Summary
Представлено здесь фосфопротеомный подход, а именно остановить и пойти экстракции отзыв основе фосфопротеом, который обеспечивает высокую пропускную способность и глубокий охват фосфопротеом Arabidopsis. Такой подход разграничивает обзор осмотического стресса, сигнализируемого в арабидопсисе.
Abstract
Фосфорилирование белка имеет решающее значение для регуляции активности ферментов и экспрессии генов в осмотическом состоянии. Масс-спектрометрия (МС) на основе фосфопротеомики изменила способ изучения трансдукции сигнала растений. Тем не менее, требование много стартовых материалов и длительное время измерения MS для достижения глубины охвата был ограничивающим фактором для высокой пропускной способности исследования глобальных фосфопротеомных изменений в растениях. Для повышения чувствительности и пропускной способности растений фосфопротемики, мы разработали остановки и идти извлечения (этап) наконечник на основе фосфопротеомики подход в сочетании с Tandem Mass Tag (TMT) маркировки для быстрого и всестороннего анализа возмущения фосфорилирования растений в ответ на осмотический стресс. Используя простоту и высокую пропускную способность техники наконечника этапа, вся процедура занимает около одного часа, используя два совета, чтобы закончить обогащение фостопептида, фракционирование и шаги очистки образца, предлагая простой в использовании и высокую эффективность подхода. Такой подход не только обеспечивает углубленный анализ фосфопротеомики растений (идентификация фосфопептида 11 000), но и демонстрирует превосходную эффективность разделения (на 5% перекрытие) между смежными фракциями. Кроме того, мультиплексирование было достигнуто с помощью маркировки TMT для количественной оценки фосфопротеомных изменений растений-мутантов дикого типа и snrk2 decuple. Этот подход успешно используется для того, чтобы выявить фосфориляционные события раф-киназа в ответ на осмотический стресс, который проливает свет на понимание ранней осмотической сигнализации в наземных растениях.
Introduction
Высокая соленость, низкая температура и засуха вызывают осмотические стрессы, что является основным экологическим фактором, влияющим на продуктивностьрастений 1,2. Фосфорилирование белка является одним из наиболее значительных пост-трансляционных модификаций, о посредничестве восприятия сигнала и трансдукции в реакции растенийна осмотический стресс 3,4,5. SNF1 связанных белка киназы 2s (SnRK2s) участвуют в осмотическом стрессе сигнализации6. Девять из десяти членов семьи SnRK2 показывают значительную активацию в ответ на осмотический стресс7,8. snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec) мутант, имеющих мутации во всех десяти SnRK2 отображается повышенная чувствительность к осмотическому стрессу. В snrk2-dec мутант, осмотическое стресс-индуцированного накопления инозитол 1,4,5-тризфосфата (IP3), абсцизиновой кислоты (ABA) биосинтеза, и экспрессии генов сильно снижается, подчеркивая жизненно важную роль SnRK2s в осмотической реакциистресса 6. Тем не менее, до сих пор неясно, как SnRK2s kinases регулировать эти биологические процессы. Профилирование фосфопротеомных изменений в ответ на осмотический стресс является эффективным способом преодоления этого разрыва и разграничения осмотических стрессовых механизмов защиты растений.
Масс-спектрометрия (МС) является мощным методом для картирования фосфатом растений9. Характеристика растительной фосфопротеомики, однако, остается проблемой из-за динамического диапазона протеома растений и сложности растительноголисата 4. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали универсальный фосфопротеомный рабочий процесс растений, который устраняет нежелательные помехи, такие как фотосинтетические пигменты и вторичные метаболиты, и позволяет глубокий охват фосфатом растений10. Несколько методов обогащения фоспопептида, таких как иммобилизованная хроматография сродства металла (IMAC) и хроматография оксида металла (MOC) были разработаны для обогащения фоспопептидов до анализа MS11,12,13,14,15,16. Кислотные нефостопептиды, соочищающиеся с помощью фостопептидов, являются основными помехами для обнаружения фостопептида. Ранее мы стандартизировали значение рН и концентрацию органической кислоты буфера загрузки IMAC для устранения связывания нефостопептидов, чтобы получить более 90% специфичности обогащения в обход предварительного дробного шага11.
