In diesem Protokoll wurden schweinespezifische Primer entwickelt, Plasmiden enthaltende Porenspezifische DNA-Fragmente konstruiert und Standardkurven für die Quantifizierung festgelegt. Anhand artspezifischer Primer wurde cpsDNA durch qPCR in Schweine-zu-Maus-Zelltransplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen quantifiziert.
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Methodenartikel
Quantifizierung der zirkulierenden schweinespezifischen DNA im Blut eines Xenotransplantationsmodells
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Xenotransplantation ist eine praktikable Methode zur Behandlung von Organversagen. Jedoch, wie die Immunabstoßung von Xenotransplantation effektiv zu überwachen ist ein Problem für Ärzte und Forscher. Dieses Manuskript beschreibt eine einfache und effektive Methode zur Überwachung der Immunabstoßung in Schweine-zu-Maus-Zelltransplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen. Zirkulierende DNA ist ein potenziell nicht-invasiver Biomarker für Organschäden. In dieser Studie wurde zirkulierende schweinespezifische DNA (cpsDNA) während der Xenograft-Abstoßung durch quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) überwacht. In diesem Protokoll wurden schweinespezifische Primer entwickelt, Plasmiden enthaltende Porenspezifische DNA-Fragmente konstruiert und Standardkurven für die Quantifizierung festgelegt. Artspezifische Primer wurden dann verwendet, um cpsDNA durch qPCR in Schweine-zu-Maus-Zell-Transplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen zu quantifizieren. Der Wert dieser Methode legt nahe, dass es als eine einfache, bequeme, kostengünstige und weniger invasive Methode verwendet werden kann, um die Immunabstoßung von Xenotransplantation zu überwachen.
Einleitung
Organversagen ist eine der Haupttodesursachen1. Transplantation von Zellen, Geweben und Organen ist ein effektiver Weg, um Organversagen zu behandeln2. Dennoch schränkt der Mangel an Spenderorganen die klinische Anwendung dieser Methodeein 3,4. Studien haben gezeigt, dass Schweine als potenzielle Quelle menschlicher Organe für die klinische Transplantation verwendet werden können5,6. Die artenübergreifende Organtransplantation ist jedoch mit einer gefährlichen Immunabstoßung konfrontiert. Daher ist es wic....
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Protokoll
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften des Institutional Review Board des Shenzhen Second People es Hospital, First Affiliated Hospital der Shenzhen University durchgeführt.
1. Entwerfen Sie porcine spezifische Primer
- Führen Sie eine Vollgenom-BLAST-Analyse durch, um porenspezifische Gene zu identifizieren, die sich von denen von Menschen, Affen oder Mäusen unterschieden, mit der Software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
- Designprimer nach 19 schweinespezifischen Genen (Tabelle 1) mit der Software von Primer 5.
2. Isolierun....
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Ergebnisse
In diesem Protokoll wurden schweinespezifische Primer entwickelt, Plasmiden enthaltende Porenspezifische DNA-Fragmente konstruiert und Standardkurven für die Quantifizierung festgelegt (Abbildung 4). Die Spezifitäten der 19 Primer wurden von PCR bestätigt. Artspezifische Primer (Primer #4 und Primer #11) wurden dann verwendet, um cpsDNA durch qPCR in Schweine-zu-Maus-Zell-Transplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen zu quantifizieren.
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Diskussion
Die Quantifizierung der zirkulierenden Poren-DNA stellt einen praktikablen Ansatz zur Überwachung der Immunabstoßung von Xenotransplantationen dar. Gadi et al.24 fanden heraus, dass der von Spendern abgeleitete zirkulierende DNA-Gehalt (ddcfDNA) im Blut von Patienten mit akuter Abstoßung signifikant höher war als der von Patienten ohne Abstoßung. Diese Studien deuten darauf hin, dass ddcfDNA ein häufiger Biomarker für die Überwachung von Organtransplantatschäden sein kann. In den letzten Jahren wu.......
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Offenlegungen
Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong unterstützt. Provinz (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spanien | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, USA | R3136S | |
| 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0,2 mL PCR-Röhrchen | Axygen Biowissenschaften, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL / 6 | Mäuse Medical Animal Center der Provinz Guangdong, China | 8 ~ 10 Wochen | |
| Zentrifuge | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA | Micro 21R 2-Log | |
| DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, USA | N3200S | 0.1– 10.0 kb |
| Markierung I | Tiangen, Peking, China | MD101-02 | 0.1– 0,6 kb |
| DNA-Mini-Säule (HiBind DNA-Mini-Säulen) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA-Ladepuffer | Solarbio, Peking, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I und E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Biografie, Shiga, Japan | 1040S Weibliche | |
| Bama Minischweine | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2 ~ 4 Monate | |
| Genomisches DNA-Extraktionskit? | Tiangen, Peking, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Männliche Cynomolgus-Affen | Guangdong Landau Biotechnologie, Guangzhou, China | 8 Jahre | |
| Nukleinsäure-Farbstoff (Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| Polymerase (Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T Plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR-Maschine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/zirkulierendes DNA-Extraktionskit | Tiangen, Peking, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
Referenzen
- Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2....
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Nachdrucke und Genehmigungen
