Summary
Dieser Test ist eine einfache Methode, um hämatopoetische Zellen bei der Entwicklung embryonaler Zebrafische zu quantitieren. Blutzellen von dissoziierten Zebrafischen werden einer Durchflusszytometrie-Analyse unterzogen. Dies ermöglicht den Nachweis von Blutdefekten bei mutierten Tieren und nach genetischer Veränderung.
Abstract
Die Vielfalt der Zelllinien, die reifes Blut bei Wirbeltieren umfassen, ergibt sich aus der Differenzierung von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs). Dies ist ein kritischer Prozess, der während der gesamten Lebensdauer von Organismen auftritt, und Störungen der molekularen Bahnen, die während der Embryogenese beteiligt sind, können katastrophale langfristige Folgen haben. Aus einer Vielzahl von Gründen ist Zebrafisch (Danio rerio) zu einem Modellorganismus geworden, um Hämatopoese zu studieren. Zebrafisch-Embryonen entwickeln sich extern, und durch 7 Tage Nachfertilisation (dpf) haben die meisten subtypen der endgültigen Blutzellen produziert, die für ihre Lebensdauer bestehen bleiben. Es wurden Assays zur Bewertung der Anzahl hämatopoetischer Zellen entwickelt, die hauptsächlich spezifische histologische Flecken, In-situ-Hybridisierungstechniken und Mikroskopie von transgenen Tieren verwenden, die blutzellspezifische Promotoren verwenden, die die Expression fluoreszierender Proteine fördern. Die meisten Färbe-Assays und In-situ-Hybridisierungstechniken quantifizieren jedoch nicht genau die Anzahl der vorhandenen Blutzellen; nur große Unterschiede in der Zellenzahl sind leicht zu visualisieren. Die Verwendung transgener Tiere und die Analyse von Personen mit fluoreszierender oder konfokaler Mikroskopie kann durchgeführt werden, aber die Quantifizierung dieser Assays beruht entweder auf der manuellen Zählung oder der Verwendung teurer Bildgebungssoftware, die beide Fehler machen können. Die Entwicklung zusätzlicher Methoden zur Beurteilung der Blutzellzahlen wäre wirtschaftlich, schneller und könnte sogar automatisiert werden, um die Wirkung der CRISPR-vermittelten genetischen Veränderung, der Morpholino-vermittelten Transkriptreduktion und der Wirkung von Wirkstoffverbindungen, die Hämatopoese in großem Maßstab beeinflussen, schnell zu bewerten. Dieser neuartige Test zur Quantifizierung von Blutzellen wird durchgeführt, indem ganze Zebrafischembryonen getrennt und die Menge der fluoreszierend markierten Blutzellen analysiert wird. Diese Assays sollten eine Aufklärung der molekularen Bahnen ermöglichen, die für die Entstehung, Expansion und Regulation von Blutzellen während der Embryogenese verantwortlich sind, was es den Forschern ermöglichen wird, neue Faktoren, die während Blutkrankheiten verändert wurden, sowie Die Wege, die während der Evolution der Wirbeltierhämatopoese wesentlich sind, weiter zu entdecken.
Introduction
Die Blutproduktion (Hämatopoese) ist ein wesentlicher Entwicklungsprozess, der zuerst im frühen Embryo beginnt. Dieser Prozess beginnt mit der Erzeugung primitiver roter Blutkörperchen und Makrophagen direkt aus dem Mesoderm und verschiebt sich später in Richtung der Produktion von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs). Diese Stammzellen, die multipotent sind, erzeugen alle Sorten von reifen Blutzellen im Organismus. Das System ist in der Lage, sich selbst zu erneuern, und wird durch diese HSPCs kontinuierlich aufgefüllt. Während dieser Prozess früh in der Entwicklung beginnt, Hämatopoese setzt sich für das Leben des Tieres, bietet die Fähigkeit, Sauerstoff zu entfernten Stellen des Körpers zu transportieren, Blutungen nach Verletzungen zu stoppen, und den Körper vor Infektionen zu schützen. Die Entwicklung dieses komplexen Systems wird zeitlich und räumlich während der Entwicklung gesteuert und jegliche Störungen in der Blutzellproduktion können für den Organismus katastrophal sein, was zu Anämie, Thrombozytopenie, Leukopenie und Leukämie führt.
