Summary
I denne protokol blev der designet svinespecifikke primere, der blev fremstillet plasmiderholdige svinespecifikke DNA-fragmenter, og der blev etableret standardkurver for kvantitet. Ved hjælp af artsspecifikke primere blev cpsDNA kvantificeret af qPCR i svine-til-mus-celletransplantationsmodeller og svin-til-abe-arteriepulptransplantationsmodeller.
Abstract
Xenotransplantation er en mulig metode til behandling af organsvigt. Men, hvordan man effektivt kan overvåge immunafvisning af xenotransplantation er et problem for læger og forskere. Dette manuskript beskriver en enkel og effektiv metode til at overvåge immunafstødning i svine-til-mus celle transplantation modeller og svin-til-abe arterie patch transplantation modeller. Cirkulerende DNA er en potentielt ikke-invasiv biomarkør for organskader. I denne undersøgelse blev cirkulerende svinespecifikt DNA (cpsDNA) overvåget under xenograftafvisning ved kvantitativ pcr i realtid (qPCR). I denne protokol blev der designet svinespecifikke primere, der blev fremstillet plasmiderholdige svinespecifikke DNA-fragmenter, og der blev etableret standardkurver for kvantitet. Artsspecifikke primere blev derefter brugt til at kvantificere cpsDNA ved qPCR i svine-til-mus celle transplantation modeller og svin-til-abe arterie patch transplantation modeller. Værdien af denne metode tyder på, at det kan bruges som en enkel, praktisk, lav pris, og mindre invasive metode til at overvåge immunafvisning af xenotransplantation.
Introduction
Organsvigt er en af de vigtigste dødsårsager1. Transplantation af celler, væv og organer er en effektiv måde at behandle organsvigt2. Ikke desto mindre begrænser manglen på donororganer den kliniske anvendelse af denne metode3,4. Undersøgelser har vist, at svin kan anvendes som en potentiel kilde til menneskelige organer til klinisk transplantation5,6. Men, cross-arter organtransplantation står over for farlige immun afvisning. Derfor er det afgørende at overvåge immunafstødning af xenotransplantation. I øjeblikket afhænger klinisk monitorering af immunafstødning hovedsageligt af patientens tegn og symptomer samt laboratorieprøver (f.eks. biopsi, immunbiokemisk analyse ogultralyd) 7,8,9. Disse overvågningsmetoder har imidlertid mange ulemper. Tegn og symptomer på immunafstødning hos patienter vises normaltsent 10, hvilket ikke er befordrende for tidlig påvisning og tidlig indgriben; biopsi har den ulempe at væreinvasiv 11, hvilket ikke er let for patienterne at acceptere; immunbiokemisk analyse mangler følsomhed eller specificitet, og ultralyd er ekstra og dyrt. Derfor er det presserende at finde en effektiv og bekvem metode til at overvåge immunafstødning.
Cirkulerende DNA er en ekstracellulær type DNA fundet i blodet. Mandel og Metais12 rapporterede første gang tilstedeværelsen af cirkulerende DNA i perifert blod i 1948. Under normale fysiologiske forhold, cirkulerende DNA i blodet hos raske mennesker er relativt lav ved baseline. Men i nogle patologier, såsom tumorer, myokardieinfarkt, autoimmune sygdomme, og transplantation afvisning, niveauet af cirkulerende DNA i blodet kan øgesbetydeligt 13,14 på grund af den massive frigivelse af cirkulerende DNA forårsaget af apoptose og nekrose. Oprindelsen af cirkulerende DNA er forbundet med apoptose og nekrose15, som er karakteristiske for xenograftafvisning16.
