Methodenartikel

Räumliche Temporale Analyse des feldweisen Flusses in der Mikrovaskulatur

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DOI:

10.3791/60493

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18. November 2019

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1Biocomplexity Institute, Indiana University, 2Department of Intelligent Systems Engineering, Indiana University, 3Department of Physics, Indiana University, 4Scientific Designs, 5Department of Medicine, Indiana University, 6School of Public Health, Indiana University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Um den mikrovaskulären Fluss aus Hochgeschwindigkeits-Kapillarflussbildsequenzen zu quantifizieren, haben wir die Software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow) entwickelt. Im gesamten Bildfeld und im Laufe der Zeit wertet STAFF Strömungsgeschwindigkeiten aus und generiert eine Sequenz farbcodierter Raumkarten für die Visualisierung und Tabellarische Ausgabe für quantitative Analysen.

Zusammenfassung

Veränderungen der Durchblutungsgeschwindigkeit und -verteilung sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gewebe- und Organperfusion als Reaktion auf unterschiedliche zelluläre Bedürfnisse. Darüber hinaus kann das Auftreten von Defekten in der Mikrozirkulation ein Primärindikator für die Entwicklung mehrerer Pathologien sein. Fortschritte in der optischen Bildgebung haben die Intravital-Mikroskopie (IVM) zu einem praktischen Ansatz gemacht, der die Bildgebung auf zellulärer und subzellulärer Ebene bei lebenden Tieren mit hoher Geschwindigkeit im Laufe der Zeit ermöglicht. Doch trotz der Bedeutung der Aufrechterhaltung einer ausreichenden Gewebeperfusion ist die räumliche und zeitliche Variabilität des Kapillarflusses selten dokumentiert. Im Standardansatz wird eine kleine Anzahl von Kapillarsegmenten für die Bildgebung über einen begrenzten Zeitpunkt ausgewählt. Um den Kapillarfluss unvoreingenommen zu quantifizieren, haben wir die Räumliche Temporalanalyse des feldweisen Flusses (STAFF), ein Makro für FIJI Open Source Bildanalysesoftware, entwickelt. Mithilfe von Hochgeschwindigkeits-Bildsequenzen von vollen Blutflussfeldern innerhalb von Kapillaren erzeugt STAFF Bilder, die Bewegungen im Zeitverlauf darstellen, die für jedes Zeitintervall für jedes Gefäßsegment als Kymographen bezeichnet werden. Aus den Kymographen berechnet STAFF Geschwindigkeiten aus der Entfernung, die rote Blutkörperchen im Laufe der Zeit bewegen, und gibt die Geschwindigkeitsdaten als eine Sequenz von farbcodierten Raumkarten für die Visualisierung und tabellarische Ausgabe für quantitative Analysen aus. In normalen Mauslebern quantifizierte STAFF-Analysen tiefgreifende Unterschiede in der Strömungsgeschwindigkeit zwischen pericentral- und periportal-Regionen innerhalb von Lobulen. Noch unerwarteter sind die Unterschiede in der Strömungsgeschwindigkeit zwischen Sinusoiden, die nebeneinander stehen, und Schwankungen, die innerhalb einzelner Gefäßsegmente über Sekunden gesehen werden. STAFF ist ein leistungsstarkes neues Werkzeug, das neue Erkenntnisse liefern kann, indem es die Messung der komplexen raumzeitlichen Dynamik des Kapillarflusses ermöglicht.

Einleitung

Die Mikrovaskulatur spielt eine entscheidende Rolle in der Physiologie und sorgt für eine effektive Perfusion von Geweben unter wechselnden Bedingungen. Mikrovaskuläre Dysfunktion ist verbunden mit unzähligen Erkrankungen einschließlich langfristiger kardiovaskulärer Morbidität und Mortalität, Entwicklung von Demenz und Erkrankungen von Leber und Niere und ist daher ein Schlüsselfaktor von Interesse in einem breiten Spektrum von biomedizinischen Untersuchungen1,2,3,4,5. Während mehrere Techniken zur Bewertung der Gewebeperfusion eingesetzt wurden, ermöglicht nur die intravitale Mikroskopie die Datenerfassung in der zeitlichen und räumlichen Auflösung, die notwendig ist, um den Blutfluss auf der Ebene einzelner Kapillaren zu charakterisieren.

