Summary
这种检测方法是测量发育胚胎斑马鱼的造血细胞的简单方法。分离斑马鱼的血细胞接受流动细胞学分析。这允许检测突变动物的血液缺陷和基因改造后。
Abstract
构成脊椎动物成熟血液的细胞血统的多样性源于造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的分化。这是一个关键的过程，发生在生物体的整个生命周期，在胚胎生成过程中涉及的分子通路的中断可能会有灾难性的长期后果。由于种种原因，斑马鱼（达尼奥·雷里奥）已成为研究造血症的模型生物体。斑马鱼胚胎在外部发育，到受精后7天（dpf）已经产生了大部分最终血细胞的亚型，这些亚型将持续一生。已开发出评估造血细胞数量的检测方法，主要利用特定的组织学污渍、原位杂交技术和转基因动物的显微镜，利用血细胞特异性促进剂推动荧光蛋白的表达。然而，大多数染色检测和原位杂交技术不能准确量化存在血细胞的数量：只有细胞数量的巨大差异才易于可视化。利用转基因动物和分析个人荧光或共聚焦显微镜可以执行，但这些检测的量化依赖于手动计数或使用昂贵的成像软件，这两者都可能出错。开发评估血细胞数量的其他方法将经济、更快，甚至可以自动化，以快速评估CRISPR介导的基因改造、莫索利诺介导的转录减少以及大规模影响造血症的药物化合物的影响。这种对血细胞进行量化的新型检测方法是分离整个斑马鱼胚胎并分析存在荧光标记的血细胞的数量。这些检测结果应允许阐明在胚胎生成过程中负责血细胞生成、扩张和调节的分子通路，从而使研究人员能够进一步发现血液疾病期间改变的新因素，以及脊椎动物造血过程中必不可少的通路。
Introduction
血液生产（造血）是一个基本的发育过程，首先开始于早期胚胎。这个过程从直接从中皮产生原始红血球和巨噬细胞开始，然后转向造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的产生。这些干细胞是多能的，在生物体中产生所有成熟的血细胞品种。该系统能够自我更新，通过这些 HSPC 不断补充。虽然这个过程在发育早期就开始了，但造血症继续为动物的生命服务，提供将氧气输送到身体的遥远部位、受伤后止血和保护身体免受感染的能力。这种复杂系统的发展在发育过程中被暂时和空间控制，血细胞生产中的任何扰动都可能对生物体造成灾难性后果，导致贫血、血小板下降、白血病和白血病。
用于造血研究的一种流行的动物模型是斑马鱼（Danio rerio），因为它们与人类有相似的血液发育。事实上，在造血过程中使用的许多基因和分子通路在整个脊椎动物进化过程中都得到了保护，使我们能够通过研究斑马鱼来了解人类的基因。重要的是，斑马鱼胚胎在体外发育，并在7天内产生最成熟的血细胞类型，从而能够在短时间内直接可视化造血系统。斑马鱼也是极其肥肉的，这使得研究人员能够在短时间内观察到更多的样本，这对生成可重复的数据也很重要。斑马鱼的短代时间和外部发展提供了更容易操纵和观察在诱变研究1，2，3，4，5和药物筛选6，7，8，9，10。这使得一组有希望的治疗人类血液疾病的化合物能够快速有效地进行测试。
重要的是，斑马鱼在基因上也是适宜的，基因组是测序和注释的。这种可牵引性允许进行反向遗传学技术，如莫索利诺-（MO-）调解的击倒和CRISPR介质的基因消融。斑马鱼也证明了它们作为执行前瞻性基因筛选的模型的效用：以这种方式发现了许多涉及脊椎动物血液形成的基本基因和途径。斑马鱼还开发了许多观察血细胞的方法。虽然存在传统的病理染色技术，但也可以对血液特异性成绩单进行原位杂交。重要的是，许多转基因鱼类线也存在，荧光蛋白是由血统特定的促进者表达的，允许用荧光蛋白11标记特定的血细胞。这样，研究人员可以随着时间的推移对活体体内的血细胞起源、扩张和调节进行最新观察。
