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OrganIschemia-Reperfusion Verletzung durch Simulation hämodynamischer Veränderungen im Lebertransplantationsmodell der Ratte

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DOI:

10.3791/61779

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6. März 2021

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1Department of Intensive Care Unit, The Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, 2Department of hepatobiliary surgery, The Affiliated Ningbo Medical Center Lihuili Hospital of Medical School of Ningbo University, 3Department of transplantation, The Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, 4Digital Technology and Engineering college, Ningbo University of Finance & Economics

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Papier enthält eine detaillierte Beschreibung, wie man ein Tiermodell der anhepatischen Phase (Leberischämie) bei Ratten baut, um die Grundlagenforschung zur Ischämie-Reperfusionsverletzung nach einer Lebertransplantation zu erleichtern.

Zusammenfassung

Orthotopische Lebertransplantation (OLT) bei Ratten ist ein bewährtes Tiermodell, das für präoperative, intraoperative und postoperative Studien verwendet wird, einschließlich Ischämie-Reperfusionsverletzungen (IRI) von extrahepatischen Organen. Dieses Modell erfordert zahlreiche Experimente und Geräte. Die Dauer der anhepatischen Phase hängt eng mit der Zeit zusammen, iri nach der Transplantation zu entwickeln. In diesem Experiment verwendeten wir hämodynamische Veränderungen, um extrahepatische Organschäden bei Ratten zu induzieren und die maximale Toleranzzeit zu bestimmen. Die Zeit bis zur schwersten Organverletzung variierte für verschiedene Organe. Diese Methode kann leicht repliziert werden und kann auch verwendet werden, um IRI der extrahepatischen Organe nach lebertransplantation zu studieren.

Einleitung

Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) ist eine häufige Komplikation nach Lebertransplantation. Hepatische IRI ist ein pathologischer Prozess mit Ischämie-vermittelten Zellschäden und abnormale Verschlechterung der Leberreperfusion. Leber-IRI und die lokale angeborene Immunantwort können in heiße und kalte IRI unterteilt werden, je nach Unterschieden in der klinischen Umgebung1. Hot IRI wird durch Stammzellverletzungen induziert, in der Regel als Folge von Lebertransplantation, Schock und Trauma2. Cold IRI ist eine Komplikation der Lebertransplantation, die durch Endothelzellen und periphere Zirkulation verursacht wird3. Klinische Berichte haben gezeigt, dass Leber IRI mit 10% der frühen Organversagen verbunden ist und kann die Inzidenz von akuter und chronischer Abstoßung erhöhen4,5. Darüber hinaus kann Leber IRI auch mehrere Organdysfunktionssyndrome oder systemische Entzündliche Reaktionssyndrom induzieren, mit hoher Mortalität6. Patienten mit extrahepatischer Organbeteiligung neigen dazu, länger im Krankenhaus zu bleiben, mehr Geld auszugeben und eine schlechtere Prognose7zu haben. Die Entwicklung von Komplikationen ist eng mit der Länge der anhepatischen Phase der Lebertransplantation8verbunden.

Orthotopische Lebertransplantation (OLT) bei Ratten wurde erstmals 1973 vom amerikanischen Professor Lee berichtet. Die experimentelle Operation simulierte die Schritte der klinischen Lebertransplantation und die Anastomose der Blutgefäße und den gemeinsamen Gallengang (CBD) mit der Nahtmethode. Das Verfahren ist schwierig und zeitaufwändig mit einer geringen Erfolgsrate9. 1979 verbesserten Kamada et al. olT bei Ratten deutlich, indem sie kreativ die "Zwei-Manschetten-Methode" für anastomose der Portalvene nutzten, um die anhepatische Phase innerhalb von 26 Minuten10zu kontrollieren. Im selben Jahr schlug Zimmermann die "Single Biliary Stent-Methode" vor. Auf der Grundlage von Lees Arbeit verwendete Zimmermann Polyethylenrohre, um das CBD des Spenders und Empfängers direkt zu anastomose, vereinfachte die Rekonstruktion von CBD und bewahrte die Funktion des Schließmuskels, und diese Methode wurde zum Standard für die Gallenrekonstruktion der OLT-Modelle11. 1980 schlugen Miyata et al. die "Drei-Manschetten-Methode" vor, bei der die Portalvene (PV), die suprahepatische Vena cava (SVC) und die intrahepatische Vena cava (IVC) durch die Manschettenmethode anastomosed wurden. Es besteht jedoch die Gefahr einer Verzerrung der Kanüle mit dieser Methode, die zur Obstruktion eines minderwertigen Vena-Cava-Refluxs12führen kann. 1983 wurde die "Zwei-Manschetten-Methode" mit der Manschettenmethode für die Anastomose der PV und IVC vorgeschlagen, aber die Nahtmethode für den SVC13übernommen. Diese Methode wurde von Wissenschaftlern weltweit angenommen, um OLT-Modelle zu etablieren. Seitdem wurden die Anastomoseschritte der Manschette verbessert, um die anhepatische Phase zu verkürzen und die Überlebensrate der Ratten14zu verbessern. In ähnlicher Weise werden verbesserte Methoden in der klinischen Praxis verwendet, um die anhepatische Phase15zu verkürzen. Die Grundlagenforschung zu IRI nach einer Lebertransplantation hat jedoch gezeigt, dass die Überlebensrate umgekehrt mit dem Grad der Verletzung von extrahepatischen Organen zusammenhängt. Daher ist weitere Forschung erforderlich, und ein einfaches und reproduzierbares Tiermodell ist erforderlich, um IRI nach einer Lebertransplantation zu simulieren.