Der mikrovaskuläre Fluss kann in der Fluoreszenzmikroskopie entweder durch Bewegung fluoreszierender Mikrosphären oder durch die Bewegung roter Blutkörperchen vor dem Hintergrund membranimpermeant Fluoreszenzmarker (z.B. fluoreszierend dextran oder albumin)6,7visualisiert werden. Der mikrovaskuläre Fluss kann in oberflächlichen Zellschichten mittels Weitfeldmikroskopie oder in der Tiefe mit der konfokalen oder multiphotonen Mikroskopie abgebildet werden. Die Kapillardurchflussraten sind jedoch so, dass der Durchgang roter Blutkörperchen in der Regel nicht mit Geschwindigkeiten unter 60 Frames/s erfasst werden kann. Da die meisten Laserscanning-Konfokal- und Multiphotonenmikroskope 1-5 s benötigen, um ein vollständiges Bildfeld zu scannen, kann diese Geschwindigkeit in der Regel nur erreicht werden, indem das Sichtfeld eingeschränkt wird, manchmal auf eine einzige Scanlinie8. Der Prozess der Begrenzung von Messungen auf ausgewählte Kapillarsegmente (1) hat das Potenzial, Selektionsverzerrungen einzuführen und (2) macht es unmöglich, räumliche und zeitliche Heterogenität in den Raten des kapillaren Blutflusses zu erfassen. Im Gegensatz dazu können Bilder von Kapillarnetzwerken mit Geschwindigkeiten von mehr als 100 fps mit Widefield-Digitalmikroskopen gesammelt werden, die mit wissenschaftlichen Komplementär-Metalloxid-Halbleiterkameras (sCMOS)9,10ausgestattet sind. Diese kostengünstigen Systeme, die in typischen biomedizinischen Laboratorien üblich sind, ermöglichen es, den mikrovaskulären Fluss über ganze zweidimensionale Netzwerke im Wesentlichen kontinuierlich abzubilden. Das Problem wird dann zu einem Analyseansatz, der in der Lage ist, aussagekräftige quantitative Daten aus den massiven und komplexen Bild-Datasets zu extrahieren, die durch die Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie generiert werden.

Um die Analyse von Vollfeld-Flow-Daten zu ermöglichen, haben wir STAFF entwickelt, eine neuartige Bildanalysesoftware, die kontinuierlich den mikrovaskulären Fluss in ganzen Mikroskopfeldern von Bildreihen messen kann, die mit hoher Geschwindigkeit11gesammelt wurden. Der Ansatz ist mit einer Vielzahl unterschiedlicher experimenteller Systeme und Bildgebungsmodalitäten kompatibel und die STAFF Bildanalyse-Software wird als Makro-Toolset für die FIJI-Implementierung von ImageJ12implementiert. Das zugrunde liegende Prinzip, das hier verwendet wird, um den mikrovaskulären Fluss zu visualisieren, ist, dass zuerst ein gewisser Kontrast vorgesehen werden muss, um die roten Blutkörperchen innerhalb von Kapillaren abbilden zu können. In unseren Studien wird der Kontrast durch eine massenhaft fluoreszierende Sonde bereitgestellt, die von den roten Blutkörperchen ausgeschlossen wird. Die Strömungsgeschwindigkeit kann dann aus der Verschiebung der roten Blutkörperchen quantifiziert werden, die als negativer Fleck innerhalb des fluoreszierend markierten Plasmas in Bildern erscheinen, die mit hoher Geschwindigkeit von einem lebenden Tier gesammelt wurden8. Wir verwenden dann STAFF, um Entfernungsdiagramme entlang jedes Kapillarsegments über mehrere Zeitintervalle zu erstellen, die als Kymographen bezeichnet werden, und dann die in den Kymographen13vorhandenen Steigungen zu erkennen, und von diesen Hängen aus berechnen wir die Raten des mikrovaskulären Flusses. Der Ansatz kann auf Bilder angewendet werden, die von jedem Kapillarbett gesammelt wurden, auf das für die Bildgebung zugegriffen werden kann. Hier beschreiben wir die Anwendung von IVM und STAFF auf Studien des Blutflusses in der Leber.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Indiana University genehmigt und durchgeführt und hielten sich an den NRC-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Tieren.

1. Chirurgische Präparation für die Intravital-Mikroskopie

HINWEIS: Dies ist keine Überlebensoperation. Sobald Abschnitt 1 "Chirurgische Präparation für die intravitale Mikroskopie" begonnen hat, können die Arbeiten bis zum Abschluss von Abschnitt 2 "Intravitalmikroskopie" nicht mehr angehalten werden.