总体而言，造血系统的保存、转基因线的存在和易于开发、易于可视化和短代时间，使斑马鱼成为经济、快速、适应性的造血模式。为了改进斑马鱼研究人员可用的技术工具箱，我们开发了这种检测方法，以有力地量化胚胎中的血细胞数量。该方法包括消化转基因动物和对荧光血球进行流动细胞测量。这样，可以快速、可重复地对突变动物的血细胞、MO和CRISPR改性的影响以及小分子的效果进行定量分析。这些检测是用户友好和经济的方式来列举血细胞，允许检查其生成，增殖和维护随着时间的推移。
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Protocol
加州州立大学奇科分校机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 顾问委员会批准了以下所有方法。
注：建议用1-苯2-硫酸酯（PTU） 治疗胚胎：表1）在 24 小时受精后 （hpf）， 以防止色素化， 通过流动细胞学对荧光歧视产生负面影响。下面列出的所有程序对于流动细胞测量和荧光激活细胞分类 （FACS） 都是可以接受的。但是，如果一个人的目标是在 FACS 之后培养造血细胞，那么在处理样品时要坚持无菌做法。漂白和以无菌方式准备胚胎样本的议定书已经描述过12。
1. 48 hpf 斑马鱼胚胎的减压
- 胚胎（至少5个，但不超过200个胚胎）在10厘米的塑料培养皿中，倾斜的菜，使胚胎下沉到底部边缘。
注意：通过取下盘子的盖子并将盖子放在培养皿的一边下，很容易使盘子倾斜。 - 删除并丢弃尽可能多的E3介质（表1），并添加500μL的减速蛋白酶（10毫克/mL）。在室温下孵育5分钟。
- 5分钟后，拿起培养皿（将所有胚胎放在盘子底部边缘），轻轻敲击培养皿的侧面，让胚胎轻轻地摩擦盘子底部，完全去除胆汁。
- 用挤压瓶，加入~20 mL的E3介质稀释蛋白酶。允许胚胎通过去除来稳定并去除E3介质。
- 重复步骤 1.4 3x 以去除脱脂蛋白酶的所有痕迹。
注：要分析每个样本，至少需要 5 个胚胎。这种去矮化程序可以容纳多达200个胚胎每培养皿。样本可在此阶段分组，如果需要，稍后可分离。或者，手动减压可以通过用制表师的钳子轻轻撕裂胆汁来执行。当胚胎数量很少时，这是有利的。通常斑马鱼会孵化出72马力。然而，严重畸形的胚胎可能不会，之后将需要去矮化（手动或化学）。
2. 为分离准备胚胎样本
- 使用P1000移液器，将5−10个胚胎放入一个1.5 mL微中微管中。
- 使用移液器拆下 E3 介质并丢弃。
注意：在以下步骤中，作为胚胎小心的 Pipette 很容易被丢弃。 - 在E3介质中加入1mL的10m二恶英（DTT），去除胚胎斑马鱼11、12、13、14周围的粘液涂层。水平放置微中心管，在室温下孵育30分钟。
3. 胚胎分离
- 用 1 mL 的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 与 Ca2+ 和 Mg2 + 清洗胚胎 3 倍，以去除 DTT 的痕迹。上次洗涤后添加 500 μL 的 DPBS 与 Ca2+ 和 Mg2+ 和 5 μL 的 5 毫克/mL （26 U/mL） 分离蛋白酶。
注意：其他异构缓冲解决方案可以使用，但它们必须包含 Ca2+ 和 Mg2+ 才能使分离酶正常工作。 - 在水平轨道摇床上以 37 °C 的速分在 185 rpm 上孵化样品 60 分钟。用P1000移液器修剪胚胎，直到样品完全分离。
注意：注意不要过度摄入胚胎：一些固体组织应该存在，它不应该是完全同质的。有可能过度发育，这将破坏在流动细胞仪上观察的目标血细胞（补充图1）。
