Summary
여기에 제시된 인포프로테오믹 접근법, 즉 아라비도시스 인포프로테오움의 높은 처리량과 깊은 커버리지를 제공하는 추출 팁 기반인 인포프로테오믹을 이동합니다. 이 접근은 아라비도시스에서 삼투압 신호의 개요를 설명합니다.
Abstract
단백질 인산화는 삼투성 조건 하에서 효소 활성 및 유전자 발현의 조절에 매우 중요합니다. 질량 분광법 (MS)기반 인포 프로 테오믹스는 식물 신호 변환을 연구하는 방법을 변화시켰습니다. 그러나, 커버리지의 깊이를 달성하기 위해 많은 시작 재료와 장기간 MS 측정 시간의 요구 사항은 식물의 글로벌 인포 프로테오믹 변화에 대한 높은 처리량 연구에 대한 제한 요인이되고있다. 식물 인산염의 감도와 처리량을 개선하기 위해, 우리는 삼투압 스트레스에 대응하여 식물 인산화 의 신속하고 포괄적 인 분석을 위한 탠덤 질량 태그 (TMT) 라벨과 결합된 정지 및 이동 추출 (stage) 팁 기반 인포프로테오믹스 접근법을 개발했습니다. 단계 팁 기술의 단순성과 높은 처리량을 활용하여 전체 절차는 두 가지 팁을 사용하여 인포펩티드 농축, 분수 및 시료 세척 단계를 완료하는 데 약 1시간이 걸리며, 이는 접근 방식의 사용하기 쉽고 높은 효율을 시사합니다. 이 접근법은 심층적인 식물 인포프로테오믹스 분석(> 11,000인스포펩티드 식별)을 제공할 뿐만 아니라 인접한 분수 간의 우수한 분리 효율(&5% 중복)을 보여줍니다. 또한, 멀티플렉싱은 TMT 라벨링을 사용하여 야생형 및 snrk2 탈취 돌연변이 식물의 인포프로테오믹 변화를 정량화하고 있다. 이 접근법은 육상 식물의 초기 삼투압 신호에 대한 이해를 밝히는 삼투압 스트레스에 대한 응답으로 Raf와 같은 키나아제의 인광 이벤트를 성공적으로 밝히는 데 사용되었습니다.
Introduction
염도가 높고, 저온, 가뭄으로 인해 삼투압이 발생하며, 이는 식물 생산성1,2에영향을 미치는 주요 환경 요인이다. 단백질 인산화는 삼투압3,4,5에대한 식물 반응에서 신호 지각 및 트랜스포팅을 중재하는 가장 중요한 번역 후 변형 중 하나입니다. SNF1 관련 단백질 키나아제 2s(SnRK2s)는 삼투성 응력 신호6에관여한다. SnRK2 가족 구성원 10명 중 9명은 삼투압7,8에대한 대응으로 상당한 활성화를 보여준다. snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-12)모든 10 SnRK2에서 돌연변이를 갖는 돌연변이는 삼투압에 과민반응을 표시하였다. snrk2-dec 돌연변이체에서는, 삼투성 스트레스-유도된 이노시톨 1,4,5-트리스포산염(IP3),abscisic acid (ABA) 생합성 및 유전자 발현의 축적이 강하게 감소되어 삼투스트레스 반응6에서SnRK2s의 중요한 역할을 강조한다. 그러나, SnRK2s 키나아제는 어떻게 이 생물학 프로세스를 통제하는지 아직도 불분명합니다. 삼투압 응력에 대한 반응으로 인포프로테오믹 변화를 프로파일링하는 것은 이 격차를 해소하고 식물의 삼투압 유발 방어 메커니즘을 묘사하는 효율적인 방법입니다.
