Summary
Этот анализ является простым методом количественно гематопоэтических клеток в развивающихся эмбриональных зебры. Клетки крови от диссоциированных зебры подвергаются анализу цитометрии потока. Это позволяет выявлять дефекты крови у животных-мутантов и после генетической модификации.
Abstract
Разнообразие клеточных линий, составляющих зрелую кровь у позвоночных животных, возникает в результате дифференциации гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (ГСПК). Это критический процесс, который происходит на протяжении всей жизни организмов, и нарушение молекулярных путей, участвующих во время эмбриогенеза может иметь катастрофические долгосрочные последствия. По множеству причин,зебрафиш (Danio rerio) стала моделью организма для изучения гематопоеза. Эмбрионы зебры развиваются внешне, и к 7 дням постферизайние (dpf) произвело большинство подтипов окончательных клеток крови, которые будут сохраняться в течение их жизни. Анализы для оценки количества гематопоэтических клеток были разработаны, в основном с использованием конкретных гистологических пятен, на месте методы гибридизации, и микроскопия трансгенных животных, которые используют клетки крови конкретных промоутеров вождения выражение флуоресцентных белков. Тем не менее, большинство окрашивания анализы и на месте методы гибридизации точно не количественно количество клеток крови настоящее время; только большие различия в числах клеток легко визуализированы. Использование трансгенных животных и анализ лиц с флуоресцентной или конфокаленной микроскопией может быть выполнена, но количественная оценка этих анализов зависит либо от подсчета вручную, либо от использования дорогостоящего программного обеспечения для визуализации, оба из которых могут делать ошибки. Разработка дополнительных методов для оценки количества клеток крови будет экономичной, быстрее, и даже может быть автоматизирована, чтобы быстро оценить влияние CRISPR-опосредованные генетической модификации, морфолино-опосредованное сокращение стенограммы, и влияние лекарственных соединений, которые влияют на гематопоеза в больших масштабах. Этот новый анализ количественных клеток крови выполняется путем разобщенности целых эмбрионов зебры и анализа количества флуоресцентно помеченных клеток крови присутствует. Эти анализы должны позволить выяснение молекулярных путей, ответственных за генерацию клеток крови, расширение и регулирование во время эмбриогенеза, что позволит исследователям в дальнейшем обнаружить новые факторы, измененные во время заболеваний крови, а также пути, необходимые во время эволюции позвоночных гематопоэз.
Introduction
Производство крови (гематопоезис) является важным процессом развития, который впервые начинается в раннем эмбрионе. Этот процесс начинается с генерации примитивных красных кровяных телец и макрофагов непосредственно из мезодерма, а затем смещается в сторону производства гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (ГФУ). Эти стволовые клетки, которые являются многопотентными, генерируют все разновидности зрелых клеток крови в организме. Способная к самооб обновлению, система постоянно пополняется через эти ГЦП. В то время как этот процесс начинается на ранних стадиях развития, гематопоеза продолжается для жизни животного, обеспечивая возможность транспортировки кислорода в отдаленные места тела, чтобы остановить кровотечение после травмы, и защитить организм от инфекции. Развитие этой сложной системы контролируется временно и пространственно во время развития, и любые возмущения в производстве клеток крови могут быть катастрофическими для организма, что приводит к анемии, тромбоцитопении, лейкопении и лейкемии.
Популярной моделью животных, используемой для гематопоэтических исследований, является зебрафиш(Danio rerio),потому что они имеют аналогичное развитие крови по сравнению с людьми. В самом деле, многие из генов и молекулярных путей, используемых во время гематопоэза сохраняется на протяжении всей эволюции позвоночных, что позволяет нам узнать о человеческих генах, изучая зебры. Важно отметить, что эмбрионы зебры развиваются вне тела и в течение 7 дней породили большинство зрелых типов клеток крови, что позволяет для прямой визуализации гематопоэтической системы в короткий промежуток времени. Зебрафиш также чрезвычайно fecund, что позволяет исследователям наблюдать большее количество образцов в короткие сроки, что также важно для генерации воспроизводимых данных. Короткое время генерации зебры и внешнее развитие обеспечивает более легкую манипуляцию и наблюдение во время исследований мутагенеза1,2,3,4,5 и скринингапрепарата 6,7,8,9,10. Это позволяет группе перспективных терапевтических соединений для человеческих заболеваний крови, чтобы быть быстро и эффективно протестированы.