  1. Akklimatisieren Sie 9–10 Wochen alte männliche C57BL/6 Mäuse, für mindestens 4 Tage und schnell für 16 h vor Studien.
  2. Wiegen Sie das Tier, sedate mit 5% Isoflurane und legen Sie auf einem Heizkissen Körpertemperatur zu halten. Verwenden Sie einen Sauerstoffdurchfluss von 1–2 L/min und halten Sie die Sedierung mit 1-2% Isofluran aufrecht. Überprüfen Sie Diereflexe durch Zehenstich. Überwachen Sie die Temperatur mit einem rektalen Thermometer. Überwachen Sie Herzfrequenz und Atmung visuell.
  3. Wenn die Anästhesie stabil ist, rasieren Sie den Bereich für die Platzierung der Jugularkanulation und den Bereich unterhalb des Rippenkäfigs für die Exposition der Leber.
  4. Für die Jugularcannulation, machen Sie einen 1 cm linken ventralen Schnitt 1–2 cm unter dem Kiefer der Maus. Löschen Sie alle Fette und Faszien rund um die Jugularvene. Binden Sie das vordere Ende des Jugulars mit 06 Nahtschnur ab, um Blutungen zu verhindern.
    1. Machen Sie einen winzigen Nick in der Jugularvene und schieben Sie die Kanüle (30 G x 1/2 Zoll, Nadel), Nadelhalter und Polyethylen-Schlauch (0,011 x 0,024 Zoll2 an einem Luer-Stub-Adapter befestigt und mit 0,9% Saline gefüllt) in ca. 1 cm, und am hinteren Ende des Jugulars mit 0-6 Nahtschnur sichern.
  5. Mit der Jugularkanüle liefern 70 kDa Fluorescein dextran (in einer Dosis von 30 mg/kg durch Injektion von 0,1 ml einer 9 mg/ml Lösung in Saline).
  6. Setzen Sie die Leber für die Bildgebung aus, indem Sie einen 4–6 cm großen Schnitt über den Oberkörper machen, 1–2 cm unterhalb der Mitte des Rippenkäfigs.
  7. Legen Sie einen nassen (in 0,9% Saline getränkten) 2 x 2 Zoll2 Gazeschwamm unter den linken seitlichen Leberlappen. Legen Sie Klebeband an die Peripherie des Glasfensters einer 40 mm Coverslip-Bodenschale und tragen Sie Cyanoacrylatkleber auf das Band auf. Drücken Sie die Glasplatte auf die Leber und drücken Sie mit Watte-Kipp-Applikatoren die Gaze in den Kleber auf dem Band, um die Gewebebewegung für die Mikroskopie zu minimieren.
  8. Tier auf die Mikroskopstufe bringen. Fügen Sie sterile 0,9% Saline in die Decke-Boden-Boden-Schale, um die Leber feucht während der Bildgebung Sitzung zu halten. Halten Sie die Temperatur bei 36–37 °C über auf der Bühne montierte Heizkissen, ein über dem Tier platziertes Heizkissen und eine Objektivheizung.

2. Intravitale Mikroskopie

  1. Führen Sie die intravitale Mikroskopie auf einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop durch, das mit einer Videokamera ausgestattet ist, die eine Hochgeschwindigkeits-Bildaufnahme durchführen kann.
    HINWEIS: Hier kamen eine Xenon-Lichtbogenlampe, eine fluoresceinspezifische Anregung (480–500 nm) und Emissionsfilter (507–543 nm), Plan Fluor 20x, N.A. 0,75 Wassertauchobjektiv und eine Hochgeschwindigkeits-SCMOS-Kamera zum Einsatz.
  2. Wählen Sie den Interessenbereich für die Kapillar-Blutflussanalyse mit minimaler Beleuchtung aus.
  3. Stellen Sie die Belichtungszeit so kurz ein, dass die Kamera 100 fps erfassen kann. Stellen Sie die Beleuchtungsstärke ein, um rote Blutkörperchen und die Topologie der Vaskulatur deutlich zu visualisieren und gleichzeitig Phototoxizität und Photobleichung der Fluoreszenzsonde zu vermeiden.
  4. Sammeln Sie Bilder mit einer Rate von 100 fps. Stellen Sie die Auflösung des Kamerapixels zwischen 0,65 und 1,3 m/Pixel ein. Stellen Sie die Framegröße zwischen 512 x 512 und 1024 x 1024 Pixel n. Chr. ein. Stellen Sie die Bittiefe zwischen 8 und 16 Bit ein. Verwenden Sie die höchste Auflösung, Framegröße und Bittiefe, die immer noch eine Bildsammlung von 100 fps auf dem System ermöglicht.
  5. Sparen Sie Zeitreihendateien als eine Sequenz von TIF-Dateien oder als natives Kamera-/Mikroskopformat, wenn Bio-Formate14 in FIJI die nativen Formatdateien öffnen können.
  6. Bild mehrere Bereiche im Laufe der Zeit. Halten Sie die Maus auf der Mikroskop-Stufe für bis zu 2 h. Euthanisieren Sie die Maus am Ende der Bildgebung.
    HINWEIS: Die Dauer der Zeitreihe basiert auf dem Ausgleich der Notwendigkeit, für ein Zeitintervall abzubilden, das die Variabilität umfasst, ohne die Lebensfähigkeit des Gewebes zu beeinträchtigen. Die Dauer der Zeitreihe kann auch durch Überlegungen zur Dateigröße bestimmt werden. eine 1 min Zeitreihe von 1024 x 1024 Pixel 16-Bit-Bildern, die mit 100 fps gesammelt werden, generiert eine Datei, die 12 GB groß ist. Überlegungen zur Dateigröße können auch die verwendete Framegröße und Bittiefe bestimmen. Es gibt keine expliziten Größenbeschränkungen in STAFF.