질량 분광법(MS)은 식물 인포프로테오메9를매핑하는 강력한 기술이다. 식물 인포프로테오믹스의 특성화는 식물 프로테오메의 동적 범위와 식물 리자테4의복잡성으로 인해 여전히 과제로 남아 있다. 이러한 과제를 극복하기 위해 광합성 안료 및 이차 대사 산물과 같은 원치 않는 간섭을 제거하고 식물 인포프로테오메10의깊은 커버리지를 가능하게 하는 범용 식물 인포프로테오믹 워크플로우를 개발했습니다. 고정금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC) 및 금속 산화물 크로마토그래피(MOC)와 같은 여러 인포펩타이드 농축 방법은 MS 분석11,12,13,14,15,16이전에인포펩티드를 농축하기 위해 개발되었다. 인스포펩티드와 함께 정화하는 산성 비인펩타이드는 인포펩티드 검출을 위한 주요 간섭이다. 이전에는 IMAC 로딩 버퍼의 pH 값 및 유기산 농도를 표준화하여 비인펩티드의 결합을 제거하고, 사전 분획단계(11)를우회하여 90% 이상의 농축 특이성을 얻었다.
인포펩티드 농축 및 분획의 다단계 공정에서 시료 손실은 인포펩티드 식별의 감도 및 인포프로테오믹 커버리지의 깊이를 저해한다. 스톱 앤 고-이동-추출 팁(무대 팁)은 팁의 끝을 캡하는 작은 디스크가 포함된 파이펫 팁으로, 펩티드 분획 및 청소17을위한 크로마토그래피와 통합할 수 있다. 단계 팁 절차 중 샘플 손실을 최소화할 수 있는 경우 튜브 간의 샘플 전달을 방지하여 최소화할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 인간 인포 프로테오메(15)의깊이를 향상 노래 인광 펩타이드에서 낮은 풍부한 다중 인광 펩티드를 분리하기 위해 Ga3 +- IMAC 및 Fe3 +-IMAC에서 단계 팁을 구현했다. 또한, 높은 pH 반전상(Hp-RP) 단계 팁의 사용은 강한 양이온 교환(SCX) 및 강력한 음이온 교환(SAX)크로마토그래피(18)에비해 인간 막 프로테오메의 폭넓은 커버리지를 입증하였다. 따라서 IMAC 및 Hp-RP 단계 팁 기술을 통합하면 단순성, 높은 특이성 및 높은 처리량으로 식물 인포프로테온 커버리지를 증가시킬 수 있습니다. 우리는 이 전략이 아라비도시스 모종에서 20,000개 이상의 인산화 부위를 확인했으며, 이는 식물 인포프로테오메19의향상된 깊이를 나타내는 것으로 입증되었다.
여기에서, 우리는 애기독증에 있는 인포프로테오믹 프로파일링을 위한 단계 팁 기지를 둔 인포프로테오믹 프로토콜을 보고합니다. 이 워크플로우는 삼투압에 대응하여 야생형 및 snrk2-dec 돌연변이 묘목의 인포프로테오믹 분동을 연구하기 위해 적용되었다. 인포프로테오믹 분석은 키나아제 활성화 및 초기 삼투압 신호에 연루된 인산화 부위를 밝혀냈습니다. 야생 형 및 snrk2-dec 돌연변이 인산염 데이터의 비교 분석은 높은 식물에서 osmore 응력 신호에 중요한 역할을 하는 Raf 와 같은 키나아제 (RAF)-SnRK2 키나아제 캐스케이드의 발견을 이끌어 주었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 샘플 준비
- 알루미늄 호일에 대조군 및 응력 처리 모종(1g)을 수확하고 액체 질소로 샘플을 동결시한다.
참고: 단백질 농도가 높은 것은 일반적으로 성숙한 식물에서 보다 2 주 오래 된 모종에서 관찰. 모종의 한 그램은 MS 분석에 충분 한 단백질 lysate의 약 10 mg을 생성 합니다. 모든 원심 분리 단계는 1단계에서 16,000 x g에서 수행됩니다. - 냉동 모종을 박격포와 액체 질소로 채워진 유봉을 사용하여 미세 한 분말로 갈아 냅니다.
- 용해 버퍼 1mL 추가(100mM Tris-HCl에서 6M 구니딘-HCl, pH 8.5) 10mM Tris (2-carboxyethyl)인 포스핀 염산염(TCEP), 40mMM 2 클로로아세타미드(CAA), 프로테아제 억제제 및 인산 억제제 칵테일을 박격포에 넣고 유봉의 도움으로 혼합한다.
- 식물용 용액을 1.5mL 튜브로 옮기고 95°C에서 5분 동안 가열합니다.