Важно отметить, что зебры также генетически подложки, и геном секвенирован и аннотирован. Эта трактуируемость позволяет обратные методы генетики, такие как морфолино- (MO-) опосредованное нокдаун и CRISPR-опосредованной генетической абляции, которые будут выполняться. Зебрафиш также доказали свою полезность в качестве модели для выполнения вперед генетических экранов; многие основные гены и пути, участвующие в формировании крови позвоночных были обнаружены таким образом. Многочисленные методы наблюдения клеток крови были также разработаны в зебры. В то время как традиционные гистологические методы окрашивания существуют, можно также выполнить на месте гибридизации для крови конкретных стенограмм. Важно отметить, что многочисленные трансгенные линии рыбы также существуют в соответствии с которой флуоресцентные белки выражаются линии конкретных промоутеров, что позволяет маркировки конкретных клеток крови сфлуоресцентными белками 11. Это позволяет исследователям выполнять до минуты наблюдения генезиса клеток крови, расширение и регулирование в живом организме с течением времени.
В целом, сохранение гематопоэтической системы, наличие и легкое развитие трансгенных линий, легкая визуализация и короткое время генерации сделали зебру экономичной, быстрой и адаптируемой моделью гематопоэза. Чтобы улучшить набор инструментов, доступных для исследователей зебры, мы разработали этот анализ, чтобы надежно количественно количество клеток крови в эмбрионах. Метод включает переваривание трансгенных животных и выполнение цитометрии потока для флуоресцентных клеток крови. Таким образом, клетки крови животных-мутантов, эффект модификации MO и CRISPR, а также эффект малых молекул могут быть количественно проанализированы в быстрой и воспроизводимой манере. Эти анализы являются удобными и экономичными способами перечисления клеток крови, что позволяет с течением времени изутовить их генерацию, распространение и техническое обслуживание.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Институциональный комитет по уходу за животными и использованию (IACUC) консультативный совет в Университете штата Калифорния, Чико, одобрил все методы, описанные ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется лечить эмбрионы с 1-фенил 2-thiourea (PTU; Таблица 1) в течение 24 часов после послеферетия (hpf) для предотвращения пигментации, которая негативно влияет на дискриминацию флуоресценции по цитометрии потока. Все процедуры, перечисленные ниже, приемлемы для цитометрии потока и флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS). Однако, если одна цель состоит в культуре гематопоэтических клеток после FACS, а затем придерживаться стерильных практик при обработке образцов. Протокол для отбеливания и подготовки образцов эмбриона стерильным способом был описан ранее12.
1. Декорионация 48 л.с. эмбрионов зебры
- С эмбрионами (не менее 5, но не более 200 эмбрионов) в 10-сантиметровой пластиковой чашке Петри, наклоните блюдо так, чтобы эмбрионы опустились на нижний край.
ПРИМЕЧАНИЕ: Легко наклонить блюдо, сняв крышку и поместив крышку под один край чашки Петри. - Удалите и отбросьте какможно больше среды E3(таблица 1 ) и добавьте 500 л протеазы дегорионации (10 мг/мл). Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
- После 5 минут, забрать чашку Петри (сохраняя все эмбрионы на нижнем краю пластины), и осторожно нажмите сторону чашки Петри, что позволяет эмбрионам аккуратно руб против нижней части пластины, чтобы полностью удалить хорионы.
- С выжать бутылку, добавить 20 мл E3 среды для разбавления протеазы. Разрешить эмбрионов, чтобы успокоиться и удалить E3 среды путем декантирования.
- Повторите шаг 1.4 3x, чтобы удалить все следы протеазы дегорионации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа каждого отдельного образца требуется не менее 5 эмбрионов. Эта процедура декорионации может вместить до 200 эмбрионов на чашку Петри. Образцы могут быть сгруппированы на данном этапе и разделены позже при желании. Кроме того, ручная декорионация может быть выполнена путем мягкого разрыва хорионов с силами часовщика. Это выгодно, когда есть небольшое количество эмбрионов. Обычно зебрафиш вылупляется из своих хорионов на 72 л.с. Тяжело пороков развития эмбрионов не может, однако, и потребует дехорионации (либо ручной или химической) после этого времени.
2. Подготовка образцов эмбрионов для диссоциации
- Используя пипетку P1000, поместите 5–10 эмбрионов в одну микроцентрифугную трубку 1,5 мл.
