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Biology

Quantificazione del DNA circolante specifico del maiale nel sangue di un modello di xenotrapianto

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61579
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1, 4, 1,5, 6, 7, 1
1Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Institute of Translational Medicine, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Xianning Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Liver-biotechnology (Shenzhen) Co., Ltd., 4Department of Radiology, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 5Department of Life Sciences, University of Toronto, 6Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, Nanjing Medical University, 7Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

In questo protocollo sono stati progettati primer specifici suiini, sono stati costruiti frammenti di DNA specifici contenenti plasmidi e sono state stabilite curve standard per la quantificazione. Utilizzando primer specifici per specie, cpsDNA è stato quantificato da qPCR in modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia.

Abstract

Lo xenotrapianto è un metodo fattibile per trattare l'insufficienza d'organo. Tuttavia, come monitorare efficacemente il rifiuto immunitario dello xenotrapianto è un problema per medici e ricercatori. Questo manoscritto descrive un metodo semplice ed efficace per monitorare il rigetto immunitario nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nei modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia. Il DNA circolante è un biomarcatore potenzialmente non invasivo per il danno agli organi. In questo studio, il DNA circolante specifico del maiale (cpsDNA) è stato monitorato durante il rigetto dello xenograft mediante PCR quantitativo in tempo reale (qPCR). In questo protocollo sono stati progettati primer specifici suiini, sono stati costruiti frammenti di DNA specifici contenenti plasmidi e sono state stabilite curve standard per la quantificazione. I primer specifici per specie sono stati quindi utilizzati per quantificare il cpsDNA da qPCR nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nei modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia. Il valore di questo metodo suggerisce che può essere usato come metodo semplice, conveniente, a basso costo e meno invasivo per monitorare il rifiuto immunitario dello xenotrapianto.

Introduction

L'insufficienza d'organo è una delle principali cause dimorte 1. Il trapianto di cellule, tessuti e organi è un modo efficace per trattare l'insufficienzad'organo 2. Tuttavia, la carenza di organi donatori limita l'applicazione clinica di questometodo 3,4. Gli studi hanno dimostrato che i maiali possono essere utilizzati come potenziale fonte di organi umani per il trapiantoclinico 5,6. Tuttavia, il trapianto di organi tra specie deve affrontare un pericoloso rifiuto immunitario. Pertanto, è fondamentale monitorare il rifiuto immunitario dello xenotrapianto. Attualmente, il monitoraggio clinico del rigetto immunitario dipende principalmente dai segni e dai sintomi del paziente, nonché dai test di laboratorio (ad esempio biopsia, analisi immunobiochimica ed ecografia)7,8,9. Tuttavia, questi metodi di monitoraggio hanno molti svantaggi. I segni e i sintomi del rigetto immunitario nei pazienti di solitocompaiono alla fine del 10, il che non favorisce la diagnosi precoce e l'intervento precoce; la biopsia ha lo svantaggio di essereinvasiva 11, il che non è facile da accettare per i pazienti; l'analisi immunobiochimica manca di sensibilità o specificità e gli ultrasuoni sono ausiliari e costosi. Pertanto, è urgente trovare un metodo efficace e conveniente per monitorare il rifiuto immunitario.

Il DNA circolante è un tipo extracellulare di DNA trovato nel sangue. Mandel e Metais12 riportarono per la prima volta la presenza di DNA circolante nel sangue periferico nel 1948. In condizioni fisiologiche normali, il DNA circolante nel sangue di persone sane è relativamente basso al basale. Tuttavia, in alcune patologie, come tumori, infarto del miocardio, malattie autoimmuni e rigetto del trapianto, il livello di DNA circolante nel sangue può essere significativamenteaumentato 13,14 a causa del rilascio massiccio di DNA circolante causato da apoptosi e necrosi. L'origine del DNA circolante è associata all'apoptosi e alla necrosi15, che sono caratteristiche del rifiuto dello xenografto16.

