Summary
Deze methode introduceert een eenvoudige techniek voor de detectie van endogene monoamineafgifte met behulp van acute hersenplakken. De opstelling maakt gebruik van een 48-well plaat met daarin een weefselhouder voor monoamineafgifte. Vrijgegeven monoamine wordt geanalyseerd door HPLC in combinatie met elektrochemische detectie. Bovendien biedt deze techniek een screeningsmethode voor het ontdekken van geneesmiddelen.
Abstract
Monoamine neurotransmitters worden geassocieerd met tal van neurologische en psychiatrische aandoeningen. Diermodellen van dergelijke omstandigheden hebben veranderingen in de afgifte en opnamedynamiek van monoamine-neurotransmitters aangetoond. Technisch complexe methoden zoals elektrofysiologie, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), beeldvorming, in vivo microdialyse, optogenetica of gebruik van radioactiviteit zijn vereist om de monoaminefunctie te bestuderen. De hier gepresenteerde methode is een geoptimaliseerde tweestapsbenadering voor het detecteren van monoamineafgifte in acute hersenplakken met behulp van een 48-well plaat met weefselhouders voor het onderzoeken van monoamineafgifte en hoogwaardige vloeistofchromatografie in combinatie met elektrochemische detectie (HPLC-ECD) voor monoamine-afgiftemeting. Kortom, rattenhersensecties met interessante gebieden, waaronder prefrontale cortex, hippocampus en dorsaal striatum, werden verkregen met behulp van een weefselsnijder of vibratome. Deze interessegebieden werden ontleed uit de hele hersenen en geïncubeerd in een zuurstofrijke fysiologische buffer. De levensvatbaarheid werd onderzocht gedurende het experimentele tijdsverloop, door middel van 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) assay. De acuut ontleedde hersengebieden werden geïncubeerd in verschillende medicijnomstandigheden waarvan bekend is dat ze monoamineafgifte induceren via de transporter (amfetamine) of door de activering van exocytotische vesiculaire afgifte (KCl). Na incubatie werden de vrijgekomen producten in het supernatant verzameld en geanalyseerd via een HPLC-ECD-systeem. Hier wordt basale monoamineafgifte gedetecteerd door HPLC uit acute hersenplakken. Deze gegevens ondersteunen eerdere in vivo en in vitro resultaten waaruit blijkt dat AMPH en KCl monoamineafgifte induceren. Deze methode is met name nuttig voor het bestuderen van mechanismen die verband houden met monoaminetransporterafhankelijke afgifte en biedt de mogelijkheid om verbindingen die de afgifte van monoamine beïnvloeden op een snelle en goedkope manier te screenen.
Introduction
Een overvloed aan neurologische en psychiatrische ziekten worden geassocieerd met ontregeling of onvoldoende onderhoud van monoamine neurotransmitter (dopamine [DA], serotonine [5-HT], noradrenaline [NE]) homeostase1,2,3. Deze aandoeningen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, depressie1,2, schizofrenie2, angst2, verslaving4, menopauze5,6,7, pijn8 en de ziekte van Parkinson3. Verschillende rattenmodellen van de menopauze hebben bijvoorbeeld aangetoond dat de ontregeling of vermindering van monoaminen in de hippocampus, prefrontale cortex en striatum kan worden geassocieerd met zowel depressie als cognitieve achteruitgang, wat wordt gezien bij vrouwen die de menopauze ervaren. De ontregeling van monoaminen in deze modellen is uitgebreid onderzocht met behulp van HPLC-ECD, hoewel de studies geen onderscheid maakten tussen gemeten neurotransmittergehalte versus neurotransmitterafgifte5,6,7. Monoaminen worden klassiek vrijgegeven in de extracellulaire ruimte via Ca2 +-afhankelijke vesiculaire afgifte9, en worden gerecycled via hun respectieve plasmamembraanheropnamesysteem (dopaminetransporter, DAT; serotoninetransporter, SERT; noradrenalinetransporter, NET)10,11. Omgekeerd suggereren gegevens dat deze transporters monoaminen kunnen vrijgeven of effluxeren, aangezien van misbruikmiddelen zoals amfetamine (AMPH) en 3,4-methyleendioxymethamfetamine (MDMA) bekend is dat ze DA en 5-HT vrijgeven, respectievelijk via hun transportersystemen12,13,14,15,16,17 . Een goed mechanistisch begrip van de dynamiek van monoamineafgifte is dus cruciaal voor het ontwikkelen van specifieke en gerichte farmacotherapieën.