Cirkulerende DNA har vist sig at være en minimalt invasiv biomarkør til påvisning af kræft17,18,19. Høj gennem-put sekvensering af donor-afledte cirkulerende DNA er pålidelig til påvisning af afvisning efter organtransplantation20,21. Men denne metode kræver en høj koncentration og kvalitet af ekstraheret DNA. DNA-kravene ud over de høje omkostninger og tidsforbrug gør denne metode ikke berettiget til rutinemæssig klinisk brug. Donor-afledt cirkulerende DNA kan kvantificeres præcist ved kvantitative real-time PCR (qPCR), som er både specifik og følsom. Derfor er kvantificering af porcin cirkulerende DNA ved qPCR en mulig metode til at overvåge immunafstødning af xenotransplantation. Dette er mindre invasive, meget følsomme og specifikke, lave omkostninger, og tidsbesparende. Svin og mennesker er genetisk adskilte med helt forskellige genomsekvenser (Figur 1). Derfor kan cirkulerende svine-DNA frigives i modtagerens blod efter xenotransplantation på grund af xeno-afvisning. CpsDNA kunne kvantificeres præcist ved qPCR med artsspecifikke primere i recipientens blod. Tidligere har vi vist rationalet og gennemførligheden af cpsDNA som biomarkør for xenotransplantation22,23. Her afslører vi flere eksperimentelle tips og detaljer. Eksperimentet består af følgende trin. For det første blev der designet svinespecifikke primere, og genomisk DNA blev isoleret, som blev brugt til at kontrollere primernes specificitet ved hjælp af almindelig PCR. For det andet, konstruere standard kurven af cpsDNA og isolere cpsDNA fra prøven blod. Endelig blev det cirkulerende svinespecifikke DNA kvantificeret ved hjælp af qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med de relevante retningslinjer og forskrifter i Institutional Review Board of Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital of Shenzhen University.
1. Design svin specifikke primere
- Udfør blastanalyse af hele genomet for at identificere porcinspecifikke gener, der var forskellige fra gener for mennesker, aber eller mus, ved hjælp af softwaren NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
- Design primere i henhold til 19 svinespecifikke gener (tabel 1) ved hjælp af primer 5's software.
2. Isolering af genomisk DNA
BEMÆRK: Det genomiske DNA (herunder blod fra svin, aber, frivillige mennesker, aber med svinetransplantationer og mus med svinceller) blev udvundet ved hjælp af et kommercielt genomisk DNA-ekstraktionssæt (Materialetabel).
- Der anbringes henholdsvis 500 μL af ovenstående prøvers fuldblod i forskellige mikrocentrifugerør.
- Der tilsættes 20 μL protease K og 500 μL lysisbuffer i ovennævnte mikrocentrifugerør, og ryst og bland derefter grundigt.
- Disse mikrocentrifugerør anbringes i et vandbad ved 56 °C i 10 minutter, og ryst 2-3 gange under denne proces, indtil opløsningen bliver klar.
- Centrifuge kort for at fjerne de flydende perler fra den indvendige væg af røret dækker. Tilsæt 500 μL vandfri ethylalkohol og ryst grundigt.
- Blandingen overføres til adsorptionssøjlen, centrifuge ved 12.000 omdr./min .
- Der tilsættes 800 μL skylleopløsning til hver adsorptionskolonne. centrifuge i 1 min ved 12.000 omdrejninger i minuttet ( ~13.400 x g). Anslaf kolonnerne ved stuetemperatur i et par minutter for at tørre den resterende skylleopløsning.
BEMÆRK: Skylleopløsningen leveres af producenten. - Overfør adsorptionssøjlerne til et andet rent centrifugalrør, tilsæt 50 μL elution buffer til midten af adsorptionsfilmene, og læg dem ved stuetemperatur i 2-5 min. Centrifuge 6.200 x g i 1 min 12.000 omdr./min. (~13.400 x g).
BEMÆRK: Elution bufferen leveres af producenten, men TE-bufferen, der indeholder 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) og 0,1 mM EDTA, kan også fremkalde DNA'et. - DNA-opløsningen opbevares ved -20 °C.
3. Kontroller primrens specificitet
BEMÆRK: Artspec specificiteter af de ovennævnte 19 primere blev bekræftet af PCR, som blev udført ved hjælp af polymerase (Tabel over Materialer) og primere præsenteret i tabel 1.
