Summary
التغايرية داخل الورم هي سمة متأصلة في الأورام، بما في ذلك الأورام الدبقية. لقد طورنا بروتوكولا بسيطا وفعالا يستخدم مزيجا من المخازن المؤقتة والطرد المركزي المتدرجة لعزل نواة واحدة عن أنسجة الورم الدبقي المجمدة الطازجة لدراسات تسلسل نواة واحدة من الحمض النووي الريبي و ATAC.
Abstract
تظهر الأورام الدبقية المنتشرة للبالغين عدم تجانس بين الورم وداخله. حتى وقت قريب، ركزت غالبية جهود التنميط الجزيئي على نطاق واسع على النهج السائبة التي أدت إلى التصنيف الجزيئي لأورام الدماغ. على مدى السنوات الخمس الماضية، أبرزت نهج تسلسل الخلايا المفردة العديد من السمات الهامة للأورام الدبقية. وقد استخدمت غالبية هذه الدراسات عينات جديدة من ورم الدماغ لعزل الخلايا المفردة باستخدام قياس التدفق الخلوي أو طرق الفصل القائمة على الأجسام المضادة. وللمضي قدما، فإن استخدام عينات الأنسجة المجمدة الطازجة من البنوك الحيوية سيوفر مرونة أكبر لتطبيقات الخلايا الواحدة. وعلاوة على ذلك، مع تقدم حقل الخلية الواحدة، سيكون التحدي التالي هو توليد بيانات متعددة الوميست من خلية واحدة أو نفس إعداد العينة لكشف تعقيد الورم بشكل أفضل. لذلك، فإن البروتوكولات البسيطة والمرنة التي تسمح بتوليث البيانات لطرق مختلفة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) والنواة الوحيدة Assay ل Chromatin التي يمكن الوصول إليها بواسطة Transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية (snATAC-seq) ستكون مهمة لهذا المجال.
وقد سهلت التطورات الأخيرة في مجال الخلية الواحدة إلى جانب الأدوات الدقيقة الفلورية التي يمكن الوصول إليها مثل منصة الجينوم 10x تطبيقات الخلايا المفردة في مختبرات البحوث. لدراسة عدم تجانس ورم الدماغ، وضعنا بروتوكولا معززا لعزل نواة واحدة من الأورام الدبقية المجمدة الطازجة. يدمج هذا البروتوكول بروتوكولات الخلية المفردة الموجودة ويجمع بين خطوة التجانس متبوعة بالتنقية والطرد المركزي المتدرجة الوسيطة المخزن المؤقت. العينات الناتجة هي تعليق نواة واحدة نقية التي يمكن استخدامها لتوليد التعبير الجيني نواة واحدة وبيانات الوصول الكروماتين من إعداد النوى نفسه.
Introduction
الأورام الدبقية المنتشرة من الدرجة الأدنى (LGG)، وهي ورم الدماغ الأساسي الأكثر شيوعا لدى البالغين، هي الأورام المتسللة التي تنشأ في كثير من الأحيان في نصف الكرة الدماغي. LGGs تظهر كل من التغايرية بين وداخل الورم، والتي ليست مدفوعة فقط من قبل السكان الورم ولكن أيضا من قبل الخلايا غير الخبيثة تشارك بشكل معقد في تطور الورم والتقدم1،2،3،4،5.
على مدى العقد الماضي، كان هناك سيل من البيانات الجينومية التي تم جمعها في مجال الأورام الدبقية. هذه البيانات تأتي أساسا من الدراسات تسلسل الورم السائبة وساهمت بشكل كبير في التوصيف الجزيئي، والتصنيف الحالي لأورام الدماغ5،6،7،8،9،10،11. ومع ذلك ، على الرغم من أن هذه الدراسات كشفت عن المشهد الجزيئي الواسع المرتبط بالأورام الدبقية ، لا يزال هناك نقص مخيب للآمال في التقدم فيما يتعلق بالتدخل العلاجي. واحدة من العقبات التي تحول دون مقاومة العلاج في أورام الدماغ هو عدم التجانس داخل الورم. لمعالجة هذه المسألة، وقد تم التركيز على دراسات مختلفة الجينوم، transcriptomic، proteomic، والتغايرية اللاجينية موجودة داخل ورم في مستوى خلية واحدة12،13،14،15،16،17.