Il DNA circolante ha dimostrato di essere un biomarcatore mini-invasivo per il rilevamento deitumori 17,18,19. Il sequenziamento elevato del DNA circolante derivato dal donatore è affidabile per il rilevamento del rigetto dopo il trapianto diorgani 20,21. Tuttavia, questo metodo richiede un'alta concentrazione e qualità del DNA estratto. I requisiti del DNA oltre all'elevato costo e al consumo di tempo rendono questo metodo non idoneo per l'uso clinico di routine. Il DNA circolante derivato dal donatore può essere quantificato con precisione dalla PCR quantitativa in tempo reale (qPCR), che è allo stesso tempo specifica e sensibile. Pertanto, quantificare il DNA circolante suino mediante qPCR è un metodo fattibile per monitorare il rigetto immunitario dello xenotrapianto. Questo è meno invasivo, altamente sensibile e specifico, a basso costo e risparmio di tempo. I suini e gli esseri umani sono geneticamente separati con sequenze genomiche molto diverse (Figura 1). Pertanto, il DNA suino circolante può essere rilasciato nel sangue del ricevente dopo lo xenotrapianto a causa dello xeno-rifiuto. CpsDNA potrebbe essere quantificato con precisione da qPCR con primer specifici per specie nel sangue del ricevente. In precedenza, abbiamo dimostrato la logica e la fattibilità del cpsDNA come biomarcatore per lo xenotrapianto22,23. Qui, divulghiamo suggerimenti e dettagli più sperimentali. L'esperimento consiste nei seguenti passaggi. In primo luogo, sono stati progettati primer specifici suiini e il DNA genomico è stato isolato, che è stato utilizzato per verificare la specificità dei primer dalla NORMALE PCR. In secondo luogo, costruire la curva standard di cpsDNA e isolare cpsDNA dal sangue campione. Infine, il DNA circolante specifico del maiale è stato quantificato utilizzando qPCR.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti dell'Institutional Review Board of Shenzhen Second People's Hospital, Primo ospedale affiliato dell'Università di Shenzhen.

1. Progettare primer specifici per suini

  1. Eseguire l'analisi BLAST dell'intero genoma per identificare geni specifici suiini diversi da quelli di esseri umani, scimmie o topi, utilizzando il software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
  2. Progettare primer secondo 19 geni specifici del maiale (Tabella 1) utilizzando il software di Primer 5.

2. Isolare il DNA genomico

NOTA: Il DNA genomico (incluso il sangue di maiali, scimmie, esseri umani volontari, scimmie con innesti di maiali e topi con cellule suine) è stato estratto utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico commerciale (Table of Materials).

  1. Posizionare rispettivamente 500 μL del sangue intero dei campioni di cui sopra in diversi tubi di microcentrifugo.
  2. Aggiungere 20 μL di proteasi K e 500 μL di tampone di lisi nei tubi di microcentrifugo di cui sopra, quindi agitare e mescolare accuratamente.
  3. Mettere questi tubi di microcentrifugo in un bagno d'acqua a 56 °C per 10 minuti e agitare 2-3 volte durante questo processo fino a quando la soluzione non diventa chiara.
  4. Centrifugare brevemente per rimuovere le perline liquide dalla parete interna dei coperchi del tubo. Aggiungere 500 μL di alcol etilico anidro e agitare accuratamente.
  5. Trasferire la miscela nella colonna di adsorbimento, centrifugare a 12.000 giri/min (~13.400 x g)per 2 min.
  6. Aggiungere 800 μL di soluzione di risciacquo ad ogni colonna di adsorbimento; centrifuga per 1 min a 12.000 giri/min (~13.400 x g). Posizionare le colonne a temperatura ambiente per alcuni minuti per asciugare la soluzione di risciacquo rimanente.
    NOTA: La soluzione di risciacquo è fornita dal produttore.
  7. Trasferire le colonne di adsorbimento in un altro tubo centrifugo pulito, aggiungere 50 μL di tampone di eluizione al centro delle pellicole di adsorbimento e posizionarle a temperatura ambiente per 2-5 minuti. Centrifuga 6.200 x g per 1 min 12.000 giri/min (~13.400 x g).
    NOTA: Il tampone di eluizione è fornito dal produttore, ma il tampone TE, contenente 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) e 0,1 mM EDTA, può anche eludere il DNA.
  8. Conservare la soluzione di DNA a -20 °C.