- Forblandet opløsning af 12,5 μL 2x PCR-forblanding (materialetabel),1 μL 5' primer (10 μM), 1 μL 3' primer (10 μM) og 8,5 μL ddH2O. Bland blandingen, herunder 2 ekstra prøver.
- Opdel 23 μL forblandet opløsning i 0,2 ml mikrocentrifugerør, tilsæt 2 μL genomisk DNA, og hætteglassene skal omhyggeligt overse. Derefter blandes og centrifuge lidt.
- De 0,2 ml mikrocentrifugerør anbringes i PCR-cycleren, og følgende udføres: Denaturering: 95 °C i 5 s; Udglødning: 60 °C til 30 s; forlængelse:72 °C til 30 s.
- Udfør agarose elektroforese som følger:
- 1,2 g agarose vejes i en kolbe indeholdende 100 ml 1x TAE og koges i 5 minutter i mikrobølgeovnen. Der tilsættes 5 μL nukleinsyrefarvestof (materialetabel) i kolben, når den er kølet af til ca. 70 °C. Hæld det i pladen langs kanten langsomt, og læg det ved stuetemperatur, indtil det størkner i en gel.
- Der tilsættes 5 μL prøve- og 2-Log DNA-stige (0,1-10,0 kb) eller markør I (0,1-0,6 kb), som indeholder 1 μL 6x DNA-belastningsbuffer, i agarosegelen. Derefter elektroforese ved 120 mA, indtil båndene er adskilt.
- Visualiser agargelen, der indeholder DNA-fragmenter, med en ultraviolet billede.
- Udfør agarose elektroforese at isolere forstærkede DNA fragmenter fra de ovennævnte prøver, som blev visualiseret i en ultraviolet imager. Ved hjælp af PCR blev de primere, der var specifikke for forstærket porcingenomisk DNA, først identificeret (Figur 2A). Endvidere blev visse artsspecifikke forhold af disse primere, som specifikt forstærkede svine-DNA i kohorten af abe/humant genomisk eller i kohorten af musegenomisk DNA bekræftet (figur 2B). Endelig blev det yderligere påvist, at to artsspecifikke primere specifikt forstærker svine-DNA i svine-til-abe-arterieprettelsen og/eller svinecelletransplantationsmodellerne (figur 2C)
4. Standardkurve af cpsDNA
- Omdan pMD19-T plasmid, der indeholder et fragment af porcine DNA, til DH5a, som specifikt kan forstærkes af primer #4 eller primer #11 (Tabel 1). Skærm for positive bakterier med 50 μg/ml ampicillin.
Primer #4 i human / abe kohorte (fremad: 5′-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3′, omvendt: 5′-CTTCATTCCATCTTCATAATAAC CCTGT-3′)
Primer #11 for mus model (fremad: 5′-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3′, omvendt: 5′-TCACATTTGATGATGGTCGTCTGTCGTCGTC T-3′)
BEMÆRK: Nærmere oplysninger om alle primere findes i tabel 1. - Høst ovenstående plasmider efter nedenstående protokol.
- Isoler en enkelt koloni fra en nystribet selektiv plade og inokuler en kultur på 1- 5 ml LB-medium, der indeholder det relevante selektive antibiotikum. Inkuberes i 12-16 timer ved 37 °C med kraftig omrystning (300 omdr./min.).
- Centrifuge ved 10.000 x g i 1 minut ved stuetemperatur. Dekantere eller aspirere og kassere kulturmedierne.
- Der tilsættes 250 μL opløsning I/RNase A. Vortex eller pipet op og ned for at blande grundigt. Komplet resuspension af celle pellet er afgørende for at opnå gode udbytter.
BEMÆRK: RNase A skal føjes til løsning I før brug. - Overfør suspension i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Der tilsættes 250 μL opløsning II. Inverter og drej forsigtigt røret flere gange for at opnå et klart lysat. En 2-3 minutters inkubation kan være nødvendig.
BEMÆRK: Undgå kraftig blanding, da dette vil forskyde kromosomale DNA og lavere plasmid renhed. Lysisreaktionen må ikke fortsætte mere end 5 minutter. - Der tilsættes 350 μL opløsning III. Straks vende flere gange, indtil en flocculent hvid bundfald former.