注：此程序最适合 48−72 hpf 胚胎。后期阶段可能需要更长的孵育与分离蛋白酶。不同阶段的时间必须根据经验确定。有更快的替代方法分离胚胎组织，但它的经验发现，这种方法，虽然它需要60分钟，是温和和彻底的，足以让活造血细胞的有效隔离。
4. 为流动细胞学准备分离的胚胎
- 将5分离的胚胎移到5mL聚苯乙烯圆底管的顶部储层上，并带有35μmM细胞过滤器盖。
- 通过在含有过滤细胞的 5 mL 聚苯乙烯管的过滤器盖中加入 4 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），无 Ca2+ 或 Mg2+ 来冲洗细胞。
注意：其他异构缓冲解决方案也可能被使用，但它们应该缺乏Ca2+ 或Mg2+ 来稀释并使分离酶无效。 - 离心管在 4 °C 和 300 x g 5 分钟内颗粒细胞。使用移液器，取出并丢弃超自然。在 500μL 的 PBS 中重新插入细胞（无 Ca2+ 或 Mg2+）。
5. 流动细胞测量
- 轻轻旋涡细胞悬架，并添加1：1，000红色死细胞污渍（材料表）。
注：红色死细胞污渍是一种细胞渗透染料，允许将死细胞和碎片排除在目标细胞之外，是用于死细胞歧视的绝佳染料选择，因为它被 633 nm 激光激发，这与用于激发常见荧光素（如绿色荧光蛋白 （GFP） 和 DsRed） 的 488 nm 激光不同。这样，死细胞和转基因血细胞没有光谱重叠。1毫克/mL 的碘化物 （PI） 是红色死细胞污渍的廉价替代品，但请务必保留一些仅用 PI 染色的样品以及仅带有感兴趣的氟化物的样品，以设置仪器补偿。否则，PI 和氟磷（如 GFP）的信号将重叠，导致误报结果。如果流动细胞仪也有405纳米激光，其他染料，如蓝色爸爸细胞污渍也是一个很好的选择。
注意：在分析血细胞时，请注意，30分钟后，某些细胞类型将开始对红色死细胞污渍进行噬菌体酶。在添加染料后 30 分钟内分析并执行流动细胞测量，使细胞免受光线和冰层的保护。 - 流细胞分析
注：每个流量细胞仪都略有不同，但以下步骤将有助于为大多数机器的分析准备样本。对于新流细胞测量的用户，请征求特定设备专家的意见。以下说明涉及 BD 法斯卡里亚融合流细胞仪。- 打开细胞仪，让激光加热20分钟。空废水箱，用适当的溶液填充护套罐（根据流量细胞计变化），并启动流体系统。
注意：对于每种类型的流量细胞仪通常有一个特定的启动程序：仔细遵循启动程序。 - 在分析软件中，绘制五个绘图（图 1A）。
- 在 y 轴上的 x 轴和侧散射 （SSC） 上测量第一个点图测量向前散射 （FSC）。将FSC设置为线性和SSC作为日志。
注：FSC 是细胞大小的测量，SSC 是颗粒度的测量：这将允许从碎片中分离细胞。胚胎斑马鱼血细胞种群的大小和粒度与15年前描述的成年斑马鱼血细胞不同。相反，它们会与所有其他消化过的胚胎细胞一起出现在同一种群体中。 - 设置第二个图来检查 FSC 高度 （H） 与 FSC 宽度 （W）。设置第三个绘图以测量 SSC （H） 与 SSC （W）。
注意：此步骤用于排除双倍（当它们通过激光时粘在一起的细胞）。 - 设置第四个点图来测量 x 轴上的红色死细胞污渍（取决于细胞计，这通常相当于用于全噬菌素 [APC]） 和 y 轴上的 SSC 的过滤器。这将允许对死细胞中的活细胞进行区分。
注意：每个细胞计的滤光片集可能有所不同。确保使用正确的检测过滤器对死细胞歧视染料。 - 第五个情节测量选择的氟。将此可视化为氟酚的直方图（图1），或使用点图 （补充图 2）。