- 튜브를 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 얼음 에 튜브를 10 초 동안 초음파 처리하고 10 초 동안 일시 중지하고 세 번 반복합니다.
- 원심 분리는 20 분 동안 튜브를 원심 분리하고 식물의 150 μL을 1.5 mL 튜브로 lysate.
- 튜브에 100% 메탄올의 600 μL을 추가합니다. 소용돌이와 튜브 아래로 회전.
- 튜브에 100% 클로로폼의 150 μL을 추가합니다. 소용돌이와 튜브 아래로 회전.
- 튜브에 ddH2O의 450 μL을 추가합니다. 소용돌이와 원심분리기는 3분 동안 튜브를 분리합니다.
- 상부 수성 층을 폐기합니다. 튜브에 100% 메탄올의 600 μL을 추가합니다. 튜브를 3분 동안 원심분리한 다음 용액을 폐기합니다.
- 단백질 펠릿을 100% 메탄올의 600 μL로 세척합니다. 용액을 버리고 단백질 펠릿을 공기 건조시십시오.
- 단백질 펠릿을 소화 완충제 600μL로 재차 스펜싱(12mM 나트륨 탈옥초레이트(SDC)/12m 나트륨 라우로일 사르코시나테(SLS)에서 100mM Tris-HCl, pH 8.5)로 재차한다. 서스펜션이 균질화 될 때까지 튜브를 초음파 처리합니다.
- BCA 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정하고 소화 완충액으로 농도를 4 μg/μL로 조정합니다. 용사(400 μg 단백질)의 100 μL을 새로운 튜브로 옮긴다.
- 50m 트리에틸람모늄 중탄산염(TEAB)의 292 μL과 리스-C(2.5단위/mL)의 8μL을 튜브에 추가합니다. 37°C에서 튜브를 3시간 동안 배양합니다.
- 튜브에 8 μg 트립신과 함께 50 mM TEAB의 100 μL을 추가합니다. 튜브를 37°C에서 12시간 동안 배양합니다.
- 튜브에 10% 트리플루오로아세산(TFA)의 25μL을 추가합니다. 4°C에서 20분 동안 튜브를 소용돌이 및 원심분리합니다.
- 상신을 탈염을 위해 조건부 탈염 열로 옮김합니다. 진공 원심분리기 농축기를 사용하여 용황을 건조시하십시오.
참고: 메탄올 1mL로 수지 활성화, 80% 아세토닐(ACN)에서 0.1% TFA의 1mL이 뒤를 이었다. 5% ACN에서 0.1% TFA의 3mL 이상으로 유기 용매를 씻어내시다. 1.16단계에서 제조된 산성 펩티드 샘플을 적재한 다음 5% ACN에서 0.1% TFA의 3mL 이상으로 컬럼을 세척한다. 염농도가 높은 시료에 더 많은 세체가 필요할 수 있습니다. 80% ACN에서 0.1% TFA의 1mL로 인포스펩티드를 엘테.
2. 탠덤 매스 태그(TMT) 라벨링
- 말린 펩티드를 200mM 4-(2-하이드록스테틸)-1-파이프라진에탄술포닉산(HEPES), pH 8.5의 100 μL로 재차질한다.
- 각 채널(0.8 mg)의 TMT 시약을 무수액 ACN의 40 μL에서 용해하십시오. TMT 시약 튜브를 5분 동안 소용돌이쳐 아래로 회전시십시오.
- TMT의 40 μL을 샘플 튜브로 옮기고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
참고: 이 실험에서 채널 126 에서 128은 매니톨 처리없이 식물의 3 개의 생물학적 복제로 표지되었으며 채널 129 에서 131은 매니톨 치료를 가진 식물의 세 가지 생물학적 복제로 표지되었습니다. - 5% 하이드록실라민8μL을 넣고 15분 동안 배양합니다.
- 5mL 튜브에 6개의 샘플을 섞고 10% TFA의 14 μL을 추가합니다.
- 튜브에 0.1% TFA의 3,876 μL을 추가합니다. 소용돌이와 스핀 다운.
- 솔루션을 탈염을 위해 조건부 탈염 열로 전송합니다. 증발기로 용루를 건조시다.