على الرغم من أن هناك تقدما تكنولوجيا ملحوظا في مجال الخلية الواحدة على مدى العامين الماضيين، واحدة من العوامل الرئيسية المقيدة هو توافر العينات الطازجة اللازمة لعزل الخلايا وإجراء هذه التجارب. للتغلب على هذا القيد، كانت هناك عدة محاولات ناجحة في إجراء المقايسات، مثل snRNA-seq و snATAC-seq من الأنسجة المجمدة، وذلك باستخدام النوى بدلا من الخلايا18،19. وتعتمد غالبية هذه الأساليب إما على فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) أو استراتيجيات الترشيح. كل من خلية واحدة ونهج نواة واحدة لها نقاط قوتها وعيوبها. نهج خلية واحدة الحفاظ على النصوص الميتوكوندريا، والتي على الرغم من أنها قد تكون مفيدة، يمكن أيضا أن تقلل من تغطية النسخ بسبب وفرة عالية. نهج عزل نواة واحدة القضاء على نسبة عالية من كسر الميتوكوندريا، مما يسمح بتغطية أكثر عمقا من النصوص النووية20.
هناك العديد من المنصات المتاحة تجاريا التي تم استخدامها على مدى السنوات الأخيرة لتقصي بيانات الجينوم خلية واحدة، بما في ذلك الحمض النووي الريبي-seq و ATAC-seq. واحدة من أبرز المنصات هي منصة الكروم الجينوم 10x للتعبير الجيني خلية واحدة والخلية الواحدة ATAC التنميط. كما تعمل المنصة بمساعدة غرف microfluidic، يمكن لأي حطام أو مجاميع تسد النظام مما يؤدي إلى فقدان البيانات والكواشف والعينات السريرية القيمة. لذلك ، يعتمد نجاح دراسات الخلايا المفردة إلى حد كبير على العزل الدقيق للخلايا / النوى المفردة.
البروتوكول الذي سنوضحه هنا هو مزيج معدل قليلا من بروتوكولات DroNc-seq و Omni-ATAC-seq ، ويستخدم نهجا مماثلا للدراسات الحديثة التي تستخدم snRNA-seq لفهم الاضطرابات العصبية وأنواعالخلايا العصبية في الدماغ البشري18و19و21و22و23و24. يستخدم البروتوكول مزيجا من الانزيمية / التفكك الميكانيكي للعينات المجمدة تليها الترشيح والطرد المركزي التدرج ويسمح لعزل سريع ودقيق من نواة واحدة من أنسجة الورم الدبقي المجمدة الطازجة. لقد استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول لتوليد بيانات snRNA-seq و snATAC-seq من نفس إعداد النوى من عينات ورم الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على عينات جليوما مجمدة طازجة من البنك الوطني لأمراض الأورام (NCT) في هايدلبرغ، ألمانيا. وقد وافق مجلس المراجعة المؤسسية في كلية الطب في هايدلبرغ على استخدام مواد المرضى، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المرضى المشمولين في الدراسة.
1. إعداد تجريبي
- تنفيذ جميع الخطوات على الجليد أو في 4 °C.
- أنابيب ما قبل البرد، والأطباق، وشفرات الحلاقة، وUncers والحشرات إلى 4 درجة مئوية.
- قم بإعداد كافة المخازن المؤقتة مقدما. هذه المخازن المؤقتة مستقرة في درجة حرارة الغرفة. يوصى بالترشيح العقيم ، خاصة بالنسبة للسكيروز. يتم تعديل الاستعدادات المخزون من كورسيسوآخرون. انظر الجداول 1-7.
- إزالة عينات من النيتروجين السائل أو -80 درجة مئوية تخزين الفريزر والحفاظ على الجليد الجاف حتى الخطوة 2.1.