Потеря образцов в многоступенчатом процессе обогащения и фракционирования фоспопептида препятствует чувствительности идентификации фоспопептида и глубине фосфопротеомного покрытия. Стоп-и-гоу-экстракции советы (этап советы) являются пипетки советы, которые содержат небольшие диски, чтобы крышка конца кончика, который может быть включен с хроматографии для пептидной фракциоции иочистки 17. Потеря образца во время процедуры наконечника этапа может быть сведена к минимуму, избегая передачи образца между трубками. Мы успешно внедрили наконечник этапа в Ga3"-IMAC и Fe3"-IMAC, чтобы отделить низкий обильный несколько фосфорилированных пептидов от потихоть фосфорилированных пептидов, которые улучшили глубину фосфопротеомачеловека 15. Кроме того, использование высокой рН обратной фазы (Hp-RP) кончик стадии продемонстрировал более широкий охват человеческой мембраны протеом по сравнению с сильным обменом катиона (SCX) и сильный анионный обмен (SAX) хроматографии18. Таким образом, интеграция IMAC и Hp-RP этапе отзыв методы могут увеличить покрытие фосфатом растений с простотой, высокой специфичностью и высокой пропускной способностью. Мы показали, что эта стратегия определила более 20000 участков фосфорилирования из саженцев Арабидопсиса, что представляет собой повышенную глубину растительного фосфопротеома19.
Здесь мы сообщаем о этапе наконечник основе фосфопротеомного протокола для фосфопротеомного профилирования в Arabidopsis. Этот рабочий процесс был применен для изучения фосфопротеомного возмущения саженцев диких и snrk2-dec мутантов в ответ на осмотическое напряжение. Фосфопротеомный анализ выявил фосфорилирование сайтов, причастных к активации киназы и раннего осмотического стресса сигнализации. Сравнительный анализ дикого типа и snrk2-dec мутант фосфопротеом данных привело к открытию Raf-как киназы (RAF)-SnRK2 киназы каскад, который играет ключевую роль в осмор стресс сигнализации в высоких растений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Пример подготовки
- Урожай контроля и стресса обработанные саженцы (1 г) в алюминиевой фольге и вспышки заморозить образцы в жидком азоте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокая концентрация белка обычно наблюдается у двухнедельных саженцев, чем у зрелых растений. Один грамм саженцев генерирует около 10 мг лисада белка, что достаточно для анализа MS. Все этапы центрифугации проходят на уровне 16 000 х г в шаге 1. - Измельчить замороженные саженцы в мелкий порошок с помощью раствора и пестика, наполненного жидким азотом.
- Добавьте 1 мл буфера лиза ((6 M гуанидин-HCl в 100 мМ Трис-HCl, рН 8,5) с 10 мМ Трис (2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (TCEP), 40 мМ 2-хлороацетамид (CAA), ингибитор протеазы и фосфатазы ингибитор коктейли) в раствор и смешать с помощью пестика.
- Перенесите лизат растения в трубку 1,5 мл и нагрейте при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
- Поместите трубку на лед на 10 мин. Sonicate трубки на льду в течение 10 с, пауза на 10 с, и повторить трижды.
- Центрифуга трубки в течение 20 мин и aliquot 150 йл растений лизать в 1,5 мл трубки.
- Добавьте в трубку 600 МКЛ 100% метанола. Вихрь и спина вниз по трубке.
- Добавьте в трубку 150 МКЛ 100% хлороформа. Вихрь и спина вниз по трубке.
- Добавьте в трубку 450 МКЛddH 2O. Вихрь и центрифуга трубки в течение 3 мин.
- Отбросьте верхний aqueous слой. Добавьте в трубку 600 МКЛ 100% метанола. Центрифуга трубки в течение 3 минут, а затем отказаться от раствора.
- Вымойте белковые гранулы 600 МКЛ 100% метанола. Откажитесь от раствора и высушите белковые гранулы.
- Resuspend белковых гранул в 600 л буфера пищеварения (12 мМ натрия дезоксихолата (SDC)/12 мМ натрия лауройл саркозинат (SLS) в 100 мМ Трис-HCl, рН 8,5). Sonicate трубки до подвески гомогенизации.