3. Definieren Sie das Gefäßnetzwerk mit TrakEM2 in FIJI

HINWEIS: Das Protokoll kann nach dem Speichern der Arbeit an einem beliebigen Punkt in Abschnitt 3 angehalten werden.

  1. Laden Sie FIJI von https://imagej.net/Fiji/Downloads herunter und installieren Sie es.
    HINWEIS: Version 1.51n von Fidschi wurde für dieses Projekt verwendet und kann von https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip heruntergeladen werden. Beachten Sie, dass UNTER Windows FIJI im Benutzerbereich und nicht in Programmdateien installiert werden sollte.
  2. Öffnen Sie die Filmdatei in FIJI mit Datei > Datei öffnen oder verwenden Sie Datei > Importieren > Bildsequenz. Wählen Sie ein einzelnes Bild aus den stabilen Bildern zwischen Atmungen aus, bei denen die Topologie des Gefäßnetzwerks leicht zu erkennen ist. Wählen Sie Bild > Duplizieren und duplizieren Sie das ausgewählte Einzelbild (nicht den Stapel) und speichern Sie das Bild in einem neuen Ordner. Schließen Sie keine Leerzeichen in Datei- oder Ordnernamen ein.
  3. Richten Sie ein neues leeres TrakEM2-Projekt ein, indem Sie Datei > Neu > TrakEM2 (leer)auswählen. Wählen Sie den neuen Ordner aus, der das einzelne Bild aus dem Film als Projektordner enthält. Die TrakEM2-Fenster werden geöffnet.
  4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in den Hauptarbeitsbereich, und wählen Sie Import > Bild importierenaus. Navigieren Sie zu dem in Schritt 3.3 gespeicherten Einzelbild und wählen Sie es aus.
  5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste erneut in den Hauptarbeitsbereich und wählen Sie Anzeigen > Autoresize canvas/Layer set. Linksklick im Hauptarbeitsfenster. Das Bild füllt den Arbeitsbereich.
  6. Um die Bereiche im Bild auszuwählen, die das Gefäßnetzwerk enthalten, richten Sie die Auswahl der Bereichslisten in TrakEM2 ein. Im kleineren TrakEM2-Fenster (Template, Projektobjekte, Layer) klicken Sie mit der rechten Maustaste auf "• alles". Wählen Sie Neue untergeordnete > Bereichslistehinzufügen aus.
  7. Ziehen Sie im kleineren TrakEM2-Fenster "Vorlage > alles" auf "Projektobjekte > Projekt". Ziehen Sie dann "Vorlage > alles > • Flächenliste" auf "Projektobjekte > Projekt > alles". Unter "Projektobjekte > Projekt > alles", • wird nun die Flächenliste vorhanden sein.
  8. Im Hauptfenster TrakEM2 unter der Registerkarte Z-Raumwurde eine mit Balken beschriftete Bereichsliste erstellt. Klicken Sie hier, um es auszuwählen. Wählen Sie im Hauptfenster TrakEM2 auch das Pinselwerkzeugaus. Drücken Sie umschalten und rollen Sie das Mausrad, um eine geeignete Größe für den Pinsel auszuwählen, z. B. kleiner als der Durchmesser der Vaskulatur. Um die TrakEM2-Einrichtung zu speichern, drücken Sie die Tasten Control + S.
  9. Malen Sie das Gefäßnetzwerk mit dem Pinselwerkzeug. Um Alt zu löschen, während Sie das Pinselwerkzeug verwenden. Schließen Sie keine Nichtfokusregionen ein. Sparen Sie häufig mit Control + S.
  10. Wenn die Beschriftung des Gefäßnetzwerks abgeschlossen ist, klicken Sie mit der rechten Maustaste in das TrakEM2-Hauptfenster, und wählen Sie Export > AreaLists als Beschriftungen (tif). Wählen Sie im Popup-Fenster Maßstab 100 % und Alle Flächenausexportieren aus. Schließen Sie TrakEM2-Fenster, und wählen Sie Ja für Projekt speichern.
  11. Das Bild von AreaLists wird geöffnet und kann als leeres schwarzes Bild angezeigt werden. Wählen Sie im Hauptmenü FIJI Bild > Anpassen > Helligkeit/Kontrast. Drücken Sie im B&C-Fenster die Auto-Taste, und die AreaList wird sichtbar. Wählen Sie im Hauptmenü FIJI Bild > Nachsuchtabellen > LUT invertieren aus. Speichern Sie dieses Bild mit schwarzen Beschriftungen auf weißem Hintergrund, und schließen Sie das Bild.
  12. Öffnen Sie die Etikettendatei in FIJI. Wählen Sie Plugins > Skelett > Skelettisieren. Speichern Sie das skelettierte Bild als tif. Verwenden Sie die Datei skeleton.tif als eine der Eingabedateien, die zum Ausführen der STAFF-Flussanalyse erforderlich sind. Verwenden Sie beim Speichern der Datei keine Leerzeichen im Dateinamen.
  13. Bearbeiten Sie die Skelettdatei nach Bedarf manuell, indem Sie eine Lücke (mit dem Malwerkzeug)in der Linienzeichnung platzieren, z. B. an Stellen, an denen Zweige in der Gefäßstruktur nicht erfasst wurden, weil sie aus der Bildebene herausgehen.