3. Verificare la specificità dei primer

NOTA: Le specificità delle specie dei 19 primer di cui sopra sono state confermate dalla PCR, che è stata eseguita utilizzando polimerasi(tabelladei materiali) e primer presentati nella tabella 1.

  1. Preparare la soluzione premiscelata di 12,5 μL di 2x premiscele PCR (Tabella deimateriali),1 μL di primer da 5' (10 μM), 1 μL di primer 3' (10 μM) e 8,5 μL di ddH2O. Preparare la miscela includendo 2 campioni extra.
  2. Dividere 23 μL di soluzione pre-miscelata in tubi di microcentrifugo da 0,2 ml, aggiungere 2 μL di DNA genomico e limitare accuratamente i tubi. Quindi mescolare e centrifugare leggermente.
  3. Posizionare i tubi di microcentrifugo da 0,2 ml nel ciclore PCR ed eseguire le seguenti operazioni: Denaturazione: 95 °C per 5 s; Ricottura: 60 °C per 30 s; estensione:72 °C per 30 s.
  4. Eseguire l'elettroforesi dell'agarosio come segue:
    1. Pesare 1,2 g di agarosio in un pallone contenente 100 ml di 1x TAE e far bollire per 5 minuti nel microonde. Aggiungere 5 μL di colorante acido nucleico(Tabella dei materiali)nel pallone dopo che si raffredda a circa 70 °C. Versarlo lentamente nella piastra lungo il bordo e posizionarlo a temperatura ambiente fino a quando non si solidifica in un gel.
    2. Aggiungere 5 μL di campione e scala del DNA a 2 log (0,1-10,0 kb) o marcatore I (0,1-0,6 kb), che contengono 1 μL di tampone di carico del DNA 6x, nel gel di agarosio. Quindi elettroforesco a 120 mA fino a quando le bande non sono separate.
    3. Visualizza il gel di agar contenente frammenti di DNA con un imager ultravioletto.
  5. Eseguire l'elettroforesi dell'agarosio per isolare frammenti di DNA amplificati dai campioni di cui sopra, che è stato visualizzato in un imager ultravioletto. Utilizzando la PCR, sono stati identificati per la prima volta i primer specifici per il DNA genomico suino amplificato (Figura 2A). Inoltre, sono state confermate alcune specificità delle specie di questi primer che hanno specificamente amplificato il DNA dei suini nella coorte di genomica scimmia/umana o nella coorte del DNA genomico del topo(figura 2B). Infine, due primer specifici per specie hanno ulteriormente dimostrato di amplificare specificamente il DNA dei suini nel cerotto dell'arteria da maiale a scimmia e/o nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo(figura 2C)