- Измерьте концентрацию белка с помощью комплекта BCA и отрегулируйте концентрацию до 4 мкг/йл с помощью буфера пищеварения. Перенесите 100 МКЛ ликата (400 мкг белков) в новую трубку.
- Добавьте в трубку 292 МКЛ из 50 мМ триэтиламмония бикарбоната (ТЭБ) и 8 МКЛ Lys-C (2,5 единицы/мл). Инкубировать трубку при 37 градусов по Цельсию в течение 3 ч.
- Добавьте в трубку 100 МКЛ из 50 мМ ТХАБ с 8 мкг трипсина. Инкубировать трубку при 37 градусов по Цельсию в течение 12 ч.
- Добавьте в трубку 25 МКЛ 10% трифтороакетической кислоты (ТФА). Вихрь и центрифуга трубки в течение 20 мин при 4 градусов по Цельсию.
- Перенесите супернатант в условный десалирование столбца для дезавуирования. Высушите элуат с помощью концентратора вакуумной центрифуги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Активировать смолу с 1 мл метанола следуют 1 мл 0,1% TFA в 80% ацетонитрил (ACN). Вымойте органический растворитель, по крайней мере 3 мл 0,1% TFA в 5% ACN. Загрузите подкисленные образцы пептида, подготовленные в шаге 1.16 в колонку, а затем промойте колонку не менее чем 3 мл 0,1% TFA в 5% ACN. Больше моет может быть необходимо для образцов с высокой концентрацией соли. Elute фостопептидов с 1 мл 0,1% TFA в 80% ACN.
2. Тандем Масса тегов (TMT) маркировки
- Повторное применение высушенных пептидов в 100 л 200 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетановая ульфонная кислота (HEPES), рН 8,5.
- Растворите реагент ТМТ каждого канала (0,8 мг) в 40 МКЛ ангидроуса ACN. Vortex реагент ТМТ трубки в течение 5 минут и спина его вниз.
- Перенесите 40 МКЛ ТМТ в образец трубки и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, канал 126 до 128 были помечены тремя биологическими репликациями растений без обработки маннитолом, и канал 129 до 131 были помечены тремя биологическими репликациями растений с лечением маннитолом. - Добавьте 8 мкл 5% гидроксиламина и инкубировать в течение 15 мин.
- Смешайте 6 образцов в трубке 5 мл и добавьте 14 МКЛ из 10% TFA.
- Добавьте в трубку 3876 МКЛ из 0,1% TFA. Вихрь и спина вниз.
- Перенесите раствор в условный столбец для дезавуирования. Высушите элуат с помощью испарителя.
3. Подготовка наконечника сцены IMAC
- Используйте 16 G тупой иглой, чтобы проникнуть в полипропиленовый фритовый диск.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите резак перпендикулярно поверхности диска и рулон резак пару раз, чтобы убедиться, что диск полностью вырезаны. Поместите диск в чашку Петри для хранения. Поместите иглу в наконечник пипетки 200 йл и нажмите фрит в кончик с помощью поршеня. - Нажмите фрит осторожно в кончик с помощью поршеня, чтобы крышка конца кончика.
- Поместите фрит-диск в советы с тем же давлением, которое обеспечивает лучшую воспроизводимость. Воспроизводимость стадии производства советы имеет важное значение для постоянного давления спины, что влияет на сроки шаги центрифуги и воспроизводимости между техническими репликациями.
- Если этап советы показывают высокое давление спины во время кондиционирования шаг, отказаться от советы, чтобы избежать потенциального засорения кончика при загрузке образцов. Вполне возможно, что диск, возможно, были нажаты слишком сильно в положение.
- Инвертировать колонку вращения Ni-NTA и разместить на трубе 1,5 мл.
- Используйте поршень, чтобы нажать фрит из бисера Ni-NTA осторожно и нажмите бисер в трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что нажать frit мягко, чтобы избежать потенциальной потери шарика или adorption на спину колонке.
