Summary
Apresentada aqui é uma abordagem fosfoproteômica, ou seja, parar e ir extração baseada em fosfoproteômica, que fornece alta produtividade e cobertura profunda de fosfoproteome arabidopsis. Esta abordagem delineia a visão geral da sinalização de estresse osmótico em Arabidopsis.
Abstract
A fosforilação proteica é crucial para a regulação da atividade enzimática e expressão genética sob condição osmótica. A espectrometria de massa (masfoproteômica baseada em MS) transformou a maneira de estudar a transdução de sinal vegetal. No entanto, a exigência de muitos materiais iniciais e tempo de medição prolongado de MS para alcançar a profundidade da cobertura tem sido o fator limitante para o estudo de alto rendimento das mudanças fosfoproteômicas globais nas plantas. Para melhorar a sensibilidade e o throughput da fosfoproteômica vegetal, desenvolvemos uma abordagem de fosfoproteômica baseada em ponta (estágio) em conjunto com a rotulagem tandem mass tag (TMT) para a análise rápida e abrangente da perturbação da fosforilação vegetal em resposta ao estresse osmótico. Aproveitando a simplicidade e o alto rendimento da técnica de ponta de palco, todo o procedimento leva aproximadamente uma hora usando duas dicas para finalizar o enriquecimento de fosforpecida, fracionamento e etapas de limpeza de amostras, sugerindo uma facilidade de uso e alta eficiência da abordagem. Essa abordagem não só fornece uma análise de fosfoproteômica vegetal aprofundada (> 11.000 identificação de fosfopeptídeo), mas também demonstra a eficiência de separação superior (< 5% sobreposição) entre frações adjacentes. Além disso, o multiplexing foi alcançado usando rotulagem TMT para quantificar as alterações fosfoproteômicas de plantas mutantes desocuple tipo selvagem e snrk2. Esta abordagem tem sido usada com sucesso para revelar os eventos de fosforilação de cinesases semelhantes a Raf em resposta ao estresse osmótico, que lança luz sobre a compreensão da sinalização osmótica precoce em plantas terrestres.
Introduction
Alta salinidade, baixa temperatura e seca causam estresses osmóticos, que é um dos principais fatores ambientais que afetam a produtividade das plantas1,2. A fosforilação proteica é uma das modificações pós-translacionais mais significativas que mediam a percepção e transdução do sinal na resposta vegetal ao estresse osmótico3,4,5. A proteína quinase 2s (SnRK2s) relacionada ao SNF1 está envolvida na sinalização de estresse osmótico6. Nove dos dez membros da família SnRK2 mostram ativação significativa em resposta ao estresse osmótico7,8. O mutante snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dez) mutante com mutações em todos os dez SnRK2 exibiu hipersensibilidade ao estresse osmótico. No mutante snrk2-dec, o acúmulo induzido pelo estresse osmótico de inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3),biossíntese de ácido abscisico (ABA) e expressões genéticas são fortemente reduzidas, destacando o papel vital do SnRK2s nas respostas ao estresse osmótico6. No entanto, ainda não está claro como os kinases SnRK2s regulam esses processos biológicos. Traçar o perfil das mudanças fosfoproteômicas em resposta ao estresse osmótico é uma maneira eficiente de preencher essa lacuna e delinear os mecanismos de defesa desencadeados pelo estresse osmótico nas plantas.
Espectrometria de massa (MS) é uma técnica poderosa para mapear o fosfoproteome vegetal9. A caracterização da fosfoproteômica vegetal, no entanto, continua sendo um desafio devido ao alcance dinâmico do proteome vegetal e à complexidade do lysatevegetal 4. Para superar esses desafios, desenvolvemos um fluxo de trabalho fosfoproteômico universal de plantas, que elimina interferências indesejadas, como pigmentos fotossintéticos e metabólitos secundários, e permite a cobertura profunda do fosfoproteomevegetal 10. Vários métodos de enriquecimento de fosfopeptídeos, como cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizados (IMAC) e cromatografia de óxido de metal (MOC) foram desenvolvidos para enriquecer fosfopeptídeos antes da análise de MS11,12,13,14,15,16. Os não fosfopeptídeos ácidos co-purificadores com fosfopeptídeos são as principais interferências para a detecção de fosfopeptídeos. Anteriormente, padronizamos o valor do pH e a concentração de ácido orgânico do tampão de carga IMAC para eliminar a vinculação de não fosfopeptídeos, para obter mais de 90% de especificidade de enriquecimento contornando a etapa de pré-fracionamento11.