Ein beliebtes Tiermodell für die hämatopoetische Forschung ist der Zebrafisch (Danio rerio), weil sie eine ähnliche Blutentwicklung im Vergleich zum Menschen haben. Tatsächlich werden viele der Gene und molekularen Bahnen, die während der Hämatopoese verwendet werden, während der Gesamten der Wirbeltierentwicklung konserviert, so dass wir durch das Studium von Zebrafischen mehr über menschliche Gene lernen können. Wichtig ist, dass zebrafischische Embryonen außerhalb des Körpers entstehen und innerhalb von 7 Tagen die meisten reifen Blutzelltypen erzeugt haben, was eine direkte Visualisierung des hämatopoetischen Systems in kurzer Zeit ermöglicht. Zebrafische sind auch extrem fecund, was es Forschern ermöglicht, eine größere Anzahl von Proben in einem kurzen Zeitrahmen zu beobachten, was auch für die Generierung reproduzierbarer Daten wichtig ist. Die kurze Erzeugungszeit und die externe Entwicklung des Zebrafisches ermöglicht eine einfachere Manipulation und Beobachtung während der Mutagenesestudien1,2,3,4,5 und Drogenscreening6,7,8,9,10. Dies ermöglicht es, eine Gruppe vielversprechender therapeutischer Verbindungen für menschliche Bluterkrankungen schnell und effizient zu testen.
Wichtig ist, dass Zebrafische auch genetisch freundlich sind, und das Genom wird sequenziert und mit Anmerkungen benotet. Diese Traktionsfähigkeit ermöglicht reverse genetische Techniken wie Morpholino- (MO-) vermittelten Knockdown und CRISPR-vermittelte genetische Ablation durchzuführen. Zebrafische haben auch ihre Nützlichkeit als Modell bewiesen, um vorn genetische Bildschirme durchzuführen; viele wesentliche Gene und Wege, die an der Wirbeltierblutbildung beteiligt sind, wurden auf diese Weise entdeckt. Zahlreiche Methoden zur Beobachtung von Blutzellen wurden auch bei Zebrafischen entwickelt. Während es traditionelle histologische Färbetechniken gibt, ist es auch möglich, in situ-Hybridisierung für blutspezifische Transkripte durchzuführen. Wichtig ist, dass es auch zahlreiche transgene Fischlinien gibt, bei denen fluoreszierende Proteine durch linienspezifische Promotoren exprimiert werden, was die Kennzeichnung bestimmter Blutzellen mit fluoreszierenden Proteinen11ermöglicht. Dies ermöglicht es Forschern, die Entstehung, Expansion und Regulierung von Blutzellen in einem lebenden Organismus im Laufe der Zeit aktuell zu beobachten.
Insgesamt hat die Erhaltung des hämatopoetischen Systems, das Vorhandensein und die einfache Entwicklung von transgenen Linien, einfache Visualisierung und kurze Erzeugungszeit den Zebrafisch zu einem wirtschaftlichen, schnellen und anpassungsfähigen Modell der Hämatopoese gemacht. Um die Toolbox der Techniken zu verbessern, die für Zebrafischforscher zur Verfügung stehen, haben wir diesen Test entwickelt, um die Anzahl der Blutzellen in Embryonen robust zu quantisieren. Die Methode beinhaltet die Verdauung transgener Tiere und die Durchführung von Durchflusszytometrie für fluoreszierende Blutzellen. Auf diese Weise können Blutzellen von mutierten Tieren, die Wirkung der MO- und CRISPR-Modifikation und die Wirkung kleiner Moleküle schnell und reproduzierbar quantitativ analysiert werden. Diese Assays sind benutzerfreundliche und wirtschaftliche Möglichkeiten, Blutzellen aufzuzählen, was die Untersuchung ihrer Erzeugung, Proliferation und Wartung im Laufe der Zeit ermöglicht.
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Protocol
Der Beirat des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der California State University, Chico, genehmigte alle unten beschriebenen Methoden.
HINWEIS: Es wird empfohlen, Embryonen mit 1-Phenyl 2-Thiourea (PTU; Tabelle 1) nach der Nachfruchtung (hpf) nach 24 Stunden, um Pigmentierung zu verhindern, die sich negativ auf die Fluoreszenzdiskriminierung durch Durchflusszytometrie auswirkt. Alle unten aufgeführten Verfahren sind für die Durchflusszytometrie und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) akzeptabel. Wenn man jedoch die hämatopoetischen Zellen nach FACS kulturieren will, dann halten Sie sich bei der Probenverarbeitung an sterile Praktiken. Das Protokoll zum sterilen Bleichen und vorbereiten von Embryoproben wurde zuvor12beschrieben.
1. Dechorionation von 48 hpf Zebrafisch-Embryonen
- Mit Embryonen (mindestens 5, aber nicht mehr als 200 Embryonen) in einer 10 cm Kunststoff Petrischale, kippen Sie die Schale, so dass die Embryonen an den unteren Rand sinken.
HINWEIS: Es ist einfach, die Schale zu kippen, indem Sie den Deckel entfernen und den Deckel unter eine Kante der Petrischale legen. - So viel E3 Medium (Tabelle 1) wie möglich entfernen und entsorgen und 500 l Dechorionationsprotease (10 mg/ml) hinzufügen. Bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
- Nach 5 min, nehmen Sie die Petrischale (halten alle Embryonen am unteren Rand der Platte), und tippen Sie sanft auf die Seite der Petrischale, so dass Embryonen sanft an der Unterseite der Platte reiben, um Kränzen vollständig zu entfernen.
