Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ventriküler Benzeri HiPSC Türevi Kardiyomiyositlerin Ve Kalsiyum Kullanımı Karakterizasyonu için Yüksek Kaliteli Hücre Preparatlarının Üretimi

Published: January 17, 2020 doi: 10.3791/60135
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Burada sürekli olarak sağlam insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler üretmek ve işlevlerini karakterize etmek için bir yöntem tanımlamak ve doğrulamak. Bu teknikler sinyal yolları içine mekanistik anlayış geliştirilmesinde yardımcı olabilir, büyük ölçekli ilaç tarama için bir platform sağlamak, ve güvenilir model kalp hastalıkları.

Abstract

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (iPSC-CMs) kalsiyum temel bilim (Ca2 +) işleme ve sinyal yollarının yanı sıra yüksek iş gücü ilaç tarama ve toksisite tahlilleri eğitimi için değerli bir insan kaynağı sağlar. Burada, farklı hücre hatlarında moleküler ve işlevsel özellikleri sürekli olarak üretebilen yüksek kaliteli iPSC-CM'ler üretmek için kullanılan metodolojilerin ayrıntılı bir açıklamasını salıyoruz. Ayrıca, Ca2+ işleme özelliklerinin değerlendirilmesi yoluyla işlevsel karakterizasyonlarını güvenilir bir şekilde değerlendirmek için bir yöntem tanımlanır. Düşük oksijen (O2)koşulları, laktat seçimi ve kültürde uzun süreli yüksek saflıkta ve yüksek kaliteli ventriküler benzeri kardiyomiyositler üretir. İzole yetişkin sıçan kardiyomiyositlerine (ARCM) benzer şekilde, 3 aylık iPSC-CM'ler daha yüksek Ca2+ genlik, daha hızlı Ca2+ geri alım oranı (bozunma-tau) ve 30 gün iPSC-CM'lere göre β-adrenerjik stimülasyona pozitif lusitropik yanıt sergiler. Strateji teknik olarak basit, uygun maliyetli ve tekrarlanabilir. Bu kardiyak hastalığı modellemek için sağlam bir platform sağlar ve büyük ölçekli ilaç tarama hedef Ca2 + işleme proteinleri.

Introduction

İnsan indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (iPSC-CMs) in vitro1,2,3,4,5,6,7,8kalp hastalıklarının büyük bir çeşitlilik modellemek için çekici bir insan tabanlı platformvardır. Ayrıca, iPSC-CMs yeni veya mevcut ilaçlara hasta yanıtlarının tahmin için kullanılabilir, vurmak bileşikleri ekrana, ve yeni kişiselleştirilmiş ilaçlar geliştirmek9,10. Ancak, önemli ilerleme rağmen, çeşitli sınırlamalar ve zorluklar iPSC-CMs11kullanırken dikkate alınması gerekir. Sonuç olarak, yöntemleri kardiyak farklılaşma protokolleri geliştirmek için, iPSC-CMs verimliliği ve olgunlaşma geliştirmek için, ve spesifik kardiyomiyosit alt türleri oluşturmak için (ventriküler, atriyal, ve nodal) yoğun olarak incelenmiş ve zaten bu engelleri aşmak için çok sayıda kültür stratejileri yol açtı12,13,14,15.

Bu protokollerin sağlamlığına rağmen, iPSC-CM'lerin kullanımı için önemli bir endişe, aynı performansı ve tekrarlanabilir sonuçları sağlayabilen yüksek kaliteli kardiyomiyositler elde etmek için uzun ve karmaşık prosedürlerin tekrarlanabilirliğidir. Tekrarlanabilirlik sadece farklı genetik arka planlar ile hücre hatları karşılaştırırken değil, aynı zamanda aynı hücre hattının hücresel ve moleküler karşılaştırmalar tekrarlanırken önemlidir. Hücre değişkenliği, örneğin iPSCs yoğunluğundaki iyi-iyi farklılıklar, kardiyak farklılaşmayı etkileyerek düşük verim ve düşük kaliteli kardiyomiyositler üretebilir. Bu hücreler hala saf cm popülasyonu gerektirmeyen deneyler yapmak için kullanılabilir (örneğin, Ca2+ geçici ölçümler icra ederken). Gerçekten de, elektrofizyolojik analiz yaparken, olmayan CM'ler ne kendiliğinden ne de elektriksel stimülasyon altında yenmez, bu nedenle onları analizden dışlamak kolay olacaktır. Ancak, kalitesiz olması nedeniyle, iPSC-CM'ler genetik yapısına bağlı olmayan değiştirilmiş elektrofizyolojik özellikleri (örneğin, düzensiz Ca2+ geçici, düşük Ca2+ genliği) gösterebilirler. Bu nedenle, özellikle kalp hastalığı modellemek için iPSC-CMs kullanırken, hastalık fenotip ile düşük kaliteli CM sonuçları karıştırmak için önemlidir. Elektrofizyolojik çalışmalara devam edilmeden önce dikkatli tarama ve dışlama işlemleri gereklidir.

Bu yöntem, yüksek saflıkta ve yüksek kaliteli kardiyomiyositler üretmek ve kalsiyum ve kontraktillik edinimi ve analiz sistemi kullanarak Ca2+ geçici ölçümler yaparak işlevlerini değerlendirmek için optimize edilmiş protokolleri içerir. Bu teknik, yüksek verimlilik ve düşük verimli iPSC-CM preparatları ayırt etmek ve insan iPSC-CM'lerin fizyolojik olarak daha alakalı bir karakterizasyonu sağlamak için basit, ama güçlü bir yoldur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada erişkin sıçan kardiyomiyositleri kullanılarak yapılan deneyler, Mount Sinai'deki Icahn Tıp Fakültesi'nin onaylı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) protokolleri ile gerçekleştirilmiştir. Erişkin sıçan kardiyomiyositler daha önce açıklandığı gibi Langendorff tabanlı yöntem ile Sprague Dawley sıçan kalplerinden izole edildi16.