A perda de amostras no processo de várias etapas de enriquecimento e fracionamento de fosfopeptídeo dificulta a sensibilidade da identificação de fosfopeptídeo e a profundidade da cobertura fosfoproteômica. As dicas de parassar e fazer extração (pontas de palco) são pontas de pipeta que contêm pequenos discos para tampar a ponta, que podem ser incorporadas com cromatografia para fracionamento de peptídeos e limpeza17. A perda amostral durante o procedimento da ponta de estágio pode ser minimizada evitando a transferência de amostras entre os tubos. Implementamos com sucesso a ponta de estágio em Ga3+-IMAC e Fe3+-IMAC para separar peptídeos múltiplos de fosfoiltos de fosforilados baixos de peptídeos fosfoilados, que melhoraram a profundidade do fosfoproteome humano15. Além disso, o uso de ponta de estágio de fase de fase de alta fase reversa de pH (Hp-RP) demonstrou a maior cobertura do proteome da membrana humana em comparação com a da forte troca de cation (SCX) e da forte cromatografia de troca de ânion (SAX)18. Portanto, integrar técnicas de ponta de estágio IMAC e Hp-RP pode aumentar a cobertura de fosfoprotetor de plantas com simplicidade, alta especificidade e alto rendimento. Demonstramos que essa estratégia identificou mais de 20.000 sítios de fosforilação de mudas arabidopsis, representando uma profundidade aprimorada de fosfoproteome vegetal19.
Aqui, relatamos um protocolo fosfoproteômico baseado em pontas de palco para perfil fosfoproteômico em Arabidopsis. Este fluxo de trabalho foi aplicado para estudar a perturbação fosfoproteômica de mudas mutantes do tipo selvagem e snrk2-dec em resposta ao estresse osmótico. A análise fosfoproteômica revelou os locais de fosforilação implicados na ativação da quinase e na sinalização de estresse osmótico precoce. A análise comparativa dos dados de fosfoproteome mutante do tipo selvagem e snrk2-dec levou à descoberta de uma cascata de quinase semelhante a Raf (RAF)-SnRK2, que desempenha um papel fundamental na sinalização de tensão dos osmore em plantas altas.
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Protocol
1. Preparação da amostra
- Colher as mudas tratadas de controle e estresse (1 g) em uma folha de alumínio e congelar as amostras em nitrogênio líquido.
NOTA: A maior concentração de proteínas é geralmente observada a partir de mudas de duas semanas de idade do que as de plantas maduras. Um grama de mudas gera aproximadamente 10 mg de proteína lysate, o que é suficiente para a análise de MS. Todas as etapas de centrifugação ocorrem a 16.000 x g na etapa 1. - Triture mudas congeladas em pó fino usando uma argamassa e pilão cheias de nitrogênio líquido.
- Adicionar 1 mL de tampão de lise ((6 M guanidina-HCl em 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) com 10 mM Tris (2-carboxyethyl)hidrocloreto de fosfina (TCEP), 40 mM 2-cloroacetamida (CAA), inibidor de protease e coquetéis inibidores de fosfatase) à argamassa e mistura com o auxílio do pilão.
- Transfira a planta para um tubo de 1,5 mL e aqueça a 95 °C por 5 min.
- Coloque o tubo no gelo por 10 minutos. Sonicar o tubo no gelo por 10 s, pausar por 10 s, e repetir três vezes.
- Centrifugar o tubo por 20 min e aliquot 150 μL de lisato de planta em um tubo de 1,5 mL.
- Adicione 600 μL de 100% de metanol no tubo. Vórtice e gire pelo tubo.
- Adicione 150 μL de 100% clorofórmio no tubo. Vórtice e gire pelo tubo.
- Adicione 450 μL de ddH2O no tubo. Vórtice e centrífuga do tubo por 3 minutos.
- Descarte a camada aquosa superior. Adicione 600 μL de 100% de metanol no tubo. Centrifugar o tubo por 3 minutos e, em seguida, descartar a solução.
- Lave pelotas de proteína com 600 μL de 100% de metanol. Descarte a solução e seque a pelota de proteína.