- Mit einer Squeeze-Flasche 20 ml E3-Medium hinzufügen, um die Protease zu verdünnen. Lassen Sie Embryonen das E3-Medium durch Dekantieren absetzen und entfernen.
- Wiederholen Sie Schritt 1.4 3x, um alle Spuren der Dechorionation Protease zu entfernen.
HINWEIS: Für jede einzelne zu analysierende Probe sind mindestens 5 Embryonen erforderlich. Dieses Dechorionationsverfahren kann bis zu 200 Embryonen pro Petrischale aufnehmen. Proben können in dieser Phase gruppiert und später getrennt werden, falls gewünscht. Alternativ kann die manuelle Dechorionation durchgeführt werden, indem man die Chorionen sanft mit der Zange des Uhrmachers reißt. Dies ist vorteilhaft, wenn es eine geringe Anzahl von Embryonen gibt. Normalerweise schlüpfen Zebrafische von 72 hpf aus ihren Kränzen. Stark missgebildete Embryonen dürfen jedoch nicht mehr und erfordern nach dieser Zeit eine Dechorionation (entweder manuell oder chemisch).
2. Vorbereitung von Embryoproben zur Dissoziation
- Mit einer P1000 Pipette 5 bis 10 Embryonen in ein einziges 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr geben.
- E3-Medium mit einer Pipette entfernen und entsorgen.
VORSICHT: Pipette mit Sorgfalt als Embryonen kann in den folgenden Schritten leicht entsorgt werden. - Fügen Sie 1 ml 10 mM Dithiothreitol (DTT) in E3 Medium hinzu, um die Schleimbeschichtung um den embryonalen Zebrafisch11,12,13,14zu entfernen. Legen Sie das Mikrozentrifugenrohr horizontal und brüten Bei Raumtemperatur für 30 min.
3. Embryo-Dissoziation
- Waschen Sie die Embryonen 3x mit 1 ml Dulbeccos Phosphatgepufferte Saline (DPBS) mit Ca2+ und Mg2+, um Spuren von DTT zu entfernen. Nach der letzten Wäsche 500 l DPBS mit Ca2+ und Mg2+ und 5 l von 5 mg/ml (26 U/ml) Dissoziationsprotease hinzufügen.
HINWEIS: Es können andere isotonische gepufferte Lösungen verwendet werden, aber sie müssen Ca2+ und Mg2+ enthalten, damit das Dissoziationsenzym ordnungsgemäß funktioniert. - Inkubieren Sie Proben bei 37 °C auf einem horizontalen Orbital-Shaker bei 185 Rpm für 60 min. Trituieren Sie Embryonen mit einer P1000 Pipette, bis die Proben vollständig getrennt sind.
VORSICHT: Achten Sie darauf, die Embryonen nicht zu verdauen; etwas festes Gewebe vorhanden sein sollte, und es sollte nicht vollständig homogen sein. Es ist möglich, zu überdauen, was die Zielblutzellen zerstört, die auf dem Durchflusszytometer beobachtet werden(Ergänzungsfigur 1).
HINWEIS: Dieses Verfahren funktioniert am besten für 48-72-hpf-Embryonen. Spätere Stadien können eine längere Inkubation mit Dissoziationsprotease erfordern. Der Zeitpunkt für verschiedene Stadien muss empirisch bestimmt werden. Es gibt schnellere alternative Methoden, um embryonales Gewebe zu dissoziieren, aber es wird empirisch festgestellt, dass diese Methode, obwohl sie 60 min dauert, sanft und gründlich genug ist, um eine effiziente Isolierung lebender hämatopoetischer Zellen zu ermöglichen.
4. Herstellung von dissoziierten Embryonen zur Durchflusszytometrie
- Pipette die 5 dissoziierten Embryonen auf das obere Reservoir eines 5 ml Polystyrol runden Unterrohrmitrohr mit einer 35 mM Zellsiebkappe.
- Spülen Sie Zellen, indem Sie 4 ml Phosphatgepufferte Saline (PBS) ohne Ca2+ oder Mg2+ auf die Siebkappe des 5 ml Polystyrol-Rohrs, das die gefilterten Zellen enthält, hinzufügen.
HINWEIS: Es können auch andere isotonische gepufferte Lösungen verwendet werden, aber es sollte ihnen an Ca2+ oder Mg2+ fehlen, um das Dissoziationsenzym zu verdünnen und unwirksam zu machen. - Zentrifugenrohre bei 4 °C und 300 x g für 5 min, um die Zellen zu pellet. Mit einer Pipette überstandes Überstand entfernen und entsorgen. Setzen Sie die Zellen in 500 l PBS (ohne Ca2+ oder Mg2+) aus.