1. Medyanın Hazırlanması

  1. HiPSC ortamını hazırlayın.
    1. Ek ve bazal orta oda sıcaklığına (RT) dengeleyin. Ek tamamen çözülmüş olduğundan emin olun. 0,22 μm vakumlu filtre kullanarak 400 mL bazal orta ve 100 mL ek ve filtreyi karıştırın. 4 °C'de saklayın ve kullanmadan önce RT'ye dengeleyin.
  2. RPMI + B27 hazırlayın.
    1. B27 takviyesi ve bazal orta (RPMI 1640) RT için dengeleyin. Bazal ortamın 490 mL'sini ve 50x takviyesinin 10 mL'ini karıştırın ve 0,22 μm vakumlu filtre kullanarak filtre uygulayın. 4 °C'de saklayın ve kullanmadan önce RT'ye dengeleyin.
  3. RPMI + B27 (-) insülin hazırlayın.
    1. B27 (-) insülin takviyesi ve bazal orta (RPMI 1640) RT. Ek tamamen çözülmüş olduğundan emin olun. Bazal ortamın 490 mL'sini ve 50x takviyesinin 10 mL'ini karıştırın ve 0,22 μm vakumlu filtre kullanarak filtre uygulayın. 4 °C'de saklayın ve kullanmadan önce RT'ye dengeleyin.
  4. Seçim ortamı (RPMI (-) glikoz + B27 + laktat) hazırlayın.
    1. B27 takviyesi ve bazal orta (RPMI 1640 (-) glikoz) RT için dengeleyin. Bazal ortamın 490 mL'sini ve 50x takviyesinin 10 mL'ini karıştırın, steril suda oluşan 4 mM sodyum laktat ekleyin ve 0,22 μm vakumlu filtre kullanarak filtre uygulayın. 4 °C'de saklayın ve kullanmadan önce RT'ye dengeleyin.
  5. RPMI 20'yi hazırlayın.
    1. Bazal orta (RPMI 1640) rt. Mix fetal sığır serumu (FBS) (%20 nihai konsantrasyon) ve RPMI dengeleyin. 0,22 μm vakumlu filtre kullanarak filtre uygulayın ve 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce RT'ye dengeleyin.
  6. HiPSC ortama protein kigaz (ROCK) inhibitörü (2 μM son konsantrasyon) içeren Rho ilişkili, sarmal bobin ekleyerek passaging ortamı hazırlayın.
  7. RPMI + B27 (-) insülin ortama (10 μM son) GSK-3 inhibitörü, CHIR 99021 ekleyerek D0 ortam hazırlayın.
  8. RPMI + B27 (-) insülin ortamını IWR-1 (5 μM final) ile karıştırarak D3 ve D4 ortamını hazırlayın.
    NOT: D1 ve D5 ortamları RPMI + B27 (-) insülinden oluşmuştur. D7 medya RPMI + B27 oluşturmaktadır.
  9. Engelleme tamponu (%2 büyükbaş serum albumin [BSA], %2 FBS, %0,05 NP-40 fosfat tamponlu salin [PBS]): 50 mL konik tüpte 1 g BSA, 1 mL FBS, 49 mL PBS ve 250 μL NP-40 ekleyin. Tamamen eriyene kadar karıştırın.

2. İnsan Embriyonik Kök Hücre (hESC) nitelikli Matris Kaplı Plaka ve Kapaklarıhazırlanması

NOT: Sterilize doku kültürü başlığı altında tüm adımları gerçekleştirin.

  1. 4 °C'de buz üzerinde bir gecede hESC nitelikli matris stok çözeltisi çözülme. Stoka bağlı olarak değişebileceğinden, uygun aliquot hacimlerini belirlemek için ürün belirtimi sayfasına bakın. Bu aliquotları -20 °C'de 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde saklayın.
  2. Matrisi kaplama plakaları veya cam kapaklar için kullanmak için, önce hESC nitelikli matrisin bir aliquot'u 4 °C'de 30 dk.'da eritin.
  3. Aliquot 24 mL soğuk Dulbecco modifiye Kartal orta (DMEM): besin karışımı F-12 (DMEM/ F:12) medya 50 mL konik tüp içine.
  4. Pipetyüzeyini soğutmak için soğuk DMEM/F:12 ortamını 2 mL cam pipetle karıştırın.
  5. Aynı pipeti kullanarak, yaklaşık 500−700 μL soğuk DMEM/F:12 alın ve mikrosantrifüj tüpünün içindeki hESC nitelikli matris aliquot ile karıştırın.
  6. Düzgün bir şekilde karıştırıldıktan sonra çözeltiyi soğuk DMEM/F:12 içeren 50 mL konik tüpe aktarın ve tekrar karıştırın.
  7. Standart bir 6 iyi plaka için, her kuyuya bu karışımın 1 mL ekleyin. Kuyunun tamamen kapalı olduğundan emin olun. En az 30 dakika için doku kültürü başlık altında RT plakaları bırakın. İstenirse, kaplamadan hemen sonra 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın ve kullanımdan önce 30 dakika boyunca RT'ye dengeleyin.
  8. Plakaları kullanmak için, matris aspire ve uygun ortam ile değiştirin. Hemen kullanın.
  9. Cam kapakları steril bir ortamda saklayın (örn. steril bir doku kültürü başlığı içinde).
  10. Kaplamadan önce, her bir coverslip'i %70 etanol ile silin. Coverslip kuruduktan sonra, steril 6 kuyu plakasının içine yerleştirin.
  11. HESC nitelikli matris çözeltisinin 250−300 μL'sini alın ve dikkatlice doğrudan cam kapak lının ortasına dağıtın. Kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca doku kültürü başlık altında RT kapakları bırakın.

3. Küçük Moleküllerin Hazırlanması

NOT: Aksi belirtilmedikçe DMSO'daki tüm küçük molekülleri ve Wnt modülatörlerini yeniden oluşturun.

  1. IWR-1 ve CHIR 99021'in her biri 25°L'lik 10 mM aliquot hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
  2. 10 mM aliquots 50 μL her Thiazovivin (ROCK inhibitörü) ve -20 °C'de saklayın.

4. IPSC'lerin Bakımı ve Geçişi

NOT: Steril doku kültürü başlığı altında aşağıdaki adımların tümlerini gerçekleştirin.