3. IMAC 스테이지 팁 준비
- 폴리 프로필렌 프릿 디스크를 관통하는 16 G 무딘 엔드 바늘을 사용합니다.
참고: 커터를 디스크 표면에 수직으로 잡고 커터를 몇 번 굴려 디스크가 완전히 절제되었는지 확인합니다. 디스크를 페트리 접시에 담아 보관합니다. 바늘을 200 μL 파이펫 팁에 넣고 플런저를 사용하여 프릿을 팁에 밀어 넣습니다. - 플런저를 사용하여 프릿을 팁 끝으로 부드럽게 눌러 팁 끝을 캡합니다.
- 더 나은 재현성을 제공하는 동일한 압력으로 팁에 frit 디스크를 배치합니다. 스테이지 팁 생산의 재현성은 원심분리기 단계의 타이밍과 기술 복제 사이의 재현성에 영향을 미치는 일정한 백압에 중요합니다.
- 스테이지 팁이 컨디셔닝 단계에서 높은 역압을 표시하는 경우 샘플을 로드할 때 팁이 막히는 것을 방지하십시오. 디스크가 너무 단단히 제자리에 끼였을 수 있습니다.
- Ni-NTA 스핀 컬럼을 반전시키고 1.5mL 튜브에 배치하십시오.
- 플런저를 사용하여 Ni-NTA 구슬의 프릿을 부드럽게 누르고 구슬을 튜브에 밀어 넣습니다.
참고: 스핀 컬럼의 잠재적인 비드 손실 이나 흡착을 피하기 위해 프리를 부드럽게 밀어야 합니다.
4. Hp-RP 단계 팁 준비
- C8 디스크를 사용하여 IMAC 단계 팁에 설명된 대로 Hp-RP 단계 팁을 준비합니다.
참고: 조밀하게 포장된 frit을 초래하고 스테이지 팁의 역압이 증가할 수 있으므로 디스크에 큰 힘을 적용하지 마십시오. 모든 원심 분리 단계는 4단계에서 5분 동안 1,000 x g에서 수행됩니다. - 100 μL 100% 메탄올에 C18 구슬 1 mg을 일시 중단하고 팁을 통해 구슬 용액을 전달합니다.
- 완충 8(80% ACN/20% 200mM NH4HCO2,pH 10.0)의 20 μL을 스테이지 팁에 추가하고 원심분리로 끝을 통해 버퍼 8을 통과한다.
- 스테이지 팁에 버퍼 A(200mM NH4HCO2)의20 μL을 추가하고 원심분리로 끝을 통해 버퍼 A를 전달합니다.
참고: 사용 중 원심분리기의 균형을 맞추고 Hp-RP 단계 팁이 완전히 건조되지 않도록 합니다.
5. 스핀 어댑터 준비
- 날카로운 엔드 핀셋을 사용하여 1.5mL 튜브의 뚜껑 중앙에 구멍을 뚫습니다.
- IMAC 스테이지 팁 또는 Hp-RP 단계 팁을 스핀 어댑터 구멍에 삽입합니다.
참고: 스테이지 팁이 스핀 어댑터 의 맨 아래에 가깝지 않은지 확인합니다.
6. IMAC 단계 팁을 사용하여 인포펩티드 농축
- 10 mgNi-NTA 구슬을 400 μL로 적재 버퍼(6% 아세트산(AA), pH 3.0)로 중단하고 모든 구슬 용액을 팁당 로드합니다. 원심분리로 솔루션을 팁을 전달합니다.
참고: 모든 원심분리 단계는 6.8단계 외에 6단계에서 3분 동안 200 x g로 진행됩니다. - IMAC 단계 팁에서 니켈 이온을 제거하고 원심분리에 의해 팁을 통과하기 위해 50m m 에틸렌디아민테트라아세산(EDTA)의 100 μL을 적재한다.
- 100 μL의 적재 버퍼를 단계 끝에 로드하고 원심분리로 솔루션을 통과합니다.
- 스테이지 팁에 6% AA에 50mM FeCl3의 100 μL을 로드하고 원심분리로 팁을 통과합니다. Fe3+ 이온은 IMAC 스테이지 팁으로 킬레이트됩니다.