4. Curva standard di cpsDNA

  1. Trasformare il plasmide pMD19-T contenente un frammento di DNA suino in DH5a, che potrebbe essere specificamente amplificato dal primer #4 o dal primer #11 (Tabella 1). Schermo per batteri positivi utilizzando 50 μg/mL di ampicillina.
    Primer #4 nella coorte uomo/scimmia (avanti: 5′-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3′, rovescio: 5′-CTTCATTCCATCTTCATAATAAC CCTGT-3′)
    Primer #11 per il modello di mouse (avanti: 5′-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3′, inverso: 5′-TCACATTTGATGGTCGTCTTGTCGTC T-3′)
    NOTA: I dettagli di tutti i primer sono disponibili nella tabella 1.
  2. Raccogliere i plasmidi di cui sopra seguendo il protocollo seguente.
    1. Isolare una singola colonia da una piastra selettiva appena striata e inoculare una coltura di 1-5 mL di mezzo LB contenente l'antibiotico selettivo appropriato. Incubare per 12-16 ore a 37 °C con scuotimento vigoroso (300 giri/min).
    2. Centrifuga a 10.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente. Decantare o aspirare e scartare i mezzi di coltura.
    3. Aggiungere 250 μL di Soluzione I/RNasi A. Vortice o pipetta su e giù per mescolare accuratamente. La sospensione completa del pellet cellulare è vitale per ottenere buone rese.
      NOTA: La RNasi A deve essere aggiunta alla soluzione I prima dell'uso.
    4. Trasferire la sospensione in un nuovo tubo microcentrifugo da 1,5 ml. Aggiungere 250 μL della soluzione II. Invertire e ruotare delicatamente il tubo più volte per ottenere un lysate chiaro. Può essere necessaria un'incubazione di 2-3 minuti.
      NOTA: Evitare una miscelazione vigorosa in quanto ciò tagliorà il DNA cromosomico e ridurre la purezza del plasmide. Non lasciare che la reazione dilisi proceda per più di 5 minuti.
    5. Aggiungere 350 μL della soluzione III. Invertire immediatamente più volte fino a 300 forme di precipitato bianco flocculento.
      NOTA: È fondamentale che la soluzione sia miscelata accuratamente e immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione III per evitare precipitazioni localizzate.
    6. Centrifuga alla massima velocità (≥13.000 x g) per 10 minuti. Si formerà un pellet bianco compatto. Procedere prontamente al passaggio successivo.
    7. Inserire una mini colonna dna in un tubo di raccolta da 2 ml.
    8. Trasferire il supernatante cancellato da 4.2.7 aspirandolo attentamente nella mini colonna del DNA. Fare attenzione a non disturbare il pellet e che nessun detriti cellulare venga trasferito nella mini colonna del DNA.
    9. Centrifuga alla massima velocità per 1 minuto. Scartare il filtrato e riutilizzare il tubo di raccolta.
    10. Aggiungere 500 μL di HBC Buffer. Centrifuga alla massima velocità per 1 minuto. Scartare il tubo di raccolta del filtrato e riutilizzarlo.
      NOTA: HBC Buffer deve essere diluito con isopropanolo al 100% prima dell'uso.
    11. Aggiungere 700 μL di DNA Wash Buffer. Centrifuga alla massima velocità per 1 minuto. Scartare il filtrato e riutilizzare il tubo di raccolta.
      NOTA: Il tampone di lavaggio del DNA deve essere diluito con etanolo al 100% prima dell'uso.