  1. IPSC'leri standart 6 kuyu plakalarında saklayın ve steril koşullarda tüm adımları gerçekleştirin. Her kuyuda 2 mL hiPSC ortam ile hücreleri koruyun. Medyayı her gün değiştirin. Hücreleri 37 °C, %6 O2,%5 CO2'detutun. Hücreleri %70−80 arasında olduklarında iletin.
  2. PBS'yi Ca2+ ve Mg2+ olmadan RT'ye dengeleyin.
  3. Geçiş işlemini başlatmak için, geçiş yapılması gereken kuyuya Ca2+ ve Mg2+ olmadan 1 mL PBS ekleyin. 7−10 dk. Rt'de kuluçka, PBS tedavisinin monokatmanın tamamen ayrıştırılmasıyla sonuçlanmadığından emin olmak için mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin.
  4. PBS'yi çıkarın ve 1 mL'lik geçiş li ortamla değiştirin. Yavaşça kazımak ve kuyunun yüzeyinden hücreleri kaldırmak için bir hücre kaldırıcı kullanın.
  5. Steril 2 mL cam pipet kullanarak hücreleri mekanik olarak ayırın. Hücreler mikroskop altında gözlendiğinde küçük kolonilere eşit olarak ayrıştırılanıncaya kadar tekrarlayın.
  6. Hücreler yeterince ayrıştırıldıktan sonra, hücreleri 1:6 bölmek için 5 mL passaging ortam ekleyin. Tercih edilen bölme oranıyla eşleşecek şekilde eklenecek geçiş ortamı miktarını ayarlayın.
  7. HESC nitelikli matrisi hESC nitelikli matris kaplamalı plakadan aspire edin ve kuyu başına 1 mL passaging ortam ile değiştirin. Kuyu başına 1 mL ayrıştırılmış hücre ekleyin.

5. Kardiyomiyosit Farklılaşması

  1. İyi kurulmuş (20'den fazla pasaj) hiPSC çizgileri kullanın ve kardiyak farklılaşmaya başlamadan önce homojen bir morfoloji sergiler.
  2. IPSC'lerin %70−80 civarında bir aksak olduğundan emin olun.
  3. Hücreleri 1x'i Ca2+ ve Mg2+olmadan PBS'de yıkayın.
  4. Kuyu başına 2 mL D0 ortam (adım 1.7) ekleyin ve hücreleri kuvöze geri aktarın.
  5. 24 saat sonra, 48 saat boyunca her kuyu başına 3 mL D1 ortam ile değiştirin.
  6. 3. günde, ortam yerine her kuyu başına 2 mL D3 ortam değiştirin. 4. günde D4 medya ile tekrarlayın.
  7. 5. günde, her kuyuda 3 mL D5 ortam ile ortam değiştirin.
  8. 7. günde, ortam yerine kuyu başına 3 mL D7 ortam değiştirin ve 37 °C, %5 CO2ve normal O2 konsantrasyonu ile bir kuvöze aktarın. Her 2 günde bir D7 (RPMI + B27) ortamını değiştirin.

6. Seçim Prosedürü ve iPSC-CM Dissociation

  1. Ca2+ geçici ölçümlerini veya herhangi bir fonksiyonel analizi gerçekleştirmeden on gün önce, RPMI + B27 ortamını 48 saat boyunca her kuyu başına 3 mL seçim ortamıyla değiştirin.
  2. 48 saat boyunca ortamı 3 mL seçim ortamıyla değiştirin.
  3. 24 saat boyunca her kuyuda 2 mL RPMI + B27 ortam ile ortam değiştirin.
  4. Bölüm 2'de açıklandığı gibi kat standart 6 kuyu plakaları.
  5. Her kuyuya EDTA ile %0,25 tripsin içeren 1 mL steril ekleyin. Plakayı 37 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın.
  6. 1.000 μL'lik pipet kullanarak, mikroskop altında gözlemlendiğinde tek hücrelerin görülebilmeleri için hücreleri mekanik olarak ayrıştırın.
  7. Hücreleri steril 15 mL konik bir tüpe aktarın ve kuyu başına 2 mL RPMI 20 ortam ekleyin. 800 x g5 dakika santrifüj .
  8. Supernatant aspire ve RPMI + B27 medya hücreleri resuspend. Plakalardan hESC nitelikli matris aspire ve RPMI + B27 medya 1 mL ile değiştirin.
  9. 1.000 mL'lik pipet ucu kullanarak, çözelti homojen görünene kadar hücre peletini mekanik olarak ayrıştırın.
  10. Her kuyuya yaklaşık 500.000 hücre aktarın. 24 saat boyunca kuvöze transfer.
  11. 48 saat boyunca her kuyu başına 3 mL seçim ortamı ile ortamı değiştirin.
  12. Ortamı kuyu başına 3 mL RPMI + B27 ile değiştirin. D7 ortam (RPMI + B2 değişen medya her 2 gün fonksiyonel analiz için hazır olana kadar hücreleri koruyun.

7. Akış Sitometrisi için iPSC-CM'lerin hazırlanması

  1. Hücreler istenilen yaşa geldikten ve metabolik seçimden geçtikten sonra (bölüm 6), Ca2+ ve Mg2+olmadan pbs ile hücreleri yıkayın.
  2. Tripsin kuyusu başına 1 mL %0,25 ve 37 °C'de 5−7 dk inkübte ekleyin.
  3. Pipet karışımı 5−10x p1000 ucu ile hücreleri tekilleştirmek ve RPMI 20 2 mL içeren 15 mL tüp aktarın.
  4. Hücreleri 600 x g'de 5 dk çevirin.
  5. Hücre peletine 100 μL fiksasyon çözeltisi (%4 PFA) ekleyin. Sürekli, nazik girdap ile damla doğru çözelti ekleyin ve sonra 15 dakika buz üzerinde ayarlayın.
  6. 1,5 mL PBS ekleyin. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve supernatant aspire.
  7. Her deneme için, fiksasyon/permeabilizasyon durumu başına bir lekesiz kontrol ekleyin.
  8. RT'de 30 dakika boyunca 500 μL blokaj çözeltisindeki hücreleri (PBS'de %0,1 NP-40 ile %2 FBS/%BSA) yeniden askıya alın.
  9. Bloke çözeltisini çıkarmadan, birincil antikor MLC2V/MLC2A (5 mg/mL) ekleyin ve RT'de 45 dk kuluçkaya yatırın.
  10. Engelleme arabelleği ile yıkayın. Santrifüj ve aspire çözeltisi ile hücreleri toplayın.
  11. İkincil antikor Alexa Fluor 555/488 (1:750) rt veya gece 4 °C 45 dakika için engelleme tampon seyreltilmiş ekleyin.
  12. 1,5 mL PBS ekleyin. Santrifüj ve aspire çözeltisi ile hücreleri toplayın.
  13. PBS'nin 250−300 μL'lik hücrelerini yeniden askıya alın. Hücreleri dağıtmak için p1000 pipet kullanın.
  14. 35 μm naylon kafes hücresüz kapağı ile yuvarlak alt tüpler hazırlayın. Hücre süzgecini 50 μL PBS ile önceden ıslayın ve tüpü buza yerleştirin.
  15. Hücre süzgeci kapakları ile yuvarlak alt tüpleriçin ayrıştırılmış hücreleri ile çözüm aktarın. Hücre çözeltisinin doğal olarak boşalmasına veya tüpün dibine düz bir yüzeye değmesine izin verin, gerektiğinde hücrelerin tam drenajını ve tüpiçine toplanmasını sağlayın. Tüpü mümkün olan en kısa sürede buza geri koyduğundan emin olun.
  16. Kalan hücreleri kurtarmak için hücre süzgecini 250 μL PBS ile durulayın.
  17. Akış sitometri analizi kadar buz ve alüminyum folyo ile kapak tüpleri koruyun.