Een breed scala aan technieken is gebruikt om monoamineafgifte te bestuderen, zoals Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV)18, in vivo microdialyse13, imaging19, pre-integratie met radioactief gelabelde monoaminen20, optogenetica en meer recent, genetisch gecodeerde fluorescerende sensoren en fotometrie21,22 . FSCV en in vivo microdialyse zijn de primaire technieken die worden gebruikt voor het bestuderen van de afgifte van monoamine. FSCV wordt gebruikt om de gestimuleerde exocytotische afgifte van voornamelijk DA in acute hersenschijfjes en in vivo23 te bestuderen. Omdat FSCV elektroden gebruikt om afgifte te stimuleren of op te roepen, is de primaire bron van afgifte van neurotransmitters Ca2 + -afhankelijke vesiculaire afgifte18,24,25,26,27,28,29,30,31 . In vivo microdialyse in combinatie met HPLC meet veranderingen in extracellulaire neurotransmitterniveaus met behulp van een sonde geplaatst in een hersengebied van belang13,32. Net als bij FSCV is een belangrijke beperking van in vivo microdialyse de moeilijkheid om de bron van neurotransmitterafgifte te bepalen: Ca2 + afhankelijke vesiculaire afgifte of transporterafhankelijk. Opmerkelijk is dat beide methoden de directe meting van monoamineafgifte mogelijk maken. Door de recente vooruitgang van de optogenetica toont onderzoek detectie van 5-HT en DA-afgifte in een korte tijdspanne met prachtige celtype specificiteit21,22. Deze strategieën vereisen echter complexe en kostbare technieken en apparatuur en meten indirect de afgifte van monoamine, met name door monoaminebinding aan receptoren. Verder worden radioactief gelabelde monoaminen ook gebruikt voor het bestuderen van monoaminedynamica. Radioactief gelabelde monoaminen kunnen vooraf worden geladen in verschillende modelsystemen, zoals heterologe cellen die elke monoaminetransporter overexpressie geven20,33,34,35,36,37,38,39,40, primaire neuronen20, synaptosomen33,39,41, 42, en acute hersenplakken43,44. Radioactiviteit vormt echter potentiële schade voor de experimentator en de tritium-gelabelde analyten kunnen de endogene monoaminedynamiek niet getrouw samenvatten45,46. Superfusiesystemen in combinatie met offline detectiemethoden zoals HPLC-ECD hebben de detectie van monoaminen uit meerdere weefselbronnen mogelijk gemaakt. Hier biedt dit protocol als een geoptimaliseerde en goedkope, eenvoudige en nauwkeurige methode met behulp van acute hersenplakken om endogene basale en gestimuleerde monoamineafgifte direct te meten.
Acute hersenplakken maken het mogelijk om mechanistische hypothesen te testen, voornamelijk omdat ze de in vivo anatomische micro-omgeving behouden en intacte synapsen behouden47,48,49,50,51,52. In enkele studies zijn acute hersenplakken of gehakt hersenweefsel gebruikt in combinatie met een superfusietechniek met behulp van KCl om Ca2 + gemedieerde afgifte te stimuleren53,54,55,56. Superfusiesystemen zijn van cruciaal belang geweest om het begrip van het veld van neurotransmitterafgiftemechanismen, waaronder monoaminen, te bevorderen. Deze systemen zijn echter relatief duur en het aantal kamers dat beschikbaar is voor weefselanalyse varieert van 4-12. Ter vergelijking: de hier gepresenteerde methode is goedkoop, maakt het mogelijk om 48 weefselmonsters te meten en kan worden verfijnd om maximaal 96 weefselmonsters te gebruiken. Elke put in de 48-putplaat bevat weefselhouders die filters gebruiken om het vrijgegeven product van het weefsel te scheiden, en vrijgegeven monoaminen worden vervolgens verzameld en geanalyseerd door HPLC-ECD. Belangrijk is dat deze methode de gelijktijdige meting van 5-HT, DA en NE-afgifte mogelijk maakt uit verschillende hersengebieden zoals de prefrontale cortex, de hippocampus en het dorsale striatum na behandeling met farmacologische middelen die de afgifte van monoamine moduleren. Zo kan de experimentator meerdere vragen beantwoorden met behulp van een goedkoop multi-well-systeem dat het aantal geteste monsters verhoogt en daardoor het aantal gebruikte dieren vermindert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten, inclusief dierbehandeling en weefselverzameling, werden uitgevoerd in overeenstemming met de Universiteit van Florida en het City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), volgens het goedgekeurde protocol 201508873 (UF) en 1071 (CCNY). Voor reagentia en buffer verwijzen wij u naar het Aanvullend Dossier.
1. Bereid acute schijfjes rattenhersenen
OPMERKING: In dit experiment werden volwassen mannelijke ratten (250-350 g) gebruikt. Deze opstelling is echter functioneel voor verschillende ontwikkelingspunten, vrouwelijke ratten en andere soorten. Als u een kleiner dier gebruikt, zoals muizen, kan de experimentator zich aanpassen om het protocol te optimaliseren door een ander aantal hersenplakken of stoten per aandoening te gebruiken. Dissectiebuffer wordt buffer 1 genoemd; effluxbuffer wordt buffer 2 genoemd.