5. Durchflusszytometrie
- Wirbeln Sie vorsichtig die Zellsuspension und fügen Sie 1:1.000 rote tote Zelle Fleck (Tabelle der Materialien).
HINWEIS: Der rote Fleck in der totzelligen Zelle ist ein zelldurchlässiger Farbstoff, der den Ausschluss abgestorbener Zellen und Trümmer von Zielzellen ermöglicht und eine ausgezeichnete Wahl für Farbstoffe für die Diskriminierung toter Zellen ist, da er durch den 633 nm-Laser angeregt wird, der sich von dem 488 nm-Laser unterscheidet, der verwendet wird, um gängige Fluorophore wie grünes Fluoreszenzprotein (GFP) und DsRed zu anzuregen. Auf diese Weise gibt es keine spektralen Überlappungen von abgestorbenen Zellen und transgenen Blutzellen. Propidiumiodid (PI) mit 1 mg/ml ist eine kostengünstige Alternative zum roten Totenzellfleck, aber stellen Sie sicher, dass einige Proben, die nur mit PI befleckt sind, sowie Proben nur mit dem Fluorophor von Interesse reservieren, um die Instrumentenkompensation festzulegen. Andernfalls überlappen sich die Signale von PI und Fluorophoren wie GFP, was zu falsch-positiven Ergebnissen führt. Wenn das Durchflusszytometer auch einen 405 nm Laser hat, sind auch andere Farbstoffe wie blauer Papazellfleck eine ausgezeichnete Wahl.
VORSICHT: Beachten Sie bei der Analyse von Blutzellen, dass nach 30 min bestimmte Zelltypen beginnen, den roten Totenzellfleck zu phagozytoisieren. Halten Sie Zellen bis zur Analyse vor Licht und Eis geschützt und führen Sie die Durchflusszytometrie innerhalb von 30 min nach Zugabe des Farbstoffs durch. - Durchflusszytometrie-Analyse
HINWEIS: Jedes Durchflusszytometer ist ein wenig anders, aber die folgenden Schritte helfen bei der Vorbereitung von Proben für die Analyse auf den meisten Maschinen. Für Benutzer, die neu sind, zytometrie zu fließen, suchen Sie den Rat von jemandem, der ein Experte für das jeweilige Gerät ist. Die folgenden Anweisungen beziehen sich auf das BD FACSAria Fusion Flow Zytometer.- Schalten Sie das Zytometer ein und lassen Sie Laser 20 min aufwärmen. Leeren Sie den Abfallbehälter, füllen Sie den Mantelbehälter mit der entsprechenden Lösung (variiert basierend auf dem Durchflusszytometer) und starten Sie das Fluidiksystem.
HINWEIS: In der Regel gibt es für jeden Durchflusszytometertyp ein bestimmtes Startverfahren; führen Sie dieses Startvorgangs sorgfältig aus. - Zeichnen Sie in der Analysesoftware fünf Diagramme (Abbildung 1A).
- Lassen Sie das erste Punktdiagramm vorwärts streuen (FSC) auf der x-Achse und Die Seitenstreuung (SSC) auf der y-Achse. Legen Sie FSC als linear und SSC als Protokoll fest.
HINWEIS: FSC ist eine Messung der Zellgröße, und SSC ist eine Messung der Granularität; dies wird die Diskriminierung von Zellen von Schutt ermöglichen. Embryonale Zebrafisch-Blutkörperchen-Populationen trennen sich nicht nach Größe und Granularität in der gleichen Weise wie erwachsene Zebrafisch-Blutkörperchen, die zuvor15beschrieben wurden. Stattdessen werden sie in der gleichen Population mit allen anderen verdauten embryonalen Zellen erscheinen. - Legen Sie das zweite Diagramm fest, um die FSC-Höhe (H) und die FSC-Breite (W) zu untersuchen. Legen Sie das dritte Diagramm fest, um SSC (H) und SSC (W) zu messen.
HINWEIS: Dieser Schritt wird verwendet, um Doublets auszuschließen (Zellen, die zusammengeklebt werden, wenn sie durch den Laser gehen). - Legen Sie das vierte Punktdiagramm fest, um den roten Totzellenfleck auf der x-Achse zu messen (abhängig vom Zytometer entspricht dies in der Regel dem Fürsophoycocyanin [APC]) und SSC auf der y-Achse. Dies wird die Diskriminierung lebender Zellen aus abgestorbenen Zellen ermöglichen.
HINWEIS: Filtersätze jedes Zytometers können unterschiedlich sein. Achten Sie darauf, den richtigen Erkennungsfilter für den Farbfarbstoff für die Diskriminierung toter Zellen zu verwenden. - Die fünfte Parzelle misst das Fluorophor der Wahl. Visualisieren Sie dies als Histogramm des Fluorophors (Abbildung 1) oder verwenden Sie ein Punktdiagramm (Ergänzungsfigur 2).
