Vidéo représentative montrant un exemple de cellules d'une différenciation à faible efficacité plaquée sur un bordereau en verre. Les cellules de la vidéo ont été obtenues à partir d'une différenciation à faible efficacité. Les cellules de ces différenciations ne sont généralement pas distribuées de façon homogène sur le bordereau et il est difficile de trouver systématiquement des cellules qui battent. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

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Discussion

Les étapes critiques pour l'utilisation des iPSC-CM humains comme modèles expérimentaux sont : 1) la génération de cardiomyocytes de haute qualité (CM) qui peuvent assurer les performances et les résultats reproductibles cohérents; 2) permettant aux cellules de mûrir en culture pendant au moins 90 jours pour évaluer adéquatement leur phénotype; 3) effectuer des études électrophysiologiques, par exemple des mesures transitoires du calcium (Ca2)pour fournir une caractérisation fonctionnelle physiologiquement pertinente des iPSC-CM humaines. Nous avons développé une méthode de différenciation à base de monocouches qui produit des iPSC-CM ventriculaires de haute qualité. Notre méthode repose sur plusieurs facteurs cruciaux et est une variante des protocoles existants14,18. Contrairement à d'autres protocoles, celui-ci utilise des conditions de faible teneur en oxygène (5% O2) pour l'entretien des iPSC ainsi que pendant la première semaine de leur différenciation en CMs. De faibles niveaux d'oxygène imitent l'état de l'environnement pendant le développement cardiaque embryonnaire et foetal19. Il a également été démontré que les conditions hypoxiques augmentent la prolifération des iPSC et leur différenciation subséquente par rapport aux CM20. La densité d'ensemencement et le passage approprié d'iPSCs sont également des facteurs critiques pour une différenciation cardiaque réussie. Une efficacité de différenciation élevée est observée lorsque 70 à 80 % des iPSC confluents sont dissociés en agrégats de petites cellules à l'aide d'une solution sans enzymes et ensemisés à un rapport de fractionnement de 1:6. La différenciation cardiaque peut être commencée lorsque les cellules atteignent une confluence de 70 à 80 %, prévue environ 4 jours après la division. Le traitement CHIR99021 (10 M) au début de la différenciation causera une mort cellulaire importante. Cependant, la prolifération cellulaire est observée lorsque CHIR99021 est retiré de la culture le lendemain. Un équilibre correct entre la mort cellulaire et la prolifération est essentiel pour préserver une culture monocouche tout au long de la différenciation, ce qui est un autre facteur important pour une différenciation réussie. Si la densité iPSC est trop faible ou trop élevée, la différenciation subséquente sera une différenciation cardiaque à faible efficacité (Figure 4A, Vidéo 2). La figure 4A montre un tel exemple de différenciation à faible efficacité, où les cardiomyocytes dérivés d'un donneur sain sont mélangés à d'autres types de cellules, tels que les cellules actines-positives musculaires lisses. Fait important, les transitoires Ca2 mD enregistrés à partir de ces préparations présentaient des caractéristiques altérées, telles que l'amplitude Ca2 et les motifs arythmiques faibles, qui pouvaient facilement être mal interprétés comme des variations biologiques. Une différenciation réussie et à haut rendement de la même lignée cellulaire a plutôt généré une population pure de cardiomyocytes ventriculaires(figure 4A, Vidéo 1) ainsi que des transitoires Ca 2MD réguliers(figure 4B, panneau supérieur). Ainsi, la qualité de la différenciation joue un rôle important dans l'ampleur globale, la forme, la régularité et la fréquence d'un transitoire Ca2.