- Удалите E3 среды с пипеткой и отбросить.
ВНИМАНИЕ: Pipette с осторожностью, как эмбрионы могут быть легко отброшены в течение следующих шагов. - Добавьте 1 мл 10 мм дитиотрейтол (DTT) в E3 среды, чтобы удалить слизистое покрытие окружающих эмбриональныхзебры 11,12,13,14. Положите трубку микроцентрифуга горизонтально и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут.
3. Диссоциация эмбрионов
- Вымойте эмбрионы 3x с 1 мл фосфата Dulbecco буферного солевого раствора (DPBS) с Ca2 "и Mg2", чтобы удалить следы DTT. После последней стирки добавьте 500 л DPBS спротеазой диссоциации Ca 2 и Mg2 и 5 л 5 мг/мл (26 U/mL).
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие изотонические буферные растворы могут быть использованы, но они должны содержать Ca2 "и Mg2" для диссоциации фермента функционировать должным образом. - Инкубировать образцы при 37 градусов по Цельсию на горизонтальном орбитальном шейкере при 185 об/мин в течение 60 мин. Тритуратные эмбрионы с пипеткой P1000 до тех пор, пока образцы не будут полностью разобщены.
ВНИМАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы не переутомить эмбрионы; некоторые твердые ткани должны присутствовать, и она не должна быть полностью однородной. Можно перенагромоть, что уничтожит целевые кровяные тельца, которые будут наблюдаться на цитометре потока(дополнительный рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура лучше всего подходит для эмбрионов 48-72 л.с. Более поздние этапы могут потребовать более длительной инкубации с протеазой диссоциации. Сроки для различных этапов должны быть определены эмпирически. Существуют более быстрые альтернативные методы для разобщения эмбриональной ткани, но эмпирически установлено, что этот метод, хотя он занимает 60 минут, является мягким и достаточно тщательным, чтобы обеспечить эффективную изоляцию живых гематопоэтических клеток.
4. Подготовка диссоциированных эмбрионов для цитометрии потока
- Pipette 5 диссоциированных эмбрионов на верхнем резервуаре 5 мл полистирола круглой нижней трубки с 35 мкм клеток ситечко крышка.
- Промыть клетки, добавив 4 мл фосфата буферного солевого раствора (PBS) без Ca2 "или Mg2" в ситечко крышка 5 мл полистирола трубки, содержащей фильтрованные клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие изотонические буферные решения также могут быть использованы, но они должны не иметь Ca2 "или Mg2", чтобы разбавить и сделать диссоциации фермента неэффективным. - Центрифуга трубки при 4 градусов по Цельсию и 300 х г в течение 5 мин, чтобы гранулировать клетки. С пипеткой, удалить и отказаться от супернатанта. Повторное распределение клеток в 500 л PBS (без Ca2 "или Mg2").
5. Цитометрия потока
- Аккуратно вихрь клеточной подвески и добавить 1:1000 красный мертвых клеток пятно(Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Красный мертвых клеток пятно клеток проницаемый краситель, который позволяет исключение мертвых клеток и мусора из целевых клеток и является отличным выбором красителя для мертвых клеток дискриминации, потому что он взволнован 633 нм лазера, который отличается от 488 нм лазер используется для возбуждения общих флуорофоров, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и DsRed. Таким образом, нет спектрального перекрытия от мертвых клеток и трансгенных клеток крови. Propidium йодид (PI) на 1 мг / мл является недорогой альтернативой красный мертвых клеток пятно, но убедитесь, что зарезервировать некоторые образцы окрашены только с ИП, а также образцы только с фторфором интерес установить инструмент компенсации. В противном случае сигналы PI и фторфоров, таких как GFP, будут перекрываться, что приведет к ложноположим результатам. Если поток цитометра также имеет 405 нм лазера, другие красители, такие как синий папа ячейки пятно также отличный выбор.
ВНИМАНИЕ: При анализе клеток крови, обратите внимание, что после 30 мин определенные типы клеток начнут фагоцитозы красные мертвые пятна клеток. Держите клетки защищены от света и на льду до анализа и выполнять цитометрию потока в течение 30 минут после добавления красителя. - Анализ цитометрии потока
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый цитометр потока немного отличается, но следующие шаги помогут в подготовке образцов для анализа на большинстве машин. Для пользователей, новых для потока цитометрии, обратитесь за советом к тому, кто является экспертом по конкретной части оборудования. Следующие инструкции относятся к цитометру потока потока BD FACSAria Fusion.- Включите цитометр и дайте лазерам прогреться в течение 20 минут. Пустой резервуар для отходов, заполнить оболочку бак с соответствующим решением (изменяется на основе потока цитометра) и начать жидкости системы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует, как правило, определенная процедура запуска для каждого типа цитометра потока; внимательно следите за этой процедурой запуска. - В программном обеспечении анализа нарисуйте пять участков(рисунок 1A).
- Испустить первую точку участка измерения вперед рассеяния (FSC) на оси x и бокового рассеяния (SSC) на оси y. Установите FSC как линейный и SSC как журнал.
ПРИМЕЧАНИЕ: FSC является измерение размера клеток, и SSC является измерение детализации; это позволит различать клетки от мусора. Эмбриональные популяции клеток крови зебры не разделяются по размеру и детализации так же, как взрослые клетки крови зебры, описанныеранее 15. Вместо этого они будут появляться в той же популяции со всеми другими переваренными эмбриональными клетками. - Установите второй участок для изучения высоты FSC (H) по сравнению с шириной FSC (W). Установите третий участок для измерения SSC (H) против SSC (W).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг используется для исключения дублетов (клеток, которые застряли вместе, когда они проходят через лазер). - Установите четвертую точку участка для измерения красного пятна мертвых клеток на оси х (в зависимости от цитометра это, как правило, эквивалентно фильтру, используемому для алофикоцианина (APC) и SSC на оси y. Это позволит различать живые клетки из мертвых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наборы фильтров каждого цитометра могут быть разными. Убедитесь в том, чтобы использовать правильный фильтр обнаружения для мертвых клеток дискриминации красителя. - Пятый сюжет измеряет флюорофор выбора. Визуализуй это как гистограмму флюорофора(рисунок 1)или используйте точечный сюжет(дополнительный рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: При изучении более одного флюорофора в одном и том же животном рекомендуется использовать точечный участок для просмотра обоих параметров одновременно. Если есть шанс, что фторфоры имеют спектральное перекрытие друг сдругом (Дополнительный рисунок 2), точечный участок также рекомендуется. Используйте настройки Области (A) для расчета области под кривой, генерируемой лазерным импульсом цитометра по всем параметрам, потому что они более точны.
- Испустить первую точку участка измерения вперед рассеяния (FSC) на оси x и бокового рассеяния (SSC) на оси y. Установите FSC как линейный и SSC как журнал.
- Загрузите образец и уменьшите скорость потока, чтобы образец не закончился быстро. Отрегулируйте настройки FSC и SSC так, чтобы основная часть популяции ячеек была хорошо видны(рисунок 1A).
- Нарисуйте ворота вокруг популяции клеток и обозначить его клетками. Убедившись, что вторая точка участок закрыт на ячейки, исключить дублеты, сначала gating на FSC, а затем на SSC синглетов.
- На четвертом участке настроить красные настройки пятна мертвых клеток так, что есть явно отрицательное население. Нарисуйте ворота вокруг этих клеток и обозначите их живыми клетками. На пятом участке ворота на живые клетки и исследуют флюорофорные отрицательные и положительные клетки. Нарисуйте ворота вокруг положительных ячеек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта иерархическая стратегия gating рассматривает одиночные флюорофорныеклетки и клетки которые reside в стробе живых клеток, которые также reside в стробе клетки. Позаботьтесь, чтобы установить ворота должным образом. Эти ворота могут быть настроены в зависимости от эксперимента. - Вы запустите каждый образец, собрав не менее 25 000 событий живых ячееок.
- Следуйте процедуре выключения, чтобы выключить fluidics. Пополнить оболочку бака и опорожнить резервуар для отходов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Часто бывает трудно визуализировать фторфор и клетки, когда экспрессия белка низкая, или популяция клеток встречается редко. Для обеспечения правильного набора параметров следует подготовить флюорофор- эмбрионы братьев и сестер должны быть подготовлены вместе с правильно рисовать ворота и регулировать лазерное напряжение(дополнительная цифра 2). Если популяция целевых ячееок встречается редко, соберите более 25 000 событий. С 5'10 переваренных животных, надо быть в состоянии собрать миллионы событий. Общее количество фторфоров и клетоктакже может быть получено с помощью этих данных. Просто подсчитайте общее количество клеток в образце с гемоцитометром и умножьте процентфторфора и клеток, чтобы получить абсолютное количество фторфораи клеток на рыбу.
- Включите цитометр и дайте лазерам прогреться в течение 20 минут. Пустой резервуар для отходов, заполнить оболочку бак с соответствующим решением (изменяется на основе потока цитометра) и начать жидкости системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы перечислить красные кровяные тельца в эмбриональных зебры, lcr:GFP16 эмбрионов были введены на одноклеточной стадии с PBS, 7,0 нг/nL ism1 MO, или 7,0 нг/ nL ism1 MO с 7,0 нг ism1 mRNA12. При 48 л.с. они перевариваются и подвергаются анализу цитометрии потока. После анализа процентной доли GFP икрасных кровяных телец из каждого образца (каждый образец 5 случайно выбранных эмбрионов; Рисунок 1A), был рассчитан средний показатель по всей контрольной группе. Это среднее значение было установлено как 1, и все проценты были рассчитаны с этой точки отсчета. Эти данные свидетельствуют о том, что уменьшение ism1 транскрипт с конкретным MO уменьшило количество GFPи красных кровяных телец, присутствующих в 48 л.с. эмбриона. Кроме того, спасение этого снижения уровня ism1 с экзогенной мРНК вернуло количество эритроцитов в нормальное русло.
Рисунок 1: ism1 MO уменьшает количество эритроцитов, вырабатываемых во время эмбриогенеза.(A) lcr :GFP16 эмбрионов были введены с PBS и подвергаются анализу цитометрии потока. Во-первых, размер и детализация были определены, и ворота были нарисованы вокруг клеточной популяции интереса(клетки,левая панель). Затем, FSC H и FSC W была оценена для устранения ячеек застряли вместе(синглеты FSC). SSC H и W также была оценена, чтобы уменьшить возможность оценки ячеек, склеивающихся(singlets SSC). Красная флуоресценция была затем рассмотрена для определения живых клеток(живых клеток). Наконец, живые клетки были обследованы на флуоресценцию GFP (правая панель). (B) lcr:GFP12 эмбрионов были введены с PBS (контроль, круги), ism1 MO (ism1 MO, квадраты), или ism1 MO ism1 mRNA12 (спасение, треугольники) на одноклеточной стадии развития. После 48 ч, они были собраны, усваивается, и подвергаются поток цитометрии, как показано на панели А. Каждая точка представляет пять случайно выбранных отдельных эмбрионов. Изменение сложите вычисляется путем принятия среднего процента GFPи ячеек контрольной выборки и установки, что как 1. Все остальные образцы сравниваются с этим средним показателем. Зп хт; 0,005, и Н.С. - не значительный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| решение | Ингредиенты | примечания |
| E3 средний (50x) | 14,61 г NaCl, 0,63 г KCI, 1,99 г MgSO4 7H2O, 1,83 г CaCl22H2O | К цилиндру объемом 2 л добавьте ингредиенты и достаточно дистиллированной воды, чтобы довести общий объем до 1 л. |
| E3 средний (1x) | 40 мл 50x E3 | К цилиндру объемом 2 л добавьте достаточно дистиллированной воды, чтобы довести общий объем до 2 л. |
| 1-Фенил-2-тиуреа (ПТУ) в среде E3 | 40 мл 50x E3 в бутылке 2 л, 40 мг PTU | К цилиндру объемом 2 л добавьте достаточно дистиллированной воды, чтобы довести общий объем до 2 л. Перемешать, по крайней мере 2 дней, чтобы полностью растворить PTU. |
Таблица 1: Рецепты решений.
Дополнительный рисунок 1: Переваривание эмбрионов с диссоциациальной протеазой. Изображения 10 эмбрионов не перевариваются должным образом (слева; непереваренные), после адекватного пищеварения (средний; усваивается), а после избыточного пищеварения (справа; переваренный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительный рисунок 2: Оценка двух фторфоров в 5 dpf эмбрионов. Ворота были привлечены дляоценки FSC и SSC для определения популяции клеток, представляющих интерес(клетки,левый столбец), для оценки синглетов (не показано), чтобыопределитьживые клетки (живые, средний столбец), и выражение фторфора(mpx:GFP17 и gata1:D sRed15). Во-первых, ворота были установлены на животное, которое не имеет фторфоров (верхний ряд). Затем mpx:GFP (без gata1:D sRed) животные были оценены, чтобы установить ворота и компенсацию за GFP (второй ряд). gata1:D(без mpx:GFP) животные были оценены, чтобы установить ворота и компенсации для DsRed (третий ряд). Наконец, два цвета могут быть оценены в двойных положительных животных, которые mpx:GFP и gata1:D Red. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Зебрафиш являются отличной моделью системы для изучения примитивных и окончательных позвоночных гематопоэзиса. За последние несколько десятилетий, несколько анализов были разработаны и уточнены, что позволяет зебры, чтобы стать быстрой и экономичной моделью для тестирования наркотиков, генерации и тестирования генетических мутантов, и в целом позволяет исследователям анализировать молекулярные пути, необходимые для гематопоеза. Этот протокол использует эмбриональных зебры, которая позволяет быстрый сбор данных, использование меньше физического пространства, чем взрослых животных, и использование меньше наркотиков для крупномасштабных химических экранов. Он также позволяет количественно после переэкспрессии мРНК, генерации мутантов CRISPR, и MO-индуцированной сокращения стенограммы изменить конкретные генетические пути, которые происходят во время раннего эмбрионального развития. Важно отметить, что он позволяет чувствительной, надежной количественной оценки клеток крови, что трудно сделать с на месте гибридизации или гистологических методов окрашивания.
Этот анализ является гибким и может быть изменен, чтобы ответить на многие вопросы исследования. Одна модификация этого протокола может быть выполнена в соответствии с которой стадия развития животного манипулируется для количественной оценки различных типов клеток крови. Например, эритроциты возникают на ранних стадиях развития зебры, а с трансгенными животными,такими как lcr :GFP16 трансгенной линии, можно обнаружить уже на стадии 16-сомита. Если кто-то заинтересован в изучении тромбоцитов, однако, itga2b:GFP18 (также известный как cd41:GFP) трансгенной линии начинает выражать GFP на 48 л.с., со зрелыми циркулирующих тромбоцитов наблюдается на 72 л.с. Если кто-то желает количественно В-клеток с этим анализом, то она может быть выполнена с ighm:EGFP19 трансгенных животных ближе к 20 dpf. Важно отметить, что этот анализ также может быть использован для следовать клетки крови с течением времени. Например, анализируя количество lcr:GFP и клеток на 24 л.с., 48 л.с., 72 л.с., можно было бы определить, если генетическая модификация (или препарат) регулирует поддержание красных кровяных телец по сравнению с только их поколения.
Эти анализы позволяют исследователям уменьшить экспрессию генов с помощью CRISPR или MOs или переэкспресс экспресс экспрессии генов путем введения мРНК на одноклеточной стадии развития и точно сравнить количество клеток крови, вырабатываемых в этих модифицированных эмбрионах. Следует всегда принимать меры по надлежащему контролю за этими экспериментами в то же время путем инъекций братьев и сестер животных с неспецифическим руководством РНК или несовместимых МО и изучения их крови вместе с экспериментальными группами. Этап развития имеет решающее значение; изменения только несколько часов во время развития может показать значительно различное количество клеток крови, присутствующих в эмбрионе. Другими словами, убедитесь, что тщательно контролировать часы развития при сравнении эмбрионов. Для обеспечения того, чтобы эмбрионы соответствовали возрасту, следует использовать морфологические сигналы. В ранних эмбрионах, рассмотреть вопрос о подсчете somites к возрасту матч. Позже в развитии, другие маркеры, такие как начало сердцебиека, размер otic пузырьков, или длина тела могут быть использованы для соответствия этапы модифицированных рыб для контроля рыбы. Кроме того, количество общих клеток может быть перечислено из переваренных эмбрионов, чтобы обеспечить такое же количество клеток присутствуют в экспериментальных и контролировать животных. В дополнение к использованию этих анализов для изучения генетической модификации, эти анализы также могут быть изменены для выполнения крупномасштабных экранов наркотиков. Эмбрионы могут подвергаться воздействию различных концентраций соединений височно во время развития, чтобы увидеть, если химические вещества, о котором идет речь имеют какое-либо влияние на гематопоеза. Если эксперимент предназначен для проверки воздействия конкретного препарата, то животные, обработанные транспортным средством только должны быть включены в качестве контроля. Таким образом, исследователи могут определить, если получить или потеря функции конкретных генов или сигнальных путей играют важную роль в гематопоезах.