4. Vorbereiten der Filmsequenz für die STAFF-Analyse

  1. Öffnen Sie die Filmdatei in FIJI mit Datei > Öffnen oder Datei > Importieren > Bildsequenz. Wählen Sie einen Zeitraum der Bildsequenz für die Strömungsanalyse (kann Sekunden bis Minuten, Hunderte bis Zehntausende von Frames sein), in dem die Gewebeposition im Laufe der Zeit stabil geblieben ist, außer während der Atmung.
  2. Wählen Sie Bild > Duplizieren und duplizieren Sie den ausgewählten Teil der Sequenz, indem Sie die Zahlen des Anfangs- und Endframes eingeben. Überprüfen Sie die räumliche und zeitliche Bildkalibrierung unter Bild > Eigenschaften und korrigieren Sie sie bei Bedarf. Speichern Sie die Bilddatei als TIF (oder als unkomprimiertes AVI). Diese movie.tif wird als Eingabedatei benötigt, um die STAFF-Analyse auszuführen. Schließen Sie keine Leerzeichen in den Dateinamen ein.

5. Installieren Sie STAFF-Makros in FIJI

HINWEIS: (Wichtig) Mehrere Ordner innerhalb der FIJI-Ordner-Unterverzeichnisse haben ähnliche Dateinamen, einige großgeschrieben, einige nicht. Stellen Sie sicher, dass die richtigen Ordner bei der Installation von STAFF ausgewählt sind.

  1. Laden Sie die STAFF-Makros von https://github.com/icbm-iupui/STAFF herunter.
  2. Öffnen Sie zunächst den Ordner FIJI, um zu installieren.
    1. Suchen Sie unter Windows den Ordner, in dem FIJI im Benutzerbereich installiert ist, am häufigsten auf dem Desktop. Finden Sie unter MacOS das FIJI-Symbol im Ordner Anwendungen, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Öffnenaus.
  3. Öffnen Sie im Ordner FIJI den Plugins-Ordner. Öffnen Sie im Ordner Plugins den Ordner Makros. Kopieren Sie STAFF.ijm in diesen Makroordner: Fidschi-Plugins-Macros-STAFF.ijm.
  4. Öffnen Sie im Ordner FIJI den Plugins-Ordner. Kopieren Sie STAFF_Dir.jar in diesen Plugin-Ordner: Fidschi-Plugins-STAFF_Dir.jar.
  5. Öffnen Sie im Ordner FIJI den Makroordner. Öffnen Sie in diesem Makroordner den AutoRun-Ordner. Kopieren Sie STAFF_Loader.ijm in diesen AutoRun-Ordner: Fidschi-Makros, AutoRun, STAFF_Loader.ijm.
  6. Starten Sie FIJI, und überprüfen Sie die Makroinstallation. Um die Installation zu überprüfen, wählen Sie Plugins > Makros. Wenn das Dropdown-Menü korrekt installiert ist, enthält das Dropdown-Menü: Projekt öffnen, Skelett analysieren, Zeitintervalle bearbeiten, Fluss analysieren und räumliche Karte erzeugen.
  7. Wenn diese Befehle nicht im Menü Makros vorhanden sind, wählen Sie Plugins > Makros > Installieren, Öffnen Sie den Ordner Fidschi-Plugins-Macros, wählen Sie die Datei STAFF.ijm aus, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche OK. Die Befehle sollten nun im Menü Plugins > Makros angezeigt werden.