注意：当检查同一动物中的多个氟磷时，建议使用点图同时查看两个参数。如果氟磷有机会相互重叠（补充图2），也建议使用点图。使用区域 （A） 设置计算细胞仪激光脉冲产生的曲线下的所有参数的区域，因为它们更准确。
- 在 y 轴上的 x 轴和侧散射 （SSC） 上测量第一个点图测量向前散射 （FSC）。将FSC设置为线性和SSC作为日志。
- 加载样品并降低流速，使样品不会很快用完。调整 FSC 和 SSC 设置，以便清楚地看到大部分细胞群（图 1A）。
- 在细胞群周围画一个门，并给细胞贴上标签。确保第二个点图被封在单元格上，通过先在 FSC 上加盖，然后在 SSC 单上门禁双倍。
- 在第四个情节调整红色死细胞污渍设置，以便有明显的负人口。在这些细胞周围画一个门，并给它们贴上活细胞的标签。在第五个情节，在活细胞的门和检查氟阴性和正细胞。在正细胞周围画一扇门。
注意：此分层门控策略检查位于活细胞门的单氟+ 细胞，该细胞也位于细胞门中。小心正确设置门。这些门可以根据实验进行定制。 - 运行每个样本，收集至少 25，000 个活细胞事件。
- 按照关闭程序关闭流体。重新填充护套罐并清空废料箱。
注意：当蛋白质表达低或细胞数量稀少时，通常很难可视化氟+ 细胞。为了确保参数设置得当，氟-兄弟姐妹胚 胎应与适当绘制门和调整激光电压（补充图2）一起准备。如果目标细胞群很少，则收集超过 25，000 个事件。有了5−10个消化过的动物，人们应该能够收集到数百万个事件。氟+细胞 的总数也可以通过这些数据获得。只需用血细胞仪计算样本中的细胞总数，并乘以氟化物+ 细胞的百分比，即可获得每条鱼的氟+ 细胞的绝对数量。
- 打开细胞仪，让激光加热20分钟。空废水箱，用适当的溶液填充护套罐（根据流量细胞计变化），并启动流体系统。
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Representative Results
为了列举胚胎斑马鱼中的红血球 ，lcr：GFP16 胚胎在单细胞阶段与 PBS、7.0 ng/nL ism1 MO 或 7.0 ng/nL ism1 MO 与 7.0 ng ism1 mRNA12一体注射。在48马力时，他们被消化并接受流动细胞学分析。在分析每个样本中的GFP+ 红血球百分比后（每个样本是5个随机选择的胚胎; 图1A），计算了所有对照组的平均值。此平均值设置为 1，并且所有百分比都是从该参考点计算的。这些数据表明，用特定 MO 减少 ism1 成绩单会减少 48 hpf 胚胎中 GFP+ 红血球的数量。此外，用外源性mRNA挽救这种 减少的ism1 水平使红血球的数量恢复正常。
图1： ism1 MO减少了胚胎生成过程中产生的红血球数量。 （A） lcr： GFP16胚胎注射了 PBS 并进行了流动细胞学分析。首先，确定大小和粒度，并在感兴趣的细胞群（细胞，左面板）周围绘制一个门。然后，对 FSC H 和 FSC W 进行了评估，以消除粘在一起的细胞（单体 FSC）。还对SSC H和W进行了评估，以减少评估粘在一起的细胞（单体SSC）的可能性。然后检查红荧光以确定活细胞（活细胞）。最后，对活细胞进行了GFP荧光检查（右面板）。（B） lcr： GFP12胚胎注射 PBS （控制， 圆圈）， ism1 MO（ism1 MO， 正方形）， 或ism1 MO + ism1 mRNA12 （救援， 三角形） 在单细胞发育阶段。48小时后，他们被收集，消化，并接受流细胞测量，如面板A所示。每个点代表五个随机选择的单独胚胎。折叠变化是通过取取控制样本中 GFP+细胞的平均百分比并将其设置为1来计算的。所有其他样本都与该平均值进行比较。*p&0.005，和N.S.=不重要。请单击此处查看此图的更大版本。
