Summary
Denna analys är en enkel metod för att kvantifiera hematopoetiska celler för att utveckla embryonala zebrafiskar. Blodkroppar från dissocierade zebrafiskar utsätts för flödescytometrianalys. Detta gör det möjligt att upptäcka bloddefekter hos muterade djur och efter genetisk modifiering.
Abstract
Mångfalden av cellstammar som består av moget blod hos ryggradsdjur härrör från differentiering av hematopoetiska stam- och stamceller (HSPCs). Detta är en kritisk process som sker under organismers hela livslängd, och störningar av de molekylära vägarna som är involverade under embryogenes kan få katastrofala långsiktiga konsekvenser. Av en mängd olika skäl har zebrafisk (Danio rerio) blivit en modellorganism för att studera hematopoiesis. Zebrafiskembryon utvecklas externt, och med 7 dagar efter efterfertilisering (dpf) har producerat de flesta subtyperna av definitiva blodkroppar som kommer att kvarstå under sin livstid. Analyser för att bedöma antalet hematopoetiska celler har utvecklats, främst med hjälp av specifika histologiska fläckar, in situ hybridiseringstekniker och mikroskopi av transgena djur som använder blodcellsspecifika promotors som driver uttrycket av fluorescerande proteiner. De flesta färgningsanalyser och hybridiseringstekniker på plats kvantifierar dock inte exakt antalet närvarande blodkroppar. Endast stora skillnader i cellantal visualiseras enkelt. Att använda transgena djur och analysera individer med fluorescerande eller konfokal mikroskopi kan utföras, men kvantifieringen av dessa analyser förlitar sig på att antingen räkna manuellt eller använda dyr bildprogramvara, som båda kan göra fel. Utveckling av ytterligare metoder för att bedöma blodcellsnummer skulle vara ekonomisk, snabbare och kan till och med automatiseras för att snabbt bedöma effekten av CRISPR-medierad genetisk modifiering, morpholino-medierad transkriptionsminskning och effekten av läkemedelsföreningar som påverkar hematopoiesis i stor skala. Denna nya analys för att kvantifiera blodkroppar utförs genom att dissociera hela zebrafiskembryon och analysera mängden fluorescerande märkta blodkroppar som finns. Dessa analyser bör möjliggöra klargörande av molekylära vägar som ansvarar för blodcellsgenerering, expansion och reglering under embryogenes, vilket gör det möjligt för forskare att ytterligare upptäcka nya faktorer som förändrats under blodsjukdomar, liksom vägar som är väsentliga under utvecklingen av ryggradsdjur hematopoiesis.
Introduction
Blodproduktion (hematopoiesis) är en viktig utvecklingsprocess som först börjar i det tidiga embryot. Denna process börjar med att generera primitiva röda blodkroppar och makrofager direkt från mesoderm, och skiftar senare mot produktion av hematopoetiska stam- och stamceller (HSPCs). Dessa stamceller, som är multipotenta, genererar alla sorter av mogna blodkroppar i organismen. Systemet kan förnya sig själv och fylls kontinuerligt på via dessa HSPC:er. Medan denna process börjar tidigt i utvecklingen, fortsätter hematopoiesis för djurets liv, vilket ger möjlighet att transportera syre till avlägsna platser i kroppen, att sluta blöda efter skada och att skydda kroppen från infektion. Utvecklingen av detta komplexa system kontrolleras tidsmässigt och rumsligt under utveckling och eventuella förändringar i blodcellsproduktionen kan vara katastrofala för organismen, vilket resulterar i anemi, trombocytopeni, leukopeni och leukemi.
En populär djurmodell som används för hematopoetisk forskning är zebrafisken (Danio rerio) eftersom de har liknande blodutveckling jämfört med människor. Faktum är att många av de gener och molekylära vägar som används under hematopoiesis bevaras genom hela ryggradsdjursutvecklingen, så att vi kan lära oss om mänskliga gener genom att studera zebrafisk. Viktigt är att zebrafiskembryon utvecklas utanför kroppen och inom 7 dagar har genererat de flesta mogna blodcellstyper, vilket möjliggör direkt visualisering av det hematopoetiska systemet på kort tid. Zebrafisk är också extremt fecund, vilket gör det möjligt för forskare att observera ett större antal prover på kort tid, vilket också är viktigt för att generera reproducerbara data. Zebrafiskens korta generationstid och externa utveckling ger lättare manipulering och observation under mutagenesstudier1,2,3,4,5 och läkemedelsscreening6,7,8,9,10. Detta gör det möjligt att snabbt och effektivt testa en panel av lovande terapeutiska föreningar för mänskliga blodsjukdomar.