- Bereid buffer 1 voor zoals vermeld in het aanvullend bestand. Verzadig buffer 1 met zuurstof door 20 minuten op ijs te borrelen met 95%/5% (O2/CO2). Verwijder 50 ml buffer 1 en laat afkoelen op ijs in een klein bekerglas of een petrischaaltje. Deze buffer wordt gebruikt om de acuut geoogste hele hersenen vast te houden.
- Verdoof een of twee volwassen ratten (250-350 g) met 1% -2% isofluraan, onthoofd ze met een guillotine en verwijder snel hun hersenen. Plaats de hersenen onmiddellijk in ijskoude zuurstofbuffer 1 in de container vanaf stap 1.1.
OPMERKING: Zorg ervoor dat isofluraan en guillotine veilig worden gebruikt. Open isofluraan onder een zuurkast. - Snijd met behulp van een vibratome of compresstome 300 μm coronale hersensecties uit elk interessegebied (figuur 1). Bubbling Buffer 1 moet aanwezig zijn tijdens het maken van secties. Breng met behulp van een roestvrijstalen spatel voorzichtig en onmiddellijk hersenplakken over in een nieuwe petrischaal gevuld met ijskoude zuurstofbuffer 1 (figuur 2).
- Ontleed verder hersenplakken (bijv. stoten, uitgesneden) door de plakjes voorzichtig naar glazen dia's te verplaatsen (figuur 1G) met behulp van rattenhersenatlas57. Identificeer bijvoorbeeld het dorsale striatum op basis van zijn donkere, dwarsgestreepte structuur en identificeer de hippocampus op basis van de nabijheid van de cortex en de unieke spiraalstructuur. De rechter- en linkerhersenhelft kunnen worden gescheiden om te gebruiken als controle- en experimentele plakjes (figuren 2G - H). Hier werd het dorsale striatum verder ontleed in 2 mm stoten (figuur 1G).
- Gebruik een plastic transferpipet met de punt afgesneden, breng plakjes of hersenstoten over in kleine containers ondergedompeld in zuurstofrijke ijskoude Buffer 1 met zuurstof die borrelt. Deze containers kunnen roestvrijstalen gaas zijn, of kleine petrischaaltjes gevuld met buffer (figuur 1H).
2. Ex-vivo endogene monoamineafgifte uit hersenplakken of -stoten
OPMERKING: Het apparaat dat voor dit gedeelte wordt gebruikt, bestaat uit een plaat met 48 putten en een weefselhouder van zes microcentrifugefiltereenheden zonder dat de inzetfilters zijn aangesloten op een carbogenlijn (figuur 2). Om de houder te maken, gebruikt u een stevige plastic staaf (bijvoorbeeld van een celschroot) en lijmt u de microcentrifugefiltereenheden zonder de inzetfilters erop. Laat het 1-2 dagen drogen. De tijd die nodig is voor het endogene monoamine-afgifte-experiment en de concentraties van amfetamine, fluoxetine en cocaïne zijn gebaseerd op de huidige literatuur en eerdere protocollen13,20,58.
-
Weefselactivering
- Breng het hersenweefsel van stap 1.1.5 over naar elke put van de effluxkamer en laat herstel gedurende 30-50 minuten bij 37 °C toe op een schuifverwarmer in 0,5-1 ml zuurstofbuffer 2, met constante, zachte borrel (figuur 2B1).
- Verdun tijdens deze incubatie de geneesmiddelen tot de gewenste concentratie voor het experiment. Alle geneesmiddelen moeten worden opgelost in Buffer 2 en de concentraties zijn gebaseerd op de huidige literatuur.
-
Eerste incubatie
- Verplaats de weefselhouder met hersenweefsel naar putjes met 500 μL zuurstofbuffer 2 en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C. Zorg ervoor dat er minimale tot geen buffer wordt getransporteerd door op de houder op de rand van de put te tikken totdat er geen overtollige buffer in de houder zit.
- In experimenten met farmacologische middelen zoals monoaminetransporterremmers, incubeer de weefselmonsters met de geneesmiddelen verdund in zuurstofbuffer 2 (bijv. 10 μM fluoxetine, 40 μM cocaïne; zie figuur 2B2). Het uiteindelijke volume in elke put is 500 μL.
-
Tweede incubatie
- Verplaats de houder met het weefsel naar een nieuwe set putjes met 500 μL totale Buffer 2 met of zonder de gewenste concentratie van elk medicijn. Zorg ervoor dat er geen overtollige buffer overblijft. Elke put vertegenwoordigt een n = 1 voor experimentele omstandigheden. Elke experimentele aandoening wordt in drievoud uitgevoerd.
- Eén put bevat een zuurstofrijke buffer 2, de volgende 10-30 μM AMPH en de laatste put bevat 10-30 μM AMPH plus monoaminetransporterremmers. Elk medicijn is opgelost in zuurstofrijke buffer 2.