- 100 μL의 적재 버퍼를 적재하여 스테이지 팁을 조건화하고 원심분리로 팁을 통해 용액을 전달합니다.
- 단계 팁에 2.7 단계에서 준비된 시료 펩타이드와 하중 버퍼의 100 μL을 적재하고 원심분리에 의해 끝을 통해 용액을 전달한다.
참고: 새로운 튜브를 스핀 어댑터로 사용하여 시료의 흐름을 수집하고 향후 분석을 위해 동결기에서 유동을 저장합니다. - 세척 버퍼 100 μL(4.5% AA 및 25% ACN)을 스테이지 팁에 적재하고 원심분리로 팁을 통과합니다.
- 로딩 버퍼로 두 번째 세척을 수행합니다. 100 μL의 적재 버퍼를 스테이지 팁에 적재하고 1000 × g 원심분리기를 사용하여 3분 동안 솔루션을 팁을 통과합니다.
참고: 세척 버퍼가 스테이지 팁의 적재 버퍼로 대체되어 용출 단계 중 인포펩티드의 손실을 제거합니다. ACN의 농도가 5% 미만인지 확인하기 위해 인포펩티드 용출 전에 IMAC 단계 팁을 평형화합니다. - 앞면의 IMAC 스테이지 팁을 가위로 트리밍하고 다듬어진 IMAC 스테이지 팁을 Hp-RP 팁 에 배치합니다. 스테이지 팁의 두 레이어가 원심분리기의 뚜껑을 건드리지 않도록 합니다.
7. Hp-RP C18 단계 팁을 사용하여 인포펩티드 분획
- 용출 버퍼 100 μL(200mM 암모늄 인산염(NH4H2PO4)을트리밍된 IMAC 단계 팁에 추가하고 원심분리에 의해 단계 팁의 두 층을 통해 용액을 전달한다.
참고: 솔루션이 스테이지 팁을 통과하지 못하면 스핀 다운 속도를 높입니다. 모든 원심 분리 단계는 7단계에서 5분 동안 1,000 x g에서 수행됩니다. 모든 Hp-RP 버퍼는 표 1에나열됩니다. - 핀셋을 사용하여 IMAC 스테이지 팁을 폐기하고 20 μL의 버퍼 A를 Hp-RP 단계 팁에 추가하고 원심분리로 버퍼를 통과합니다.
참고: 모든 용출 버퍼가 IMAC 단계 팁을 통과한 후 폐기해야 합니다. - 버퍼 1의 20 μL을 추가하여 분수 1을 elute하고 원심분리로 새 튜브에서 용출을 수집합니다. 버퍼 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 프로세스를 반복하여 새 튜브에서 각 분수를 수집합니다. 진공 농축기로 각 분획의 최종 용출을 건조시다.
참고: 신선한 분수 버퍼를 준비합니다. 각 분수의 스핀 어댑터로 8개의 새로운 튜브를 가져 가라. 다른 스핀 어댑터에서 각 분획의 용출을 수집합니다. 인포펩타이드는 기본적인 조건하에서 안정되지 않으므로 농축기또는 산성으로 용액을 즉시 10% TFA로 건조시하십시오.
8. LC-MS/MS 분석 및 데이터 분석
- 0.1%의 μL을 추가하여 0.1%의 포믹산(FA)을 추가하고 질량 분광계로 샘플을 분석합니다.
- 각 분수에 대해 6-30% 버퍼 B(80% ACN 및 0.1% FA)로 90분 그라데이션을 실행합니다.
- 높은 충돌 에너지 해리(HCD)를 사용하여 상위 10개의 표지된 펩타이드를 단편화한다. 데이터베이스 검색을 완료하여 인산화 사이트를 식별합니다.
- 원시 파일을 MaxQuant 소프트웨어에 로드하고, 실험이름을 지정하고, 분수 및 PTM을 설정합니다.
참고 : MaxQuant 소프트웨어의 튜토리얼은 https://www.maxquant.org/ 찾을 수 있습니다. - LC-MS/MS 실행 유형의 리포터 이온 MS2와 6plex TMT를 등불 라벨로 선택합니다. PIF 함수별로 필터를 활성화하고 최소 PIF를 0.75로 설정합니다.