8. Cam Kapakları üzerine Kaplama Kardiyomiyositler

NOT: Steril bir ortamda tüm adımları gerçekleştirin.

  1. 2.10 ve 2.11 adımlarında açıklandığı gibi cam kapakları hazırlayın.
  2. iPSC-CM'ler seçildikten ve istenilen yaşta olduktan sonra, iPSC-CM'leri ayrıştırmak için 6.5−6.7 adımlarını izleyin.
  3. Supernatant aspire ve RPMI 20 medya yeterli miktarda hücreleri yeniden askıya 250 μL başına yaklaşık 300.000 hücre ye sahip.
  4. 2 mL cam pipet kullanarak, çözelti homojen görünene kadar hücre peletini mekanik olarak ayrıştırın.
  5. Kapaklardan hESC nitelikli matrisi aspire edin.
  6. 1000 μL'lik pipet kullanarak çözeltinin 250 μL'sini 15 mL konik tüpten karıştırın ve çekin.
  7. Çözeltinin 250 μL'sini cam kapaklara yavaşça dağıtın ve sadece hESC'ye uygun matris kaplamanın bulunduğu alana ilave özen tinleyin.
  8. Kuvöze dikkatlice aktarın ve kapaklarda hücreleri sallamamaya veya yaymamaya özen tayarak geceboyunca ayrılın. Ertesi sabah, coverslip ile her kuyuya 2 mL D7 (RPMI + B27) ortam ekleyin. 24 saat sonra ve bundan sonra her 2 gün medya değiştirin.

9. Hücreleri Sabitleme

  1. Ca2+ ve Mg2+ ile yeterli miktarda PBS'nin 4 °C'ye eşit olduğundan emin olun.
  2. PBS'de Ca2+ ve Mg2+ ile seyreltilmiş %4'lük paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın ve 4 °C'ye dengeleyin.
  3. IPSC-CM'ler uygun yaşa geldikten, metabolik seçimden (bölüm 6) geçtikten ve kapak lara (bölüm 8) büründükten sonra, hücreleri 1 mL soğuk PBS ile 1 mL'lik Ca2+ ve Mg2+ kuyu başına yıkayın.
  4. 1 mL soğuk % 4 PFA ekleyin ve 15 dakika için kaputun altında RT hücreleri bırakın.
  5. Aşırı PFA'yı ortadan kaldırmak için hücreleri soğuk PBS ile yıkayın.
  6. Ca2+ ve Mg2+ ile 2 mL PBS ekleyin ve 4 °C'de saklayın.

10. İmmünofluoresan Boyama

  1. PBS'yi sabit hücrelerden çıkarın ve 1 mL engelleme arabelleği ekleyin. RT'de 1 saat kuluçka.
  2. Engelleme tamponu çıkarın ve birincil antikor ekleyin (5 mg /mL) engelleme tampon seyreltilmiş. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  3. Her biri 5 dakika boyunca Ca2+ ve Mg2+ ile PBS'de 3 x yıkayın.
  4. Tampon 1:1.000 engelleme seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin.
  5. Plakayı ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplayın ve RT'de 45 dakika boyunca inkübün.
  6. Her biri Ca2+ ve Mg2+ile PBS'de 3x yıkayın.
  7. Hücreleri tamamen kapsayabilmek ve 10 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatmak için yeterli miktarda DAPI çalışma çözeltisi ekleyin.
  8. Fazla DAPI'yi gidermek için ca2+ ve Mg2+ ile numuneyi PBS ile iyice yıkayın.
  9. Yeni cam slaytlar alın ve ortasına bir damla montaj ortamı ekleyin. Montaj ortamını eşit olarak yaymak için damlalık kullanın. Kapakları, hücreler slaytlara yüzüstü koyun.
    NOT: Hücreler ışıktan korunursa 30 gün boyunca saklanabilir.