      1. Facoltativo: ripetere per una seconda fase di lavaggio del tampone di lavaggio del DNA.
    12. Centrifugare la mini colonna di DNA vuota per 2 minuti alla massima velocità per asciugare la matrice della colonna.
      NOTA: È importante asciugare la matrice della mini colonna del DNA prima dell'eluizione. L'etanolo residuo può interferire con le applicazioni a valle.
    13. Trasferire la mini colonna del DNA in un tubo di microcentrifugo pulito da 1,5 ml.
    14. Aggiungere 30-100 μL di tampone di eluizione o acqua deionizzata sterile direttamente al centro della membrana della colonna.
      NOTA: L'efficienza dell'eluizione del DNA dalla colonna DNA Mini dipende dal pH. Se si utilizza acqua deionizzata sterile, assicurarsi che il pH sia intorno alle 8.5.
    15. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 minuto.
    16. Centrifuga alla massima velocità per 1 minuto.
      NOTA: Questo rappresenta circa il 70% del DNA legato. Una seconda eluizione opzionale produrrà qualsiasi DNA residuo, anche se a una concentrazione inferiore.
  3. Verificare i plasmidi di cui sopra utilizzando mediante digestione enzimatica a doppia restrizione utilizzando EcoR I (15 U/μL) e Bam H1(15 U/μL)22.
    1. Eseguire i passaggi di make-up sul ghiaccio. Preparare il sistema di reazione di 1 μL di EcoR I (15 U), 1 μL di Bam H1 (15 U), 2 μL di Tampone 10x, 1 μg di plasmide; aggiungere ddH2O a 20 μL di volume totale, mescolare accuratamente. Incubare in un bagno d'acqua a 37 °C per 2 ore.
    2. Separare i prodotti digeriti dell'1% di agarosio seguito da elettroforesi ed esporre alla luce UV come prima.
  4. Diluire il plasmide concentrato in 2 x 1011 copie/mL per la soluzione standard iniziale utilizzando ddH2O. Prendiamo il plasmide (P2) contenente un frammento di DNA suino per esempio di copie che calcolano:
    1. Calcolare il numero di plasmidi in 1 mL di soluzione standard iniziale: N = (2 x 1011)/ (6,02 x 1023) mol.
    2. Calcolare il peso molecolare di P2: M = 2810 bp x 650 D/bp = 2810 x 650 D (g/mol).
    3. Calcolare la massa di P2: m=N*M= (2 x 1011)/ (6,02 x 1023) mol x 2810 x 650 g/mol.
    4. Calcolare il volume di P2: V = m/C = [(2 x 1011)/(6,02 x 1023) x 2810 x 650] g/C. (C è la concentrazione di P2 (ng/μL), misurata da uno spettrofotometro).
  5. Diluire la soluzione standard iniziale in serie 10 volte in 2 x 1010 copie/mL, 2 x 109 copie/mL, 2 x 108 copie/mL, 2 x 107 copie/mL...e 2 x 100 copie/mL per la soluzione standard utilizzando ddH2O. Vortex accuratamente durante la diluizione.
  6. Stabilisci la curva standard.
    1. Preparare il sistema di reazione di qPCR (tutti i passaggi sono protetti dalla luce): Aggiungere la soluzione premismiata che contiene 325 μL di qPCR Mix(Table of Materials),13 μL di primer 5', 13 μL di primer 3' e 169 μL di ddH2O in un tubo microcentrifuge da 1,5 mL, che è stato poi accuratamente miscelato e leggermente centrifugato.
    2. Dividere i 40 μL sopra la soluzione pre-miscelata in una striscia a 8 tubi e aggiungere 10 μL di DNA standard di diverse concentrazioni. Cappucciare con cura, mescolare e centrifugare leggermente.
    3. Inserire il nastro a 8 tubi nella macchina qPCR seguendo la procedura illustrata nella figura 3.