2. تشريح الأنسجة وتفككها
- نقل عينة الأنسجة المجمدة الطازجة (10-60 ملغ) إلى طبق بيتري المبردة مسبقا. Mince / ختم الأنسجة المجمدة الطازجة مع شفرة حلاقة إلى قطع صغيرة على الجليد.
- أضف 500 ميكرولتر من عازل تحلل النوى المبرد إلى أنبوب مبرد مسبقا سعة 1.5 مل. ضع قطع الأنسجة في أنبوب 1.5 مل الذي يحتوي على مخزن تحلل النوى ، ونقلها إلى Douncer (جدول المواد).
ملاحظة: هناك اثنين من الحشرات التجانس Dounce: "فضفاضة" أو "A" الآفات للحد من العينة الأولية و "ضيق" أو "B" pestle لتجانس عينة كاملة. - Dounce قطع الأنسجة مع "فضفاضة" الحشرات لحوالي 20 السكتات الدماغية، حتى يتم تقليل الاحتكاك. إذا كان الحطام موجودا، فقد يتم مسح العينة مسبقا عن طريق الترشيح باستخدام مصفاة 100 مم.
- Dounce مع "ضيق" الحشرات لمدة 20 السكتات الدماغية لتحقيق تجانس الأنسجة كاملة.
- نقل المتجانسة (حوالي 500 ميكرولتر) في أنبوب 2 مل المبردة مسبقا. أضف 1 مل من عازل التحلل المبرد. تخلط بلطف واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. مزيج بلطف مع طرف ماصة واسعة تتحمل وكرر 1-2 مرات خلال الحضانة.
- تصفية المتجانسة بأكملها باستخدام شبكة مصفاة 30 ميكرومتر، وجمع في أنبوب فالكون 15 مل ونقل مرة أخرى إلى أنبوب جديد قبل المبردة 2 مل. مصفاة واحدة عادة ما تكون كافية للمتجانس بأكمله.
- تحقق تحت المجهر الخفيف للتحقق من إزالة الحطام الكبير و سلامة الغشاء النووي. يجب أن تكون النوى مستديرة ولا ينبغي تشويه الغشاء النووي. إذا كان الحطام موجودا، يمكن إعادة تصفية النوى.
- الطرد المركزي النوى في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية على مقاعد البدلاء أعلى الطرد المركزي. إزالة supernatant، تاركا وراءه ~ 50 ميكرولتر مع بيليه تحتوي على النوى. إعادة إنفاق بيليه بلطف في آخر 1 مل من العازلة تحلل النوى واحتضان لمدة 5 دقائق على الجليد.
- طرد مركزي النوى في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة supernatant دون بيليه المزعجة، إضافة 500 مل من العازلة تجانس 1x (HB) (الجدول 4) واحتضان لمدة 5 دقائق دون إعادة تعليق. ثم، resuspend النوى في آخر 1.0 مل من 1x HB.
- طرد مركزي النوى في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة supernatant وإعادة تركيب بلطف النوى في 200 ميكرولتر من 1x HB في أنبوب جديد 2.0 مل.
3. الطرد المركزي المتدرجة
- إضافة 200 ميكرولتر من محلول يوديكسانول 50٪ (الجدول 5) لإعطاء تركيز نهائي من 25٪ يوديكسانول. تخلط جيدا 10 مرات مع ماصة تعيين على 300 مل.
- إضافة 300 ميكرولتر من محلول يوديكسانول 29٪ (الجدول 6) تحت خليط 25٪. استخدام P1000 نصيحة غرامة لتجنب خليط من الطبقات.
- إضافة 300 ميكرولتر من محلول يوديكسانول 35٪ (الجدول 7) تحت خليط 29٪. استخدام P1000 نصيحة غرامة لتجنب خليط من الطبقات.
تنبيه: تتطلب هذه الخطوة إزالة تدريجية لطرف ماصة أثناء الأنابيب لتجنب الإزاحة المفرطة لحجم. - ضع العينات في جهاز طرد مركزي متأرجح، وتدور لمدة 20 دقيقة عند 3500 × غرام عند 4 درجات مئوية مع إيقاف تشغيل الفرامل.