- Incubeer het weefsel gedurende 20 minuten bij 37 °C met 500 μL van de medicijnconditie.
OPMERKING: Extra putten kunnen een zuurstofrijke hoge K + Buffer 2 bevatten met of zonder de monoaminetransporterremmers. Los elk medicijn op in de zuurstofrijke buffer 2 (500 μL). - Verzamel tijdens deze tweede incubatie van 20 minuten de oplossing uit de putten van de eerste incubatie in stap 2.2.1 en breng over naar microcentrifugebuizen met 50 μL 1 N perchloorzuur of fosforzuur (afhankelijk van het type HPLC, eindconcentratie 0,1 N). Het uiteindelijke volume van het monster is 550 μL. Houd microcentrifugebuizen op ijs en label de buizen # 1.
- Na de tweede incubatie van 20 minuten verplaatst u de weefselhouder met hersensecties of stoten naar een lege put en houdt u de plaat op ijs. Breng het supernatant over in microcentrifugebuizen die 50 μL 1 N perchloorzuur of fosforzuur bevatten. Het uiteindelijke volume van het monster is 550 μL. Houd microcentrifugebuizen op ijs en label de buizen # 2.
- Voeg 1 ml ijskoude buffer 1 toe aan elk putje met weefsel. Verzamel al het weefsel met behulp van een klein pincet en breng het over naar schone microcentrifugebuizen.
- Houd buisjes met hersenweefsel op -80 °C. Gooi de 1 ml buffer 1 weg (figuur 2B4).
- Filteroplossingen verkregen uit elke incubatie met behulp van microcentrifugefilterbuizen (0,22 μm) bij 2.500 x g gedurende 2 minuten. Gebruik het filtraat om het monoaminegehalte te bepalen met behulp van HPLC met elektrochemische detectie (figuur 2B5).
3. Levensvatbaarheid van weefsel
- MTT-test
OPMERKING: Een belangrijk punt van zorg met betrekking tot deze experimentele opstelling is de levensvatbaarheid van het weefsel, omdat het weefsel maximaal enkele uren kan worden gebruikt59. Een MTT-test60,61 wordt gebruikt om de levensvatbaarheid van weefsel aan het einde van het experiment te bepalen. Deze test is gebaseerd op de omzetting van het gele tetrazoliumzout MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide) naar paarse formazankristallen door levensvatbare cellen met voldoende metabolisme.- Onderhoud na het experiment een aparte groep weefselmonsters en scheid ze in twee groepen.
- Incubeer één groep gedurende 20 minuten bij 37 °C in Triton X-100 (1%) opgelost in Buffer 2 als controle. Triton X-100 behandeling resulteert in celdood. Handhaaf de tweede groep in Buffer 2 en incubateer niet in Triton X-100 (weefsel levensvatbaarheidscontrole).
- Voeg MTT (stockoplossing 5 mg/ml in PBS, pH 7,4) toe aan beide groepen in de zuurstofhoudende buffer 2 tot een eindconcentratie van 0,5 mg/ml.
- Incubeer de weefselmonsters gedurende 20 minuten bij 37 °C, was met PBS en breng ze over in microcentrifugebuizen met 250 μL van een mengsel van SDS (10%, w/v), DMF (25%, v/v) en water om de formazankristallen op te lossen.
- Incubeer de monsters gedurende 24 uur.
- Centrifugeer de buizen gedurende 10 minuten bij 10.000 x g en meet de absorptie van het supernatant (200 μL) bij 562 nm en 690 nm met behulp van een microplaatlezer. De levensvatbaarheid van het weefsel wordt als volgt berekend: (A562-A690)/weefselgewicht.
4. HPLC-analyse van monoaminen
- Kwantificeer monoamineafgifte van elke experimentele aandoening met behulp van HPLC-ECD volgens eerdere protocollen13,44, met behulp van een omgekeerde fasekolom.
- Bereid de mobiele fase voor die nodig is voor detectie. Deze bestaat uit 100 mM fosforzuur, 100 mM citroenzuur, 0,1 mM EDTA-Na2, 600 mg/L octanesulfonzuur, 8% v/v acetonitril (uiteindelijke pH 6,0). De samenstelling van de mobiele fase is afhankelijk van het type HPLC en de gebruikte kolom.
- Stel de potentiaal van de elektrochemische detector (2 mm glasachtige koolstofelektrode) in op 0,46 V en stel het debiet in op 0,05 ml/min.
- Laad 5 μL van elk monster, inclusief neurotransmitterstandaarden in de HPLC voor auto-injectie en detectie. De hoeveelheid van elk toegevoegd monster is afhankelijk van het type HPLC dat wordt gebruikt.