BEMÆRK: Det er afgørende, at opløsningen blandes grundigt og umiddelbart efter tilsætning af løsning III for at undgå lokaliseret nedbør. - Centrifuge ved maksimal hastighed (≥13.000 x g)i 10 minutter. En kompakt hvid pellet vil danne. Gå straks videre til næste trin.
- Indsæt en DNA mini kolonne i en 2 ml samling rør.
- Overfør den ryddede supernatant fra 4.2.7 ved omhyggeligt at indsuge den i DNA mini kolonne. Pas på ikke at forstyrre pellet, og at ingen cellulære rester overføres til DNA mini kolonne.
- Centrifuge ved maksimal hastighed i 1 minut. Kassér filtratet og genbrug opsamlingsrøret.
- Der tilsættes 500 μL HBC-buffer. Centrifuge ved maksimal hastighed i 1 minut. Kassér filtratet og genbrug opsamlingsrøret.
BEMÆRK: HBC Buffer skal fortyndes med 100% isopropanol før brug. - Der tilsættes 700 μL DNA-vaskebuffer. Centrifuge ved maksimal hastighed i 1 minut. Kassér filtratet og genbrug opsamlingsrøret.
BEMÆRK: DNA-vaskebufferen skal fortyndes med 100 % ethanol før brug.- Valgfrit: Gentag for en anden DNA vask buffer vask trin.
- Centrifuge den tomme DNA mini kolonne i 2 minutter ved maksimal hastighed til at tørre kolonnematrixen.
BEMÆRK: Det er vigtigt at tørre DNA mini kolonne matrix før eluering. Resterende ethanol kan forstyrre downstream-anvendelser. - Overfør DNA mini kolonne til en ren 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
- Der tilsættes 30-100 μL Elution Buffer eller sterilt deioniseret vand direkte til midten af søjlemembranen.
BEMÆRK: Effektiviteten af eluting DNA fra DNA Mini kolonne er afhængig af pH. Hvis du bruger sterilt deioniseret vand, skal du sørge for, at pH-3'en er omkring 8,5. - Lad sidde ved stuetemperatur i 1 minut.
- Centrifuge ved maksimal hastighed i 1 minut.
BEMÆRK: Dette udgør ca. 70% af det bundne DNA. En valgfri anden elution vil give eventuelle resterende DNA, men ved en lavere koncentration.
- Ovenstående plasmider kontrolleres ved dobbelt begrænsning af enzymfordøjelsen ved hjælp af EcoR I (15 U/μL) og Bam H1(15 U/μL)22.
- Udfør make-up trin på isen. Reaktionssystemet på 1 μL EcoR I (15 U), 1 μL Bam H1 (15 U), 2 μL 10x Buffer, 1 μg plasmid tilsættes ddH2O til 20 μL af det samlede volumen, blandes grundigt. Inkuberes i et vandbad ved 37 °C i 2 timer.
- Adskaf de fordøjede produkter med 1% agarose efterfulgt af elektroforese og udsættes for UV-lys som før.
- Den koncentrerede plasmid fortyndes i 2 x 1011 kopier/ml for startstandardopløsningen ved hjælp af ddH2O. Tag plasmid (P2), der indeholder et fragment af porcine DNA, f.eks.
- Antallet af plasmider beregnes i 1 ml startstandardopløsning: N = (2 x 1011)/ (6,02 x 1023) mol.
- Beregn molekylvægten P2: M = 2810 bp x 650 D/bp = 2810 x 650 D (g/mol).
- Massen af P2: m=N*M= (2 x 1011)/ (6,02 x 1023)mol x 2810 x 650 g/mol.
- B= m/C = [((2 x 1011)/(6,02 x 1023)x 2810 x 650] g/C. (C er koncentrationen af P2 (ng/μL), som måles ved hjælp af et spektrofotometer).