- إزالة العينات برفق دون اهتزاز ومراقبة تحت الضوء. يجب أن تكون الفرقة البيضاء واضحة من نواة نقية 95٪ مرئية بين الطبقة الثانية والثالثة(الشكل 1).
4. عزل النوى
- يستنشق الطبقات العليا حتى النطاق النووي الأبيض في الطور الفاصل من 29٪-35٪.
- جمع النطاق النوى في حجم 200 مل، ونقل إلى أنبوب جديد ومرشح مع مرشح 20 ميكرومتر (جدول المواد).
ملاحظة: لا تحتاج النوى إلى إعادة إنفاقها قبل الترشيح. - تحقق تحت المجهر الخفيف للتحقق من إزالة الحطام الكبير و سلامة الغشاء النووي. يجب أن تكون النوى مستديرة ولا ينبغي تشويه الغشاء النووي.
- عد النوى باستخدام تريبان الأزرق تلطيخ على مقياس الدم ونوى aliquot لsnRNA-seq/snATAC-seq.
5. واحد نواة الجيش الملكي النيبالي وAC seq
- معالجة النوى فورا باستخدام التعبير الجيني خلية واحدة وخلايا واحدة مجموعات كاشف ATAC(جدول المواد).
ملاحظة: تركيزات عينة النوى لنظام الجينوم 10x هي 1500-3000 نواة لكل ميكرولتر لsnRNA-seq، و 3500-7000 نواة لكل متر ميكرولتر لsnATAC-seq. يمكن تخفيف النوى باستخدام برنامج تلفزيوني 1x. - تسلسل المكتبات الناتجة في مرفق الجينوم الأساسية.
- إجراء تحليل لمراقبة جودة البيانات. يتم تضمين النوى لمزيد من التحليل إذا كانت تحتوي على المعرف الجزيئي الفريد (UMI) >1000 ، وعدد الجينات >500 ونسبة مئوية من جينات الميتوكوندريا <5 ٪، وهي ضمن متوسط + ثلاثة انحرافات معيارية لUMIs والجينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
علم الجينوم نواة واحدة هو حقل متطور مع بيانات محدودة والبروتوكولات. ومن العوامل الحاسمة التي تؤثر على نتيجة المقايسات النووية الوحيدة عزل النوى النقية وسليمة. جمعنا بروتوكولين منشورين (بروتوكولات DroNc-seq و Omni-ATAC-seq) لعزل النوى عالية الجودة والنقية من كتل الأنسجة الدبقية المجمدة الطازجة في وقت قصير نسبيا وبالتالي الحفاظ على استقرار النصوص (الشكل 1).
استخدام مختلف خطوات الترشيح جنبا إلى جنب مع الطرد المركزي التدرج باستخدام iodixanol / السكروز التدرج يسمح لعزل نواة نقية مع غالبية الحطام المهملة(الشكل 2). ويمكن استخدام نفس إعداد النوى المعزولة لكل من snRNA-seq و snATAC-seq. الأهم من ذلك ، لأن النوى المستخدمة هي من نفس العينة ، يمكن أن تكون البيانات التي تم إنشاؤها جزءا لا يتجزأ من استخدام حزم مثل سورات لتوليد مجموعات وتوفير منظور متعدد omics25 (الشكل 3).