HINWEIS: Wenn Sie mehr als ein Fluorophor in demselben Tier untersuchen, wird empfohlen, ein Punktdiagramm zu verwenden, um beide Parameter gleichzeitig anzuzeigen. Wenn es eine Chance gibt, dass die Fluorophore spektrale Überlappung haben(Ergänzungsabbildung 2), wird auch ein Punktdiagramm empfohlen. Verwenden Sie die Area (A)-Einstellungen, um die Fläche unter der vom Laserpuls des Zytometers erzeugten Kurve für alle Parameter zu berechnen, da sie genauer sind.
- Lassen Sie das erste Punktdiagramm vorwärts streuen (FSC) auf der x-Achse und Die Seitenstreuung (SSC) auf der y-Achse. Legen Sie FSC als linear und SSC als Protokoll fest.
- Laden Sie die Probe, und reduzieren Sie den Durchfluss, damit die Probe nicht schnell abläuft. Passen Sie die FSC- und SSC-Einstellungen so an, dass der Großteil der Zellpopulation deutlich sichtbar ist (Abbildung 1A).
- Zeichnen Sie ein Tor um die Zellpopulation und beschriften Sie es zellen. Stellen Sie sicher, dass das zweite Punktdiagramm auf Zellen abgegrenzt ist, schließen Sie Doublets aus, indem Sie zuerst auf FSC und dann auf SSC-Singlets gezwickt werden.
- Passen Sie auf der vierten Fläche die Roten Totzellen-Färbungseinstellungen so an, dass es eindeutig eine negative Population gibt. Zeichnen Sie ein Tor um diese Zellen und beschriften Sie sie als lebende Zellen. Auf der fünften Handlung, Tor auf lebenden Zellen und untersuchen Fluorophor negative und positive Zellen. Zeichnen Sie ein Tor um die positiven Zellen.
HINWEIS: Diese hierarchische Gating-Strategie untersucht einzelne Fluorophor+ Zellen, die sich im Tor der lebenden Zellen befinden, die sich ebenfalls im Zelltor befinden. Achten Sie darauf, Tore richtig einzustellen. Diese Tore können je nach Experiment angepasst werden. - Führen Sie jedes Beispiel aus und sammeln Sie mindestens 25.000 Livezellenereignisse.
- Befolgen Sie das Herunterfahren, um die Fluidik auszuschalten. Füllen Sie den Manteltank und leeren Sie den Abfallbehälter.
HINWEIS: Es ist oft schwierig, Fluorophor+ Zellen zu visualisieren, wenn die Proteinexpression niedrig ist oder die Zellpopulation selten ist. Um sicherzustellen, dass die Parameter richtig eingestellt sind, sollten Fluorophor- GeschwisterEmbryonen neben dem ordnungsgemäßen Ziehen von Toren und der Anpassung der Laserspannungen vorbereitet werden (Ergänzende Abbildung 2). Wenn die Zielzellenpopulation selten ist, sammeln Sie mehr als 25.000 Ereignisse. Mit 5-10 verdauten Tieren sollte man in der Lage sein, Millionen von Ereignissen zu sammeln. Die Gesamtzahl der Fluorophor+ Zellen kann auch mit diesen Daten erhalten werden. Zählen Sie einfach die Gesamtzahl der Zellen in der Probe mit einem Hämozytometer und multiplizieren Sie den Prozentsatz der Fluorophor+ Zellen, um die absolute Anzahl der Fluorophor+ Zellen pro Fisch zu erhalten.
- Schalten Sie das Zytometer ein und lassen Sie Laser 20 min aufwärmen. Leeren Sie den Abfallbehälter, füllen Sie den Mantelbehälter mit der entsprechenden Lösung (variiert basierend auf dem Durchflusszytometer) und starten Sie das Fluidiksystem.
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Representative Results
Um rote Blutkörperchen in embryonalen Zebrafischen aufzuzählen, wurden lcr:GFP16 Embryonen im Einzellstadium mit PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO oder 7,0 ng/nL ism1 MO mit 7,0 ng ism1 mRNA12injiziert. Bei 48 hpf wurden sie verdaut und einer Strömungszytometrie-Analyse unterzogen. Nach der Analyse des Prozentsatzes der GFP+ rote Blutkörperchen aus jeder Probe (jede Probe ist 5 zufällig ausgewählte Embryonen; Abbildung 1A), wurde der Durchschnitt aller Kontrollgruppen berechnet. Dieser Durchschnitt wurde auf 1festgelegt, und alle Prozentsätze wurden von diesem Bezugspunkt aus berechnet. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Reduktion von ism1-Transkriptmitschrift mit einem spezifischen MO die Anzahl der GFP+ roten Blutkörperchen im 48-hpf-Embryo reduzierte. Zusätzlich, Rettung dieser Verringerung der ism1-Spiegel mit exogenen mRNA die Anzahl der roten Blutkörperchen wieder normal.