Viktigt är att zebrafisk också är genetiskt mottaglig, och genomet är sekvenserat och kommenterat. Denna kantbarhet gör det möjligt att utföra omvända genetiktekniker som morpholino- (MO-) medierad knockdown och CRISPR-medierad genetisk ablation. Zebrafisk har också bevisat sitt användbarhet som modell för att utföra framåtriktade genetiska skärmar; många viktiga gener och vägar som är involverade i ryggradsdjur blod bildas har upptäckts på detta sätt. Många metoder för att observera blodkroppar har också utvecklats i zebrafisk. Medan traditionella histologiska färgningstekniker finns, är det också möjligt att utföra in situ hybridisering för blodspecifika transkriptioner. Det är viktigt att det finns många transgena fiskartlinjer där fluorescerande proteiner uttrycks av härstamningsspecifika promotors, vilket gör det möjligt att märka specifika blodkroppar med fluorescerandeproteiner 11. Detta gör det möjligt för forskare att utföra den snabba observationen av blodcellsuppkomst, expansion och reglering i en levande organism över tid.
Sammantaget har bevarandet av det hematoopoetiska systemet, närvaron och den enkla utvecklingen av transgena linjer, enkel visualisering och kort generationstid gjort zebrafisken till en ekonomisk, snabb och anpassningsbar modell av hematopoiesis. För att förbättra verktygslådan med tekniker tillgängliga för zebrafiskforskare utvecklade vi denna analys för att robust kvantifiera antalet blodkroppar i embryon. Metoden innebär att smälta transgena djur och utföra flödescytometri för fluorescerande blodkroppar. På detta sätt kan blodkroppar från muterade djur, effekten av MO- och CRISPR-modifiering och effekten av små molekyler kvantitativt analyseras på ett snabbt och reproducerbart sätt. Dessa analyser är användarvänliga och ekonomiska sätt att räkna upp blodkroppar, vilket möjliggör undersökning av deras generation, spridning och underhåll över tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) rådgivande nämnd vid California State University, Chico, godkände alla metoder som beskrivs nedan.
OBS: Det rekommenderas att behandla embryon med 1-fenyl 2-thiourea (PTU; Tabell 1) vid 24 timmars postfertilisering (hpf) för att förhindra pigmentering som negativt påverkar fluorescensdiskriminering genom flödescytometri. Alla procedurer som listas nedan är acceptabla för flödescytometri och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Men om ens mål är att odla de hematopoetiska cellerna efter FACS, följ sedan sterila metoder vid bearbetning av prover. Protokollet för blekning och beredning av embryoprover på sterilt sätt har beskrivits tidigare12.
1. Dechorionation av 48 hpf zebrafiskembryon
- Med embryon (minst 5, men högst 200 embryon) i en 10 cm plast petriskål, luta skålen så att embryona sjunker till bottenkanten.
OBS: Det är lätt att luta skålen genom att ta bort locket och placera locket under ena kanten av Petri-skålen. - Avlägsna och kassera så mycket E3-medium (tabell 1) som möjligt och tillsätt 500 μL av dechorionation protease (10 mg/ml). Inkubera i rumstemperatur i 5 min.
- Efter 5 min, plocka upp Petri-skålen (håll alla embryon i bottenkanten av plattan) och knacka försiktigt på sidan av Petri-skålen, så att embryon försiktigt kan gnugga mot botten av plattan för att helt ta bort chorions.
- Tillsätt ~20 ml E3 medium för att späda ut proteasen med en klämflaska. Låt embryon sätta sig och ta bort E3-mediet genom att dekantera.
- Upprepa steg 1,4 3x för att ta bort alla spår av dechorionation protease.