لتحديد ما إذا كان البروتوكول مشابها لمجموعات بيانات snRNA-seq المنشورة، قارنا البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام الإجراء بأربع دراسات SnRNA-seq متاحة للجمهور تتعلق بالجهاز العصبي المركزي (CNS): Slyperوآخرون. 20، Lake et al.26، Jakel وآخرون24 وحبيب وآخرون. لمقارنة مقاييس مراقبة الجودة، قمنا بتنزيل مصفوفات العد التالية من برنامج التعبير الجيني Omnibus (GEO): GSE104525 (مجموعة بيانات حبيب، 2017)، GSE97930 (مجموعة بيانات البحيرة، 2018)، GSE118257 (مجموعة بيانات جيكل، 2019) وGSE140819 (مجموعة بيانات Slyper، 2020). بالنسبة لمجموعة بيانات البحيرة ، تم إنشاء مصفوفة تعداد خام شائعة عن طريق دمج المصفوفات الفردية لنصف الكرة المخيخي والقشرة الأمامية والقشرة البصرية. بالنسبة لمجموعة بيانات Slyper، تم اختيار العد الخام للعينة HTAPP-443-SMP-5491 (الورم الدبقي للأطفال عالي الجودة).
لإجراء مقارنة غير متحيزة، تمت معالجة جميع العينات باستثناء مجموعة بيانات Jakel باستخدام بروتوكول موحد مشترك. أولا، استخدمنا حزمة Seurat R-الإحصائية لإنشاء كائن سورات لكل مصفوفة خام27. وأعقب ذلك خطوتان: 1) لإزالة قطرات المحتملة، واستخدمت القطع التالية - تم استبعاد نواة تحتوي على أقل من 1000 UMI، أقل من 500 الجينات أو أكثر من 5٪ من الحمض النووي الريبي الميتوكوندريا من التحليل و 2) لاستبعاد القيم المتطرفة، والنواة التي سقطت خارج المتوسط بالإضافة إلى ثلاثة انحرافات معيارية لتوزيع UMIs والجينات أزيلت. بالنسبة لمجموعة بيانات Jakel، لا يمكن تنفيذ هذه الخطوة الثانية، حيث تمت معالجة مجموعة البيانات المتاحة للجمهور مسبقا بخطوة مراقبة جودة أقل صرامة.
لمقارنة توزيع UMIs والجينات عبر العينات ، قمنا بدمج جميع مجموعات البيانات وتصورنا توزيع عدد UMIs والجينات باستخدام مؤامرة الكمان(الشكل 4). وأشارت هذه النتيجة إلى أن الأسلوب مماثل لأحدث بروتوكول snRNA-seq الموصوففي Slyper وآخرون.
يتناول البروتوكول الموضح هنا عينات الورم الدبقي ، ولكن يمكن تطبيق نفس النهج عمليا على الأورام والأنسجة غير CNS. ومع ذلك ، فإن هذا يتطلب تحسين التراكيب العازلة تحلل وأوقات الحضانة.
الشكل 1: مخطط التدفق لعزل النوى. يوفر مخطط التدفق نظرة موجزة على الخطوات التي ينطوي عليها عزل نواة واحدة من أنسجة الورم الدبقي المجمدة الطازجة. يتم عرض الصور التمثيلية لعينة الورم والفرقة النووية بعد تدرج Iodixanol / السكروز (محاط بخط منقط أحمر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أمثلة على النوى قبل وبعد الطرد المركزي المتدرجة. (أ)تظهر صورة العينة قبل إجراء الطرد المركزي والترشيح المتدرجة كميات كبيرة من الحطام (B) تظهر صورة العينة بعد الطرد المركزي المتدرجة وخطوة الترشيح نواة سليمة مع الحد الأدنى من الحطام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مثال على البيانات المضمنة من snRNA-seq و snATAC-seq باستخدام نفس إعداد النوى. تم استخدام حزمة Seurat R-statistical لدمج بيانات snRNA-seq و snATAC-seq27. (أ) صورة مضمنة مشتركة للبيانات snRNA-seq و snATAC-seq(B)المجموعات التي تنتجها المشاركة في تضمين البيانات snRNA-seq و snATAC-seq. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: معلمات مراقبة الجودة لمختلف مجموعات بيانات الدماغ البشري snRNA-seq التي تبين العدد الفردي ل UMI (A) وعدد الجينات (B) لكل نواة. وكان عدد النوى التي اجتازت مرشحات الجودة على النحو التالي: 3527 نواة من مجموعة بيانات Slyper، و14636 نواة من مجموعة بيانات نارايانان التي تم إنشاؤها باستخدام البروتوكول الموصوف، و7369 نواة من مجموعة بيانات جيكل، و16494 نواة من مجموعة بيانات البحيرة، و4652 نواة من مجموعة بيانات حبيب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 6x التجانس المخزن المؤقت مستقرة ماستر ميكس | ||
| الكاشف | (فاينال كونك) | Vol ل 100 (مل) |
| 1 م كاكل2 | 30 مليون متر | 3.0 |
| 1 م مغ(Ac)2 | 18 مليون متر | 1.8 |
| 1 M تريس pH 7.8 | 60 مليون متر | 6.0 |
| H2O | 89.2 | |
| الحفاظ على درجة حرارة الغرفة، وتجنب التعرض المباشر للضوء | ||
الجدول 1: إعداد 6x التجانس المخزن المؤقت مستقرة ماجستير ميكس.