4. Подготовка наконечника этапа Hp-RP
- Подготовьте наконечник этапа Hp-RP, как описано для наконечника этапа IMAC с помощью диска C8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не наносите большую силу на диск, потому что это может привести к плотно упакованы фрит и увеличить давление спины кончика сцены. Все этапы центрифугации проходят при 1000 х г в течение 5 минут в шаге 4. - Приостановить 1 мг бусинки C18 в 100 л 100% метанола и передать раствор бисера через кончик.
- Добавьте 20 мкл буфера 8 (80% ACN/20% 200 мМ NH4HCO2, pH 10.0) к кончику сцены и перейдите буфер 8 через кончик центрифугации.
- Добавьте 20 МКЛ буфера А (200 мМН NH4HCO2) к кончикусцены и пройдите буфер А через кончик центрифугой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сбалансировать центрифугу во время использования и убедитесь, что наконечник этапа Hp-RP не полностью высушен.
5. Подготовка адаптера спина
- Используйте острый конец пинцета, чтобы проколоть отверстие в центре крышки трубки 1,5 мл.
- Вставьте наконечник сцены IMAC или наконечник этапа Hp-RP в отверстие адаптера спина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что кончик сцены не находится близко к нижней части адаптера спина.
6. Обогащение фостопептида с помощью наконечника сцены IMAC
- Приостановить 10 мг ni-NTA шарики с 400 йл нагрузки буфера (6% уксусной кислоты (АА), рН 3,0) и загрузить все бусы раствор в на кончик. Перейдите раствор через кончик центрифугой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы центрифугации происходят при 200 x g в течение 3 минут в шаге 6, кроме шага 6.8. - Загрузите 100 мкл этилендиаминтетраакетической кислоты (ЭДТА) для того, чтобы лишить ионы никеля кончика сцены IMAC и передать раствор через кончик центрифугой.
- Загрузите 100 МКЛ буфера загрузки на кончик сцены и перейдите раствор через кончик центрифугой.
- Загрузите 100 мкл 50 мм FeCl3 в 6% АА к кончику сцены и перейдите раствор через кончик центрифугой. Fe3 "ионы будут chelate на IMAC этапе отзыв.
- Загрузите 100 МКЛ буфера загрузки, чтобы обу кондиционер и передать раствор через кончик центрифугации.
- Загрузите 100 МКЛ погрузочного буфера с образцом пептидов, подготовленных в шаге 2,7 к кончику сцены и перейдите раствор через кончик центрифугации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите новую трубку в качестве адаптера спина, чтобы собрать поток через образец и хранить поток через в морозильной камере для будущего анализа. - Загрузите 100 мкл стирального буфера (4,5% АА и 25% ACN) на кончик сцены и перейдите раствор через кончик центрифугой.
- Выполните вторую стирку с буфером загрузки. Загрузите 100 мкл буфера загрузки на кончик сцены и перейдите раствор через кончик, используя 1000 × g центрифуги в течение 3 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что стиральный буфер заменяется буфером загрузки в кончике сцены, чтобы исключить потерю фоспопептидов во время этапа облеавания. Equilibrate IMAC этапе отзыв до фостопептида элюции для обеспечения концентрации ACN ниже 5%. - Обрежьте наконечник сцены IMAC спереди ножницами и поместите подстриженный наконечник этапа IMAC внутри наконечника Hp-RP. Убедитесь, что два слоя сценических наконечников не касаются крышки центрифуги.
7. Фракционирование фостопептида с использованием наконечника этапа Hp-RP C18
- Добавьте 100 мкл буфера элюции (200 мМ фосфата аммония (NH4H2PO4)) к обрезанной стадии IMAC и перейдите раствор через два слоя стадии советы центрифугации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если раствор не проходит через кончик сцены, увеличьте скорость вращения вниз. Все этапы центрифугации проходят при 1000 х г в течение 5 минут в шаге 7. Все буферы Hp-RP перечислены в таблице 1. - Отбросьте наконечник этапа IMAC с помощью пинцета и добавьте 20 л буфера A к кончику этапа Hp-RP и перейдите буфер через кончик центрифугой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что весь буфер elution проходит через наконечник этапа IMAC, прежде чем отказаться от него. - Добавьте 20 йл буфера 1 к elute фракции 1 и соберите элуат в новой трубке центрифугации. Повторите процесс с буферами 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8, чтобы собрать каждую фракцию в новой трубке. Высушите окончательный элуат каждой фракции с помощью вакуумного концентратора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте новые буферы фракции. Возьмите 8 новых труб в качестве адаптера спина каждой фракции. Соберите элуат каждой фракции в другой адаптер спина. Фостопептиды не стабильны в основных условиях, поэтому высушите элуаты концентратором или подкисляйте на 10% TFA немедленно.