6. Quantifizierung des Gefäßflusses mit STAFF

  1. Erstellen Sie ein neues Projekt.
    1. Wählen Sie Plugins > Makros > Projekt öffnen und folgen Sie den Anweisungen zum Erstellen oder Aktualisieren einer Konfigurationsdatei.
    2. Navigieren Sie im Menü Projekt öffnen zum Projektverzeichnis, zum Eingabedateiordner und zu den Eingabedateien Movie.tif und Skeleton.tif, und wählen Sie es aus. Bearbeiten Sie ggf. die Namen der automatisch ausgefüllten Ausgabedatei.
    3. Eingangswerte für kürzeste Segmentlänge (20 m), gemessene Höchstgeschwindigkeit (2.000 m/s) und maximale Geschwindigkeit zugeordnet (1.000 m/s).
      HINWEIS: Das Produkt mit kürzester Segmentlänge und Frames pro Sekunde ergibt die theoretisch messbare maximale Durchflussgeschwindigkeit. Die höchsten kapillaren Durchflussgeschwindigkeiten, die in der Literatur berichtet werden, liegen bei etwa 2.000 m/s15. In der Leber beobachteten wir, dass die Kapillarflussgeschwindigkeiten im Durchschnitt bei etwa 300 m/s lagen und selten 1.000 m/s überstiegen.
    4. Geben Sie die Werte für Pixelgröße und Bildrate für die Bildsequenz ein (aus Bildmetadaten oder experimentellen Notizen). Diese Werte erfordern Benutzereingaben. Aktivieren Sie das Feld Flicker-Korrektur, wenn die Bilder regelmäßig hintergrundintensitätsflackern.
    5. Wählen Sie Parameter für die beste Visualisierung der Daten aus. Wählen Sie die maximale Geschwindigkeit aus, die zugeordnet ist, um etwa 95 % der Daten einzuschließen, sodass die Daten über den gesamten Bereich der Farbskala zugeordnet werden. STAFF ordnet Hochgeschwindigkeitsausreißer dem Hochgeschwindigkeitsende der Farbskala zu.
  2. Analysieren Sie das Skelett.
    1. Wählen Sie Plugins > Makros > Skelett analysieren . Die Datei skeleton.tif wird geöffnet und der ROI-Manager (Region of Interest) wird geöffnet und ausgeführt.
      HINWEIS: Analysieren von Skelett klassifiziert jedes Pixel nach seiner Anzahl von Nachbarn als entweder an einem Endpunkt, an einer Kreuzung oder innerhalb eines Segments. Für jedes Segment werden eine Identifikationsnummer (ID-Nummer), eine kalibrierte Verzweigungslänge und die räumlichen Koordinaten der Verzweigungsen den Enden aufgezeichnet.
    2. Warten Sie, bis Segment-IDs auf dem Skelett angezeigt werden, die Segmentliste im ROI-Manager und ein Popup, das angibt, dass die ROI Manager-Datei für das Skelett gespeichert ist. Klicken Sie auf OK.
    3. Stellen Sie sicher, dass zwischen den Atmungsbewegungen das Skelett dort bleibt, wo rote Blutkörperchen durch die Kapillare gehen (z. B. nicht die Kante und nicht außerhalb der Kapillare). Zeigen Sie die beschrifteten Segmente als Overlay im Film an, indem Sie die Filmdatei öffnen und dann die ROI-ZIP-Datei in den geöffneten Film ziehen. Spielen Sie den Film mit den segmentierten Segmenten ab.
  3. Wählen Sie Zeitintervalle aus.
    1. Wählen Sie Plugins > Makros > Zeitintervalleauswählen . Warten Sie, während das Makro einen Kymographen aus einem einzelnen Segment über die Gesamtzeit für den Film generiert. Aus diesem Kymographwählt wählt der Benutzer Zeitintervalle für die Analyse aus. Verwenden Sie Control + + Tasten, um die Größe des Kymographen bei Bedarf zu erhöhen.
    2. Das Rechteckauswahlwerkzeug wird automatisch aktiviert. Zeichnen Sie ein Rechteck um jedes Zeitintervall. Ein guter Ausgangspunkt für die Zeitintervalllänge ist das Intervall von 1–2 s zwischen Atmungsaufatmungen, die als horizontale verschwommene Bereiche im Kymographen sichtbar sind.