| 1 م سكروز |
| 34.23 غرام من السكروز |
| تذوب في 78.5 مل من الماء |
| املأ حتى 100 مل بالماء |
الجدول 2: إعداد السكروز 1 M.
| 6x التجانس العازلة غير مستقر الحل (650 مل لكل عينة) | ||
| الكاشف | (فاينال كونك) | Vol لكل عينة (μL) |
| 6x استقرار المخزن المؤقت للتجانس | 6x | 648.84 |
| 100 م م PMSF (فلوريد الفينيل ميثيل سلفونيل) | 0.1 مليون متر | 1.08 |
| 14.3 م β ميركابتوثانول | 1 مليون متر | 0.08 |
الجدول 3: إعداد حل غير مستقر للتخزين المؤقت للتجانس 6x (650 ميكرولتر لكل عينة).
| 1x التجانس العازلة غير مستقر الحل (2 مل لكل عينة) | ||
| الكاشف | (فاينال كونك) | Vol لكل عينة (μL) |
| 6x التجانس المخزن المؤقت غير مستقر | 1x | 333.33 |
| 1 م سكروز | 320 مليون متر | 640.00 |
| 50 مليون EDTA | 0,1 مليون متر | 4.00 |
| 10٪ NP40 | 0.1% | 20.00 |
| H2O | 1006.27 | |
الجدول 4: إعداد حل 1x التجانس العازلة غير مستقرة (2 مل لكل عينة).
| محلول يوديكسانول بنسبة 50٪ (200 ميكرولتر لكل عينة) | ||
| الكاشف | (فاينال كونك) | Vol لكل عينة (μL) |
| 6x التجانس المخزن المؤقت غير مستقر | 1x | 66.67 |
| 60٪ محلول يوديكسانول | 50% | 333.33 |
الجدول 5: إعداد محلول يوديكسانول بنسبة 50 في المائة (200 ميكرولتر لكل عينة).
| محلول يوديكسانول بنسبة 29٪ (300 ميكرولتر لكل عينة) | ||
| الكاشف | (فاينال كونك) | Vol لكل عينة (μL) |
| 6x التجانس المخزن المؤقت غير مستقر | 1x | 100 |
| 1 م سكروز | 160 مليون متر | 96 |
| 60٪ محلول يوديكسانول | 29% | 290 |
| H2O | 114 | |
الجدول 6: إعداد محلول يوديكسانول بنسبة 29 في المائة (300 ميكرولتر لكل عينة).