| 溶液 | 成分 | 笔记 |
| E3 介质 （50x） | 14.61 克的 NaCl， 0.63 克的 Kci， 1.99 克的 Mgso4[7H2O， 1.83 克的卡克2[2h2O | 在 2 升分级气缸中，加入原料和足够的蒸馏水，使总容量达到 1 升。 |
| E3 介质 （1x） | 50x E3的40mL | 在 2 升分级气缸中，加入足够的蒸馏水，使总容量达到 2 升。 |
| 1-苯-2-硫利亚（PTU）在E3介质 | 40毫升的50倍E3在2L瓶，40毫克的PTU | 在 2 升分级气缸中，加入足够的蒸馏水，使总容量达到 2 升。 搅拌至少2天，以完全溶解PTU。 |
表1：解决方案的食谱。
补充图1：消化与分离蛋白酶的胚胎。10个胚胎未正确消化（左;未消化）、充分消化后（中;消化）和过度消化（右;消化过度）的图像。请单击此处下载此图。
补充图2：对5个dpf胚胎中的两种荧光素进行评估。盖茨被吸引来评估FSC和SSC，以确定感兴趣的细胞群（细胞，左列），评估单体（未显示），以确定活细胞（活，中柱）和荧光表达（mpx：GFP17和gata1:D红15）。首先，大门设置在没有氟磷（上排）的动物身上。然后mpx：GFP+（没有gata1:D红）动物被评估为设置门和补偿GFP（第二排）。加塔 1:D红+ （没有mpx：Gfp） 动物被评估设置大门和补偿 DsRed （第三排） 。最后，这两种颜色可以在mpx：GFP+和gata1:D Red+的双正动物中进行评估。请单击此处下载此图。
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Discussion
斑马鱼是研究原始和明确的脊椎动物造血的优良模型系统。在过去的几十年里，已经开发和完善了多种检测方法，使斑马鱼成为测试药物、生成和测试基因突变体的快速和经济模型，并总体上使研究人员能够分析造血所必需的分子通路。该协议利用胚胎斑马鱼，它允许快速的数据收集，使用比成年动物更少的物理空间，并使用更少的药物用于大型化学屏幕。它还允许在mRNA过度表达、产生CRISPR突变体和MO诱导的转录减少后进行量化，以改变早期胚胎发育过程中发生的特定遗传途径。重要的是，它允许敏感，强大的血细胞量量化，这是很难做到的原位杂交或组织学染色技术。
此分析是灵活的，可以修改以回答许多研究问题。可以对此协议进行一次修改，通过该协议操纵动物的发育阶段来量化不同的血细胞类型。例如，红血球在斑马鱼发育早期就出现，而lcr：GFP 16转基因线等转基因动物早在16-somite阶段就可以被检测出来。然而，如果一个人有兴趣研究血栓细胞，itga2b：GFP18（也称为cd41：GFP）转基因线开始以48马力f表达GFP，成熟循环血栓细胞在72马力下观察到。如果一个人希望用这种检测来量化B细胞，那么它可以与ighm：EGFP19转基因动物一起进行，接近20dpf。 重要的是，这种检测也可以用来跟踪血细胞随着时间的推移。例如，通过分析lcr：GFP+细胞的数量在24马力，48马力，72马力，人们可以确定，如果基因改造（或药物）是调节红血球的维持，而不是只是他们的一代。