11. Hücre İçi Ca2+ Geçicilerinin Değerlendirilmesi

  1. IPSC-CM'ler en az 3 aylıkken, metabolik seçilimden (bölüm 6) geçtikten sonra, kapak kapaklarına kaplandıktan sonra, 2 μL Fura-2, (son konsantrasyon: 1 μM) ve 10 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Fura-2 ışığa duyarlıdır. Karanlıkta tüm yükleme yordamları ve deneyleri gerçekleştirin.
  2. Kalsiyum ve kontraktilite alım ve analiz sistemini hazırlayın.
    1. Yay lambasının başlatılmasını sağlayan sistemi güçlendirin (Şekil 1B).
    2. Odayı sisteme yerleştirin ve pompadaki tüpleri şekil 1C'degösterildiği gibi uyarıcıdan odaya uygun giriş ve çıkışlara ve elektrik kablosuna bağlayın.
    3. Akışkan sıralı ısıtıcıdan geçen perfüzyon tüpünü 37 °C önceden ısıtılmış Tyrode çözeltisi ile doldurun.
    4. Arka plan alanını en aza indirmek için kamerayı ve çerçeve diyafram boyutlarını ayarlayın.
  3. IPSC-CMs ile cam bir kapak yıkın ve odaya bağlayın.
  4. Tyrode'un çözeltisinin 500 μL'ini doğrudan sabitlenmiş cam kapağının üzerine hafifçe ekleyin ve hazneyi (1,5 mL/dk) Tyrode'un çözeltisiyle perfüzyona başlayın.
  5. Hız iPSC-CMs ile 1 Hz alan stimülasyonu elektrik stimülatörü kullanarak (10 V, 4 ms).
  6. Hücreler için en az 3−5 dk uyarım ile odasında iPSC-CMs inkübatma Fura-2 boya yıkamak ve çevreye uyum ve floresan boya yıkamak için.
  7. Görüntüleme penceresini cam kapak kaymasının sol üst alanına ayarlayın.
  8. Kaydetmeye başla.
  9. Tutarlı bir 5−10 tepe akışı topladıktan sonra, kaydı geçici olarak durdurmak için Duraklat'ı tıklatın.
  10. Görüntüleme penceresinin ne odağının ne de boyutlarının değiştirilmemesini sağlayarak, mikroskobun sahne aşamasını bitişik alana taşıyın, karşı uca doğru hareket edin ve kayda devam edin.
  11. Coverslip boyunca tatmak için 11.9 ve 11.10 adımlarını tekrarlayın, başlangıçta sola doğru hareket, sonra tüm coverslip alanı kapsayacak şekilde bir zig-zag moda aşağı doğru. Bu, kapak başına 80−100 ölçümden oluşur.
    NOT: İkincil faktörler Ca2+ geçici sinde azalmaya neden olduğu için toplam ölçüm süresini 10 dakikaya kadar azaltın.
  12. Ca2+ geçicileri elde ediledikten sonra, verileri üreticinin talimatlarına göre floresan izleme analiz yazılımı ile analiz edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1 A'da açıklanan protokol, kültürde zamanla ventrikül/yetişkin benzeri fenotip elde eden son derece saf kardiyomiyositler üretmiştir. Atriyal ve ventriküler miyozin düzenleyici ışık zinciri 2 izoform (MLC2A ve MLC2V, sırasıyla) için immünoforesans boyama ile değerlendirildiği gibi, bu protokol tarafından oluşturulan hücrelerin çoğunluğu MLC2A-pozitif gün 30 kardiyak farklılaşma indüksiyonsonra, MLC2V aynı anda çok daha düşük miktarlarda ifade edildi(Şekil 2A, üst paneller). Kültürde zaman arttıkça (gün 60 ve 90), MLC2 izoformlarının (MLC2A'dan MLC2V'ye) tam bir geçişi gözlenmiştir(Şekil 2A,alt paneller). MLC2A ve MLC2V-pozitif hücreleri ölçmek için akış sitometrisi analizi yapıldı. İmmünofloresan sonuçlarına uygun olarak, akış sitometri verileri erken evre (gün 30) iPSC-CM'lerin çoğunlukla MLC2A'yı (%29.8 MLC2A + vs. %1,9 MLC2V +) (bkz. Şekil 2B, sol panel), geç evre (gün 90) iPSC-CMs ile karşılaştırıldığında, çoğunlukla MLC2V (%41,3 MLC2V + vs. %16,7 MLC2A +) ifade edilir (Bkz. Şekil 2B, sağ panel). MLC2A ve MLC2V'nin ekspresyon deseni kardiyak farklılaşma ve olgunlaşmanın bir özelliği olarak bilindiğinden, bu sonuçlar uzun sürenin iPSC-CM'lerin olgunlaşmasını artırdığını ve hücrelerin çoğunluğunun ventriküler fenotipte bağlı olduğunu göstermektedir. Daha sonra Ca2+ işleme olgunluğu zaman bağımlılığını değerlendirdik. Ca2+ geçici iPSC-CM'lerde üç farklılaşma zamanında (gün 30, 60 ve 90) ölçüldü ve izole yetişkin sıçan kardiyomiyositleri (ARCMs) ile karşılaştırıldı. 90. günde iPSC-CM'lerde Ca2+ genliği önemli ölçüde artmış ve ARCM'lara benzerdi(Şekil 3A,B). 90. günde Ca2+ geri alım oranı (decay-tau) 30. Β-adrenerjik stimülasyonun Ca2+ geçicileri üzerindeki etkisi, 10 nM isoproterenol (ISO) ile 37 °C'de 10 dakika süreyle hücreler eve değerlendirilerek daha da değerlendirildi. ARCM'larda görüldüğü gibi, ISO Ca2+ geçici sayısını önemli ölçüde artırdı ve 90 iPSC-CM'de Ca2+ geri alım oranını hızlandırdı. 30. gün iPSC-CM'lerde değişiklik gözlenmedi (Şekil 3D-F). İlginçtir ki, 90. Bu sonuçlar birlikte ele alındığında, bu yöntemden elde edilen iPSC-CM'lerin yerel CM'lerde, özellikle ventriküler benzeri fenotiplerde, olgun Ca2+ işleme özelliklerinde ve pozitif β-adrenerjik yanıtlarda görülenlere benzer özelliklere sahip olduğunu göstermektedir.

Kardiyak olmayan hücrelerin kontamine edilmesi, diferansiyasyon sırasında insan iPSC-CM'lerinin fonksiyonel olgunlaşmasını etkileyebilir17. Şekil 4A, yüksek verimli farklılaşmalardan elde edilen 3 aylık hücreler (üst paneller, Video 1),spesifik ventriküler belirteç (MLC2V) ve düşük verimli farklılaşmalardan elde edilen 3 aylık hücreler (alt paneller, Video 2),alfa-düz kas aktini (αSMA)-pozitif hücrelerle karışık iPSC-C'leri gösteren bir karşılaştırma gösterir. İlginçtir ki, fonksiyonel analiz, yüksek verimlilik farklılaşmasından iPSC-CM'lere kıyasla karışık iPSC-CM'ler/cm olmayan preparatlarda değişmiş Ca2+ geçicilerini göstermiştir. Özellikle, düşük verimli farklılasyonlardan elde edilen hücreler saf iPSC-CM'lere(Şekil 4B, üst panel) ve ARVC'lere(Şekil 4B, alt panel) göre çok küçük Ca2+ genlik ve otomatiklik(Şekil 4B, orta panel) sergilenmiştir. Buna ek olarak, düşük verimli farklıritasyonlardan hücreler aritmik desenler sundular (Şekil 4C).