    3. Klicken Sie im ROI-Manager auf die T-Taste oder die Schaltfläche Hinzufügen, um die Auswahl des Zeitintervalls aufzuzeichnen. Wiederholen Sie dies für beliebig viele Zeitintervalle. Treffen Sie eine Auswahl sequenziell von oben (oder links) bis unten (oder rechts) des Kymographen.
    4. Bewerten Sie die Parameterauswahl (aus Open-Create Project), indem Sie eine kleine Anzahl von Zeitintervallen (3 bis 4) auswählen und die Analyse nur für diese Intervalle abschließen, da "Flow analysieren" (der nächste Schritt) für große Datasets Stunden in Anspruch nehmen kann.
    5. Klicken Sie im Erstellen eines ROI für jedes Zeitintervallfenster auf OK, wenn Sie fertig sind. Ein Popupfenster wird angezeigt, wenn die ausgewählten Intervalle im Projektordnergespeichert wurden. Klicken Sie auf OK.
  4. Analysieren Sie den Fluss.
    1. Wählen Sie Plugins > Makros > Flow analysieren und das Dialogfeld Flow-Parameter analysieren öffnet und zeigt die Werte an, die im Schritt Projekt öffnen eingegeben wurden. Bei Bedarf bearbeiten und dann auf OKklicken.
    2. Das Dialogfeld Dateinamen ausgeben wird geöffnet und zeigt die Namen an, die im Schritt Projekt öffnen eingegeben wurden. Bei Bedarf bearbeiten und dann auf OKklicken.
    3. Es wird ein Dialogfeld geöffnet, in dem sie gefragt wird, ob der Benutzer bereit ist, mit der Analyse zu beginnen. Klicken Sie auf OK, und die Analyse beginnt. Warten Sie auf ein Dialogfeld, das geöffnet wird, um anzugeben, wann die Flussanalyse abgeschlossen ist.
      HINWEIS: Die benötigte Zeit hängt von der Prozessorgeschwindigkeit und -größe des Datasets ab.
    4. Vergewissern Sie sich, dass Ergebnisdateien als Tabellenkalkulationsdateien im Csv-Format im Projektordner gespeichert wurden.
      HINWEIS: Ausgabedateien enthalten: segment_velocities.csv enthält Geschwindigkeitswerte, die positive und negative Werte aufweisen, die die Strömungsrichtung angeben. Zellen, die Segmente darstellen, die kleiner als die minimale Länge sind, enthalten den Text SHORT. Zellen mit Geschwindigkeitswerten, die größer als die gemessene Höchstgeschwindigkeit sind, enthalten den Text OUT (für Ausreißer). kym_ang.csv enthält Kymographenwinkel, die mit dem Directionality Plugin in FIJI gemessen werden. good_fit.csv enthält die Güte der Anpassung einer Kurve an die Verteilung der Winkel, die von jedem Kymograph gemessen werden. Schlechte Passfähigkeit (< 0,8) kann auf versteckte Astpunkte in einem Segment, Geschwindigkeitsänderung während des Zeitintervalls, Lampen- oder Raumlichtflimmern hinweisen.
    5. Überprüfen Sie, ob segment_velocities.csv nur wenige OUT-Werte enthält. Wenn eine große Anzahl von OUT-Werten vorhanden ist, stellen Sie sicher, dass die zu analysierende minimale Segmentlänge nicht weniger als 15–20 m beträgt, und führen Sie dann Flow analysierenerneut aus. Wenn die neue segment_velocities.csv immer noch einen großen Anteil an OUT-Werten enthält, aktivieren Sie das Flickerkorrekturfeld, und führen Sie dann Flow analysierenerneut aus.
  5. Erstellen Sie räumliche Karten.
    1. Wählen Sie Plugins > Makros > Räumliche Karte erzeugen und das Fenster Räumliche Kartenparameter wird geöffnet, in dem die im Schritt Projekt öffnen eingegebenen Werte angezeigt werden. Bearbeiten Sie bei Bedarf, oder wählen Sie OKaus.
    2. Beobachten Sie, wie eine zeitliche Abfolge räumlicher Karten von Strömungsgeschwindigkeiten mit Einer Farbe generiert wird, die die Strömungsgeschwindigkeit angibt. Die Ausgabe erfolgt in Form eines .tif-Bildstapels mit einem Bild für jedes Zeitintervall. Scrollen Sie durch den .tif-Stack, um räumliche und zeitliche Variationen im Flow zu visualisieren. Speichern Sie den Stapel als AVI-Datei (unkomprimiert für maximale Portabilität), um ihn als Film freizugeben.