Abbildung 1: ism1 MO reduziert die Anzahl der roten Blutkörperchen, die während der Embryogenese produziert werden. (A) lcr:GFP16 Embryonen wurden mit PBS injiziert und einer Durchflusszytometrieanalyse unterzogen. Zuerst wurden Größe und Granularität bestimmt, und ein Tor wurde um die Zellpopulation von Interesse gezogen(Zellen,linkes Panel). Anschließend wurden FSC H und FSC W ausgewertet, um zusammengeklebte Zellen zu eliminieren (Singlets FSC). SSC H und W wurden auch bewertet, um die Möglichkeit der Bewertung von zusammengeklebten Zellen zu reduzieren (Singlets SSC). Die rote Fluoreszenz wurde dann untersucht, um lebende Zellen (lebende Zellen) zu bestimmen. Schließlich wurden lebende Zellen auf GFP-Fluoreszenz (rechtes Panel) untersucht. (B) lcr:GFP12 Embryonen wurden im Einzellstadium der Entwicklung mit PBS (Steuerung, Kreise), ism1 MO(ism1 MO, Quadrate) oder ism1 MO + ism1 mRNA12 (Rettung, Dreiecke) injiziert. Nach 48 h wurden sie gesammelt, verdaut und der Durchflusszytometrie unterzogen, wie in Panel A gezeigt. Jeder Punkt stellt fünf zufällig ausgewählte einzelne Embryonen dar. Die Faltenänderung wird berechnet, indem der durchschnittliche Prozentsatz der GFP+ Zellen der Kontrollstichprobe als 1verwendet wird. Alle anderen Stichproben werden mit diesem Durchschnitt verglichen. *p < 0.005 und N.S. = nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Lösung | Zutaten | Notizen |
| E3 mittel (50x) | 14,61 g NaCl, 0,63 g KCI, 1,99 g MgSO4,7H2O, 1,83 g CaCl2 | Zu einem 2 L abgestuften Zylinder die Zutaten und genügend destilliertes Wasser hinzufügen, um das Gesamtvolumen auf 1 L zu bringen. |
| E3 mittel (1x) | 40 ml von 50x E3 | Zu einem 2 L abgestuften Zylinder, fügen Sie genügend destilliertes Wasser, um das Gesamtvolumen auf 2 L zu bringen. |
| 1-Phenyl-2-Thiourea (PTU) in E3 mittel | 40 ml 50x E3 in einer 2 L Flasche, 40 mg PTU | Zu einem 2 L abgestuften Zylinder, fügen Sie genügend destilliertes Wasser, um das Gesamtvolumen auf 2 L zu bringen. Mindestens 2 Tage umrühren, um PTU vollständig aufzulösen. |
Tabelle 1: Rezepte für Lösungen.
Ergänzende Abbildung 1: Verdauung von Embryonen mit Dissoziationsprotease. Bilder von 10 Embryonen, die nicht richtig verdaut wurden (links; unverdaut), nach ausreichender Verdauung (Mitte; verdaut) und nach übermäßiger Verdauung (rechts; überdaut). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Bewertung von zwei Fluorophoren in 5 dpf Embryonen. Gates wurden gezogen, umFSC und SSC zubewerten, um die Zellpopulation von Interesse(Zellen,linke Spalte) zu bestimmen, Singlets (nicht gezeigt) zu bewerten, um lebende Zellen(live,mittlere Spalte) und Fluorophor-Expression (mpx:GFP17 und gata1:D sRed15) zu bestimmen. Zuerst wurden Tore auf ein Tier gesetzt, das keine Fluorophore (obere Reihe) hat. Dann wurden mpx:GFP+ (ohne gata1:D sRed) Tiere ausgewertet, um die Tore und die Kompensation für GFP (zweite Reihe) zu setzen. gata1:D sRed+ (ohne mpx:GFP) Tiere wurden ausgewertet, um die Tore und Die Kompensation für DsRed (dritte Reihe) zu setzen. Schließlich können die beiden Farben in doppelt positiven Tieren bewertet werden, die mpx:GFP+ und gata1:D sRed+sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
Zebrafische sind ein ausgezeichnetes Modellsystem für das Studium der primitiven und definitiven Wirbeltierhämatopoese. In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Assays entwickelt und verfeinert, die es Zebrafischen ermöglichten, ein schnelles und wirtschaftliches Modell für das Testen von Medikamenten, die Erzeugung und Erprobung genetischer Mutanten zu werden und insgesamt es Forschern zu ermöglichen, molekulare Pfade zu analysieren, die für hämatopoese unerlässlich sind. Dieses Protokoll verwendet embryonale Zebrafische, die eine schnelle Datenerfassung, die Nutzung von weniger physischem Raum als erwachsene Tiere und die Verwendung von weniger Medikamenten für großflächige chemische Bildschirme ermöglichen. Es ermöglicht auch Quantifizierung nach Überexpression von mRNA, Erzeugung von CRISPR-Mutanten und MO-induzierte Transkriptreduktion, um spezifische genetische Pfade zu verändern, die während der frühen embryonalen Entwicklung auftreten. Wichtig ist, dass es eine empfindliche, robuste Quantifizierung von Blutzellen ermöglicht, was mit In-situ-Hybridisierung oder histologischen Färbetechniken schwer zu tun ist.