OBS: För varje enskilt prov att analysera krävs minst 5 embryon. Denna dechorionation procedur kan rymma upp till 200 embryon per Petri maträtt. Prover kan grupperas i detta skede och separeras senare om så önskas. Alternativt kan manuell dechorionation utföras genom att försiktigt riva käkarna med urmakarens tång. Detta är fördelaktigt när det finns ett litet antal embryon. Vanligtvis kommer zebrafisk att kläcka från sina chorions med 72 hkf. Allvarligt missbildade embryon kanske dock inte, och kommer att kräva dechorionation (antingen manuell eller kemisk) efter den tiden.
2. Beredning av embryoprover för dissociation
- Använd en P1000-pipett och placera 5−10 embryon i ett enda 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Ta bort E3 medium med en pipett och kassera.
VARNING: Pipett med försiktighet eftersom embryon lätt kan kasseras under följande steg. - Tillsätt 1 ml 10 mM dithiothreitol (DTT) i E3 medium för att ta bort slembeläggningen som omger den embryonalazebrafisken 11,12,13,14. Lägg mikrocentrifugröret horisontellt och inkubera i rumstemperatur i 30 minuter.
3. Embryodisociation
- Tvätta embryona 3x med 1 ml av Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) med Ca2+ och Mg2+ för att avlägsna spår av DTT. Efter den sista tvätten tillsätt 500 μL DPBS med Ca2+ och Mg2+ och 5 μL på 5 mg/ml (26 U/ml) dissociationsproteas.
OBS: Andra isotonbuffrade lösningar kan användas, men de måste innehålla Ca2+ och Mg2+ för att dissociationsenzymet ska fungera korrekt. - Inkubera prover vid 37 °C på en horisontell orbital shaker vid 185 varv/min i 60 minuter. Triturate embryon med en P1000 pipett tills proverna är helt dissocierade.
VARNING: Var försiktig så att embryona inte översmälts; viss fast vävnad bör finnas, och den bör inte vara helt homogen. Det är möjligt att överdigna, vilket kommer att förstöra de målblodceller som ska observeras på flödescytometern (Kompletterande figur 1).
OBS: Denna procedur fungerar bäst för 48−72 hpf embryon. Senare steg kan kräva längre inkubation med dissociation protease. Tidpunkten för olika steg måste bestämmas empiriskt. Det finns snabbare alternativa metoder för att skilja embryonal vävnad, men det finns empiriskt att denna metod, även om det tar 60 minuter, är tillräckligt mild och noggrann för att möjliggöra effektiv isolering av levande hematopoetiska celler.
4. Beredning av dissocierade embryon för flödescytometri
- Pipett de 5 dissocierade embryona på den övre behållaren i ett 5 ml polystyren runt bottenrör med ett 35 μmM cellsillock.
- Skölj cellerna genom att tillsätta 4 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan Ca2+ eller Mg2+ till sillocket på 5 ml polystyrenrör som innehåller de filtrerade cellerna.
OBS: Andra isotonbuffrade lösningar kan också användas, men de bör sakna Ca2+ eller Mg2+ för att späda ut och göra dissociationsenzymet ineffektivt. - Centrifugrör vid 4 °C och 300 x g i 5 minuter för att pelleta cellerna. Ta bort och kassera supernatanten med en pipett. Återanvänd cellerna i 500 μL PBS (utan Ca2+ eller Mg2+).
5. Flödescytometri
- Virvel försiktigt cellupphängningen och tillsätt 1:1 000 röd död cellfläck(Materialförteckning).
OBS: Den röda döda cellfläcken är ett cellpermeabelt färgämne som gör det möjligt att utesluta döda celler och skräp från målceller och är ett utmärkt val av färgämne för död celldiskriminering, eftersom det är upphetsad av 633 nm laser, som skiljer sig från 488 nm laser som används för att excite vanliga fluorforer såsom grönt fluorescerande protein (GFP) och DsRed. På detta sätt finns det ingen spektral överlappning från döda celler och transgena blodkroppar. Propidium jodid (PI) vid 1 mg/ml är ett billigt alternativ till den röda döda cellfläcken, men se till att reservera några prover färgade endast med PI samt prover endast med fluoror av intresse för att ställa in instrumentkompensationen. Annars kommer signalerna från PI och fluorforer som GFP att överlappa varandra, vilket resulterar i falskt positiva resultat. Om flödescytometern också har en 405 nm laser är andra färgämnen som blå pappacellsfläck också ett utmärkt val.