- 가변 변형 패널에 아세틸(단백질 N-term), 산화(M), 인(STY)을 선택한다. 카르바미도메틸(C)을 고정 수정으로 선택합니다.
- 소화 모드를 특정로 설정하고, 트립신/P를 소화 효소로 선택하고, 두 개의 골짜기를 놓친다.
- PSM 거짓 발견율(FDR) 및 단백질 FDR을 0.01로 설정합니다. 수정된 펩티드에 대한 최소 점수를 40으로 설정합니다.
- fasta 파일 패널에 아라비도시스 탈리아나 데이터베이스를 추가하고 데이터베이스 검색을 실행합니다.
- 검색이 완료되면 인(STY) 사이트의 txt 파일을 Perseus 소프트웨어에 로드합니다.
참고 : Perseus 소프트웨어의 자세한 튜토리얼은 https://www.maxquant.org/perseus/ 찾을 수 있습니다. - 역형 인산화 부위를 걸로 합니다. 현지화 확률 75%를 컷오프로 사용하여 비지역화된 인산화 부위를 필터링합니다.
- 통계 분석을 위해 인산화 부위의 강도를 사용합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 워크플로우의 성능을 입증하기 위해 Hp-RP 단계 팁 분획과 결합된 IMAC 단계 팁을 활용하여 30분 동안 매니톨 처리 유무에 관계없이 야생형 및 snrk2-dec 돌연변이 묘목의 인포프로테오믹 변화를 측정했습니다. 각 샘플은 생물학적 삼중방식으로 수행되었으며 실험 워크플로우가 도 1로표현된다. 각 시료의 소화된 펩티드(400 μg)는 1개의 TMT-6plex 채널로 분류되었고, 풀과 탈염시켰다. 인포스펩타이드는 IMAC 단계 팁을 사용하여 더욱 농축되었고, 정제된 인포스펩타이드는 이후 Hp-RP 단계 팁에 의해 8개의 분획으로 분획되었다. 각 분획은 90분 LC 그라데이션 분석에 의해 분석되었다. 원시 파일은 아라비도시스 탈리아나 데이터베이스에 대한 검색 엔진을 사용하여 검색되었습니다.
총 11,077개의 고유 인포펩타이드가 6,852개의 국소화된 인산화 부위(클래스 I, 국소화 확률 > 0.75)를 가진 3,630개의 인광단백질에 해당하는 것으로 확인되었으며, 이는 아라비도시스 인포프로테오메의 넓은 커버리지를 나타낸다. 총 8,107 및 7,248개의 인산화가 야생형 및 snrk2-dec 돌연변이 샘플에서 각각 확인되었다. 이는 아라비도시스에서신호 변환의 글로벌 뷰를 삭제하기 위한 심층 커버리지를 제공하는 워크플로우의 효율성을 보여줍니다. 우리는 8 분획에 걸쳐 확인 된 인포펩티드의 수를 비교했다. 몇몇 인포펩타이드는 처음 두 분획, 분획 1 및 2에서 확인되었다. 그러나, 대부분의 인포스펩타이드는 나머지 6분수(도2A)에서균등하게 분포되었다.이 접근법은 식물 인포프로테오메로부터 복잡한 인포펩티드를 분리하는 기능을 제공한다는 것을 시사한다. 이러한 워크플로우의 분리 효율을 더욱 입증하기 위해 인접한 두 분획(eq. F1-f2) 사이의 인포펩티드의 중첩을 평가했습니다. 인접한 분획에서 5% 미만의 인포스펩타이드가 겹치며, 이는 Hp-RP 단계팁(도 2B)의견고한 분획 효율을 나타낸다.