Dieser Test ist flexibel und kann geändert werden, um viele Forschungsfragen zu beantworten. Eine Änderung dieses Protokolls kann durchgeführt werden, wobei die Entwicklungsphase des Tieres manipuliert wird, um verschiedene Blutkörperchen zu quantitieren. Zum Beispiel entstehen rote Blutkörperchen früh in der Zebrafischentwicklung, und bei transgenen Tieren wie der transgenen Lcr:GFP16 kann bereits im 16-Sod-Stadium nachgewiesen werden. Wenn man jedoch daran interessiert ist, Thrombozyten zu untersuchen, beginnt die transgene Linie itga2b:GFP18 (auch bekannt als cd41:GFP) GFP bei 48 hpf auszudrücken, wobei reife zirkulierende Thrombozyten bei 72 hpf beobachtet werden. Wenn man B-Zellen mit diesem Test quantitieren möchte, dann kann es mit ighmdurchgeführt werden :EGFP19 transgene Tiere näher an 20 dpf. Wichtig ist, dieser Assay kann auch verwendet werden, um Blutzellen im Laufe der Zeit zu folgen. Zum Beispiel, durch die Analyse der Zahlen von lcr:GFP+ Zellen bei 24 hpf, 48 hpf, 72 hpf, könnte man feststellen, ob eine genetische Veränderung (oder Medikament) die Erhaltung der roten Blutkörperchen im Vergleich zu nur ihrer Generation reguliert.
Diese Assays ermöglichen es Forschern, die Genexpression mit CRISPR oder MOs oder die Überexpress-Genexpression zu reduzieren, indem mRNA im Einzell-Entwicklungsstadium injiziert wird, und die Anzahl der in diesen modifizierten Embryonen produzierten Blutzellen genau zu vergleichen. Es sollte stets darauf geachtet werden, diese Experimente ordnungsgemäß zu kontrollieren, indem Geschwistertiere mit unspezifischen Blinden-RNAs oder nicht übereinstimmenden MOs injiziert und ihr Blut zusammen mit den experimentellen Gruppen untersucht werden. Die Entwicklungsphase ist von entscheidender Bedeutung; Veränderungen von nur wenigen Stunden während der Entwicklung könnten sehr unterschiedliche Anzahl von Blutzellen in einem Embryo zeigen. Mit anderen Worten, achten Sie darauf, die Entwicklungsstunden beim Vergleich von Embryonen sorgfältig zu überwachen. Um sicherzustellen, dass Embryonen altersgerecht sind, sollten morphologische Hinweise verwendet werden. In frühen Embryonen sollten Sie erwägen, die Damiten auf das Alter zu zählen. Später in der Entwicklung können andere Marker wie der Beginn des Herzschlags, die Größe des otischen Vesikels oder die Länge des Körpers verwendet werden, um die Stadien von modifizierten Fischen zu entsprechen, um Fische zu kontrollieren. Darüber hinaus kann die Anzahl der Gesamtzellen aus verdauten Embryonen aufgezählt werden, um sicherzustellen, dass die gleiche Anzahl von Zellen bei Versuchs- und Kontrolltieren vorhanden ist. Neben der Verwendung dieser Assays zur Untersuchung genetischer Veränderungen können diese Assays auch modifiziert werden, um großangelegte Drogen-Screens durchzuführen. Embryonen können während der Entwicklung zeitlich unterschiedlichen Konzentrationen von Verbindungen ausgesetzt werden, um festzustellen, ob die betreffenden Chemikalien irgendeine Wirkung auf die Hämatopoese haben. Wenn das Experiment dazu bestimmt ist, die Wirkung eines bestimmten Arzneimittels zu testen, sollten auch Tiere, die mit dem Fahrzeug behandelt werden, als Kontrolle einbezogen werden. Auf diese Weise können Forscher feststellen, ob der Gewinn oder Verlust der Funktion bestimmter Gene oder Signalwege eine wesentliche Rolle bei der Hämatopoese spielt.