- Resuspend pelotas de proteína em 600 μL de tampão de digestão (12 mM desoxicolato de sódio (SDC)/12 mM de sódio lauroyl sarcosinate (SLS) em 100 mM Tris-HCl, pH 8.5). Sonicar o tubo até que a suspensão seja homogeneizada.
- Meça a concentração proteica utilizando um kit BCA e ajuste a concentração para 4 μg/μL com o tampão de digestão. Transfira 100 μL do lysato (400 μg de proteínas) para um novo tubo.
- Adicione 292 μL de 50 mM trietilamônio bicarbonato (TEAB) e 8 μL de Lys-C (2,5 Unidade/mL) ao tubo. Incubar o tubo a 37 °C por 3 h.
- Adicione 100 μL de 50 mM TEAB com 8 μg de trippsina ao tubo. Incubar o tubo a 37 °C por 12 h.
- Adicione 25 μL de ácido trifluoroacético de 10% (TFA) ao tubo. Vórtice e centrífuga do tubo por 20 min a 4 °C.
- Transfira o supernatante para uma coluna de desalte condicionada para desalting. Seque o elunato usando um concentrador de centrífuga a vácuo.
NOTA: Ative a resina com 1 mL de metanol seguido de 1 mL de 0,1% TFA em acetonitrila de 80% (ACN). Lave o solvente orgânico com pelo menos 3 mL de 0,1% de TFA em 5% de ACN. Carregue amostras de peptídeo acidificados preparadas na etapa 1.16 na coluna e depois lave a coluna com pelo menos 3 mL de 0,1% TFA em 5% de ACN. Mais lavagens podem ser necessárias para amostras com altas concentrações de sal. Elute os fosfopeptídeos com 1 mL de 0,1% TFA em 80% ACN.
2. Etiqueta de Etiqueta de Massa Tandem (TMT)
- Resuspend os peptídeos secos em 100 μL de 200 mM 4-(2-hidroxiilo)-1-piperazineethanelfonic ácido (HEPES), pH 8.5.
- Dissolva o reagente TMT de cada canal (0,8 mgs) em 40 μL de ACN anidro. Vórtice o tubo de reagente TMT por 5 minutos e gire-o para baixo.
- Transfira 40 μL de TMT para o tubo de amostra e incubar por 1h à temperatura ambiente.
NOTA: Neste experimento, o canal 126 a 128 foi rotulado com três réplicas biológicas de plantas sem tratamento de manitol, e o canal 129 a 131 foi rotulado com três réplicas biológicas de plantas com tratamento de manitol. - Adicione 8 μL de 5% de hidroxilamina e incubar por 15 min.
- Misture 6 amostras em um tubo de 5 mL e adicione 14 μL de 10% TFA.
- Adicione 3.876 μL de 0,1% TFA ao tubo. Vórtice e girar para baixo.
- Transfira a solução para uma coluna de desalting condicionada para desalar. Seque o eluado usando um evaporador.
3. Preparação da ponta do estágio IMAC
- Use uma agulha de 16 G para penetrar um disco frit de polipropileno.
NOTA: Segure o cortador perpendicular à superfície do disco e role o cortador algumas vezes para ter certeza de que o disco está completamente extirpado. Coloque o disco em uma placa de Petri para armazenamento. Coloque a agulha em uma ponta de pipeta de 200 μL e empurre o frit para a ponta usando um êmbolo. - Pressione o frit suavemente na ponta usando um êmbolo para tampar a ponta.
- Coloque o disco frito em pontas com a mesma pressão, o que proporciona melhor reprodutibilidade. A reprodutibilidade da produção de pontas de palco é importante para a pressão constante das costas, o que afeta o tempo das etapas centrífugas e a reprodutibilidade entre as réplicas técnicas.
- Se as dicas de palco mostrarem alta pressão nas costas durante a etapa de condicionamento, descarte as pontas para evitar possíveis entupimentos de ponta ao carregar amostras. Pode ser que o disco possa ter sido pressionado com muita força na posição.
- Inverta a coluna de giro Ni-NTA e coloque em um tubo de 1,5 mL.
- Use um êmbolo para pressionar o frit de contas Ni-NTA suavemente e empurre as contas para dentro do tubo.
NOTA: Certifique-se de empurrar o frit suavemente para evitar a perda potencial de contas ou adsorção na coluna de giro.