워크플로우에 의해 얻은 데이터를 사용하여, 우리는 매니톨 처리시 야생 형 및 snrk2-dec 돌연변이의 인포 프로테오믹 프로파일을 비교했습니다. 야생형 및 snrk2-dec 돌연변이 샘플에서 매니톨 처리 후 총 433 및 380개의 인산화 부위가 각각 증가하였다(도3). 그 중, 312 인산은 야생 형에서 유도 (FDR & 0.01)를 보였지만 snrk2-dec 돌연변이 식물에서는 그렇지 않았습니다. 유전자 종양학 (GO) 분석은 인산염 대사 과정의 조절, 신호 변환의 인산화 및 활성화의 기능이 SnRK2 의존인계단백질에서 현저하게 풍부하다는 것을 밝혔다. 흥미롭게도, 뿌리 발달과 관련된 GO 용어는 또한 SnRK2 의존군에서 농축되었으며, 삼투압6하에서루트 성장 지연의 표현형과 일치하였다. 우리는 또한 야생 형 과 snrk2-dec 돌연변이 모두에서 매니톨 치료에 의해 최대 규제 116 인을 확인했다. 이 인포단백질은 SnRK2의 독립적이거나, SnRK2s 활성화 전에 삼투압 유발 신호를 중재하는 후보였다. 우리는 RAF18 (AT1G16270), RAF24 (AT2G35050), 및 RAF42 (AT3G46920)와 같은 여러 B4 하위 그룹 RAF가 삼투압에 의해 크게 강화된 것으로 관찰했습니다. 추가 연구는 RAF 키나아제는 삼투압 응력에 의해 신속하게 활성화되고 SnRK2s20의인산화 및 활성화에 필요하다는 것을 밝혔습니다.
그림 1: 단계 팁 기반 인포프로테오믹 방법의 워크플로우. 단백질은 야생형 및 snrk2-dec-dec 돌연변이 묘목에서 추출및 소화되었다. 각 복제의 소화 된 펩티드는 독특한 TMT6-플렉스 채널로 표시되었다. 인포펩타이드는 IMAC 스테이지 팁을 사용하여 풀을 풀로 한 다음 농축되었습니다. 정제된 인은 Hp-RP 단계 팁으로 분리되었다. 각 분획은 질량 분광계에 의해 분석되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: IMAC 스테이지 팁 및 Hp-RP 분획에 의한 야생형 및 snrk2 디컵 돌연변이 모종의 인포프로테오믹 프로파일링. (A)분수당 식별된 인포펩티드의 개수. (B)단계 팁 기반 Hp-RP 크로마토그래피의 분리 효율. 인접한 분획 사이의 중첩은 인접 분수에서 확인된 동일한 펩티드의 백분율로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 삼투압응에 대응하여 인포프로테오믹 변화를 정량화한다. 화산 플롯은(A)야생형 및(B) snrk2-dec 돌연변이 묘목에서 인산화 부위의 로그2 접이식 변화를 매니톨 치료에 대응하여 보여준다. 검은 원은 매니톨에 의해 유도된 키나아제 인산화 부위를 나타낸다. 빨간색 원은 매니톨에 대한 응답으로 RAF의 인광 부위를 위로 조절합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 버퍼 A | 200 mM 암모늄 용암모늄 (NH4HCO2), pH 10.0. | |
| 버퍼 B | 100% ACN. | |
| 버퍼 1 | 5% 버퍼 B, 95% 버퍼 A. | |
| 버퍼 2 | 8% 버퍼 B, 92% 버퍼 A. | |
| 버퍼 3 | 11% 버퍼 B, 89% 버퍼 A. | |
| 버퍼 4 | 14% 버퍼 B, 86% 버퍼 A. | |
| 버퍼 5 | 17% 버퍼 B, 83% 버퍼 A. | |
| 버퍼 6 | 20% 버퍼 B, 80% 버퍼 A. | |
| 버퍼 7 | 23% 버퍼 B, 77% 버퍼 A. | |
| 버퍼 8 | 80% 버퍼 B, 20% 버퍼 A. | |
표 1: Hp-RP 단계 팁 분별용 버퍼입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
식물 프로테오메와 인포프로테오움의 동적 범위와 복잡성은 여전히 인포프로테오믹스 분석의 깊이에 대한 제한 요소입니다. 10,000개의 인산화부위(21,22)를식별하는 단일 실행 LC-MS/MS 분석의 능력에도 불구하고, 전체 식물 인포프로테오메의 커버리지는 여전히 제한적이다. 따라서 환경 스트레스에 대응하여 식물 신호 네트워크의 글로벌 뷰를 프로파일링하는 데 높은 감도 및 우수한 분리 효율을 제공하는 인포프로테오믹 워크플로우가 요구된다. 상용 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 컬럼 계 크로마토그래피는 MS분석(23,24)에앞서 펩타이드 복잡성을 감소시키는 일반적인 방법이다. 그러나 지루한 샘플 수집 단계와 큰 용출 량은 감도 및 처리량 측면에서 HPLC 기반 방법의 주요 과제입니다. 단계 팁은 고감도 및 고처리량 작업에 대한 펩티드 사전 분획 또는 농축을 실행하는 대체 접근법입니다. 인포펩티드 농축 및 분획과 결합된 동소바릭 라벨링을 이도어하는 이 새로운 인포프로테오믹 워크플로우는 다른 인포프로테오믹워크플로우(25,26)에비해 식물 인포프로테오믹스의 더 나은 커버리지와 깊이를 제공한다.