- Zodra de HPLC de run heeft voltooid, gebruikt u de gegeven HPLC-analysesoftware om de chromatografische gegevens te verzamelen en te analyseren.
- Analyseer monoamine inhoud met behulp van een standaard curve samengesteld uit elke monoamine (Dopamine: DA, Noradrenaline: NE, en serotonine: 5-HT; Figuur 2C). Gebruik de resulterende chromatogrammen om het gebied onder de curve (AUC) te verkrijgen op basis van de richtlijnen van de fabrikant.
5. Weefsellysaten voorbereiden voor eiwitkwantificering
-
Eiwit assay
- Voeg ijskoude lysisbuffer plus proteaseremmers (0,1 g/1 ml) toe aan elke microcentrifugebuis met hersensecties/ponsen en homogeniseer met behulp van een stamperhomogenisator. De microcentrifugebuizen moeten tijdens het homogeniseren op ijs worden gehouden om eiwitafbraak te voorkomen.
- Incubeer weefselhomogenaten gedurende 1 uur bij 4 °C met lichtrotatie.
- Centrifugeer weefsel homogeneert bij 16.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en herstel het supernatant.
- Bepaal de eiwitconcentratie in de supernatanten, met runderserumalbumine (BSA) als standaard.
- Normaliseer het monoaminegehalte in elk hersenmonster tot het totale eiwitgehalte (μg) gemeten in 250 μL hersenweefsel gelyseerd. Gebruik de onderstaande formule om het nmol monoamine/g eiwit te bepalen. df = verdunningsfactor.
6. Statistische analyse
- Analyseer monoamine release (nmol / g) met behulp van eenrichtings ANOVA gevolgd door Sidak's meerdere vergelijkingstest voor post-hoc vergelijkingen.
- Analyseer de levensvatbaarheid van weefsel met behulp van een Unpaired Student's t-test voor onafhankelijke groepen (Controle vs. 1% Triton X-100).
- Stel voor alle statistische analyses het alfaniveau in op ≤ 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze techniek beschrijft het gebruik van hersenplakken om de afgifte van endogene monoaminen te meten met behulp van HPLC met elektrochemische detectie op basis van een 48-putplaat met een interne weefselhouder. De experimentele opstelling is weergegeven in figuur 1 en figuur 2. Aanvankelijk werd, om de levensvatbaarheid van het weefsel tegen het einde van het experiment te garanderen, een MTT-test (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide, een tetrazol) -test uitgevoerd. Na functionele experimenten zijn de acute hersenschijfjes metabolisch actief en blijven ze levensvatbaar in vergelijking met die welke zijn geïncubeerd met 1% Triton X-100, een aandoening van celdood (figuur 3).
Acute, 20 min, behandeling van hippocampus en prefrontale cortex hersensecties met AMPH induceert een significante toename van de extracellulaire niveaus van elk monoamine (figuur 4A, B). AMPH (30 μM) verhoogde het niveau van extracellulaire 5-HT van hippocampale plakjes en prefrontale cortexplakken met 220-voudig en 64-voudig, extracellulair NE met 19-voudig en 8-voudig, en extracellulair DA met respectievelijk 8-voudig en 7-voudig. Soortgelijke experimenten werden uitgevoerd in aanwezigheid van fluoxetine (10 μM), een selectieve serotonineheropnameremmer. Remming van SERT met fluoxetine voorkomt de toename van extracellulair 5-HT geïnduceerd door AMPH in zowel de hippocampus als de prefrontale cortex. Fluoxetine heeft daarentegen geen invloed op het effect van AMPH op extracellulaire DA of NE in dezelfde hersengebieden, in overeenstemming met de selectiviteit voor SERT (figuur 4A, B). Alle experimentele omstandigheden werden in drievoud uitgevoerd.
De afgifte van monoaminen van 2 mm dorsale striatumstoten werd vervolgens gemeten. Acute, 20 min, behandeling van dorsale striatumstoten met AMPH (10 μM) induceert een 35-voudige toename van de extracellulaire niveaus van DA (figuur 4C) ten opzichte van basale niveaus. DA-detectie was gericht op het dorsale striatum vanwege de lagere basale niveaus van 5-HT en NE die eerder in deze regio werden gemeld62,63. AMPH induceert dus een kleine dosisafhankelijke toename van extracellulair 5-HT in vergelijking met extracellulaire DA-niveaus geïnduceerd door AMPH (gegevens niet weergegeven). Incubatie van dorsale striatumstoten met cocaïne (40 μM), een monoaminetransporterblokker, resulteerde in een significante remming van AMPH-geïnduceerde extracellulaire DA in vergelijking met stoten die uitsluitend met AMPH werden geïncubeerd (figuur 4C). Deze gegevens ondersteunen verder eerdere bevindingen die aangeven dat AMPH DA-efflux induceerde via DAT16.