Bei der Untersuchung verschiedener Transgene ist es wichtig, dass die Anzahl der pro Probe verdauten Tiere optimiert wird; zu wenige Tiere können wenig oder gar keine Fluoreszenz erzeugen. Dies gilt insbesondere für die Untersuchung von HSPCs, die zu einem bestimmten Zeitpunkt nicht reichlich vorhanden sind. Es ist auch wichtig, wenn Transgene untersucht werden, die schwache Promotoren haben, die die Fluoreszenz antreiben. Um diesen Problemen entgegenzuwirken, sind mehr Tiere (und damit mehr Zellen) für genaue Zählungen erforderlich. Bei der Änderung der Entwicklungsstadien ist es auch wichtig, die Verdauungszeit zu optimieren. Dieses Protokoll ist für 5 einzelne 48-hpf-Embryonen pro Röhre optimiert. Das Verdauen reiferer Embryonen wird wahrscheinlich längere Zeit in DerIer benötigen.
Während des Verfahrens können einige potenzielle Probleme auftreten. Wenn keine Fluoreszenz beobachtet wird, könnte es ein technisches Problem mit dem Zytometer geben, das gelöst werden muss. Aus diesem Grund ist es wichtig, zu überprüfen, ob die Embryonen fluoreszierend sind, bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, indem Sie sie schnell unter dem Mikroskop überprüfen. Ein weiteres häufiges Problem ist die Überverdauung der Embryonen, die die Zellen zerstört. Achten Sie auf den Verdauungsschritt und ändern Sie das Timing, wenn zu viele abgestorbene Zellen beobachtet werden.
Diese Assays haben einige Einschränkungen. Das größte Problem ist, dass diese Assays auf dem Ausdruck eines transgenen Markers basieren. Möglicherweise spiegelt die Veränderung der Expression des transgenen Markers nicht die Biologie dessen wider, was im Embryo vorkommt. Darüber hinaus ist die Durchflusszytometrie möglicherweise nicht die beste Methode, um Zellen zu quantitieren, wenn die Zielzellpopulation extrem niedrig ist. Um mit diesen Möglichkeiten umzugehen, könnten andere Assays wie in situ oder histologische Färbetechniken eingesetzt werden. Wenn spezifische Antikörper für den Zelltyp der Interessen immunhistochemie vorhanden sind, kann auch durchgeführt werden. Embryonen könnten auch qRT-PCR unterzogen werden, um linienspezifische Gene zu messen, und wenn diese Tests auf einer FACS-Maschine durchgeführt werden, könnten die Zellen einzeln mit noch empfindlicheren Methoden isoliert und untersucht werden. Ohne diese Probleme kann dieser quantitative Flow-Zytometrie-Assay viele nützliche Informationen für Forscher generieren.
Mit diesen Assays können Forscher hämatopoetische Defekte bei Wirbeltieren leicht beobachten. Die Veränderung genetischer Pfade mit MOs oder CRISPR und die anschließende Durchführung der Durchflusszytometrie zur Aufklärung, ob das Gen bei hämatopoese eine Rolle spielt, kann schnell durchgeführt werden und ist quantitativ. Zusätzlich können vordere genetische Screens (solange die Tiere eine fluoreszierende Markierung haben) durchgeführt und Defekte bewertet werden. Zebrafische haben sich auch zu einem ausgezeichneten Modell für großflächige Drogenbildschirme6,7,8,9,10, ermöglicht effiziente Arzneimittel-Screening-Assays auf lebende Organismen zu beobachten, ob die Medikamente wirksam sind und wenn sie negative Auswirkungen auf die Entwicklung / Überleben haben. Die Kopplung dieses Tests mit der automatisierten Durchflusszytometrie-Technologie, die durch die Robotik verbessert wird, würde ihn noch effizienter machen20,21,22, was eine wirklich groß angelegte Analyse und das Screening von Pfaden ermöglicht, die für die Entstehung, das Wachstum und die Regulierung von Blutzellen wichtig sind und unklar bleiben.
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Disclosures
D.L.S. ist ein wissenschaftlicher Berater und hat eine Entschädigung von Finless Foods, Inc. erhalten und Xytogen Biotech, Inc. K.F.R. erklärt keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Die Finanzierung erfolgte durch die National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 an D.L.S.), die National Science Foundation (NSF: MRT 1626406 bis D.L.S.) und das Honor es Program an der California State University Chico (nach K.F.R.). Die Autoren danken Betsey Tamietti für das Labormanagement und Kathy Johns für die Amtshilfe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
References
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al.
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Stachura, D. L., Traver, D.
- Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).
- Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. III Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , Academic Press. Cambridge, MA. (2009).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. I. 100, Elsevier. Boston, MA. 233-260 (2010).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).
- Ganis, J. J., et al. Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR. Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, e1-e11 (2013).
- Ding, M., et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective. SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).
- Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies. Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).
- Joslin, J., et al. A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery. SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).