7. Quantitative Analyse mit STAFF-Ausgang

  1. Öffnen Sie die Datei segment_velocities.csv in einer Kalkulationstabelle oder einem statistischen Analyseprogramm. Diese Werte haben ein positives oder negatives Vorzeichen, das die Strömungsrichtung relativ zu den Start-/Stopppunkten dieses Segments angibt (in der Segment-ROI-Datei aufgezeichnet).
  2. Erstellen Sie eine neue Tabellenkalkulationsseite, die die absoluten Werte aller Geschwindigkeitswerte enthält. Verwenden Sie diese Werte, um die durchschnittliche Gesamtströmungsgeschwindigkeit, die durchschnittliche Strömungsgeschwindigkeit für alle Gefäßsegmente im Zeitverlauf, die Strömungsgeschwindigkeit für jedes Gefäßsegment im Zeitverlauf zu berechnen und Histogramme von Geschwindigkeitsverteilungen vorzunehmen.
  3. Berechnen Sie Werte um bestimmte morphologische Regionen oder andere interessenspezifische Regionen, indem Sie zunächst die spezifischen relevanten Segmente im markierten Skelett finden und dann Analysen für diese ausgewählten Segmente durchführen.

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Ergebnisse

Die STAFF-Analyse erzeugt eine vollständige Zählung der mikrovaskulären Geschwindigkeiten über ganze Mikroskopfelder hinweg über Zeiträume von Sekunden bis Minuten. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3und Abbildung 4dargestellt. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für eine Zeitreihe des mikrovaskulären Netzwerks in der Leber einer Maus, die Erz...

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Diskussion

Dieses Protokoll enthält mehrere wichtige Schritte. Erstens ist die Minimierung der Bewegung während der intravitalen Bildgebung der Leber wichtig für die Erzeugung von Filmen, die für die Kapillarflussanalyse mit STAFF verwendet werden können. Aufgrund der Nähe des Zwerchfells treten kurze Phasen der Atmungs-induzierten Bewegung auf, wobei die gesicherte Leber nach jedem Atemzug in ihre Ausgangsposition zurückkehrt. Die Sicherung der chirurgisch exponierten Leber gegen die Abdeckungsplatte mit Gaze, dann die Bildgebung ...

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Offenlegungen

Die Autoren berichten von keinen konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Die hier vorgestellten Studien wurden durch Fördermittel der National Institutes of Health (NIH U01 GM111243 und NIH NIDDK P30 DK079312) unterstützt. Intravitale Mikroskopie-Studien wurden am Indiana Center for Biological Microscopy durchgeführt. Wir danken Dr. Malgorzata Kamocka für die technische Unterstützung bei der Mikroskopie.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
# 5 PinzetteFine Science Tools11251-20Dumont # 5 Inox Pinzette
C57BL / 6 MäuseJackson Labsmännlich 9-12 Wochen alt
KanüleInstechBTPE-10Polyethylenschlauch 0,011 x 0,024 Zoll
CMOS-KameraHamamatsuC11440-42U304,0LT Scientific CMOS
DeckglasbodenElektronenmikroskopie SciencesWillCo Dish Glasboden-GWST5040
PräparierschereFine Science Tools
Fiji ImageJ Bildanalysesoftwarehttps://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Fluorescein DextranThermo Fisher, InvitrogenD1822Dextran, Fluorescein, 70.000 MW, anionisch, Lysin fixierbar
MullschwammFisher22-415-5042x2 Zoll Dukal sterile Mullschwämme
HeizkissenReptithermRH-4zwischen Maus und Tisch
HeizkissenSunbeam000732-500-000Uüber Maus
Inverses EpifluoreszenzmikroskopNikonNikon TiE inverses Mikroskop
Isis Nagetier ElektrorasiererBraun AesculapGT420
Luer Stub AdapterFisher14-826-19EKatheteradapter
MikroschereCastro Viejo
Mikroskop ObjektivNikonPlan Fluor 20x, NA 0.75 Wasser Immersionsnadel
Fisher30 G x1/2"
Nadel HalterOlsen-Hegar
ObjektivheizungBioScience ToolsMTC-HLS-025Temperaturregler mit Objektivheizung
RektalthermometerBraintree Scientific, INCTH-5AMaus Überwachung der Körpertemperatur
STAFF Makroshttps://github.com/icbm-iupui/STAFF
NahtfadenHarvard Bioscience723288seidenschwarzes Nahtmaterial, 6-0, Spule
Isofluorane Abbott GmbH PZN4831850

Referenzen

  1. Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
  2. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
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