VARNING: Vid analys av blodkroppar, observera att efter 30 min kommer vissa celltyper att börja faagocytose den röda döda cellfläcken. Håll cellerna skyddade mot ljus och is tills de analyseras och utför flödescytometri inom 30 minuter efter tillsats av färgämnet. - Analys av flödescytometri
OBS: Varje flödescytometer är lite annorlunda, men följande steg hjälper till att förbereda prover för analys på de flesta maskiner. För användare som är nya att flöda cytometri, sök råd från någon som är expert på den specifika utrustningen. Följande instruktioner gäller BD FACSAria Fusion flöde cytometer.- Sätt på cytometern och låt lasrarna värmas upp i 20 minuter. Töm avfallstank, fyll mantsketanken med lämplig lösning (varierar beroende på flödescytometer) och starta fluidiksystemet.
OBS: Det finns vanligtvis ett särskilt startförfarande för varje typ av flödescytometer; följ den startproceduren noggrant. - Rita fem diagram i analysprogramvaran (figur 1A).
- Låt det första punktdiagramt mäta framåtspridning (FSC) på x-axeln och sidospridningen (SSC) på y-axeln. Ange FSC som linjärt och SSC som logg.
OBS: FSC är ett mått på cellstorlek, och SSC är ett mått på granularitet; Detta kommer att möjliggöra diskriminering av celler från skräp. Embryonala zebrafiskblodcellspopulationer separerar inte efter storlek och granularitet på samma sätt som vuxna zebrafiskblodceller som beskrivits tidigare15. Istället kommer de att visas i samma population med alla andra smälta embryonala celler. - Ställ in det andra området för att undersöka FSC-höjd (H) kontra FSC-bredd (W). Ställ in det tredje måttet för att mäta SSC (H) kontra SSC (W).
OBS: Det här steget används för att utesluta dubblettar (celler som sitter ihop när de passerar genom lasern). - Ställ in det fjärde punktdiagrammet för att mäta den röda döda cellfläcken på x-axeln (beroende på cytometern är detta vanligtvis likvärdigt med filtret som används för allofykocyanin [APC]) och SSC på y-axeln. Detta kommer att möjliggöra diskriminering av levande celler från döda celler.
OBS: Filteruppsättningarna för varje cytometer kan vara olika. Se till att använda rätt detekteringsfilter för färgämnet för dödcellsdiskriminering. - Den femte tomten mäter valets fluorofor. Visualisera detta som ett histogram av fluorforen(figur 1)eller använd ett punktdiagram (Kompletterande figur 2).
OBS: Vid undersökning av mer än en fluorfor i samma djur rekommenderas att du använder ett prickdiagram för att se båda parametrarna samtidigt. Om det finns någon chans att fluorforerna har spektral överlappning med varandra (Kompletterande figur 2), rekommenderas också ett punktdiagram. Använd inställningarna för område (A) för att beräkna området under kurvan som genereras av cytometerns laserpuls för alla parametrar, eftersom de är mer exakta.
- Låt det första punktdiagramt mäta framåtspridning (FSC) på x-axeln och sidospridningen (SSC) på y-axeln. Ange FSC som linjärt och SSC som logg.
- Ladda provet och minska flödeshastigheten så att provet inte tar snabbt. Justera FSC- och SSC-inställningarna så att huvuddelen av cellpopulationen tydligt kan ses (figur 1A).
- Rita en grind runt cellpopulationen och märk den celler. Se till att det andra prickdiagramt är inhägnat på celler, exkludera dubblettar genom att först gating på FSC och sedan på SSC-singlar.
- På den fjärde tomten justera de röda döda cellfläcksinställningarna så att det helt klart finns en negativ population. Rita en port runt cellerna och märk dem levande celler. På den femte tomten, grind på levande celler och undersöka fluorfor negativa och positiva celler. Rita en grind runt de positiva cellerna.
OBS: Denna hierarkiska gating strategi undersöker enstaka fluorfor+ celler som finns i levande celler grinden, som också finns i cellporten. Var noga med att sätta portarna ordentligt. Dessa portar kan anpassas beroende på experimentet. - Kör varje exempel och samla in minst 25 000 livecellhändelser.
- Följ avstängningsproceduren för att stänga av fluidiken. Fyll på mantlatanken och töm avfallstanken.