8. Анализ LC-MS/MS и анализ данных
- Добавьте 5 МКЛ 0,1% формической кислоты (FA) и проанализируйте образец с помощью масс-спектрометра.
- Вы запустите градиент 90 минут с буфером B 6-30% (80% ACN и 0.1% FA) для каждой фракции.
- Фрагмент 10 лучших помеченных пептидов с использованием высокой диссоциации энергии столкновения (HCD). Завершите поиск по базе данных для выявления сайтов фосфорилирования.
- Загрузите необработанные файлы в программное обеспечение Max'u'ut, назовите эксперименты и установите фракции и PTM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Учебник программного обеспечения Max'u'ut можно найти https://www.maxquant.org/. - Выберите ион MS2 репортера в типе запуска LC-MS/MS и 6plex TMT в качестве изобаричных меток. Включите фильтр по функции PIF и установите мин PIF как 0.75.
- Выберите ацетил (Protein N-term), Окисление (M) и Фосфо (STY) к панели переменных модификаций. Выберите карбамидометил (C) в качестве фиксированных модификаций.
- Установите режим пищеварения как специфический, выберите трипсин/P в качестве фермента пищеварения, и два пропущенных расщепления.
- Установите скорость ложных открытий PSM (FDR) и белка FDR как 0.01. Установите минимальный балл для модифицированных пептидов как 40.
- Добавьте базу данных Arabidopsis thaliana в панель файлов fasta и запустите поиск по базам данных.
- Загрузите txt файл сайтов Phospho (STY) на программное обеспечение Perseus по мере обысков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные учебники программного обеспечения Perseus можно найти на https://www.maxquant.org/perseus/. - Отфильтруй обратные участки фосфорилирования. Отфильтруйте нелокализованные участки фосфорилирования, используя вероятность локализации 75% в качестве отреза.
- Для статистического анализа используйте интенсивности участков фосфорилирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать производительность этого рабочего процесса, мы использовали IMAC этапе отзыв в сочетании с Hp-RP этапе отзыв фракционирования для измерения фосфопротеомных изменений в диком типе и snrk2-dec мутант саженцы с или без лечения маннитолом в течение 30 минут. Каждый образец был выполнен в биологических трипликатах, а экспериментальный рабочий процесс представлен на рисунке 1. Переваренные пептиды (400 мкг) каждого образца были помечены одним каналом TMT-6plex, сгустились и разбиваются. Фостопептиды были дополнительно обогащены с помощью наконечника сцены IMAC, и очищенные фостопептиды были впоследствии дробятся на восемь фракций наконечником этапа Hp-RP. Каждая фракция была проанализирована с помощью 90-минутного градиентного анализа LC. Необработанные файлы искали с помощью поисковой системы против базы данных Arabidopsis thaliana.
В общей сложности было выявлено 11 077 уникальных фостопептидов, соответствующих 3630 фосфопротеинам с 6852 локализованными участками фосфорилирования (класс I, вероятность локализации 0,75), что свидетельствует о широком охвате фосфопротеом Arabidopsis. В общей сложности 8107 и 7248 фостопептидов были выявлены из дикого типа и snrk2-dec мутант образца, соответственно. Это иллюстрирует эффективность рабочего процесса в обеспечении углубленного охвата для разграничения глобального представления о трансдукции сигнала в Arabidopsis. Мы сравнили количество выявленных фостопептидов в 8 фракциях. Несколько фостопептидов были выявлены в первых двух фракциях, фракция 1 и 2. Тем не менее, большинство фостопептидов были равномерно распределены в остальных 6 фракций(рисунок 2A), предполагая, что этот подход обеспечивает возможность отделить сложные фостопептиды от фосфатома растений. Чтобы еще больше продемонстрировать эффективность разделения этого рабочего процесса, мы оценили перекрытие фостопептидов между двумя смежными фракциями (eq. F1-to-F2). Менее 5% фостопептидов перекрываются в соседних фракциях, что свидетельствует о надежной эффективности фракциоции наконечника этапа Hp-RP(рисунок 2B).