Şekil 4A'nın üst panelinde gösterilen iPSC-CM'lerin de metabolik seçilimden geçtiğini ve bunun da zaten yüksek verimli bir farklılaşmadan elde edilen iPSC-CM popülasyonunu daha da zenginleştirmek için önemli bir adım olduğunu belirtmek önemlidir. Bu veriler, yüksek kaliteli CM'ler üreten yüksek verimli kardiyak farklılaşma protokollerinin, kardiyak fenotipin in vitro'da doğru bir şekilde yeniden özetlenmesini gerektiğini göstermektedir.

Şekil 5, CM'lerin tek katmanının farklı alanlarında 1.200 s'lik bir zaman diliminde çizilen Ca2+ genlik değişkenliğini gösterir. 1 Hz (200 s) stimülasyon frekansının başında ölçülen Ca2+ genlikleri son derece değişkendi ve stimülasyon devam ettikçe daha tutarlı hale geldi (200−900 s). Ancak, 900 s bir süre sonra Ca2 + genlik önemli ölçüde azaltıldı. Bu veriler, iPSC-CM'lerde Ca2+ geçicileri kaydederken, hücrelerin en az 200 s. Sürekli uyarılma altında 37 °C'de stabilize olmasını sağlamak gerektiğini göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: iPCS-CMs hazırlama ve Ca2+ geçici aletlerin genel şeması. (A) IPSC'lerin gelişim evrelerini gösteren kardiyak ayırım protokolü şeması. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Kalsiyum ve kontraktillik alım ve analiz sistemi. a) Peristalitik pompa b) Ters mikroskop c) Dijital kamera için güç kaynağı d) Elektrik uyarıcı e) Floresan sistem arayüzü f) Filtre tekerlek denetleyicisi (C) Sistem odası. a) Sistem odası gövdesi. b)Sıvı girişi. c)Akışkan çıkış. d)Akışkan sıralı çözelti ısıtıcı. f)Sistem odasını elektrik stimülatörüne bağlayan elektrotlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Farklılaşma nın farklı olduğu günlerde iPSC-CM'lerde MLC2A ve MLC2V ekspresyonunun karşılaştırılması. (A) MLC2A ve MLC2V için farklılaşma indüksiyonu sonrası 30, 60 ve 90. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) MLC2V ve MLC2A için iPSC-CM'lerin 1 ay ve 3 ay sonra farklılaşma sonrası akış sitometri analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Farklılaşma nın farklı olduğu günlerde iPSC-CM özelliklerinin karşılaştırılması. (A) Temsilci Ca2+ farklılaşma nın farklı olduğu günlerde geçici izler. (B-C) Ortalama Ca2+ genlik ve Ca2+ bozunma 1 Hz.(D-F)farklı farklılaşma günlerinde iPSC-CM'lerde isoproterenol (ISO, 10 nM) tedavisinin stimülasyonu sırasında ortaya çıkar. ARCM'lar izole sıçan erişkin kardiyomiyositleri gösteriyor. N = 70−100 alan; *p < 0.05; p < 0.001, öğrencinin t-testiile belirlenir. Veriler Mean ± S.E.M. olarak temsil edilir, bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: iPSC-CM'lerin yüksek verimlilik ve düşük verimlilik farklılisimleri arasında karşılaştırma. (A) αSMA ve MLC2V için iPSC-CM'lerin immünororeskence boyama. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Ca2+ geçicilerini yüksek verimlilik (üstte) ve düşük verimli (orta) farklılasyonlardan ve izole sıçan erişkin kardiyomiyositlerden (aşağıda) gösteren temsili izler. Miyositler 0.5 Hz, 1 Hz, 1.5 Hz, 2 Hz ve 3 Hz.(C) (C)Kötü bir farklılaşmadan kaynaklanan aritmik bir örüntü gösteren temsili iz de uyarıldı. Oklar nokta temposu gösterir. ARCMs izole sıçan yetişkin kardiyomiyositgösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Tek bir kapak kaymasından zamana bağlı Ca2+ genliği. Coverslip'te farklı alanlardan ca2+ genlikleri zamana bağlı bir şekilde çizildi. Ca2+ geçici sini ölçmek için tavsiye edilmeyen süreler kesikli alanlarda (<200 s veya >900 s) belirtilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1
Video 1: Yüksek verimlilik farklılaşmasının bir örneğini gösteren temsili video. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 2
Video 2: Düşük verimlilik farklılaşmasının bir örneğini gösteren temsili video. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 3
Video 3: IPSC-CM'lerin cam kapaklı homojen tek katmanlı dağılımının bir örneğini gösteren temsili video. Bu video, işlevsel analiz için kullanılmak üzere önerilen hücre yoğunluğunu gösterir. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 4
Video 4: Düşük verimli bir farklılaşmadan bir cam kapak kayma üzerine kaplanmış hücrelerin bir örnek gösteren temsili video. Videodaki hücreler düşük verimli bir farklılaşmadan elde edildi. Bu tür farklısiyetlerden elde edilen hücreler genellikle kapak boyunca homojen olarak dağıtılmaz ve sürekli olarak dayak hücrelerini bulmak zordur. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deneysel modeller olarak insan iPSC-CMs kullanmak için kritik adımlar şunlardır: 1) tutarlı performans ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlayabilir yüksek kaliteli kardiyomiyositler (CMs) üreten; 2) hücrelerin en az 90 gün boyunca kültür içinde olgunlaşmasına izin vererek fenotiplerini yeterince değerlendirmek; 3) insan iPSC-CM'lerinin fizyolojik olarak ilgili fonksiyonel karakterizasyonunu sağlamak için kalsiyum (Ca2+) geçici ölçümler gibi elektrofizyolojik çalışmalar yapmak. Yüksek kaliteli ventriküler benzeri iPSC-CM'ler üreten monokatmanlı bir farklılaşma yöntemi geliştirdik. Yöntemimiz birkaç önemli faktöre dayanır ve mevcut protokollerin bir çeşididir14,18. Diğer protokollerin aksine, bu düşük oksijen koşulları kullanır (5% O2)iPSCs bakım yanı sıra CMs içine farklılaşma ilk haftasında. Düşük oksijen düzeyleri embriyonik ve fetal kalp gelişimi sırasında çevresel durumu taklit19. Hipoksik koşulların da iPSCs proliferasyonu ve cms20sonraki farklılaşma artırmak için gösterilmiştir. Tohumlama yoğunluğu ve uygun iPSC'ler passaging de başarılı bir kardiyak farklılaşma için kritik faktörlerdir. %70−80 eşzamanlı iPSC'ler enzimsiz bir çözelti kullanılarak küçük hücreli agregalara ayrıştırıldığında ve 1:6 oranında bölündüğünde yüksek farklılaşma verimliliği gözlenir. Hücreler bölündükten yaklaşık 4 gün sonra beklenen %70−80'lik bir kesişmeye ulaştığında kardiyak farklılaşmaya başlanabilir. CHIR99021 (10 μM) tedavi nin başlangıcında ki farklılaşma önemli hücre ölümüne neden olacaktır. Ancak, chir99021 ertesi gün kültürden çıkarıldığında hücre çoğalması gözlenir. Hücre ölümü ve çoğalması arasında doğru bir denge, başarılı bir farklılaşma için bir diğer önemli faktör olan farklılaşma boyunca tek katmanlı bir kültürün korunması için gereklidir. iPSC yoğunluğu çok düşük veya çok yüksekse, sonraki farklılaşma düşük verimli kardiyak farklılaşma olacaktır(Şekil 4A, Video 2). Şekil 4A, sağlıklı bir donörden elde edilen kardiyomiyositlerin α-düz kas aktin pozitif hücreleri gibi diğer hücre tipleri ile karıştırıldığı düşük verimli bir farklılaşma örneği gösterir. Daha da önemlisi, bu tür preparatlardan kaydedilen Ca2+ geçici leri, düşük Ca2+ genliği ve aritmik desenler gibi biyolojik varyasyon olarak kolayca yanlış yorumlanabilecek farklı özellikler gösterdi. Aynı hücre hattından başarılı ve yüksek verimli bir farklılaşma, bunun yerine, ventriküler benzeri kardiyomiyositsaf bir popülasyon üretti(Şekil 4A, Video 1) düzenli Ca2 + geçici ile birlikte(Şekil 4B, üst panel). Bu nedenle, farklılaşmanın kalitesi ca2+ geçicinin genel büyüklüğü, şekli, düzenliliği ve sıklığında önemli bir rol oynar.