这些检测结果允许研究人员通过在单细胞发育阶段注射mRNA来减少CRISPR或MOs或过度表达基因表达的基因表达，并准确比较这些改性胚胎中产生的血细胞数量。应始终注意同时对这些实验进行适当的控制，给兄弟姐妹动物注射非特异性指南RNA或不匹配的MOs，并与实验组一起检查它们的血液。发展阶段至关重要：在发育过程中仅仅几个小时的改变可能显示胚胎中存在大量不同的血细胞。换句话说，在比较胚胎时，一定要仔细监测发育时间。为了确保胚胎与年龄匹配，应利用形态学线索。在早期胚胎中，考虑将草本计入年龄匹配。在开发后期，其他标记，如心脏跳动的开始，体囊的大小，或身体的长度，可以用来匹配修改后的鱼的阶段，以控制鱼。此外，从消化的胚胎中可以列举出总细胞的数量，以确保实验和控制动物中存在相同数量的细胞。除了使用这些检测来检查基因改造，这些检测也可以修改，以执行大规模的药物筛选。胚胎在发育过程中可以暂时暴露在不同浓度的化合物中，看看这些化学物质是否对造血有任何影响。如果实验旨在测试特定药物的效果，那么仅使用车辆治疗的动物也应作为控制措施进行。通过这些方法，研究人员可以确定特定基因或信号通路的增益或功能丧失是否在造血症中起着至关重要的作用。
在检查不同的转基因基因时，必须优化每个样本消化的动物数量：动物太少可能会产生很少或根本没有荧光。在检查特定时间点不丰富的 HSP 时尤其如此。在检查转基因物质时，也至关重要，因为转基因的驱动荧光剂较弱。为了抵消这些问题，需要更多的动物（因此，更多的细胞）需要精确计数。在改变发育阶段时，优化消化时间也至关重要。此协议针对每管 5 个单独的 48 hpf 胚胎进行优化。消化更成熟的胚胎可能需要更长的时间。
在手术过程中可能会出现一些潜在的问题。如果没有荧光观察，可能会有一个技术问题与细胞仪，需要解决。因此，在开始手术之前，必须通过在显微镜下快速检查胚胎来验证胚胎是否为荧光。另一个常见的问题是过度消化胚胎，这会破坏细胞。在消化步骤时小心，如果观察到太多死细胞，请更改时间。
这些分析有几个局限性。最大的问题是，这些检测依赖于转基因标记的表达。转基因标记表达的改变可能无法反映胚胎中正在发生的事情的生物学。此外，如果目标细胞数量极低，流动细胞测量可能不是量化细胞的最佳方法。为了处理这些可能性，可以使用其他检测方法，如原位或组织学染色技术。如果存在特定的抗体，也可以进行感兴趣的细胞类型的免疫组织化学。胚胎也可以受 qRT-PCR 测量血统特定基因，如果这些检测在 FACS 机器上执行，细胞可以单独分离和研究，使用更敏感的方法。排除这些问题，这种定量流细胞测定可以为研究人员生成大量有用的信息。
通过这些检测，研究人员可以很容易地观察脊椎动物的造血缺陷。使用 MOs 或 CRISPR 修改遗传通路，然后执行流动细胞测量，以阐明该基因是否在造血症中发挥作用，可以快速完成，并且是定量的。此外，可以进行前瞻性基因筛查（只要动物有荧光标签），并评估缺陷。斑马鱼也成为大规模药物筛选6，7，8，9，10的优良模型，使有效的药物筛选检测活生物体观察药物是否有效，以及它们是否对发育/生存有负面影响。将这种检测方法与机器人增强的自动流动细胞测量技术结合，将使其更加高效，从而能够真正大规模地分析和筛选在血细胞起源、生长和调控中仍然模糊不清的途径。
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Disclosures
D.L.S.是一名科学顾问，并得到了无鳍食品公司和Xytogen生物技术公司的赔偿，K.F.R.公司宣布没有竞争利益。
Acknowledgments
资金由国家卫生研究院（NIH：R15 DK114732-01到D.L.S.）、国家科学基金会（NSF：MRI 1626406到D.L.S.）以及加州州立大学奇科分校的荣誉项目（到K.F.R.）提供。作者感谢贝西·塔米埃蒂的实验室管理和凯西·约翰斯的行政援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
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