OBS: Det är ofta svårt att visualisera fluorfor+ celler när proteinuttrycket är lågt, eller cellpopulationen är sällsynt. För att säkerställa att parametrarna är korrekt inställda bör fluorforembryonberedas tillsammans med för att korrekt dra grindar och justera laserspänningar (Kompletterande figur 2). Om målcellpopulationen är sällsynt samlar du in mer än 25 000 händelser. Med 5−10 smälta djur bör man kunna samla miljontals händelser. Det totala antalet fluorfor+ celler kan också erhållas med dessa data. Räkna helt enkelt det totala antalet celler i provet med en hemocytometer och multiplicera procentandelen fluorfor+ celler för att få det absoluta antalet fluorforer+ celler per fisk.
- Sätt på cytometern och låt lasrarna värmas upp i 20 minuter. Töm avfallstank, fyll mantsketanken med lämplig lösning (varierar beroende på flödescytometer) och starta fluidiksystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att räkna upp röda blodkroppar i embryonal zebrafisk injicerades lcr:GFP16 embryon i encellsstadiet med PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO, eller 7, 0 ng/nL ism1 MO med 7,0 ng ism1 mRNA12. Vid 48 hpf smältes de och utsattes för flöde cytometri analys. Efter att ha analyserat procentandelen GFP+ röda blodkroppar från varje prov (varje prov är 5 slumpmässigt utvalda embryon; Figur 1A) beräknades genomsnittet för hela kontrollgruppen. Detta medelvärde fastställdes till 1, och alla procentsatser beräknades från den referenspunkten. Dessa data tyder på att minska ism1 transkription med en specifik MO minskade antalet GFP+ röda blodkroppar som finns i 48 hpf embryot. Dessutom, rädda denna minskning av ism1 nivåer med exogena mRNA återvände antalet röda blodkroppar till det normala.
Figur 1: ism1 MO minskar antalet röda blodkroppar somproduceras under embryogenes. Först bestämdes storlek och granularitet, och en grind drogs runt cellpopulationen av intresse (celler, vänster panel). Sedan utvärderades FSC H och FSC W för att eliminera celler som fastnat ihop (singlets FSC). SSC H och W utvärderades också för att minska möjligheten att utvärdera celler som fastnat tillsammans (singlets SSC). Röd fluorescens undersöktes sedan för att bestämma levande celler (levande celler). Slutligen undersöktes levande celler för GFP fluorescens (höger panel). (B) lcr:GFP12 embryon injicerades med PBS (kontroll, cirklar), ism1 MO (ism1 MO, rutor) eller ism1 MO + ism1 mRNA12 (räddning, trianglar) i ett cellstadiet av utvecklingen. Efter 48 h samlades de in, smältes och utsattes för flödescytometri som visas i panel A. Varje punkt representerar fem slumpmässigt utvalda enskilda embryon. Vikförändringen beräknas genom att ta den genomsnittliga procentandelen GFP+ celler i kontrollprovet och ställa in den som 1. Alla andra prover jämförs med det genomsnittet. *p < 0,005 och N.S. = inte signifikanta. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Lösning | Ingredienser | Anteckningar |
| E3 medium (50x) | 14,61 g NaCl, 0,63 g KCI, 1,99 g MgSO4·7H2O, 1,83 g CaCl2·2H2O | Till en 2 L graderad cylinder, tillsätt ingredienserna och tillräckligt med destillerat vatten för att få den totala volymen till 1 L. |
| E3 medium (1x) | 40 ml 50x E3 | Tillsätt tillräckligt med destillerat vatten till en 2 L graderad cylinder för att få den totala volymen till 2 L. |
| 1-Fenyl-2-thiourea (PTU) i E3 medium | 40 ml 50x E3 i en 2 L flaska, 40 mg PTU | Tillsätt tillräckligt med destillerat vatten till en 2 L graderad cylinder för att få den totala volymen till 2 L. Rör om i minst 2 dagar för att helt lösa upp PTU. |
Tabell 1: Recept på lösningar.