4. Preparação da ponta do estágio Hp-RP
- Prepare a ponta do estágio Hp-RP, conforme descrito para a ponta de palco do IMAC usando um disco C8.
NOTA: Não aplique grande força ao disco porque pode resultar em um frit densamente embalado e aumentar a pressão traseira da ponta do palco. Todas as etapas de centrifugação ocorrem a 1.000 x g por 5 min na etapa 4. - Suspenda 1 mg de contas C18 em 100 μL 100% de metanol e passe a solução de contas através da ponta.
- Adicione 20 μL de tampão 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2, pH 10.0) à ponta do palco e passe tampão 8 através da ponta por centrifugação.
- Adicione 20 μL de Buffer A (200 mM NH4HCO2) à ponta do palco e passe o buffer A através da ponta por centrifugação.
NOTA: Equilibre a centrífuga durante o uso e certifique-se de que a ponta do estágio Hp-RP não esteja completamente seca.
5. Preparação do adaptador de giro
- Use pinças de extremidade afiada para perfurar um orifício no centro da tampa de um tubo de 1,5 mL.
- Insira a ponta do estágio IMAC ou a ponta do estágio Hp-RP no orifício do adaptador de giro.
NOTA: Certifique-se de que a ponta do palco não está perto da parte inferior do adaptador de giro.
6. Enriquecimento de fosforpecida usando ponta de palco IMAC
- Suspenda as contas Ni-NTA de 10 mg com 400 μL de tampão de carga (ácido acético de 6% (AA), pH 3.0) e carregue todas as contas em por ponta. Passe a solução através da ponta por centrifugação.
NOTA: Todas as etapas de centrifugação ocorrem a 200 x g para 3 min na etapa 6, além da etapa 6.8. - Carregar 100 μL de ácido edradiaminatoacético de 50 mM (EDTA) para retirar os íons de níquel da ponta do estágio IMAC e passar a solução através da ponta por centrifugação.
- Carregue 100 μL de tampão de carga até a ponta do palco e passe a solução através da ponta por centrifugação.
- Carregar 100 μL de 50 mM FeCl3 em 6% AA até a ponta do palco e passar a solução através da ponta por centrifugação. Os íons Fe3+ vão se passar pela ponta do estágio do IMAC.
- Carregue 100 μL de tampão de carga para condicionar a ponta do palco e passar a solução através da ponta por centrifugação.
- Carregue 100 μL de tampão de carga com peptídeos de amostra preparados na etapa 2.7 até a ponta do palco e passe a solução através da ponta por centrifugação.
NOTA: Tome um novo tubo como adaptador de rotação para coletar o fluxo da amostra e armazene o fluxo no congelador para análise futura. - Carregue 100 μL de tampão de lavagem (4,5% AA e 25% ACN) até a ponta do palco e passe a solução através da ponta por centrifugação.
- Realize a segunda lavagem com tampão de carga. Carregue 100 μL de tampão de carga até a ponta do palco e passe a solução através da ponta usando centrífuga de 1000 × g por 3 min.
NOTA: Certifique-se de que o tampão de lavagem seja substituído por um tampão de carga na ponta do estágio para eliminar a perda de fosforpeptídeos durante a etapa de eluição. Equilibre a ponta do estágio IMAC antes da eluição do fosforpeptídeo para garantir que a concentração da ACN seja inferior a 5%. - Apare a ponta do estágio IMAC na frente com uma tesoura e coloque a ponta de palco do IMAC aparada dentro da ponta Hp-RP. Certifique-se de que as duas camadas de pontas de palco não toquem na tampa da centrífuga.
7. Fracionamento de fosfopeptídeo usando ponta de estágio Hp-RP C18
- Adicione 100 μL de tampão de elução (fosfato de amônio de 200 mM (NH4H2PO4)) à ponta do estágio IMAC aparada e passe a solução através das duas camadas de pontas de estágio por centrifugação.
NOTA: Se a solução não passar pela ponta do estágio, aumente a velocidade de rotação para baixo. Todas as etapas de centrifugação ocorrem a 1.000 x g por 5 min na etapa 7. Todos os buffers Hp-RP estão listados na Tabela 1. - Descarte a ponta de estágio do IMAC usando uma pinça e adicione 20 μL de Buffer A à ponta do estágio Hp-RP e passe o buffer através da ponta por centrifugação.