Başarılı ve verimli bir farklılaşmanın bir diğer önemli yönü de zenginleştirilmiş bir kardiyomiyosit popülasyonu elde etmektir. Farklılaşmamış kök hücreler ve diğer iPSC kaynaklı hücre tipleri enerji kaynağı olarak glikoz kullanırken, CM'ler ATP ve glutamat üretimi için laktat verimli bir şekilde kullanabilirsiniz21. Böylece, CMs daha saf bir nüfus elde etmek için, hücreler laktat takviyeli ve glikoz-tükenmiş kültür ortamı kültürlü. Ancak, bu seçici ortamda iPSC-CM'lerin uzun süre saklanması işlevsel bozulmaya yol açabilir. Bu nedenle, iPSC-CM'leri arındırmak ve hala işlevlerini korumak için, metabolik seçim sadece 10 gün boyunca, 80−90 gün farklılaşma indüksiyon undüksiyon beri yapılır. Bu dönemden sonra seçim ortamı değiştirilir ve hücreler RPMI/B27 ortamlarında tutulur. Seçim protokolü çok daha erken22 (örneğin, 15 gün civarında) uygulanabilir olsa da, böylece hücreler fonksiyonel çalışmalar (gün 90) için hazır zaman çoğalan artık iPSCs veya diğer hücre tipleri önlemek için, 80 güne kadar beklemek tavsiye edilir. Bu nedenle, başarılı, verimli ve sağlam bir kardiyak farklılaşma için, yukarıda bahsedilen faktörlerin tümünün dikkate alınması hayati önem taşımaktadır.

Kardiyak farklılaşma protokollerinin sağlamlığına ve verimliliğine ek olarak, olgunlaşma ve hücre tipi özellikleri (örneğin, atriyal ve ventriküler hücre tipleri) da kalp hastalığını modellemek için iPSC-CM'lerin kullanılmasında önemli bir sorun teşkil etmektedir. Son birkaç yıl içinde, elektrikstimülasyon, mekanik streç ve substrat sertliği23dahil olmak üzere birçok umut verici olgunlaşma stratejileri bildirilmiştir. Ancak, iPSC-CMs uzun in vitro kültür yetişkin gibi kardiyomiyosit24,25oluşturmak için basit ve pratik bir yaklaşım olmaya devam ediyor.

Yayınlanan diğer raporlar ile tutarlı12,bu in vitro farklılaşma protokolü tarafından oluşturulan iPSC-CMs ventrikül özgü MLC2V sağlam ifade ve gün 90 MLC2A çok daha düşük seviyelerde(Şekil 2A,B). Fetal CM'ler hem MLC2A hem de MLC2V izoformlar içermekle birlikte, erişkin ventriküler CM'ler sadece MLC2V içerir. MLC isoform prevalansındaki bu anahtar neonatal evre26sırasında ortaya çıkar.

Bu protokol ile oluşturulan kardiyomiyositler, mlc2V gibi ventriküler spesifik belirteçleri ifade eder ve hücreler kültürde daha uzun süre tutuldukça giderek artar(Şekil 2A,B). Bu, uzun süreli bir in vitro kültürün ventriküler fenotip için işlenmiş gibi görünen CM'lerin olgunlaşmasını artırdığını gösterir.

Kültürde zaman da büyük ölçüde Ca2 + işleme olgunlaşma24,25etkiler. Önceki raporlar, farklılaşma indüksiyon20 gün sonra, hücreler25büyüdükçe calc Ca2 + geçici önemli bir değişiklik olmadığını açıkladı. Ancak, burada ayrıntılı protokolden oluşturulan kardiyomiyositler, kardiyak farklılaşmanın indüksiyonundan 30, 60 ve 90 gün sonra değerlendirilen üç zaman puanı boyunca Ca2+ genlik ve Ca2+ bozunmada ilerleyici değişiklikler göstermektedir (Şekil 3A-C). İlginçtir ki, bu veriler, 90 inci maddede ölçülen Ca2+ genlik ve Ca 2+ bozunma gibi Ca2+ geçici parametrelerin izole sıçan erişkin kardiyomiyositlerde (ARCM) ölçülenlere benzediğini göstermektedir. Ayrıca, 90 günlük iPSC-CM'ler de 0,5 Hz ile 3 Hz arasında değişen çeşitli elektriksel uyarımları sürekli olarak takip edebildiler, ARCM'lara benzer(Şekil 4B). Gelecekteki çalışmalarda, kültürde daha uzun bir zamanın ARCM'lara kıyasla bu iPSC-CM'lerin işlevsel özelliklerini nasıl etkilediğini görmek ilginç olacaktır.