| محلول يوديكسانول بنسبة 35٪ (300 ميكرولتر لكل عينة) | ||
| الكاشف | (فاينال كونك) | Vol لكل عينة (μL) |
| 6x التجانس المخزن المؤقت غير مستقر | 1x | 100 |
| 1 م سكروز | 160 مليون متر | 96 |
| 60٪ محلول يوديكسانول | 35% | 350 |
| H2O | 54 | |
الجدول 7: إعداد محلول يوديكسانول بنسبة 35 في المائة (300 ميكرولتر لكل عينة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مجال التغاير داخل الورم هو في مرحلة مثيرة، مع المقايسات الجديدة والمنصات التي يجري تطويرها لتحدي وتوسيع المعرفة القائمة. التغاير داخل الورم هو عامل حاسم يساهم في تطور المرض ومقاومة طرائق العلاج الحالية في الأورام الدبقية28. وقد ركزت الدراسات الحديثة على أورام الدماغ على هذا الجانب الهام باستخدام الخلايا المفردة المقايسات النسخية و epigenomic لتوصيف أفضل للتجانس الخلوي داخل نفس الورم29,30,31,32. واحدة من الاختناقات الحالية مع المقايسات خلية واحدة في أورام الدماغ، وغيرها من الأورام الصلبة، هو توافر عينات سريرية جديدة. للتغلب على هذه المشكلة، أظهرت دراسات مختلفة أن استخدام النوى من الأنسجة المجمدة الطازجة يمكن أن يكون بديلا للعينات الطازجة ويمكن استخدامها بنجاح لاستجواب التغايرية الخلوية18،33.
هنا، ونحن تحسين أساليب العزل النوى واحد السابقة من حيث البساطة والطول والوفرة، ونوعية النوى. هذا النهج يجلب كذلك ميزة التنميط snRNA-seq و snATAC-seq من نفس إعداد النوى، مما يسمح لدراسات الاقتصادات المتعددة. في هذا الإجراء، قمنا بتعديل البروتوكولات الموجودة بإضافة عملية إضافية لفصل التدرج باستخدام وسيط غير الأيوني القائم على iodixanol. ويسمح هذا النهج بعزل النوى النقية دون الحاجة إلى فرز ال FACS، ويتم تقييم جودة النوى تحت المجهر الخفيف. تعليق ذات نوعية جيدة من النوى لا ينبغي أن يكون تكتل، والحد الأدنى من الحطام، والنوى سليمة. على الرغم من نادرة، يمكن أن يحدث تكتل من النوى خلال خطوة العزل، والتي يمكن حلها عن طريق الأنابيب الخفيفة باستخدام نصائح ماصة P200 واسعة تتحمل أو عن طريق إجهاد النوى من خلال مرشح 20 ملم. العامل الأكثر أهمية في جينوم النواة الواحدة هو القدرة على الحصول على نواة واحدة نقية وسليمة. ويمكن أن يؤدي وجود الحطام أو المجاميع إلى كتلة من الغرف الدقيقة الفلورية داخل منصات الخلية الواحدة، مما يؤدي إما إلى بيانات منخفضة الجودة أو إلى احتمال فشل التجربة. الغرض من استخدام المرشحات في خطوات مختلفة تليها المراقبة تحت المجهر الخفيف هو منع مثل هذه الحوادث.
كمية ونوعية المواد بدءا (مثل, ورم المجمدة الطازجة) هي أيضا اعتبارات هامة. لقد استخدمنا بنجاح البروتوكول الموصوف هنا مع كتل أنسجة ورم الدماغ التي تتراوح بين 10 ملغ إلى 60 ملغ. بالنسبة لهذه العينات، 500 ميكرولتر من العازلة تحلل النوى (الخطوة 1) كافية للحصول على نواة ذات نوعية جيدة كافية لتسلسل نواة واحدة. كتل الورم أكبر بكثير التي تحتوي على أكبر من 60-70٪ محتوى الورم يمكن تقطيعها إلى قطع أصغر، ويمكن إما أن توضع القطع على الفور مرة أخرى إلى النيتروجين السائل أو -80 درجة مئوية تخزين أو تقسيمها إلى أنابيب لعزل نواة واحدة ومختلطة بمجرد الانتهاء من خطوة التحلل. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تقييم جودة الأنسجة ومحتوى الورم عن طريق تلطيخ Hematoxylin و Eosin (H &؛ E) يليه تأكيد من أخصائي علم الأمراض.