NOTA: Certifique-se de que todo o buffer de elução passe pela ponta do estágio IMAC antes de descartá-lo. - Adicione 20 μL de Buffer 1 à fração elute 1 e colete o elunato em um novo tubo por centrifugação. Repita o processo com buffers 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 para coletar cada fração em um novo tubo. Seque o eluado final de cada fração usando um concentrador de vácuo.
NOTA: Prepare buffers de fracionamento frescos. Tome 8 novos tubos como adaptador de giro de cada fração. Colete o eluato de cada fração em um adaptador de giro diferente. Os fosforpeptídeos não são estáveis em condições básicas, por isso seque os elunatos por um concentrador ou acidificados por 10% de TFA imediatamente.
8. Análise e análise de dados LC-MS/MS
- Adicione 5 μL de ácido fórmico de 0,1% (FA) e analise a amostra por um espectrômetro de massa.
- Execute um gradiente de 90 min com 6-30% tampão B (80% ACN e 0,1% FA) para cada fração.
- Fragmente os peptídeos rotulados top 10 usando alta dissociação de energia de colisão (HCD). Complete uma pesquisa no banco de dados para identificar sites de fosforilação.
- Carregue os arquivos brutos no software MaxQuant, nomeie os experimentos e defina frações e PTM.
NOTA: O tutorial do software MaxQuant pode ser encontrado em https://www.maxquant.org/. - Selecione o ion MS2 no tipo de execução LC-MS/MS e TMT de 6plex como rótulos isobáricos. Habilite o filtro pela função PIF e defina o PIF min como 0,75.
- Selecione Acetil (Protein N-term), Oxidação (M) e Phospho (STY) no painel de modificações variáveis. Selecione Carbamidometila (C) como modificações fixas.
- Defina o modo de digestão como específico, selecione Trypsin/P como enzima de digestão e dois decotes perdidos.
- Defina a taxa de descoberta falsa do PSM (FDR) e a proteína FDR como 0,01. Defina a pontuação mínima para peptídeos modificados como 40.
- Adicione o banco de dados Arabidopsis thaliana ao painel de arquivos fasta e execute a pesquisa do banco de dados.
- Carregue o arquivo txt dos sites Phospho (STY) para o software Perseus à medida que a pesquisa é feita.
NOTA: Os tutoriais detalhados do software Perseus podem ser encontrados em https://www.maxquant.org/perseus/. - Filtre os locais de fosforilação reversa. Filtre os locais de fosforilação não localizados usando a probabilidade de localização 75% como o corte.
- Use as intensidades dos locais de fosforilação para análise estatística.
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Representative Results
Para demonstrar o desempenho deste fluxo de trabalho, exploramos a ponta de palco do IMAC juntamente com o fracionamento da ponta do estágio Hp-RP para medir as mudanças fosfoproteômicas em mudas mutantes de tipo selvagem e snrk2-dec com ou sem tratamento mannitol por 30 minutos. Cada amostra foi realizada em triplicados biológicos, e o fluxo de trabalho experimental está representado na Figura 1. Os peptídeos digeridos (400 μg) de cada amostra foram rotulados com um canal TMT-6plex, agrupado e desselgado. Os fosforpeptídeos foram ainda mais enriquecidos usando uma ponta de estágio IMAC, e os fosfopeptídeos purificados foram posteriormente fracionados em oito frações por uma ponta de estágio Hp-RP. Cada fração foi analisada por uma análise gradiente de LC de 90 min. Os arquivos brutos foram pesquisados usando um mecanismo de busca contra o banco de dados Arabidopsis Thaliana.
Foram identificados 11.077 fosfopeptídeos únicos correspondentes a 3.630 fosfoproteínas com 6.852 locais localizados de fosforilação (Classe I, probabilidade de localização > 0,75), indicando a ampla cobertura do fosfoproteome arabidopsis. Foram identificados 8.107 e 7.248 fosforpeptides a partir de amostras mutantes de tipo selvagem e snrk2-dec, respectivamente. Isso ilustra a eficiência do fluxo de trabalho no fornecimento de cobertura aprofundada para delinear a visão global da transdução de sinal na Arabidopsis. Comparamos o número de fosfopeptídeos identificados em 8 frações. Alguns fosfopeptídeos foram identificados nas duas primeiras frações, a fração 1 e 2. No entanto, a maioria dos fosfopeptídeos foram distribuídos uniformemente nas outras 6 frações (Figura 2A), sugerindo que esta abordagem fornece a capacidade de separar fosfopeptídeos complexos do fosfoproteome vegetal. Para demonstrar ainda mais a eficiência de separação deste fluxo de trabalho, avaliamos a sobreposição de fosforpeptídeos entre duas frações adjacentes (eq. F1-to-F2). Menos de 5% de fosforpeptídeos se sobrepõem nas frações adjacentes, indicando eficiência de fracionamento robusta da ponta do estágio Hp-RP(Figura 2B).