Ten slotte, om exocytotische afgifte van monoaminen aan te tonen, werden hersensecties geïncubeerd met KCl (40 mM). Het verhogen van de concentratie van extracellulaire KCl om membraandepolarisatie op te roepen via incubatie met 40 mM KCl is voldoende om de exocytotische afgifte van monoaminen te induceren in vergelijking met controleomstandigheden (figuur 5). Noch fluoxetine noch cocaïne blokkeert de toename van de extracellulaire niveaus van monoaminen geïnduceerd door KCl-membraandepolarisatie.
Figuur 1: Acute rattenhersenschijf en sectiepreparaat. (A) Een rattenbrein wordt in een hersenmatrix geplaatst. Een superieure snede duidt op de bovenkant van het optische chiasme; de inferieure snede is 3 mm achter de basis van de hypothalamus. Er werden sneden gemaakt om de hippocampus en het striatum te verwijderen en om een horizontale basis te garanderen om het monster stevig op de compresstome of vibratome te lijmen voorafgaand aan het snijden. (B-D) Superlijm werd verspreid over de basis van het podium, hersenen werden vastgelijmd, onmiddellijk bedekt met agarose en de agarose werd gestold met behulp van de bevroren klem in (D). (E-F) Een compresstome werd gebruikt om plakjes van 300 μm voor de hersenen van de rat te maken en plakjes werden tot gebruik in zuurstofrijke buffer geplaatst. (G) Secties werden op een glijbaan geplaatst en 2 mm ponsen van het dorsale striatum werden gemaakt. (G) Stoten van het dorsale striatum (boven), uitsparingen van de hippocampus (midden) en uitsparingen van de cortex (onderkant) worden op 4 °C gehouden in zuurstofrijke dissectiebuffer voordat functionele experimenten worden gestart. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Experimentele opstelling voor effluxexperiment. (A) De effluxkamer bestaat uit een 48-put weefselkweekplaat en een weefselhouderbak die verbonden is met de carbogenlijn. (B) Een diagram met het experimentele ontwerp voor het endogene monoamine-effluxexperiment waarin de weefselactivering (B1), pre-incubatie met/zonder monoaminetransporterremmers (B2), effluxexperiment (B3) en de uiteindelijke monsterverwerking worden gepresenteerd (B4-B5). (C) Het linkerpaneel toont een experimentator die het perfusaat in het HPLC laadt ter voorbereiding op automatische injectie. Het rechterpaneel toont een representatief chromatogram dat de monoaminestandaardpieken aangeeft. Het gebied onder de curve (AUC) wordt gemeten voor elke monoaminestandaard en hersenmonsters. Na kalibratie wordt de AUC gemeten voor elk hersenmonster omgezet in nM-concentratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Acute hersenplakken waren levensvatbaar aan het einde van het experiment. Een MTT-test werd uitgevoerd om de levensvatbaarheid van het weefsel te bepalen en vergeleken met Triton X-100 1%, wat celdood induceert. Het resultaat van de MTT-test toonde aan dat tegen het einde van 6 uur weefselmonsters nog steeds levensvatbaar waren. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SEM (N = 6). P < 0,0001, ongepaarde t-test . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Amfetamine induceert monoamineafgifte in acute hersenschijfjes van de hippocampus, prefrontale cortex en stoten van het dorsale striatum. (A-B) Hippocampale en prefrontale cortexplakken geïncubeerd in 30 μM AMPH resulteert in een significante toename van 5-HT, DA en NE-afgifte. Fluoxetine remt de afgifte van 5-HT aanzienlijk, maar heeft geen invloed op de AFGIFTE VAN DA of NE in deze regio's. (C) 2 mm dorsale striatumstoten werden geïncubeerd in cocaïne (40 μM) of AMPH (30 μM). AMPH stimuleerde DA-afgifte en voorbehandeling met cocaïne leidde tot een significante vermindering van amph-geïnduceerde DA-afgifte. Alle metingen zijn in nmol/g eiwit. Statistieken vertegenwoordigen een eenrichtings-ANOVA gevolgd door Sidak's meervoudige vergelijkingstest. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SEM (N = 6). Statistieken vertegenwoordigen een eenrichtings-ANOVA met Sidak's meervoudige vergelijkingstest (** p = 0,01, *** p = 0,001, **** p = 0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Hoge extracellulaire K+ resulteert in monoamineafgifte door membraandepolarisatie. (A-B) KCl (40 mM) induceert membraandepolarisatie en de afgifte van alle drie de monoaminen in de HPC en PFC. In beide hersengebieden heeft voorbehandeling met fluoxetine (10 μM) geen invloed op het effect van KCl op extracellulaire monoamineafgifte. (C) KCl (40 mM) induceert membraandepolarisatie en het vrijkomen van DA in het dorsale striatum, en voorbehandeling met cocaïne (40 μM) heeft geen invloed op het effect van KCl op DA-afgifte. Statistieken vertegenwoordigen een eenrichtings-ANOVA gevolgd door Sidak's meervoudige vergelijkingstest. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SEM (N = 6). Statistieken vertegenwoordigen een eenrichtings-ANOVA met sidak's meervoudige vergelijkingstest (***p < 0,001, ****p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand: Recepten voor buffers en oplossingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Monoamine-afgiftemetingen worden al jaren uitgevoerd in een aantal systemen zoals heterologe cellen, neuronale culturen, hersensynaptosomen, ex vivo acute hersenplakken en hele dieren13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 . Dergelijke preparaten hebben het veld van de neurowetenschappen in staat gesteld om basale neurotransmitterafgiftemechanismen te onderzoeken die kunnen leiden tot de ontdekking van nieuwe farmacologische middelen voor neurologische en psychiatrische stoornissen waarbij monoaminen een rol spelen. Ondanks het wijdverbreide gebruik van dergelijke methoden zijn er bepaalde beperkingen met betrekking tot de bron en/of de hoeveelheid endogene monoamine-afgifte, met name bij radioactieve procedures. Bovendien zijn ex vivo acute hersenschijfpreparaten op grote schaal gebruikt in combinatie met elektrofysiologische, farmacologische, genetische, moleculaire, immunocytochemische en andere benaderingen18,24,25,47,50,51,59,69,70 , omdat ze de weefselarchitectuur behouden en zowel neuronale activiteit als synaptische verbindingen behouden. Hersenplakken bieden dus uitzonderlijke voordelen in vergelijking met andere in vitro modellen zoals heterologe systemen, primaire gekweekte neuronen en synaptosomen. Grotendeels is hun voordeel dat deze systemen veel aspecten van de in vivo omgeving kunnen reproduceren.
Elektrofysiologische, optogenetische, fluorescerende sensoren en voltametrische benaderingen bieden een uitstekende temporele en ruimtelijke resolutie om mechanismen te onderzoeken die verband houden met monoamineafgifte, met name DA. Het uitgangspunt voor het gebruik van deze benaderingen is echter dat de elektrische of door licht geïnduceerde stimulatie van neuronen de klassieke en goed gedocumenteerde calciumafhankelijke exocytotische vesiculaire afgifte van neurotransmitters induceert18,21,22,24,27,30. Een van de meer waarneembare beperkingen van deze benaderingen is dat monoaminen die vrijkomen via alternatieve mechanismen (d.w.z. niet-vesiculaire afgifte) niet worden gedetecteerd door deze technieken. Radioactief gelabelde neurotransmittermoleculen zijn ook gebruikt om de afgifte van monoamine te bestuderen, maar deze aanpak heeft aanzienlijke beperkingen. Cellen of weefselmonsters worden geladen met niet-fysiologische concentraties van gelabelde neurotransmitters die de oorspronkelijke omgeving niet getrouw samenvatten20,42,46. Interessant is dat een paar studies het gebruik van hersenplakken in superfusiesystemen documenteren om endogene monoamineafgifte53,54,56 te onderzoeken. Deze studies gebruiken echter radioactieve neurotransmitters en degenen die de endogene neurotransmitter onderzoeken, richten zich alleen op K + en niet-fysiologische omstandigheden om afgifte van neurotransmitters te induceren.
De momenteel gepresenteerde methode kan worden gebruikt om transporter-gemedieerde monoamineafgifte uit inheems weefsel te onderzoeken. Hierdoor kan de experimentator de beperkingen van tritiated neurotransmitters overwinnen. Bovendien biedt deze aanpak een eenvoudige opstelling om de afgifte van endogene monoamine nauwkeuriger te meten door een directe detectie van monoaminen in plaats van de indirecte meting bij gebruik van fluorescerende sensoren of radioactief gelabeld monoamine. Het is algemeen bekend dat amfetamine werkt als een monoaminetransporter-afgiftemiddel in de prefrontale cortex71, dorsale striatum56,72 en hippocampus39 hersengebieden. Deze bevindingen werden bevestigd met behulp van dit 48-well plate-systeem. Bovendien kan deze methode een aanvulling blijken te zijn op de momenteel gebruikte methoden die het totale monoaminegehalte meten met behulp van HPLC-ECD, maar die de afgifte van monoamine niet hebben onderzocht5,6,7. Deze methode biedt een nieuwe beluchter die is ontworpen om de endogene afgifte van monoaminen uit acute hersenplakken te meten met behulp van HPLC in combinatie met elektrochemische detectie.