Ayrıca β-adrenerjik reseptör sinyali kardiyak indüksiyon27sonrası zamana bağlı maturational patern gösterdiğinden, bu protokol ile oluşturulan iPSC-CM'lerde izoproterenolün Ca2+ geçici üzerindeki etkisi test edilmiştir. İzoproterenol ile stimülasyon gün 90 iPSC-CMs pozitif lusitropic yanıta yol açtı, ARCMs gözlenen benzer(Şekil 3D-F).

Bu çalışmada yapılan iPSC-CM'lerin fonksiyonel değerlendirmeleri, izole edilmiş erişkin CM'lere göre bazı farklılıklar alabilmektedir. Yetişkin CM'ler iyi gelişmiş ve iyi düzenlenmiş sarcomeres var. Bu sarcomere hareketinin tespiti yoluyla kontraktilite ölçümleri için izin verir. Mevcut protokollerin hiçbiri tamamen olgunlaşmış, yetişkin benzeri iPSC-CM'ler oluşturmadığından, sarcomere algılama yoluyla kontraktility ölçümleri mümkün değildir. Hücre kasıldığında hücre kenarlarının hareketini tespit etmek mümkün olsa da, bu hareketleri iPSC-CM'lerde kesin bir şekilde izlemek çok daha zordur. Şu andan itibaren, teknolojik gelişmeler bu hücrelerde kontraktility doğru değerlendirmeler için izin vermek için gereklidir. Diğer taraftan, Fura-2 gibi Ca2+ göstergesi kullanarak iPSC-CM'lerin Ca2+ geçicilerini ölçmek mümkündür. Ancak, yetişkinlere uygun CM'lerin aksine, iPSC-CM'ler kümelenir ve iyi tanımlanmış bir kenarlık yoktur. Bu nedenle, kaydedilen Ca2+ geçicileri genellikle tek bir hücreyi değil, belirli bir alandaki bir hücre grubunu temsil eder. Alan boyutunu ayarlamak mümkün olsa da, tek bir hücreden Ca2+ geçicilerini kaydetmek inanılmaz derecede zordur. CM'lerin kapaklara kaplandığında yoğunluğun, hücrelerle sürekli olarak alan bulmanızı sağlayan homojen bir monolayer dağılımı(Video 3)elde etmesi çok önemlidir. Hücreler coverslip üzerinde tek katmanlı olarak dağıtılmazsa(Video 4),hücreleri olmayan alanlar olacaktır ve kapak özellikle ölçümleri gerçekleştirmek için hücreleri dövmek olan alanlar için taranırsa, bu bir "seçim önyargısına" yol açabilir. Dayak hücrelerinin belirli bir alanını seçmek yerine, coverslip boyunca birden çok alandan veri toplanması önerilir, bu da yalnızca hücreler homojen bir tek katmanlı olarak dağıtıldığında mümkündür. Yaklaşık 10 dakika süren 100 farklı alandan alınan ölçümler, hücrelerin güvenilir fonksiyonel özelliklerini sağlamak için yeterlidir. Son olarak, Şekil 5'tegösterildiği gibi, iPSC-CM'lerin ölçüm koşullarına uyum sağlamak için zamana ihtiyacı vardır. Güvenilir ölçümler için, hücrelerin ölçüm koşullarında en az 3 dakika stabilize edilmesi önerilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu araştırma AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.) tarafından desteklenmiştir; Mount Sinai KL2 Bilim Adamları Klinik ve Çevirisel Araştırma Kariyer Geliştirme KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 ve AHA 18TPA34170460 (K.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal Sigma Aldrich A5228
Alexa Fluor 488 goat anti mouse Invitrogen A11001
Alexa Fluor 555 goat anti rabbit Invitrogen A21428
B27 Supplement Gibco 17504-044
B27(-) insulin Supplement Gibco A18956-01
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DAPI nuclear stain ThermoFisher D1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes Gibco 11330-032
Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook Celltreat 229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well Corning 353046
Fluidic inline heater Live Cell Instrument IL-H-10
Fura-2, AM Invitrogen F1221
hESC-qualified matrix Corning 354277 Matrigel Matrix
hPSC media Gibco A33493-01 StemFlex Basal Medium
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument EC-B25
MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody Synaptic Systems 311011
Myocyte calcium and contractility system Ionoptix ISW-400
Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) Proteintech 10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane ThermoFisher 124-0045
PBS with Calcium and Magnesium Corning 21-030-CV
PBS without Calcium and Magensium Corning 21-031-CV
Premium Glass Cover Slips Lab Scientific 7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) Gibco 11879-020
RPMI medium 1640 (1X) Gibco 11875-093
Sodium L-lactate Sigma Aldrich L7022
StemFlex Supplement Gibco A33492-01
Thiazovivin Tocris 3845
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher 25200056
Tyrode's solution Boston Bioproducts BSS-355w Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955 (2015).
  2. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  3. Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
  4. Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
  5. Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
  6. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  7. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  8. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
  9. Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
  10. Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
  11. Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
  12. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).
  13. Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).
  14. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  16. Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  19. Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
  20. Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
  21. Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
  24. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  25. Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
  26. Scuderi, G. J., Butcher, J. Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).
  27. Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).

Tags

Tıp Sayı 155 indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (iPSC-CMs) iPSCs kalsiyum geçici kalsiyum kullanımı kardiyak hastalık modelleme kardiyomiyosit olgunlaşma
Ventriküler Benzeri HiPSC Türevi Kardiyomiyositlerin Ve Kalsiyum Kullanımı Karakterizasyonu için Yüksek Kaliteli Hücre Preparatlarının Üretimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oh, J. G., Dave, J., Kho, C.,… More

Oh, J. G., Dave, J., Kho, C., Stillitano, F. Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization. J. Vis. Exp. (155), e60135, doi:10.3791/60135 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter