Summary
Qui è presentato un approccio fosfoproteomico, vale a dire fosfoproteomico a base di punta di estrazione stop and go, che fornisce un'elevata produttività e una copertura profonda del fosfoproteoma arabidopsis. Questo approccio delinea la panoramica della segnalazione dello stress osmotico in Arabidopsis.
Abstract
La fosforilazione proteica è fondamentale per la regolazione dell'attività enzimatica e dell'espressione genica in condizioni osmotiche. La spettrometria di massa (MS) basata sulla fosfoproteomica ha trasformato il modo di studiare la trasduzione del segnale vegetale. Tuttavia, il requisito di molte materie prime e il tempo prolungato di misurazione della SM per raggiungere la profondità di copertura è stato il fattore limitante per lo studio ad alta produttività dei cambiamenti fosfoproteomici globali negli impianti. Per migliorare la sensibilità e la produttività della fosfoproteomica vegetale, abbiamo sviluppato un approccio fosfoproteomica a base di punta stop and go (stage) abbinato all'etichettatura Tandem Mass Tag (TMT) per l'analisi rapida e completa della perturbazione della fosforilazione delle piante in risposta allo stress osmotico. Sfruttando la semplicità e l'elevata produttività della tecnica della punta dello stadio, l'intera procedura richiede circa un'ora utilizzando due punte per completare l'arricchimento del fosfopeptide, il frazionamento e le fasi di pulizia del campione, suggerendo un approccio facile da usare e ad alta efficienza. Questo approccio non solo fornisce un'analisi approfondita della fosfoproteomica vegetale (> 11.000 identificazione del fosfopeptide), ma dimostra anche l'efficienza di separazione superiore (< sovrapposizione del 5%) tra frazioni adiacenti. Inoltre, il multiplexing è stato ottenuto utilizzando l'etichettatura TMT per quantificare i cambiamenti fosfoproteomici delle piante mutanti di decuple di tipo selvaggio e snrk2. Questo approccio è stato utilizzato con successo per rivelare gli eventi di fosforilazione delle chinasi simili alla Raf in risposta allo stress osmotico, che fa luce sulla comprensione della segnalazione osmotica precoce nelle piante terrestri.
Introduction
L'alta salinità, la bassa temperatura e la siccità causano stress osmotici, che è un importante fattore ambientale che influisce sulla produttivitàdelle piante 1,2. La fosforilazione proteica è una delle modifiche post-traslazionali più significative che mediano la percezione del segnale e la trasduzione nella risposta delle piante allo stressosmotico 3,4,5. La protein chinasi 2s (SnRK2s) correlata alla SNF1 è coinvolta nella segnalazione dello stress osmotico6. Nove dei dieci membri della famiglia SnRK2 mostrano un'attivazione significativa in risposta allo stressosmotico 7,8. Il mutante snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 (snrk2-dec) con mutazioni in tutte e dieci le SnRK2 mostrava ipersensibilità allo stress osmotico. Nel mutante snrk2-dec, l'accumulo osmotico indotto dallo stress di inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3),biosintesi dell'acido ascisico (ABA) ed espressioni geniche è fortemente ridotto, evidenziando il ruolo vitale di SnRK2s nelle risposte allo stress osmotico6. Tuttavia, non è ancora chiaro come le chinasi SnRK2s regolino questi processi biologici. Profilare i cambiamenti fosfoproteomici in risposta allo stress osmotico è un modo efficiente per colmare questo divario e delineare i meccanismi di difesa osmotici innescati dallo stress nelle piante.
La spettrometria di massa (MS) è una tecnica potente per mappare il fosfoproteoma vegetale9. La caratterizzazione della fosfoproteomica vegetale, tuttavia, rimane una sfida a causa della gamma dinamica del proteoma vegetale e della complessità del lico vegetale4. Per superare queste sfide, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro fosfoproteomico vegetale universale, che elimina le interferenze indesiderate come da pigmenti fotosintetici e metaboliti secondari e consentendo la copertura profonda del fosfoproteoma vegetale10. Diversi metodi di arricchimento del fosfopeptide come la cromatografia immobilizzata dell'affinità ionica metallica (IMAC) e la cromatografia dell'ossido metallico (MOC) sono stati sviluppati per arricchire i fosfopeptidi prima dell'analisi MS11,12,13,14,15,16. I non fosfopeptidi acidi co-purificanti con fosfopeptidi sono le principali interferenze per il rilevamento del fosfopeptide. In precedenza, abbiamo standardizzato il valore del pH e la concentrazione di acido organico del tampone di carico IMAC per eliminare il legame dei non fosfopeptidi, per ottenere più del 90% di specificità di arricchimento bypassando la fase di pre-frazionamento11.
La perdita del campione nel processo in più fasi di arricchimento e frazionamento del fosfopeptide ostacola la sensibilità dell'identificazione del fosfopeptide e la profondità della copertura fosfoproteomica. Le punte di estrazione stop-and-go (punte dello stadio) sono punte di pipetta che contengono piccoli dischi per limitare l'estremità della punta, che possono essere incorporati con cromatografia per il frazionamento peptidico e lapulizia 17. La perdita del campione durante la procedura di punta dello stadio può essere ridotta al minimo evitando il trasferimento del campione tra i tubi. Abbiamo implementato con successo la punta dello stadio in Ga3+-IMAC e Fe3+-IMAC per separare i peptidi fosforilati multipli a bassa abbondanza dai peptidi singolarmente fosforilati, che hanno migliorato la profondità del fosfoproteoma umano15. Inoltre, l'uso di una punta in fase invertita ad alto pH (Hp-RP) ha dimostrato una copertura più ampia del proteoma della membrana umana rispetto a quella di forte scambio di cationi (SCX) e cromatografia a forte scambio di anione (SAX)18. Pertanto, l'integrazione delle tecniche di punta dello stadio IMAC e Hp-RP può aumentare la copertura del fosfoproteoma dell'impianto con semplicità, alta specificità e alta produttività. Abbiamo dimostrato che questa strategia ha identificato più di 20.000 siti di fosforilazione dalle piantine arabidopsis, rappresentando una maggiore profondità del fosfoproteoma vegetale19.
Qui, segnalamo un protocollo fosfoproteomico basato su punta di fase per la profilazione fosfoproteomica in Arabidopsis. Questo flusso di lavoro è stato applicato per studiare la perturbazione fosfoproteomica delle piantine mutanti di tipo selvaggio e snrk2-dec in risposta allo stress osmotico. L'analisi fosfoproteomica ha rivelato i siti di fosforilazione implicati nell'attivazione della chinasi e nella segnalazione precoce dello stress osmotico. L'analisi comparativa dei dati del fosfoproteoma mutante di tipo selvaggio e snrk2-dec ha portato alla scoperta di una cascata di chinasi raf-like (RAF)-SnRK2 chinasi che gioca un ruolo chiave nella segnalazione dello stress di Osmore nelle piante alte.
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Protocol
1. Preparazione del campione
- Raccogliere le piantine trattate con controllo e stress (1 g) in un foglio di alluminio e congelare i campioni in azoto liquido.
NOTA: Una maggiore concentrazione proteica è solitamente osservata da piantine di due settimane rispetto a quella delle piante mature. Un grammo di piantine genera circa 10 mg di llysato proteico, che è sufficiente per l'analisi ms. Tutte le fasi di centrifugazione si svolgono a 16.000 x g nel passaggio 1. - Macinare piantine congelate in una polvere fine usando un mortaio e un pestello pieni di azoto liquido.
- Aggiungere 1 mL di tampone di lysis ((6 M guanidina-HCl in Tris-HCl da 100 mM, pH 8.5) con 10 mM Tris (2-carbossietile)fosfina cloridrato (TCEP), 40 mM 2-cloroacetamide (CAA), inibitore della proteasi e cocktail inibitori della fosfatasi) alla malta e mescolare con l'aiuto di pestello.
- Trasferire il lysate dell'impianto in un tubo da 1,5 ml e riscaldare a 95 °C per 5 min.
- Posizionare il tubo sul ghiaccio per 10 minuti. Sonicare il tubo sul ghiaccio per 10 s, fermarsi per 10 s e ripetere tre volte.
- Centrifugare il tubo per 20 minuti e aliquota 150 μL di lysate vegetale in un tubo da 1,5 ml.
- Aggiungere 600 μL di metanolo al 100% nel tubo. Vortice e spin lungo il tubo.
- Aggiungere 150 μL di cloroformio al 100% nel tubo. Vortice e spin lungo il tubo.
- Aggiungere 450 μL di ddH2O nel tubo. Vortice e centrifuga il tubo per 3 min.
- Scartare il livello acquoso superiore. Aggiungere 600 μL di metanolo al 100% nel tubo. Centrifugare il tubo per 3 minuti e quindi scartare la soluzione.
- Lavare pellet proteici con 600 μL di metanolo al 100%. Scartare la soluzione e asciugare all'aria il pellet proteico.
- Resuspend protein pellets in 600 μL di tampone di digestione (12 mM di deossicholato di sodio (SDC)/12 mM di sarcosiosio lauroile di sodio (SLS) in 100 mM Tris-HCl, pH 8.5). Sonicare il tubo fino a quando la sospensione non è omogeneizzata.
- Misurare la concentrazione proteica utilizzando un kit BCA e regolare la concentrazione a 4 μg/μL con il tampone di digestione. Trasferire 100 μL del lysate (400 μg di proteine) in un nuovo tubo.
- Aggiungere al tubo 292 μL di bicarbonato di trietilammonio da 50 mM (TEAB) e 8 μL di Lys-C (2,5 Unità/ml). Incubare il tubo a 37 °C per 3 ore.
- Aggiungere 100 μL di TEAB da 50 mM con tripina da 8 μg al tubo. Incubare il tubo a 37 °C per 12 ore.
- Aggiungere al tubo 25 μL di acido trifluoroacetico (TFA) al 10%. Vortice e centrifuga il tubo per 20 min a 4 °C.
- Trasferire il supernatante in una colonna di desalinizzazione condizionata per la dissalezione. Asciugare l'eluato utilizzando un concentratore di centrifuga sottovuoto.
NOTA: Attivare la resina con 1 mL di metanolo seguita da 1 mL di 0,1% di TFA nell'acetonitrile all'80% (ACN). Lavare il solvente organico con almeno 3 mL di 0,1% di TFA nel 5% di ACN. Caricare campioni di peptidi acidificati preparati nel passaggio 1.16 nella colonna e quindi lavare la colonna con almeno 3 mL di 0,1% di TFA nel 5% di ACN. Potrebbero essere necessari più lavaggi per campioni con alte concentrazioni di sale. Elute i fosfopeptidi con 1 mL di 0,1% di TFA nell'80% di ACN.
2. Etichettatura TMT (Tandem Mass Tag)
- Riprendono i peptidi essiccati in 100 μL di acido 4-(2-idrossietile)-1-piperazinaetanosolfonico (HEPES), pH 8,5.
- Sciogliere il reagente TMT di ogni canale (0,8 mg) in 40 μL di ACN anidro. Vortice il tubo reagente TMT per 5 minuti e girarlo verso il basso.
- Trasferire 40 μL di TMT nel tubo campione e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
NOTA: In questo esperimento, il canale da 126 a 128 è stato etichettato con tre repliche biologiche di piante senza trattamento con mannitolo e il canale da 129 a 131 è stato etichettato con tre repliche biologiche di piante con trattamento con mannitolo. - Aggiungere 8 μL di idrossilammina al 5% e incubare per 15 min.
- Mescolare 6 campioni in un tubo da 5 ml e aggiungere 14 μL di 10% di TFA.
- Aggiungere 3.876 μL di 0,1% di TFA al tubo. Vortice e spin down.
- Trasferire la soluzione in una colonna di desalinizzazione condizionata per la desalinizzazione. Asciugare l'eluito utilizzando un evaporatore.
3. Preparazione della punta del palco IMAC
- Utilizzare un ago smussato da 16 G per penetrare in un disco di fritta in polipropilene.
NOTA: tenere la fresa perpendicolare alla superficie del disco e arrotolare la fresa un paio di volte per assicurarsi che il disco sia completamente asportato. Posizionare il disco in una piastra di Petri per la conservazione. Posizionare l'ago in una punta della pipetta da 200 μL e spingere la fritta nella punta utilizzando uno stantuffo. - Premere delicatamente la fritta nella punta utilizzando uno stantuffo per limitare l'estremità della punta.
- Posizionare il disco fritta in punte con la stessa pressione, che fornisce una migliore riproducibilità. La riproducibilità della produzione di punte di fase è importante per una contro pressione costante, che influisce sulla tempistica delle fasi di centrifuga e sulla riproducibilità tra repliche tecniche.
- Se le punte del palco mostrano un'alta controtendione durante la fase di condizionamento, scartare le punte per evitare potenziali intasamenti della punta durante il caricamento dei campioni. Potrebbe essere che il disco potrebbe essere stato premuto troppo duramente in posizione.
- Invertire la colonna di rotazione Ni-NTA e posizionarlo su un tubo da 1,5 ml.
- Utilizzare uno stantuffo per premere delicatamente la fritta delle perline Ni-NTA e spingere le perline nel tubo.
NOTA: Assicurarsi di spingere delicatamente la fritta per evitare la potenziale perdita di perline o adsorbimento sulla colonna di rotazione.
4. Preparazione della punta dello stadio Hp-RP
- Preparare la punta dello stadio Hp-RP come descritto per la punta dello stadio IMAC utilizzando un disco C8.
NOTA: Non applicare una forza grande al disco perché può causare una fritta densamente imballata e aumentare la controtezione della punta dello stadio. Tutte le fasi di centrifugazione si svolgono a 1.000 x g per 5 minuti nel passaggio 4. - Sospendere 1 mg di perline C18 in 100 μL 100% di metanolo e passare la soluzione di perline attraverso la punta.
- Aggiungere 20 μL di tampone 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2, pH 10.0) alla punta dello stadio e passare il buffer 8 attraverso la punta mediante centrifugazione.
- Aggiungere 20 μL di Tampone A (200 mM NH4HCO 2 ) alla punta dello stadio e passare il buffer Aattraversola punta mediante centrifugazione.
NOTA: Bilanciare la centrifuga durante l'uso e assicurarsi che la punta dello stadio Hp-RP non sia completamente asciugata.
5. Preparazione dell'adattatore di spin
- Utilizzare pinzette affilate per forare un foro al centro del coperchio di un tubo da 1,5 ml.
- Inserire la punta dello stadio IMAC o la punta dello stadio Hp-RP nel foro dell'adattatore di rotazione.
NOTA: Assicurarsi che la punta del palco non sia vicina alla parte inferiore dell'adattatore di rotazione.
6. Arricchimento del fosfopeptide mediante punta dello stadio IMAC
- Sospendere le perle Ni-NTA da 10 mg con 400 μL di tampone di carico (acido acetico al 6% (AA), pH 3.0) e caricare tutta la soluzione di perline in per punta. Passare la soluzione attraverso la punta per centrifugazione.
NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione si svolgono a 200 x g per 3 minuti nel passaggio 6 oltre al passaggio 6.8. - Caricare 100 μL di acido etilendiamminatetraacetico (EDTA) da 50 mM per rimuovere gli ioni di nichel dalla punta dello stadio IMAC e passare la soluzione attraverso la punta mediante centrifugazione.
- Caricare 100 μL di tampone di carico sulla punta dello stadio e passare la soluzione attraverso la punta mediante centrifugazione.
- Caricare 100 μL di 50 mM FeCl3 nel 6% di AA sulla punta dello stadio e passare la soluzione attraverso la punta mediante centrifugazione. Gli ioni Fe3+ si alateranno alla punta dello stadio IMAC.
- Caricare 100 μL di tampone di carico per condizionare la punta dello stadio e passare la soluzione attraverso la punta mediante centrifugazione.
- Caricare 100 μL di tampone di carico con peptidi campione preparati al passaggio 2.7 fino alla punta dello stadio e passare la soluzione attraverso la punta mediante centrifugazione.
NOTA: Prendi un nuovo tubo come adattatore di rotazione per raccogliere il flusso del campione e conservare il flusso nel congelatore per analisi future. - Caricare 100 μL di tampone di lavaggio (4,5% AA e 25% ACN) sulla punta dello stadio e passare la soluzione attraverso la punta mediante centrifugazione.
- Eseguire il secondo lavaggio con buffer di carico. Caricare 100 μL di tampone di carico sulla punta dello stadio e passare la soluzione attraverso la punta utilizzando 1000 × g di centrifuga per 3 min.
NOTA: Assicurarsi che il tampone di lavaggio sia sostituito dal tampone di carico nella punta dello stadio per eliminare la perdita di fosfopeptidi durante la fase di eluizione. Equilibrare la punta dello stadio IMAC prima dell'eluizione del fosfopeptide per garantire che la concentrazione di ACN sia inferiore al 5%. - Tagliare la punta del palco IMAC nella parte anteriore con una forbice e posizionare la punta del palco IMAC rifilata all'interno della punta Hp-RP. Assicurarsi che i due strati di punte del palco non tocchino il coperchio della centrifuga.
7. Frazionamento del fosfopeptide utilizzando la punta dello stadio Hp-RP C18
- Aggiungere 100 μL di tampone di eluizione (fosfato di ammonio da 200 mM (NH4H2PO4)) alla punta dello stadio IMAC rifilata e passare la soluzione attraverso i due strati di punte dello stadio mediante centrifugazione.
NOTA: Se la soluzione non passa attraverso la punta dello stadio, aumentare la velocità di spin down. Tutte le fasi di centrifugazione si svolgono a 1.000 x g per 5 minuti nel passaggio 7. Tutti i buffer Hp-RP sono elencati nella tabella 1. - Scartare la punta dello stadio IMAC utilizzando una pinzetta e aggiungere 20 μL di Buffer A alla punta dello stadio Hp-RP e passare il buffer attraverso la punta per centrifugazione.
NOTA: assicurarsi che tutto il buffer di eluizione passi attraverso la punta dello stadio IMAC prima di scartarlo. - Aggiungere 20 μL di Buffer 1 per eludere la frazione 1 e raccogliere l'eluato in un nuovo tubo mediante centrifugazione. Ripetere il processo con buffer 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 per raccogliere ogni frazione in un nuovo tubo. Asciugare l'eluato finale di ogni frazione utilizzando un concentratore sottovuoto.
NOTA: Preparare nuovi tamponi di frazionamento. Prendi 8 nuovi tubi come adattatore di rotazione di ogni frazione. Raccogliere l'eluato di ogni frazione in un adattatore di spin diverso. I fosfopeptidi non sono stabili in condizioni di base, quindi asciugare immediatamente gli eluati da un concentratore o acidificati del 10% di TFA.
8. Analisi LC-MS/MS e analisi dei dati
- Aggiungere 5 μL di acido formico 0,1% (FA) e analizzare il campione con uno spettrometro di massa.
- Eseguire una sfumatura di 90 minuti con il buffer B del 6-30% (80% ACN e 0,1% FA) per ogni frazione.
- Frammentare i primi 10 peptidi etichettati utilizzando una dissociazione ad alta energia di collisione (HCD). Completare una ricerca nel database per identificare i siti di fosforilazione.
- Caricare i file non elaborati nel software MaxQuant, denominare gli esperimenti e impostare frazioni e PTM.
NOTA: Il tutorial del software MaxQuant è disponibile all'https://www.maxquant.org/. - Selezionare l'ione reporter MS2 nel tipo di esecuzione LC-MS/MS e 6plex TMT come etichette isobariche. Abilitare il filtro in base alla funzione PIF e impostare il pif minimo su 0,75.
- Selezionate Acetil (Protein N-term), Oxidation (M) e Phospho (STY) nel pannello delle modifiche variabili. Selezionate Carbamidometile (C) come modifiche fisse.
- Impostare la modalità di digestione come specifica, selezionare Tripina/P come enzima di digestione e due scollatura mancata.
- Impostare il tasso di falsa scoperta PSM (FDR) e la proteina FDR come 0,01. Impostare il punteggio minimo per i peptidi modificati su 40.
- Aggiungere il database Arabidopsis thaliana al pannello dei file fasta ed eseguire la ricerca nel database.
- Caricare il file txt dei siti Phospho (STY) sul software Perseus al termine della ricerca.
NOTA: I tutorial dettagliati del software Perseus sono disponibili all'https://www.maxquant.org/perseus/. - Filtrare i siti di fosforilazione inversa. Filtrare i siti di fosforilazione non localizzati utilizzando la probabilità di localizzazione del 75% come cut-off.
- Utilizzare le intensità dei siti di fosforilazione per l'analisi statistica.
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Representative Results
Per dimostrare le prestazioni di questo flusso di lavoro, abbiamo sfruttato la punta dello stadio IMAC abbinata al frazionamento della punta dello stadio Hp-RP per misurare i cambiamenti fosfoproteomici nelle piantine mutanti di tipo selvaggio e snrk2-dec con o senza trattamento con mannitolo per 30 minuti. Ogni campione è stato eseguito in triplicati biologici e il flusso di lavoro sperimentale è rappresentato nella figura 1. I peptidi digeriti (400 μg) di ciascun campione sono stati etichettati con un canale TMT-6plex, raggruppati e dissale. I fosfopeptidi sono stati ulteriormente arricchiti utilizzando una punta dello stadio IMAC, e i fosfopeptidi purificati sono stati successivamente frazionati in otto frazioni da una punta dello stadio Hp-RP. Ogni frazione è stata analizzata da un'analisi del gradiente LC di 90 minuti. I file grezzi sono stati cercati utilizzando un motore di ricerca contro il database Arabidopsis thaliana.
Un totale di 11.077 fosfopeptidi unici sono stati identificati corrispondenti a 3.630 fosfoproteine con 6.852 siti di fosforilazione localizzati (Classe I, probabilità di localizzazione > 0,75), indicando l'ampia copertura del fosfoproteoma arabidopsis. Un totale di 8.107 e 7.248 fosfopeptidi sono stati identificati rispettivamente da campioni mutanti di tipo selvaggio e snrk2-dec. Ciò illustra l'efficienza del flusso di lavoro nel fornire una copertura approfondita per delineare la visione globale della trasduzione del segnale in Arabidopsis. Abbiamo confrontato il numero di fosfopeptidi identificati in 8 frazioni. Alcuni fosfopeptidi sono stati identificati nelle prime due frazioni, la frazione 1 e 2. Tuttavia, la maggior parte dei fosfopeptidi sono stati distribuiti uniformemente nelle altre 6 frazioni (Figura 2A), suggerendo che questo approccio fornisce la capacità di separare i fosfopeptidi complessi dal fosfoproteoma vegetale. Per dimostrare ulteriormente l'efficienza di separazione di questo flusso di lavoro, abbiamo valutato la sovrapposizione di fosfopeptidi tra due frazioni adiacenti (ad esempio F1-to-F2). Meno del 5% di fosfopeptidi si sovrappongono nelle frazioni adiacenti, indicando una robusta efficienza di frazionamento della punta dello stadio Hp-RP (Figura 2B).
Utilizzando i dati ottenuti dal flusso di lavoro, abbiamo confrontato i profili fosfoproteomici di tipo selvaggio e mutante snrk2-dec con il trattamento con mannitol. Un totale di 433 e 380 siti di fosforilazione sono stati aumentati dopo il trattamento con mannitolo rispettivamente nel campione mutante di tipo selvatico e snrk2-dec (figura 3). Tra questi, 312 fosfositi hanno mostrato induzione (FDR < 0,01) in piante mutanti di tipo selvaggio, ma non in piante mutanti snrk2-dec. L'analisi dell'ontologia genica (GO) ha rivelato che la funzione della fosforilazione e dell'attivazione della protein chinasi, la regolazione del processo metabolico fosfato, la trasduzione del segnale, sono significativamente arricchite nelle fosfoproteine dipendenti dalla SnRK2. È interessante notare che il termine GO relativo allo sviluppo delle radici è stato arricchito anche nel gruppo dipendente da SnRK2, coerentemente con il fenotipo di ritardo della crescita delle radici sotto stress osmotico6. Abbiamo anche identificato 116 fosfositi up-regolati dal trattamento con mannitolo sia in mutante di tipo selvaggio che in mutante snrk2-dec. Queste fosfoproteine erano indipendenti da SnRK2, o candidati che mediavano la segnalazione osmotica innescata dallo stress prima dell'attivazione di SnRK2. Abbiamo osservato che diversi RAF del sottogruppo B4 come RAF18 (AT1G16270), RAF24 (AT2G35050) e RAF42 (AT3G46920), erano significativamente regolati dallo stress osmotico. Ulteriori studi hanno rivelato che le chinasi della RAF sono rapidamente attivate dallo stress osmotico e necessarie per la fosforilazione e l'attivazione di SnRK2s20.
Figura 1: Flusso di lavoro del metodo fosfoproteomico basato su punta di fase. Le proteine sono state estratte e digerite da piantine mutanti di tipo selvatico e snrk2-dec trattate con o senza mannitolo. I peptidi digeriti di ogni replica sono stati etichettati con un canale TMT6-plex unico. I fosfopeptidi sono stati raggruppati e poi arricchiti utilizzando una punta del palco IMAC. I fosfopeptidi purificati erano separati da una punta dello stadio Hp-RP. Ogni frazione è stata analizzata dallo spettrometro di massa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Profilazione fosfoproteomica di piantine mutanti di tipo selvaggio e snrk2 per punta dello stadio IMAC e frazionamento Hp-RP. (A) Numero di fosfopeptidi identificati per frazione. (B) L'efficienza di separazione della cromatografia Hp-RP basata su punta dello stadio. La sovrapposizione tra le frazioni adiacenti è rappresentata dalla percentuale dello stesso peptide identificata nelle frazioni adiacenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione dei cambiamenti fosfoproteomici in risposta allo stress osmotico. Le trame vulcaniche mostrano il cambiamento log2 volte dei siti di fosforilazione nelle piantine mutanti(A)di tipo selvaggio e(B) snrk2-dec in risposta al trattamento con mannitol. Il cerchio nero rappresenta i siti di fosforilazione della chinasi indotti dal mannitolo. Il cerchio rosso indica i siti di fosforilazione dei RAL up-regulated in risposta al mannitolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Buffer A | Formato di ammonio da 200 mM (NH4HCO2), pH 10,0. | |
| Buffer B | 100% ACN. | |
| Buffer 1 | 5% Buffer B, 95% Buffer A. | |
| Buffer 2 | 8% Buffer B, 92% Buffer A. | |
| Buffer 3 | 11% Buffer B, 89% Buffer A. | |
| Buffer 4 | 14% Buffer B, 86% Buffer A. | |
| Buffer 5 | 17% Buffer B, 83% Buffer A. | |
| Buffer 6 | 20% Buffer B, 80% Buffer A. | |
| Buffer 7 | 23% Buffer B, 77% Buffer A. | |
| Buffer 8 | 80% Buffer B, 20% Buffer A. | |
Tabella 1: Buffer per il frazionamento della punta dello stadio Hp-RP.
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Discussion
La gamma dinamica e la complessità del proteoma e del fosfoproteoma delle piante sono ancora un fattore limitante alla profondità delle analisi fosfoproteomiche. Nonostante la capacità dell'analisi LC-MS/MS a esecuzione singola di identificare 10.000 siti di fosforilazione21,22, la copertura dell'intero fosfoproteoma vegetale è ancora limitata. Pertanto, è necessario un flusso di lavoro fosfoproteomico che fornisca un'elevata sensibilità e un'efficienza di separazione superiore nella profilazione della visione globale delle reti di segnalazione degli impianti in risposta allo stress ambientale. La cromatografia liquida commerciale ad alta pressione (HPLC) basata sulla colonna è un metodo comune per ridurre la complessità peptidica prima dell'analisi MS23,24. Tuttavia, le noiose fasi di raccolta dei campioni e il grande volume di eluizione sono le principali sfide dei metodi basati su HPLC in termini di sensibilità e velocità effettiva. la punta dello stadio è un approccio alternativo per eseguire il pre-frazionamento o l'arricchimento peptidico per lavori ad alta sensibilità e ad alta produttività. Questo nuovo flusso di lavoro fosfoproteomico che sfrutta l'etichettatura isobarica accoppiato con l'arricchimento e il frazionamento del fosfopeptide fornisce una migliore copertura e profondità della fosfoproteomica vegetale rispetto ad altri flussi di lavoro fosfoproteomici25,26.
Il valore del pH dei campioni è il fattore cruciale che determina la specificità dell'arricchimento dei fosfopeptidi. Il valore del pH può essere influenzato dalla fase precedente della preparazione del campione, quindi è essenziale controllare il valore del pH prima del caricamento del campione. Se il pH viene spostato, aggiungendo acido acetico o idrossido di sodio ai campioni per regolare il pH a 3,0. Eseguiamo questo protocollo per l'eluizione simultanea e il caricamento di fosfopeptidi sulla punta dello stadio C18. Pertanto, è importante equilibrare la punta dello stadio IMAC prima dell'eluizione del fosfopeptide per garantire che la concentrazione di ACN sia inferiore al 5%.
Il numero di frazioni dipende dalla complessità e dalle dimensioni del campione. Tipicamente, da 5 a 8 frazioni sono sufficienti per fornire un'ampia copertura dell'identificazione del fosfopeptide nelle piante. La concentrazione di ACN nei tamponi di frazionamento può essere regolata in base all'idrofobicità dei campioni. La maggior parte dei fosfopeptidi viene eluitta da perline C18 utilizzando una concentrazione di ACN dal 5% al 25%. I fosfopeptidi sono tipicamente più idrofili rispetto ai peptidi non fosforilati a causa delle cariche negative aggiuntive del gruppo fosfato. Tuttavia, l'etichettatura del reagente TMT su N-terminale del peptide porta ad un aumento dell'idrofobicità dei peptidi etichettati27, il che può spiegare perché sono stati identificati meno fosfopeptidi nelle prime due frazioni nel nostro caso(figura 2A). Pertanto, un test che utilizza un reagente TMT-zero e un'aliquota di campioni può essere utilizzato per valutare il numero di frazioni e la concentrazione di ACN in ogni tampone di frazionamento. I buffer ottimizzati possono comportare una migliore efficienza di separazione dei fosfopeptidi etichettati TMT-6plex.
I limiti del frazionamento basato sulla punta dello stadio sono il numero di frazioni e la capacità delle punte. È difficile espandere il numero di frazioni nella separazione della punta dello stadio perché i buffer gradienti discontinui vengono utilizzati per il frazionamento della punta dello stadio. D'altra parte, una sfumatura continua può essere applicata alle colonne HPLC per ottenere un numero di frazione elevato. La capacità delle punte è un altro fattore che limita l'applicazione delle punte dello stadio. Per l'analisi fosfoproteomica su larga scala (> 10 mg di proteine) è meglio utilizzare l'arricchimento a base di HPLC con una lunghezza della colonna più lunga imballata con più perline C18 e frazionamento, che va oltre la scala analitica delle punte dello stadio. Nel complesso, l'arricchimento e il frazionamento del fosfopeptide a punta di stadio sono un metodo utile per analisi fosfoproteomiche su piccola e media scala. Questo approccio può essere integrato con l'etichettatura isobarica per ottenere una quantificazione multiplexata. I risultati hanno anche dimostrato che potrebbe essere utilizzato per la profilazione e la quantificazione della fosfoproteomica vegetale approfondita. Questo flusso di lavoro è applicabile ad altre specie e diversi tipi di tessuti per la delimitazione di reti di segnalazione specializzate.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca strategica prioritaria dell'Accademia cinese delle scienze, Grant XDB27040106.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
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