Usando os dados obtidos pelo fluxo de trabalho, comparamos os perfis fosfoproteômicos do mutante tipo selvagem e snrk2-dec no tratamento de manitol. Um total de 433 e 380 locais de fosforilação foram aumentados após o tratamento de manitol em amostras mutantes de tipo selvagem e snrk2-dec, respectivamente(Figura 3). Entre isso, 312 fosites apresentaram indução (FDR < 0,01) em tipo selvagem, mas não em plantas mutantes snrk2-dec. A análise da Ontologia Genética (GO) revelou que a função da fosforilação e ativação da quinase proteica, regulação do processo metabólico fosfato, transdução de sinais, são significativamente enriquecidas nas fosfoproteínas dependentes de SnRK2. Curiosamente, o termo GO relacionado ao desenvolvimento radicular também foi enriquecido no grupo dependente do SnRK2, consistente com o fenótipo de retardamento do crescimento raiz sob estresse osmótico6. Também identificamos 116 fosfositas reguladas pelo tratamento mannitol tanto no tipo selvagem quanto no mutante snrk2-dec. Essas fosfoproteínas eram independentes do SnRK2, ou candidatos que mediam a sinalização acionada pelo estresse osmótico antes da ativação do SnRK2s. Observou-se que vários RAFs do subgrupo B4, como RAF18 (AT1G16270), RAF24 (AT2G35050) e RAF42 (AT3G46920), foram significativamente regulados pelo estresse osmótico. Estudo suplementar revelou que as quinases da RAF são rapidamente ativadas por estresse osmótico e necessárias para fosforilação e ativação do SnRK2s20.
Figura 1: Fluxo de trabalho do método fosfoproteômico baseado em ponta de palco. A proteína foi extraída e digerida a partir de mudas mutantes do tipo selvagem e snrk2-dec tratadas com ou sem manitol. Os peptídeos digeridos de cada réplica foram rotulados com um canal TMT6-plex exclusivo. Os fosforpeptídeos foram agrupados e enriquecidos usando uma ponta de palco IMAC. Os fosfopeptídeos purificados foram separados por uma ponta de estágio Hp-RP. Cada fração foi analisada por espectrômetro de massa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Perfil fosfoproteômico de mudas mutantes tipo selvagem e snrk2 decuple por ponta de palco IMAC e fracionamento hp-rp. (A) O número de fosfopeptídeos identificados por fração. (B) A eficiência de separação da cromatografia hp-rp baseada em ponta de palco. A sobreposição entre as frações adjacentes é representada pela porcentagem do mesmo peptídeo identificado nas frações adjacentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação das alterações fosfoproteômicas em resposta ao estresse osmótico. As tramas vulcânicas mostram a alteração de 2º tempo de sítios de fosforilação em (A) tipo selvagem e(B) mudas mutantes snrk2-dec em resposta ao tratamento de manitol. O círculo negro representa os sítios de fosforilação da quinase induzidos pelo manitol. O círculo vermelho indica os locais de fosforilação de RAFs regulados em resposta ao manitol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tampão A | Formato de amônio de 200 mM (NH4HCO2), pH 10.0. | |
| Tampão B | 100% ACN. | |
| Buffer 1 | 5% tampão B, 95% buffer A. | |
| Tampão 2 | 8% tampão B, 92% buffer A. | |
| Buffer 3 | 11% tampão B, 89% buffer A. | |
| Buffer 4 | 14% tampão B, 86% buffer A. | |
| Buffer 5 | 17% tampão B, 83% buffer A. | |
| Buffer 6 | 20% tampão B, 80% buffer A. | |
| Buffer 7 | 23% tampão B, 77% buffer A. | |
| Buffer 8 | 80% tampão B, 20% buffer A. | |
Tabela 1: Buffers para fracionamento da ponta do estágio Hp-RP.