- Startstandardopløsningen fortyndes serielt 10 gange i 2 x10 10 kopier/ml, 2 x 109 kopier/ml, 2 x 108 kopier/ml, 2 x 107 kopier/ml..., og 2 x 100 kopier/ml til standardopløsning ved hdH2O. Vortex.
- Faststing standardkurven.
- Der klargørsvaringssystemet qPCR (alle trin er beskyttet mod lys): Tilsæt den forblandet opløsning, som indeholder 325 μL qPCR Mix (Tabel over Materialer),13 μL 5' primer, 13 μL 3' primer og 169 μL ddH2O i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, som derefter blev grundigt blandet og let centrifugeret.
- 40 μL ovenforblandet opløsning opdeles i en 8-rørstrimmel, og der tilsættes 10 μL standard-DNA i forskellige koncentrationer. Hætte omhyggeligt, bland og centrifuge lidt.
- 8-rørstrimmel anbringes i qPCR-maskinen efter proceduren i figur 3.
5. Isoler cirkulerende DNA fra blodprøverne
- Ved hjælp af EDTA-rør indsamles blodprøver på forskellige tidspunkter i gris-til-abe-arterieprettelsesmodellerne og svine-til-musecelletransplantationsmodellerne.
- Der udtages blodprøver på ca. 400 μL (fra modellerne for mikroskopi mellem svin og aber) eller 100 μL (fra svine-til-musecelletransplantationsmodellerne) og overføres til 1,5 ml mikrocentrifugerør. Blodcellerne fjernes fra blodprøverne ved centrifugering ved lav temperatur og høj hastighed (3.000 x g, 4 °C, 5 min).
- Overfør supernatanten til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør, og celleregenereret fjernes ved centrifugering ved 16.000 x g i 10 min.
- Overfør supernatanten til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Ekstrakt den cirkulerende DNA fra ovennævnte supernatant ved hjælp af en kommerciel serum / cirkulerende DNA ekstraktion kit efter protokol 2 i den isolerende genomiske DNA-producenters protokol.
- Omvandt mængden af cirkulerende DNA til 40 μL og opbevares ved -20 °C.
6. Kvantisering af cirkulerende svinespecifikt DNA
- Præblandet opløsning af 25 μL qPCR-mix (materialetabel),1 μL 5' primer, 1 μL 3' primer, 10 μL prøve-DNA og 13 μL ddH2O. Bland blandingen, herunder 2 ekstra prøver.
- Den 40 μL forblandet opløsning opdeles i en 8-rørstrimmel, og der tilsættes 10 μL prøve-DNA efterfulgt af omhyggelig udjævning. Forbered yderligere to reaktioner end nødvendigt.
- Sæt 8-rørstriben i qPCR-maskinen efter samme procedure som standardkurven. Det er bedre at køre en standard først for at sikre, at reaktionen er afgørende for kvantificering på forhånd. Proceduren for qPCR's reaktionssystem blev vist i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol blev der konstrueret svinespecifikke primere, plasmiderholdige svinespecifikke DNA-fragmenter blev konstrueret, og der blev etableret standardkurver for kvantitet (figur 4). Arts specificiteter af de 19 primere blev bekræftet af PCR. Artsspecifikke primere (primer #4 og primer #11) blev derefter brugt til at kvantificere cpsDNA ved qPCR i svine-til-mus celle transplantation modeller og svin-til-abe arterie patch transplantation modeller.
Agarose elektroforese blev brugt til at isolere forstærkede DNA fragmenter fra de ovennævnte prøver, som derefter visualiseres i en ultraviolet imager. Ved hjælp af PCR blev de primere, der var specifikke for forstærket porcingenomisk DNA, først identificeret (Figur 2A). Endvidere blev visse artsspecifikke forhold af disse primere, der specifikt forstærkede svine-DNA i kohorten af abe/humant genomisk eller i kohorten af musens genomiske DNA, bekræftet (figur 2B). Endelig blev det yderligere påvist, at to artsspecifikke primere specifikt forstærker svine-DNA i svine-til-abe-arterieprettelsen og/eller svinecelletransplantationsmodellerne (figur 2C).