Basierend auf der Definition der anhepatischen Phase simulierten wir die hämodynamischen Veränderungen in der Lebertransplantation, die zu IRI von extrahepatischen Organen bei Ratten führten. Hierin bieten wir eine detaillierte Beschreibung, wie man ein Tiermodell der anhepatischen Phase (Leberischämie) bei Ratten baut, um die Grundlagenforschung zu IRI nach einer Lebertransplantation zu erleichtern.

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Protokoll

Die Tierethikkommission genehmigte das Experiment der Guangxi Medical University (No20190920). Alle Tiere wurden vom Animal Experiment Center der Guangxi Medical University versorgt. Wir verwendeten SPF Männchen Sprague Dawley Ratten (200-250 g, 10-12 Wochen), gehalten unter der Raumtemperatur von 25 ± 2°C und Feuchtigkeit von 50 ± 10%. Die Fütterung wurde 24 Stunden vor dem Betrieb gestoppt; wasserversorgt war.

HINWEIS: Ein Bediener kann alle Operationen ohne Mikrochirurgie oder chirurgisches Mikroskop durchführen.

1. Betrieb

  1. Nach dem Wiegen die Ratten mit Isofluran ansien (5%) mit einer Tieranästhesiemaschine.
  2. Nach 1-2 Minuten die Zehen der Ratte vorsichtig mit einer Pinzette einklemmen. Wenn die Ratte nach dem Kneifen nicht reagiert, ist sie in einen Zustand der Anästhesie eingetreten. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf den Augen, um Trockenheit zu verhindern. Verwenden Sie Tierheizungslampen, um die Körpertemperatur der Ratten bei 37-38 °C zu halten.
  3. Nach der Abdominaldesinfektion (Povidon-Jodlösung) die Ratte auf dem Tierseziertisch fixieren. Machen Sie einen mittleren Schnitt von 3 cm unter dem xiphoiden Prozess mit Zangen und Schere.
  4. Öffnen Sie die Bauchhöhle, setzen Sie die Leber mit einem Retraktor aus und mobilisieren Sie das hepatogastrische Band. Verwenden Sie Wattestäbchen, um den mittleren Lappen der Leber sanft umzudrehen und drehen Sie ihn nach oben, um die Porta hepatis freizulegen. Identifizieren Sie CBD, PV und HA.
  5. Schieben Sie den Dünndarm mit Wattestäbchen in Richtung der linken unteren Bauchhöhle, bedecken Sie ihn mit nasser Gaze und bewegen Sie die intrahepatische Vena cava in die rechte Nierenvene.
  6. Isolieren Sie die Portalvene, die Leberarterie und die untere Vena cava oberhalb der rechten Nierenvene mit einer Intraokularlinse und Zangen, die mit 3-0 Seidenfaden markiert sind, jeweils mit einem Schlupfknoten.
  7. Schneiden Sie die linke und rechte untere Extremität san und belichten Sie die Oberschenkelvene mit ophthalmologischen Zangen. Injizieren Sie langsam niedermolekulares Heparin 625 I.E./kg durch die Femoralvene, um den ganzen Körper zu heparinisieren.
  8. Ligate die Portalvene, Leberarterie, und unterlegene Vena Cava über der rechten Nierenvene mit Nr. 3-0 Nähte, dauere 45 Minuten (Abbildung 1). Ersetzen Sie den Dünndarm in der Bauchhöhle und bedecken Sie ihn mit Gaze. Reduzieren Sie die Inhalationsanästhesie während dieser Perioden.
  9. Nach 45 Minuten, lassen Sie die Portalvene, leberarteriende arterien, und die unterlegene Vena cava über der rechten Nierenvene.
  10. Den Muskel und die Haut schichtenund befolgen und die inhalative Anästhesie beenden. Stellen Sie postoperative Analgesie mit subkutanem Morphin von 5 mg/kg alle 4 Stunden zur Verfügung.
  11. Beobachten Sie die Ratte, bis sie wach ist, und füttern Sie sie unter einer Temperatur von 25 ± 2 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50 ± 10 %. Tierheizungslampen sind notwendig.