Un autre aspect important d'une différenciation réussie et efficace est l'obtention d'une population enrichie de cardiomyocytes. Tandis que les cellules souches indifférenciées et d'autres types de cellules iPSC-dérivés emploient le glucose comme source d'énergie, les CM peuvent employer le lactate efficacement pour la production d'ATP et de glutamate21. Ainsi, afin d'obtenir une population encore plus pure de CMs, les cellules sont cultivées dans le milieu de culture lactate-supplémenté et glucose-appauvri. Culturing iPSC-CMs dans ce média de sélection pendant une longue période, cependant, peut conduire à une déficience fonctionnelle. Par conséquent, pour purifier iPSC-CM et encore préserver leur fonction, la sélection métabolique est effectuée seulement pendant 10 jours, à partir de jours 80-90 depuis l'induction de différenciation. Après cette période, le support de sélection est remplacé, et les cellules sont maintenues dans les médias RPMI/B27. Bien que le protocole de sélection puisse être mis en œuvre beaucoup plus tôt22 (p. ex., vers le 15e jour), il est conseillé d'attendre jusqu'au jour 80, car cela peut empêcher les iPSC résiduels ou d'autres types de cellules de proliférer au moment où les cellules sont prêtes pour des études fonctionnelles (jour 90). Il est donc essentiel que, pour une différenciation cardiaque réussie, efficace et robuste, tous les facteurs mentionnés ci-dessus soient pris en considération.

En plus de la robustesse et de l'efficacité des protocoles de différenciation cardiaque, la maturation et la spécification de type cellulaire (p. ex., les types de cellules auriculaires et ventriculaires) posent également un défi majeur pour l'utilisation des iPSC-CM pour modéliser les maladies cardiaques. Au cours des dernières années, de nombreuses stratégies de maturation prometteuses ont été signalées, y compris la stimulation électrique, l'étirement mécanique et la rigidité du substrat23. Cependant, la culture in vitro prolongée des iPSC-CM continue d'être une approche simple et pratique pour générer des cardiomyocytes adultes24,25.

Conformément à d'autres rapports publiés12, iPSC-CMs générés par ce protocole de différenciation in vitro montrent une expression robuste de MLC2V spécifique au ventricule et des niveaux beaucoup plus faibles de MLC2A au jour 90 (figure 2A,B). Tandis que les MC foetaux contiennent des isoformes MLC2A et MLC2V, les MC ventriculaires adultes ne contiennent que mLC2V. Ce commutateur dans la prédominance isoforme de MLC se produit pendant le stade néonatal26.

Les cardiomyocytes générés par ce protocole expriment des marqueurs spécifiques ventriculaires, tels que le MLC2V, qui augmente progressivement en abondance à mesure que les cellules sont maintenues en culture plus longtemps(figure 2A,B). Ceci indique qu'une culture in vitro prolongée améliore la maturation des CM qui semblent être commis au phénotype ventriculaire.

Le temps dans la culture affecte également considérablement Ca2 'manipulation maturation24,25. Les rapports précédents ont décrit qu'après 20 jours de l'induction de différenciation, il n'y avait aucun changement majeur dans les transitoires calc Ca2pendant que les cellules se sont développées plus âgées25. Cependant, les cardiomyocytes générés par le protocole détaillé ici montrent des changements progressifs dans l'amplitude Ca2 et la désintégration ca2 au cours des trois points de temps évalués (30, 60 et 90 jours après l'induction de la différenciation cardiaque) (Figure 3A-C). Fait intéressant, ces données montrent que les paramètres transitoires Ca2, tels que l'amplitude Ca2 et la désintégration Ca2, mesurés au jour 90 iPSC-CM étaient semblables à ceux mesurés chez les cardiomyocytes adultes de rat isolés (ARCM). De plus, les iPSC-CM vieux de 90 jours ont également pu suivre diverses stimulations électriques allant de 0,5 Hz à 3 Hz de façon constante, semblables aux ARCM(figure 4B). Dans les travaux futurs, il serait intéressant de voir comment un temps encore plus long dans la culture affecte les caractéristiques fonctionnelles de ces iPSC-CM par rapport aux ARCM.

De plus, puisque la signalisation des récepteurs adrénergiques de l'adrénergique montre un modèle de maturation distinct dépendant du temps après induction cardiaque27, l'effet de l'isoprotérénol sur le transitoire Ca2md dans les iPSC-CM générés par ce protocole a été testé. La stimulation à l'isoproténol a donné lieu à une réponse lusitropique positive au jour 90 iPSC-CM, semblable à ce qui est observé dans les ARCM(figure 3D-F).