Figur 1: Genidentitet mellem svin (sus scrofa, ssc) og human (homo sapiens, har) eller abe (Macaca fascicularis, mfa). Gensekvenserne fra tre forskellige arter blev sammenlignet med BLAST-analyse. BLAST-sekvensanalysen anvendte genomiske anmærkningsoplysninger (mRNA-sekvensen) fra de tre arter, der blev downloadet fra NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). MRNA sekvenser af mennesker, abe, og svin gener var 139116, 65927, og 71498,henholdsvis 22. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Almindelig PCR validerer specifikke forhold for svinspecifikke primere. ( A Grisens genomiske DNA-fragmenter blev forstærket af primere 1-19. (B) Det genomiske DNA-fragment mellem mennesker/abe/mus kunne ikke forstærkes af nogle primere (primer #4 og #11). Stjernerne (*) indikerer ingen forstærkninger i human/abegenomisk DNA. Pundtegnet (#) angiver ingen forstærkning i musegenomisk DNA. c )Deto artsspecifikke primere (primer #4 og #11) blev yderligere bevist, at de specifikt forstærker svine-DNA i svine-til-abe-arterieprettelsen og/eller celletransplantationsmodellerne for svin til mus ,henholdsvis 22. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Proceduren for qPCR-reaktion22. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Etablering af standardkurven for absolut kvantificering. Forstærkningsområderne, smeltekurveområder og standardkurvevisningerne på (A) primer #4 og (B) primer #11 fra qPCR-maskinen (se Materialetabel)udstilles. En god standard (R-værdi tæt på 1, forstærkning effektivitet er inden for 100% ±5%) kan anvendes i op til et halvt år22. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantificering af porcin cirkulerende DNA repræsenterer en mulig tilgang til overvågning af immunafstødning af xenotransplantation. Gadi et al.24 fandt, at donor-afledt cirkulerende DNA (ddcfDNA) indhold i blodet hos patienter med akut afvisning var betydeligt højere end for patienter uden afvisning. Disse undersøgelser tyder på, at ddcfDNA kan være en fælles biomarkør til overvågning af organtransplantationsskader. I de senere år er qPCR i stigende grad blevet anvendt til analyse af nukleinsyrer på grund af sin enkle drift, høj grad af automatisering, høj følsomhed, god specificitet og lave omkostninger.
I denne undersøgelse blev svinespecifikke primere designet på grundlag af resultaterne af bioinformatikanalyse. Deres specificitet blev verificeret af almindelig PCR. CpsDNA af blodprøverne fra svine-til-abe-arteriestrettelsesmodellerne og svine-til-musecelletransplantationsmodellerne kunne kvantificeres præcist ved qPCR med artsspecifikke primere. De største fordele ved tilgangen er følgende. For det første er denne metode til kvantificering af DNA meget følsom og specifik på grundlag af de meget specifikke primere. Desuden er protokollen for tilgangen meget enkel at udføre, som bestod af design af specifikke primere, isolering af DNA og qPCR-analyse på én arbejdsdag, hvilket er tidsbesparende. Det er en ikke-invasiv metode, der starter fra en lille mængde serum eller plasmamateriale. I mellemtiden har vi vist, at denne metode er meget reproducerbar22. I modsætning til høj-throughput sekventering og flyvning massespektrometri, denne metode er lave omkostninger.
Overvågning af immunafstødning ved kvantificering af cirkulerende svinespecifikt DNA i blodet hos svin-til-abe-arteriepulprettelsesmodeller og celletransplantationsmodeller for svin til mus ved hjælp af qPCR har lagt grunden til grundforskningen og den kliniske anvendelse af porcine-human xenotransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Key F&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ201708171721116272), særlige midler til opførelse af hospitaler på højt niveau i Guangdong-provinsen (2019), Sanming Project of Medicine i Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit ? | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
- Buchman, T.
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
- Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
- Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
- Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
- Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
- Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
- Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
- Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
- Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
- Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
- Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l'homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
- Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
- Wagner, J. Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
- Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
- De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
- Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
- Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
- Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).