العوامل الهامة التالية التي يجب أخذها في الاعتبار هي درجة الحرارة ووقت المعالجة. تخزين الأنسجة غير السليم، والتعامل مع العينات، والبروتوكولات المطولة يمكن أن تؤثر سلبا على جودة البيانات الجينوم النهائي. وينبغي الاحتفاظ بالعينات على الجليد، وينبغي أن يكون وقت تجهيز العينات سريعا لمنع تدهور النوى. متوسط معالجة عينة واحدة مع هذا البروتوكول هو 45-60 دقيقة، ويستغرق حوالي 2 ساعة لمعالجة أربع عينات. يمكن أن يؤثر التخزين غير السليم للأنسجة أيضا على عزل النوى وجودة البيانات. لقد قمنا بتقييم ما إذا كان طول مدة التخزين عند -80 درجة مئوية قد أثر على جودة البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام البروتوكول الموصوف. ولم تظهر مقارنة نتائج التسلسل التي تم الحصول عليها من العينات المجمدة التي تم تجميعها بين سنة واحدة و14 سنة (2006-2019) أي اختلافات في جودة البيانات فيما يتعلق بوقت التخزين. لذلك، يمكن استخدام عينات الأنسجة المجمدة المجمدة المجمدة المخزنة بشكل صحيح للدراسات بأثر رجعي باستخدام هذا البروتوكول.
هناك العديد من القيود مع بروتوكولات النوى واحد. على سبيل المثال، لا يمكن فرز أنواع الخلايا المختلفة استنادا إلى علامات سطح الخلية، ولا يمكن اكتشاف النصوص السيتوبلازمية. أيضا، ونحن حذف النصوص الميتوكوندريا وبالتالي فقدان على بعض المعلومات البيولوجية المتعلقة التمثيل الغذائي للورم. وعلاوة على ذلك، قد تتطلب أنواع مختلفة من الأنسجة مخازن تحلل مختلفة مما يتطلب تحسين البروتوكول مع كل إعداد تجريبي جديد.
بشكل عام، البروتوكول الموصوف هنا بسيط، ويقلل من وقت معالجة العينة، وينتج نواة عالية الجودة. عدم وجود خطوة الفرز يقلل من الضغط على النوى ويلغي الحاجة إلى مفرز الخلية. غياب الحمض النووي الريبي الميتوكوندريا يزيد من عمق تسلسل النصوص النووية. والأهم من ذلك، وعلى غرار بروتوكولات العزل النووية الوحيدة الأخرى، يسهل هذا البروتوكول المعزز استخدام العينات المجمدة المحفوظة للتحليل بأثر رجعي. لقد نجحنا في تطبيق هذا سير العمل لأداء snRNA-seq و snATAC-seq باستخدام نفس إعداد النوى من أورام الدماغ دون الحاجة إلى تغيير المخازن المؤقتة. لذلك ، يسمح هذا النهج بإجراء دراسات متعددة الاقتصادات من نفس العينة.
في الختام، فإن طريقة عزل النوى الواحدة الموصوفة هنا هي تقنية فعالة ودقيقة وسريعة للغاية يمكن تطبيقها لإجراء دراسات تسلسل النواة الواحدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر المختبر المفتوح للخلية الواحدة (scOpenLab) في المركز الألماني للسرطان (DKFZ) على المناقشات المفيدة. تم دعم هذا البحث من قبل المعونة الألمانية للسرطان، ماكس إيدر برنامج منحة رقم 70111964 (S.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
References
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Filbin, M. G., Suva, M. L. Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time. Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).
- Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. Characterization of gliomas: from morphology to molecules. Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Eckel-Passow, J. E., et al. Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).
- Suzuki, H., et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).
- Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Noushmehr, H., et al. Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).
- Yan, H., et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).
- Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas. Cancer Research. 69 (24), 9157-9159 (2009).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Wu, M., Singh, A. K. Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis. Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications. Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Mathys, H., et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer's disease. Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Al-Dalahmah, O., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19 (2020).
- Jakel, S., et al. Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis. Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. , (2018).
- Lake, B. B., et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).
- Stuart, T., et al.
- Bready, D., Placantonakis, D. G.
- Venteicher, A. S., et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 355 (6332), (2017).
- Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
- Weng, Q., et al. Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis. Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).
- Neftel, C., et al. An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Al-Ali, R., et al. Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201 (2019).