Kompletterande figur 1: Matsmältning av embryon med dissociationsproteas. Bilder av 10 embryon som inte smälts ordentligt (vänster; osmält), efter adekvat matsmältning (mitten; smält), och efter överskott av matsmältningen (höger; överdigesterad). Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 2: Utvärdering av två fluorforer i 5 dpf-embryon. Gates drogs för attutvärdera FSC och SSC för att bestämma cellpopulationen av intresse(celler, vänster kolumn), för att utvärdera singlets (visas inte), för att bestämma levande celler(levande,mellersta kolumn) och fluoroforuttryck (mpx: GFP17 och gata1:D sRed15). Först sattes grindar på ett djur som inte har några fluorforer (översta raden). Därefter utvärderades mpx:GFP+ (utan gata1:D sRed) djur för att ställa in portarna och kompensationen för GFP (andra raden). gata1:D sRed+ (utan mpx:GFP) djur utvärderades för att ställa in portarna och kompensation för DsRed (tredje raden). Slutligen kan de två färgerna utvärderas i dubbla positiva djur som är mpx:GFP+ och gata1:D sRed+. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafisk är ett utmärkt modellsystem för att studera primitiva och definitiva ryggradsdjur hematopoiesis. Under de senaste decennierna har flera analyser utvecklats och förfinats, vilket gör det möjligt för zebrafisk att bli en snabb och ekonomisk modell för att testa läkemedel, generera och testa genetiska mutanter och totalt sett göra det möjligt för forskare att analysera molekylära vägar som är väsentliga för hematopoiesis. Detta protokoll använder embryonala zebrafiskar som möjliggör snabb datainsamling, användning av mindre fysiskt utrymme än vuxna djur och användning av mindre droger för storskaliga kemiska skärmar. Det tillåter också kvantifiering efter överuttryck av mRNA, generering av CRISPR-mutanter och MO-inducerad transkriptionsreduktion för att ändra specifika genetiska vägar som uppstår under tidig embryonal utveckling. Viktigt är att det möjliggör känslig, robust kvantifiering av blodkroppar, vilket är svårt att göra med in situ hybridisering eller histologiska färgningstekniker.
Denna analys är flexibel och kan modifieras för att svara på många forskningsfrågor. En ändring av detta protokoll kan utföras varigenom djurets utvecklingsstadium manipuleras för att kvantifiera olika blodcellstyper. Till exempel uppstår röda blodkroppar tidigt i zebrafiskutveckling, och med transgena djur som lcr: GFP16 transgen linje kan detekteras så tidigt som 16-somitstadiet. Om man är intresserad av att studera trombocyter börjar dock itga2b:GFP18 (även känd som cd41:GFP) transgen linje uttrycka GFP vid 48 hkf, med mogna cirkulerande trombocyter observerade vid 72 hkf. Om man vill kvantifiera B-celler med denna analys kan den utföras med ighm:EGFP19 transgena djur närmare 20 dpf. Viktigt är att denna analys också kan användas för att följa blodkroppar över tid. Till exempel, genom att analysera antalet lcr: GFP+ celler vid 24 hkf, 48 hpf, 72 hpf, kan man avgöra om en genetisk modifiering (eller läkemedel) reglerar underhållet av röda blodkroppar jämfört med bara deras generation.
Dessa analyser gör det möjligt för forskare att minska genuttrycket med CRISPR eller MOs eller överuttryck genuttryck genom att injicera mRNA i ett cellstadiet av utvecklingen och noggrant jämföra antalet blodkroppar som produceras i dessa modifierade embryon. Man bör alltid vara noga med att utföra lämpliga kontroller för dessa experiment samtidigt genom att injicera syskondjur med icke-specifika RNAs eller omaka MOs och undersöka deras blod tillsammans med försöksgrupperna. Utvecklingsstadiet är kritiskt; förändringar på bara några timmar under utvecklingen kan visa mycket olika antal blodkroppar som finns i ett embryo. Med andra ord, se till att noggrant övervaka utvecklingstimmarna när du jämför embryon. För att säkerställa att embryon åldersmatchas bör morfologiska signaler användas. I tidiga embryon, överväga att räkna somiter till åldersmatchning. Senare i utvecklingen kan andra markörer som början av hjärtat slå, storleken på otic vesicle eller kroppens längd användas för att matcha stadierna av modifierad fisk för att kontrollera fisk. Dessutom kan antalet totala celler räknas upp från smälta embryon för att säkerställa att samma antal celler finns i försöks- och kontrolldjur. Förutom att använda dessa analyser för att undersöka genetisk modifiering kan dessa analyser också modifieras för att utföra storskaliga läkemedelsskärmar. Embryon kan utsättas för olika koncentrationer av föreningar tidsmässigt under utvecklingen för att se om kemikalierna i fråga har någon effekt på hematopoiesis. Om försöket är konstruerat för att testa effekten av ett visst läkemedel bör djur som endast behandlas med fordon också ingå som en kontroll. På dessa sätt kan forskare avgöra om förstärkning eller funktionsförlust av specifika gener eller signalvägar spelar en viktig roll i hematopoiesis.