Les évaluations fonctionnelles des cM iPSC effectuées dans le cadre de cette étude présentent certaines différences et certaines limites par rapport aux CM adultes isolés. Les CM adultes ont des sarcoques bien développés et bien disposés. Cela permet des mesures de la contractilité grâce à la détection du mouvement des sarcomes. Étant donné qu'aucun des protocoles actuels ne génère des iPSC-CM entièrement matures et adultes, les mesures de la contractilité par la détection des sarcoques ne sont pas réalisables. Bien qu'il soit possible de détecter le mouvement des bords cellulaires lorsque la cellule se contracte, il est beaucoup plus difficile de suivre ces mouvements d'une manière précise dans les iPSC-CM. À partir de maintenant, des progrès technologiques sont nécessaires pour permettre des évaluations précises de la contractilité dans ces cellules. D'autre part, il est possible de mesurer les transitoires Ca2 md des iPSC-CM à l'aide d'un indicateur Ca2 comme Fura-2. Contrairement aux CM adultes, cependant, les iPSC-CM sont regroupés et n'ont pas de frontière bien définie. Par conséquent, les transitoires Ca2 enregistrés ne représentent généralement pas une seule cellule, mais plutôt un groupe de cellules dans une zone spécifique. Bien qu'il soit possible d'ajuster la taille de la zone, l'enregistrement des passagers Ca2 à partir d'une seule cellule est incroyablement difficile. Il est essentiel que lorsque les MC sont plaqués sur les couvertures, la densité est telle qu'ils atteignent une distribution homogène monocouche (Vidéo 3), qui permet de trouver constamment des zones avec des cellules. Si les cellules ne sont pas distribuées comme une monocouche sur la couverture (Vidéo 4), il y aura des zones sans cellules, et si le coverslip est examiné spécifiquement pour les zones avec des cellules de battement pour effectuer les mesures, cela peut conduire à un «biais de sélection». Au lieu de sélectionner une zone spécifique de cellules de battement, il est recommandé de recueillir des données à partir de plusieurs zones à travers le coverslip, ce qui n'est possible que lorsque les cellules sont distribuées comme une monocouche homogène. Les mesures de 100 de ces différentes zones, qui prennent environ 10 min, sont suffisantes pour fournir des propriétés fonctionnelles fiables des cellules. Enfin, comme le montre la figure 5,les iPSC-CM ont besoin de temps pour s'adapter aux conditions de mesure. Pour des mesures fiables, il est recommandé que les cellules soient stabilisées aux conditions de mesure pendant au moins 3 min.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Cette recherche a été appuyée par la subvention de développement scientifique 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2 Scholars Award for Clinical and Translational Research Career Development KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 et AHA 18TPA34170460 (C.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal Sigma Aldrich A5228
Alexa Fluor 488 goat anti mouse Invitrogen A11001
Alexa Fluor 555 goat anti rabbit Invitrogen A21428
B27 Supplement Gibco 17504-044
B27(-) insulin Supplement Gibco A18956-01
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DAPI nuclear stain ThermoFisher D1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes Gibco 11330-032
Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook Celltreat 229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well Corning 353046
Fluidic inline heater Live Cell Instrument IL-H-10
Fura-2, AM Invitrogen F1221
hESC-qualified matrix Corning 354277 Matrigel Matrix
hPSC media Gibco A33493-01 StemFlex Basal Medium
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument EC-B25
MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody Synaptic Systems 311011
Myocyte calcium and contractility system Ionoptix ISW-400
Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) Proteintech 10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane ThermoFisher 124-0045
PBS with Calcium and Magnesium Corning 21-030-CV
PBS without Calcium and Magensium Corning 21-031-CV
Premium Glass Cover Slips Lab Scientific 7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) Gibco 11879-020
RPMI medium 1640 (1X) Gibco 11875-093
Sodium L-lactate Sigma Aldrich L7022
StemFlex Supplement Gibco A33492-01
Thiazovivin Tocris 3845
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher 25200056
Tyrode's solution Boston Bioproducts BSS-355w Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride

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Génération de cardiomyocytes dérivés de HiPSC ventriculaires et de préparations cellulaires de haute qualité pour la caractérisation de la manipulation du calcium
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