시료의 pH 값은 인포펩티드의 농축 특이성을 결정하는 중요한 요소입니다. pH 값은 샘플 제제의 이전 단계에 의해 영향을 받을 수 있으므로 시료 로딩 전에 pH 값을 확인하는 것이 필수적입니다. pH가 이동되면, 3.0으로 pH를 조정하기 위해 시료에 아세트산 또는 수산화 나트륨을 첨가한다. 우리는 C18 단계 팁에 인광 펩티드의 동시 용출 및 적재를 위한 이 프로토콜을 실행합니다. 따라서, ACN의 농도가 5% 미만인지 확인하기 위해 인포펩티드 용출 전에 IMAC 단계 팁을 평형화하는 것이 중요하다.
분수 수는 복잡성 및 샘플 크기에 따라 달라집니다. 전형적으로, 5-8 분수는 식물에서 인펩티드 식별의 광범위한 범위를 제공하기에 충분하다. 분획 버퍼에서 ACN의 농도는 샘플의 소수성에 따라 조절될 수 있다. 대부분의 인포스펩타이드는 5%에서 25% ACN 농도의 범위를 사용하여 C18 구슬에서 용출된다. 인산펩타이드는 전형적으로 인산염 군의 추가 음전하로 인광이 아닌 펩타이드에 비해 더 많은 수성성이다. 그러나, 펩티드의 N 단열에 TMT 시약을 태그하면 표지된펩타이드(27)의소수성 증가로 이어지며, 이는 왜 우리의 경우 처음 두 분획에서 더 적은 인포스펩티드가 확인되었는지 설명할 수있다(그림 2A). 따라서, TMT 제로 시약 및 시료의 알리쿼트를 이용한 시험을 사용하여 각 분획 버퍼에서 분획 및 ACN 농도의 수를 평가할 수 있다. 최적화된 버퍼는 TMT-6plex 라벨인 인스포펩티드의 더 나은 분리 효율을 초래할 수 있다.
단계 팁 기반 분획의 한계는 분수 수와 팁 용량입니다. 단계 팁 분획에 불연속 그라데이션 버퍼가 사용되기 때문에 스테이지 팁 분리에서 분획 수를 확장하기는 어렵습니다. 반면에 HPLC 열에 연속 그라데이션을 적용하여 높은 분수 수를 달성할 수 있습니다. 팁의 용량은 단계 팁의 적용을 제한하는 또 다른 요소입니다. 대규모 인포프로테오믹스 분석(> 10 mg 단백질)의 경우, 스테이지 팁의 분석 척도를 넘어서는 더 많은 C18 구슬과 분수로 포장된 더 긴 컬럼 길이로 HPLC 기반 농축을 사용하는 것이 좋습니다. 함께 종합하면, 단계 팁 기반 인포펩티드 농축 및 분획은 중소형인포프로테오믹스 분석을 위한 유용한 방법입니다. 이 방법은 다중 화정을 달성하기 위해 동소바릭 라벨링과 통합될 수 있습니다. 결과는 또한 심층적인 식물 인포프로테오믹스 프로파일링 및 정량화에 사용될 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 이 워크플로우는 특수 신호 네트워크의 묘사를 위해 다른 종 및 다른 조직 유형에 적용됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 과학 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램, 그랜트 XDB27040106에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