Важно, чтобы при изучении различных трансгенов было оптимизировано количество животных, переваренных на образец; слишком мало животных может генерировать мало или в отсутствие флуоресценции. Это особенно верно при изучении ГФУ, которые не являются обильными в определенной точке времени. Это также имеет решающее значение при изучении трансгенов, которые имеют слабые промоутеры вождения флуоресценции. Чтобы противодействовать этим вопросам больше животных (и, следовательно, больше клеток) необходимы для точного подсчета. При изменении стадии развития, это также имеет решающее значение для оптимизации времени пищеварения. Этот протокол оптимизирован для 5 отдельных эмбрионов 48 л.с. на трубку. Переваривание более зрелых эмбрионов, скорее всего, потребует больше времени.
Некоторые потенциальные проблемы могут возникнуть во время процедуры. Если не наблюдается флуоресценции, может быть техническая проблема с цитометром, которая должна быть решена. По этой причине необходимо проверить, что эмбрионы флуоресцентные перед началом процедуры, быстро проверяя их под микроскопом. Другой распространенной проблемой является чрезмерное переваривание эмбрионов, которое разрушает клетки. Позаботьтесь на этапе пищеварения и изменить сроки, если слишком много мертвых клеток наблюдается.
Эти анализы имеют несколько ограничений. Самая большая проблема заключается в том, что эти анализы опираются на выражение трансгенного маркера. Потенциально изменение экспрессии трансгенного маркера может не отражать биологию того, что происходит в эмбрионе. Кроме того, цитометрия потока может быть не лучшим методом количественной оценки клеток, если популяция целевых клеток крайне низка. Чтобы справиться с этими возможностями, другие анализы, такие как на месте или гистологические методы окрашивания могут быть использованы. Если конкретные антитела существуют для клеточного типа интерес иммуногистохимии также может быть выполнена. Эмбрионы также могут подвергаться qRT-PCR для измерения линии конкретных генов, и если эти анализы выполняются на машине FACS, клетки могут быть изолированы и изучены индивидуально с еще более чувствительными методами. Исключая эти вопросы, этот количественный анализ цитометрии потока может генерировать много полезной информации для исследователей.
С помощью этих анализов, исследователи могут легко наблюдать гематопоэтические дефекты у позвоночных животных. Изменение генетических путей с МО или CRISPR, а затем выполнение цитометрии потока, чтобы выяснить, если ген играет роль в гематопоэз может быть сделано быстро и количественно. Кроме того, могут быть выполнены форвардные генетические экраны (если у животных есть флуоресцентный тег) и оценены дефекты. Зебрафиш также стали отличной моделью для крупномасштабныхэкранов наркотиков 6,7,8,9,10, что позволяет эффективного скрининга наркотиков анализы на живые организмы, чтобы наблюдать, если препараты являются эффективными, иеслиони имеют негативные последствия для развития / выживания. Соединение этого анализа с автоматизированной технологией цитометрии потока, усовершенствованной робототехникой, сделаетего еще более эффективным 20, 21,22,что позволит действительно крупномасштабный анализ и скрининг путей, важных в генезисе клеток крови, росте и регулировании, которые остаются неясными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.L.S. является научным консультантом и получил компенсацию от Finless Foods, Inc. и Xytogen Biotech, Inc. K.F.R. не заявляет о своих конкурирующих интересах.
Acknowledgments
Финансирование было предоставлено Национальными институтами здравоохранения (NIH: R15 DK114732-01 в D.L.S.), Национальным научным фондом (NSF: MRI 1626406 до D.L.S.), а также программой Почета в Калифорнийском государственном университете Чико (К.Ф.Р.). Авторы благодарят Бетси Тамиетти за лабораторное управление и Кэти Джонс за административную помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
References
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al.
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Stachura, D. L., Traver, D.
- Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).
- Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. III Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , Academic Press. Cambridge, MA. (2009).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. I. 100, Elsevier. Boston, MA. 233-260 (2010).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).
- Ganis, J. J., et al. Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR. Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, e1-e11 (2013).
- Ding, M., et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective. SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).
- Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies. Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).
- Joslin, J., et al. A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery. SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).