5. Isolare il DNA circolante dai campioni di sangue

  1. Utilizzando tubi EDTA, raccogliere campioni di sangue in diversi punti di tempo nei modelli di patch dell'arteria da maiale a scimmia e nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo.
  2. Raccogliere campioni di sangue di circa 400 μL (dai modelli di patch per arteria da maiale a scimmia) o 100 μL (dai modelli di trapianto di cellule da maiale a topo) e trasferirli a tubi di microcentrifugo da 1,5 ml. Rimuovere le cellule del sangue dai campioni di sangue mediante centrifugazione a bassa temperatura e alta velocità (3.000 x g,4 °C, 5 min).
  3. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 ml e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 16.000 x g per 10 min.
  4. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 ml. Estrarre il DNA circolante dal supernatante di cui sopra utilizzando un kit di estrazione del DNA siebro/circolante commerciale seguendo il protocollo 2 del protocollo isolante dei produttori di DNA genomico.
  5. Condensare il volume del DNA circolante a 40 μL e immagazzinare a -20 °C.

6. Quantificazione del DNA circolante specifico del maiale

  1. Preparare la soluzione premismiata di 25 μL di qPCR Mix(Table of Materials),1 μL di primer da 5', 1 μL di primer 3', 10 μL di DNA campione e 13 μL di ddH2O. Preparare la miscela includendo 2 campioni extra.
  2. Dividere la soluzione pre-miscelata da 40 μL in una striscia a 8 tubi e aggiungere 10 μL di DNA campione, seguita da un'attenta tappatura. Preparare due reazioni in più del necessario.
  3. Mettere la striscia a 8 tubi nella macchina qPCR seguendo la stessa procedura della curva standard. È meglio eseguire prima uno standard per assicurarsi che la reazione sia fondamentale per la quantificazione in anticipo. La procedura del sistema di reazione di qPCR è stata illustrata nella figura 3.

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Representative Results

In questo protocollo sono stati progettati primer specifici suini, sono stati costruiti frammenti di DNA specifici contenenti plasmidi e sono state stabilite curve standard per la quantificazione(figura 4). Le specificità delle specie dei 19 primer sono state confermate dalla PCR. I primer specifici per specie (primer #4 e primer #11) sono stati quindi utilizzati per quantificare cpsDNA da qPCR nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nei modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia.

L'elettroforesi dell'agarosio è stata utilizzata per isolare frammenti di DNA amplificati dai campioni di cui sopra, che viene quindi visualizzato in un imager ultravioletto. Utilizzando la PCR, i primer specifici per il DNA genomico suino amplificato sono stati identificati per la prima volta (Figura 2A). Inoltre, sono state confermate alcune specificità delle specie di questi primer che hanno specificamente amplificato il DNA dei suini nella coorte di genomica scimmia/umana o nella coorte del DNA genomico del topo (Figura 2B). Infine, due primer specifici per specie hanno ulteriormente dimostrato di amplificare specificamente il DNA dei suini nel cerotto dell'arteria da maiale a scimmia e/o nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo, rispettivamente (figura 2C).

Figure 1
Figura 1: Identità genica tramaiale (sus scrofa, ssc) e umano(homo sapiens, ha) o scimmia(Macaca fascicularis, mfa). Le sequenze geniche di tre diverse specie sono state confrontate dall'analisi BLAST. L'analisi della sequenza BLAST ha utilizzato informazioni di annotazione genomica (la sequenza di mRNA) delle tre specie scaricate da NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Le sequenze di mRNA dei geni umani, scimmie e suini erano rispettivamente 139116, 65927 e 71498,rispettivamente 22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 2: La PCR regolare convalida la specificità dei primer specifici dei suini. (A I frammenti di DNA genomico dei suini sono stati amplificati dai primer 1-19. (B) Il frammento di DNA genomico uomo/scimmia/topo non poteva essere amplificato da alcuni primer (primer #4 e #11). Le stelle (*) non indicano amplificazioni nel DNA genomico umano/scimmia. Il segno della sterlina (#) non indica alcuna amplificazione nel DNA genomico del topo. (C) I due primer specifici delle specie (primer #4 e #11) hanno inoltre dimostrato di amplificare specificamente il DNA dei suini nel cerotto dell'arteria da maiale a scimmia e/o nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo,rispettivamente 22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 3: La procedura per la reazione qPCR22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 3
Figura 4: Definizione della curva standard per la quantificazione assoluta. Vengono esposti i grafici di amplificazione, i grafici della curva di fusioneele viste della curva standard del primer #4 e (B) #11 (vedi Tabelladei materiali). Un buon standard (valore R vicino a 1, l'efficienza di amplificazione è entro il 100%±5%) potrebbe essere utilizzato fino a mezzo anno22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La tabella 1. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Quantificare il DNA circolante suina rappresenta un approccio fattibile per monitorare il rigetto immunitario dello xenotrapianto. 24 hanno scoperto che il contenuto di DNA circolante derivato dal donatore (ddcfDNA) nel sangue dei pazienti con rigetto acuto era significativamente superiore a quello dei pazienti senza rifiuto. Questi studi suggeriscono che il ddcfDNA può essere un biomarcatore comune per il monitoraggio dei danni da innesto degli organi. Negli ultimi anni, qPCR è stato sempre più applicato all'analisi degli acidi nucleici a causa del suo funzionamento semplice, alto grado di automazione, alta sensibilità, buona specificità e basso costo.