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Discussion
O alcance dinâmico e a complexidade do proteome vegetal e do fosfoproteome ainda são um fator limitante à profundidade das análises fosfoproteômicas. Apesar da capacidade de análise lc-MS/MS de execução única para identificar 10.000 locais de fosforilação21,22, a cobertura de todo o fosfoproteome vegetal ainda é limitada. Portanto, é necessário um fluxo de trabalho fosfoproteômico que ofereça alta sensibilidade e eficiência de separação superior no perfil da visão global das redes de sinalização vegetal em resposta ao estresse ambiental. Cromatografia líquida comercial de alta pressão (HPLC) é um método comum para reduzir a complexidade do peptídeo antes da análise de EM23,24. No entanto, etapas tediosas de coleta de amostras e grande volume de eluição são os principais desafios dos métodos baseados em HPLC em termos de sensibilidade e throughput. ponta de palco é uma abordagem alternativa para executar pré-fracionamento ou enriquecimento de peptídeos para obras de alta sensibilidade e alta produtividade. Este novo fluxo de trabalho fosfoproteômico explorando rotulagem isobárica aliada ao enriquecimento e fracionamento de fosfopeptídeo proporciona melhor cobertura e profundidade da fosfoproteômica vegetal sobre outros fluxos de trabalho fosfoproteômicos25,26.
O valor do pH das amostras é o fator crucial que determina a especificidade de enriquecimento dos fosfopeptídeos. O valor do pH pode ser afetado pela etapa anterior de preparação da amostra, por isso é essencial verificar o valor do pH antes do carregamento da amostra. Se o pH for deslocado, adicionar ácido acético ou hidróxido de sódio às amostras para ajustar o pH para 3,0. Executamos este protocolo para elução simultânea e carregamento de fosforpeptídeos na ponta do palco C18. Por isso, é importante equilibrar a ponta do estágio IMAC antes da eluição do fosforpeto para garantir que a concentração da ACN seja inferior a 5%.
O número de frações depende da complexidade e tamanho da amostra. Normalmente, 5 a 8 frações são suficientes para fornecer ampla cobertura da identificação de fosfopeptídeos nas plantas. A concentração de ACN em tampões fracionados pode ser ajustada de acordo com a hidroofobidade das amostras. A maioria dos fosfopeptídeos são elucidos de contas C18 usando a faixa de 5% a 25% de concentração de ACN. Os fosforpeptídeos normalmente são mais hidrofílicos em comparação com peptídeos não fosfoilados devido às cargas negativas adicionais do grupo fosfato. No entanto, a marcação do reagente TMT no N-terminus de peptídeo leva a um aumento da hidrofobióbica dos peptídeos rotulados27, o que pode explicar por que menos fosfopeptídeos foram identificados nas duas primeiras frações em nosso caso(Figura 2A). Assim, um teste utilizando um reagente TMT-zero e uma alíquota de amostras pode ser usado para avaliar o número de frações e a concentração de ACN em cada buffer de fracionamento. Os buffers otimizados podem resultar em uma melhor eficiência de separação de fosforpeptídeos rotulados por TMT-6plex.
As limitações do fracionamento baseado em pontas de palco são o número de frações e a capacidade de gorjetas. É difícil expandir o número de frações na separação da ponta de estágio porque buffers de gradiente descontínuos são usados para fracionamento de ponta de estágio. Por outro lado, um gradiente contínuo pode ser aplicado às colunas HPLC para alcançar um número de fração alto. A capacidade das dicas é outro fator que limita a aplicação de dicas de palco. Para análise de fosfoproteômica em larga escala (> proteínas de 10 mg) é melhor usar o enriquecimento baseado em HPLC com comprimento de coluna mais longo embalado com mais contas C18 e fracionamento, que está além da escala analítica das pontas de estágio. Juntos, o enriquecimento e fracionamento de fosfopeptídeos baseados em pontas de palco é um método útil para análises de fosfoproteomia de pequena a média escala. Essa abordagem pode ser integrada com rotulagem isobárica para alcançar quantificação multiplexada. Os resultados também demonstraram que ele poderia ser usado para perfil e quantificação de fosfoproteômica vegetal em profundidade. Este fluxo de trabalho é aplicável a outras espécies e diferentes tipos de tecidos para o delineamento de redes de sinalização especializadas.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Estratégica Prioritária da Academia Chinesa de Ciências, Grant XDB27040106.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
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