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Ergebnisse

Rattentoleranz gegenüber Leber-Ischämie
In diesem Tiermodell sind die Stellen, an denen Blutgefäße während des Betriebs ligiert wurden, in Abbildung 1dargestellt. Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in 5 Gruppen für Ischämie für 15 Minuten (I15-Gruppe), 30 Minuten (I30-Gruppe), 45 Minuten (I45-Gruppe), 60 Minuten (I60) und Scheingruppe mit 10 Ratten in jeder Gruppe eingeteilt. Die Überlebensrate jeder Gruppe wurde 14 Tage nach der Operation beobachtet. Alle Ratten ü...

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Diskussion

OLT bei Ratten ist ein ideales Modell für die Untersuchung der Organkonservierung bei Lebertransplantation, IRI, Transplantationsabstoßung, Immuntoleranz, Transplantationspathologie und Pharmakologie, Homotransplantation und Xenotransplantation. Derzeit ist es weit verbreitet in der experimentellen Forschung der Lebertransplantation verwendet.

Während Pilotstudien verabreichten wir zunächst pentobarbitales Natriumintraperitonealanästhesie und fanden heraus, dass dies zu einer hohen postoperati...

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Offenlegungen

Die Autoren dieses Manuskripts haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir möchten die nützlichen Vorschläge von Dr. Wen-tao Li und Dr. Ji-hua Wu vom Second Affiliated Hospital der Guangxi Medical University würdigen. Die Autoren danken unseren Teamkollegen für nützliche Kommentare und Diskussionen. Die Autoren bedanken sich auch bei den anonymen Rezensenten und Redakteuren von JoVE für ihre Kommentare. Ein besonderer Dank gilt den Eltern von Dr. Yuan für ihre kontinuierliche Unterstützung und Ermutigung. Die Arbeit wurde von der Ningbo Natural Science Foundation (2014A610248) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4%ige Paraformaldehyd-LösungShanghai Macklin Biochemical Co., LtdP804536
LufttrockenschrankShanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd.BPG
Alanin-Aminotransferase (ALT)KitElabscience Biotechnology Co.,LtdE-BC-K235-S
AmmoniakSinopharm Chemical Reagents Co., Ltd10002118
Amylase KitElabscience Biotechnology Co.,LtdE-BC-K005-M
wasserfreies EthanolSinopharm Chemical Reagents Co., Ltd100092183
Tier AnästhesiegerätShenzhen Ruiwode Life Technology Co. LtdR640
Aspartat-Aminotransferase (AST) KitRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03040
automatischer biochemischer Analysator.SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd.2400
Biosysteme (bei Bedarf)Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd.BL-420F
ZentrifugeBaiyang Medical Instrument Co., Ltd.BY-600A
DeckglasJiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd10212432C
Kreatinin KitRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03076
EntwässerungsmaschineUngarn 3DHISTECH Co., LtdDonatello Serie 2
EinbettmaschineHubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.KH-BL1
TiefkühlmaschineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
Hämatoxylin-Eosin-FarbstofflösungWuhan Saiwell Biotechnology Co., LtdG1005
hocheffizientes ParaffinwachsShanghai huayong Paraffinwachs Co., LtdQ / YSQN40-91
SalzsäureSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd10011018
Intraokularlinsenzange (IOL)Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd.JTZRN
IsofluranShenzhen Ruiwode Life Technology Co., Ltd—
Mikroschere (falls erforderlich)Shanghai Surgical Instrument FactoryWA1010
NadelhalterShanghai Surgical Instrument FactoryJ32010
neutrales KaugummiShanghai Huashen Healing Equipment Co., Ltd.–
normales optisches MikroskopNikon Instrument Shanghai Co., LtdNikon Eclipse CI
ophthalmische PinzetteShanghai Surgical Instrument FactoryJ3CO30gerade
ophthalmische PinzetteShanghai Surgical Instrument FactoryJD1060Biegung
ophthalmische SchereShanghai Surgical Instrument FactoryJ1E0
pathologischer SlicerShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
PipettenDragon Laboratory Instruments Co., Ltd.
RetraktorenBeijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd.JNT-KXQ
ScannerUngarn 3DHISTECH Co., LtdPannoramic 250
ObjektträgerWuhan Saiwell Biotechnology Co., LtdG6004
XylolSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd1330-20-7
7010101008

Referenzen

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