Det är viktigt att antalet djur som smälts per prov optimeras vid undersökning av olika transgener. för få djur kan generera liten eller ingen fluorescens. Detta gäller särskilt när man undersöker HSPC: er som inte är rikliga vid en viss tidpunkt. Det är också kritiskt när man undersöker transgener som har svaga promotors som kör fluorescens. För att motverka dessa frågor krävs fler djur (och därmed fler celler) för exakta räkningar. Vid ändring av utvecklingsstadier är det också viktigt att optimera matsmältningstiden. Detta protokoll är optimerat för 5 enskilda 48 hpf embryon per rör. Att smälta mer mogna embryon kommer sannolikt att kräva längre tid.
Vissa potentiella problem kan uppstå under proceduren. Om det inte finns någon fluorescens observerad kan det finnas ett tekniskt problem med cytometern som måste lösas. Av denna anledning är det viktigt att kontrollera att embryona är fluorescerande innan proceduren påbörjas genom att snabbt kontrollera dem under ett mikroskop. En annan vanlig fråga är översmältning av embryona, som förstör cellerna. Var försiktig vid matsmältningssteget och ändra tidpunkten om för många döda celler observeras.
Dessa analyser har några begränsningar. Den största frågan är att dessa analyser förlitar sig på uttrycket av en transgen markör. Potentiellt kan förändringen av den transgena markörens uttryck inte återspegla biologin för vad som händer i embryot. Dessutom kan flödescytometri inte vara den bästa metoden för att kvantifiera celler om målcellspopulationen är extremt låg. För att hantera dessa möjligheter kan andra analyser som in situ eller histologiska färgningstekniker användas. Om det finns specifika antikroppar för celltypen av intresse kan immunhistokemi också utföras. Embryon kan också utsättas för qRT-PCR för att mäta härstamningsspecifika gener, och om dessa analyser utförs på en FACS-maskin kan cellerna isoleras och studeras individuellt med ännu känsligare metoder. Exklusive dessa problem kan denna kvantitativa flödescytometrianalys generera mycket användbar information för forskare.
Med dessa analyser kan forskare enkelt observera hematopoetiska defekter hos ryggradsdjur. Modifiera genetiska vägar med MOs eller CRISPR och sedan utföra flöde cytometri för att klargöra om genen spelar en roll i hematopoiesis kan göras snabbt och är kvantitativ. Dessutom kan framåt genetiska skärmar (så länge djuren har en fluorescerande tagg) utföras och defekter bedömas. Zebrafisk har också blivit en utmärkt modell för storskaligaläkemedelsskärmar 6,7,8,9,10, vilket gör det möjligt för effektiva läkemedelsscreeningsanalyser på levande organismer att observera om läkemedlen är effektiva och om de har negativa effekter på utveckling / överlevnad. Att koppla denna analys med automatiserad flödescytometriteknik förstärkt av robotteknik skulle göra den ännueffektivare 20,21,22, vilket möjliggör verkligt storskalig analys och screening av vägar som är viktiga i blodcellsuppkomst, tillväxt och reglering som förblir dunkla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.L.S. är en vetenskaplig konsult och har fått ersättning från Finless Foods, Inc. och Xytogen Biotech, Inc. K.F.R. förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Finansiering tillhandahölls av National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 till D.L.S.), National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 till D.L.S.), och från Honor's Program vid California State University Chico (till K.F.R.). Författarna tackar Betsey Tamietti för laboratorieledningen och Kathy Johns för administrativ hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
References
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al.
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Stachura, D. L., Traver, D.
- Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).
- Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. III Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , Academic Press. Cambridge, MA. (2009).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. I. 100, Elsevier. Boston, MA. 233-260 (2010).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).
- Ganis, J. J., et al. Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR. Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, e1-e11 (2013).
- Ding, M., et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective. SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).
- Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies. Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).
- Joslin, J., et al. A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery. SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).