Используя данные, полученные в рабочем процессе, мы сравнили фосфопротеомные профили дикого типа и snrk2-dec мутанта при лечении маннитолом. В общей сложности 433 и 380 участков фосфорилирования были увеличены после лечения маннитолом в диком типе и snrk2-dec мутант образца, соответственно (Рисунок 3). Среди них 312 фосфоситов показали индукцию (FDR lt; 0.01) в диком типе, но не в растениях-мутантах snrk2-dec. Анализ генной онтологии (GO) показал, что функция фосфорилирования и активации белковой киназы, регуляция метаболического процесса фосфатов, трансдукция сигнала значительно обогащаются в зависимых от SnRK2 фосфатинах. Интересно, что термин GO, связанный с развитием корней, также обогащался в зависимой группе SnRK2, в соответствии с фенотипом замедления роста корней при осмотическомстрессе 6. Мы также определили 116 фосфоситов, регулируемых лечением маннитолом как в диком типе, так и в мутанте snrk2-dec. Эти фосфопротеины были независимы от SnRK2, или кандидатов, которые являются посредниками осмотического стресса срабатывания сигнализации до активации SnRK2s. Мы заметили, что несколько B4 подгруппы RAFs, такие как RAF18 (AT1G16270), RAF24 (AT2G35050), и RAF42 (AT3G46920), были значительно up-regulated осмотическим стрессом. Дальнейшее исследование показало, что кинаски RAF быстро активируются осмотическим стрессом и необходимы для фосфорилирования и активации SnRK2s20.
Рисунок 1: Рабочий процесс стадии наконечник основе фосфопротеомного метода. Белок извлекался и переваривался из саженцев мутантов дикого типа и snrk2-dec, обработанных маннитолом или без него. Переваренные пептиды каждой репликации были помечены уникальным ТМТ6-сплетенным каналом. Phosphopeptides были объединились, а затем обогащены с помощью IMAC этапе отзыв. Очищенные фостопептиды были разделены наконечником этапа Hp-RP. Каждая фракция была проанализирована масс-спектрометром. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Фосфопротеомное профилирование саженцев диких и snrk2 decuple мутантов на кончике сцены IMAC и фракционации Hp-RP. (A) Количество выявленных фостопептидов на фракцию. (B)Эффективность разделения этапной хроматографии Hp-RP на основе наконечника. Перекрытие между соседними фракциями представлено процентом того же пептида, идентифицированного в смежных фракциях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Количественная оценка фосфопротеомных изменений в ответ на осмотический стресс. Вулкан участки показывают log2 раз изменение фосфорилирования сайтов в (A) дикого типа и (B) snrk2-dec саженцев мутантов в ответ на лечение маннитолом. Черный круг представляет собой участки фосфорилирования киназы, индуцированные маннитолом. Красный круг указывает на фосфорилирование участков РАФ, регулируемых в ответ на маннитол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Буфер A | 200 мМм аммония (NH4HCO2), рН 10,0. | |
| Буфер B | 100% ACN. | |
| Буфер 1 | 5% буфер B, 95% буфер А. | |
| Буфер 2 | 8% Буфер B, 92% Буфер А. | |
| Буфер 3 | 11% буфер B, 89% буфер А. | |
| Буфер 4 | 14% Буфер B, 86% Буфер А. | |
| Буфер 5 | 17% буфер B, 83% буфер А. | |
| Буфер 6 | 20% буфер B, 80% буфер А. | |
| Буфер 7 | 23% Буфер B, 77% Буфер А. | |
| Буфер 8 | 80% буфер B, 20% буфер А. | |
Таблица 1: Буферы для фракции наконечника этапа Hp-RP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Динамический диапазон и сложность растительного протеома и фосфопротеома по-прежнему являются ограничивающим фактором глубины фосфопротеомических анализов. Несмотря на возможность одного запуска LC-MS/MS анализа для выявления 10000 фосфорилированиясайтов 21,22, охват всего завода фосфопротеом по-прежнему ограничено. Таким образом, при профилировании глобального представления сетей сигнализации растений в ответ на экологический стресс необходим фосфопротеомный рабочий процесс, который обеспечивает высокую чувствительность и превосходную эффективность