In questo studio, i primer specifici suini sono stati progettati sulla base dei risultati dell'analisi bioinformatica. La loro specificità è stata verificata dalla NORMALE PCR. Il cpsDNA dei campioni di sangue dei modelli di patch dell'arteria da maiale a scimmia e i modelli di trapianto di cellule da maiale a topo potrebbero essere quantificati con precisione da qPCR con primer specifici per specie. I principali vantaggi dell'approccio sono i seguenti. In primo luogo, sulla base dei primer altamente specifici, questo metodo di quantificazione del DNA è altamente sensibile e specifico. Inoltre, il protocollo dell'approccio è molto semplice da eseguire, che consisteva nella progettazione di primer specifici, isolamento del DNA e analisi qPCR in un giorno lavorativo, che è risparmio di tempo. È un metodo non invasivo che parte da un piccolo volume di siero o materiale plasmatico. Nel frattempo, abbiamo dimostrato che questo metodo è altamente riproducibile22. In contrasto con il sequenziamento ad alta produttività e la spettrometria di massa di volo, questo metodo è a basso costo.

Il monitoraggio del rigetto immunitario mediante quantificazione del DNA circolante specifico del maiale nel sangue dei modelli di patch dell'arteria da maiale a scimmia e dei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo utilizzando qPCR ha gettato le basi per la ricerca di base e l'applicazione clinica dello xenotrapianto porcino-umano.

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Disclosures

Gli autori non segnalano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), Fondi speciali per la costruzione di ospedali di alto livello nel Guangdong Provincia (2019), Sanming Project of Medicine a Shenzhen (SZSM201412020), Fondo per la costruzione di discipline mediche di alto livello di Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Biowest, Barcelona, Spain 111860
BamHI-HF New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA R3136S
1.5 mL microcentrifuge tube Axygen Biosciences, Union City, CA, USA MCT-150-C
0.2 mL PCR tube Axygen Biosciences, Union City, CA, USA PCR-02-C
C57BL/6 Mice Medical Animal Center of Guangdong Province,  China 8~10 weeks
Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA Micro 21R
2-Log DNA Ladder New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA N3200S 0.1–10.0 kb
Marker I  Tiangen, Beijing, China MD101-02 0.1–0.6 kb
DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA DNACOL-01
DNA loading buffer Solarbio, Beijing, China D1010
E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA D6942
D6943
EcoR I Takara Bio, Shiga, Japan  1040S
Female Bama mini pigs BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China 2~4 months
Genomic DNA Extraction Kit ? Tiangen, Beijing, China DP304-02
SYBR Green Realtime PCR Master Mix Toyobo, Osaka, Japan QPK-201
Gel Doc XR Bio-Rad, Hercules, USA
Male cynomolgus monkeys Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China 8 years
Nucleic acid dye(Gelred) Biotium, Fremont, USA 42003
polymerase(Premix Taq) Takara Bio, Shiga, Japan RR901A
pMD19-T plasmid Takara Bio, Shiga, Japan D102A
qPCR machine Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA
Serum/Circulating DNA Extraction Kit Tiangen, Beijing, China DP339
TAE sangon Biotech, Shanghai, China B548101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  2. Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
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Quantificazione del DNA circolante specifico del maiale nel sangue di un modello di xenotrapianto
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Deng, Y., Zhou, M., Lu, Y., Chen, J., Pu, Z., Yu, D., Dai, Y., Zhan, Y., Mou, L. Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model. J. Vis. Exp. (163), e61579, doi:10.3791/61579 (2020).

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