разделения. Коммерческая жидкой хроматографии высокого давления (HPLC) на основе колонки хроматографии является распространенным методом для снижения пептидной сложности до ms анализ23,24. Тем не менее, утомительные шаги по сбору образцов и большой объем elution являются основными проблемами методов на основе HPLC с точки зрения чувствительности и пропускной способности. наконечник стадии является альтернативным подходом для выполнения пептидной префракции или обогащения для высокой чувствительности и высокой пропускной способности работ. Этот новый фосфопротеомный рабочий процесс, эксплуатируемый изобарической маркировкой в сочетании с обогащением и фракционированием фоспопептида, обеспечивает лучшее покрытие и глубину фосфатеомики растений помимо других фосфопротеомных рабочихпроцессов 25,26.
Значение рН образцов является решающим фактором, который определяет специфичность обогащения фостопептидов. На значение рН может повлиять предыдущий этап подготовки образца, поэтому необходимо проверить значение рН перед загрузкой образца. Если рН смещается, добавляя уксусную кислоту или гидроксид натрия в образцы для регулировки рН до 3,0. Мы выполняем этот протокол для одновременного элюции и загрузки фостопептидов на наконечник сцены C18. Поэтому важно уравнять наконечник стадии IMAC до фостопептида, чтобы концентрация ACN была ниже 5%.
Количество фракций зависит от сложности и размеров выборки. Как правило, от 5 до 8 фракций достаточно, чтобы обеспечить широкий охват фостопептида идентификации растений. Концентрация ACN в буферах фракционации может быть скорректирована в зависимости от гидрофобности образцов. Большинство фостопептидов вымыли из бусин C18, используя диапазон от 5% до 25% концентрации ACN. Фоспопептиды, как правило, более гидрофильные по сравнению с не фосфорилированными пептидами из-за дополнительных отрицательных зарядов фосфатной группы. Тем не менее, пометка реагента TMT на N-термине пептида приводит к увеличению гидрофобности помеченныхпептидов 27, что может объяснить, почему меньше фоспопептидов были выявлены в первых двух фракциях в нашем случае(рисунок 2A). Таким образом, тест с использованием реагента TMT-zero и алицита образцов может быть использован для оценки количества фракций и концентрации ACN в каждом буфере фракционации. Оптимизированные буферы могут привести к повышению эффективности разделения TMT-6plex с маркировкой фостопептидов.
Ограничения стадии наконечника основе фракциоции являются количество фракций и способность советы. Трудно расширить число фракций в этапе разделения кончика, потому что прерывистые буферы градиента используются для фракционования кончиков этапов. С другой стороны, непрерывный градиент может быть применен к столбцам HPLC для достижения высокого числа фракций. Емкость подсказок является еще одним фактором, который ограничивает применение стадии советы. Для крупномасштабного анализа фосфопротеомики (10 мг белков) лучше использовать обогащение на основе HPLC с более длинной длиной колонны, упакованной с большим количеством бусинок C18 и фракционированием, что выходит за рамки аналитического масштаба сценических советов. В совокупности, этап наконечник основе обогащения фоспопептида и фракционирования является полезным методом для малого и среднего масштаба фосфопротеомики анализов. Этот подход может быть интегрирован с изобаричной маркировкой для достижения мультиплексной количественной оценки. Результаты также показали, что он может быть использован для углубленного профилирования и количественной оценки фосфопротемики растений. Этот рабочий процесс применим к другим видам и различным типам тканей для разграничения специализированных сетей сигнализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Стратегической приоритетной исследовательской программой Китайской академии наук Grant XDB27040106.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