Tijdens het gebruik van deze methode is het van cruciaal belang dat de hersenweefsels tijdens het experiment koud worden gehouden in zuurstofrijke buffer om verslechtering te voorkomen. Bovendien is het van cruciaal belang dat de gebruikte weefsels worden geactiveerd in een buffer met pargyline om afbraak van monoamine te voorkomen. Verder moet de experimentator mogelijk meerdere aspecten van deze methode oplossen. Ten eerste, afhankelijk van het ontwikkelingstijdpunt of de soort van het dier, moet men mogelijk kleinere of grotere secties maken of meer of minder secties, plakjes of stoten per aandoening gebruiken. Ten tweede, afhankelijk van het hersengebied van belang, zullen er verschillende hoeveelheden van elke neurotransmitter zijn. Ten derde, hoewel het van cruciaal belang is om te zorgen voor consistent borrelen van zuurstof wanneer dit wordt opgemerkt, moet de experimentator voorzichtig zijn om geen overmatige oxygenatie te bieden, omdat dit kan leiden tot het per ongeluk verwijderen van weefsel uit de put. Ten slotte, omdat er verschillende soorten HPLC-apparaten en verschillende scheidingskolommen zijn, zal de experimentator op basis van de literatuur moeten bepalen welk apparaat of welke kolom het beste zou werken voor hun experiment.
Hoewel deze methode de experimentator de mogelijkheid biedt om snel en nauwkeurig ex-vivo gegevens te verkrijgen over de afgifte van endogene monoaminen, zijn er beperkingen die in gedachten moeten worden gehouden. Omdat dit een ex vivo benadering is, worden netwerken en verbindingen verbroken, waardoor de slices of punches niet representatief zijn voor een intact systeem. Een andere belangrijke beperking van deze benadering is het gebrek aan temporele en ruimtelijke resolutie als monoamineafgifte wordt gemeten in een tijdschaal van minuten en van een populatie van afgifteplaatsen. Toekomstige verfijning van de aanpak kan een optimalisatie van tijd- en ruimteresolutie mogelijk maken. Aanvullende experimenten zullen ook de mechanismen onderzoeken die verband houden met releasegebeurtenissen. Nadat de geldigheid van de huidige methode is aangetoond, zullen toekomstige experimenten de moleculaire gebeurtenissen moeten ontleden die leiden tot monoamine-afgifte. Aanvullende experimenten omvatten Ca2+-vrije effluxbuffer en selectieve remmers van vesiculaire afgifte als aanvullende controles. Aangezien de regionale distributie van de monoaminen en hun transporters drie onafhankelijke gebeurtenissen zijn, moeten toekomstige experimenten uitgebreidere farmacologie en een tijdsverloopstudie omvatten, omdat verschillende medicijnomstandigheden kortere of langere incubatietijden kunnen vereisen. Op basis van regionale distributie of type weefsel dat wordt gebruikt, kunnen verdere experimenten bijvoorbeeld meer specifieke farmacologische blokkers gebruiken voor NET, SERT of DAT, zoals respectievelijk desipramine, fluoxetine en GBR12909. Verder, hoewel het weefsel gedurende het hele experiment levensvatbaar bleef, kan de experimentator niet uitsluiten dat de monoaminetransporterfunctie tijdens de duur van het hele proces is beïnvloed. De apparatuur die nodig is voor deze methode is goedkoop, maar er is een behoefte om toegang te hebben tot een dure HPLC-ECD. Dit kan worden verzacht door kernfaciliteiten, omdat velen momenteel toegang hebben tot HPLC-ECD's voor gemeenschappelijk gebruik. Ondanks dergelijke beperkingen biedt de huidige methode een fundamentele procedure, die verder kan worden gemanipuleerd om de afgifte van monoamine te onderzoeken.
Over het algemeen biedt deze methode een eenvoudige, hoge doorvoer en goedkope tweestapsprocedure om de gelijktijdige afgifte van monoaminen uit volwassen knaagdierneuronen te evalueren met behulp van ex vivo acute hersenplakken uit verschillende hersengebieden. Idealiter kan deze methode worden gecombineerd met in vivo protocollen en biedt het voorlopige gegevens, waardoor de experimentator het aantal dieren dat in vivo modellen nodig is, kan verminderen, zoals aanbevolen in de "drie V's" (vervanging, vermindering en verfijning) van dierenwelzijn. Het is dus mogelijk om dit ex vivo platform te implementeren voor de screening van potentieel therapeutische moleculen met als doel nieuwe farmacologische middelen te ontdekken voor de behandeling van aandoeningen die verband houden met dereguleringen in monoaminehomeostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies Fondecyt Initiation Fund N 11191049 aan J.A.P. en NIH-subsidie DA038598 aan G.E.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 Well plate | NA | NA | Assay |
| Acetonitrile | Fischer Scientific | A998-1 | Mobile Phase |
| Calcium Chloride Ahydrous | Sigma Aldrich | C1016 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Clarity Software | Anetc | ||
| Citric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 1002608421 | Dissection Buffer |
| DMF | Sigma Aldrich | D4551 | MTT Assay |
| EDTA-Na2 | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| GraphPad Software | Graphpad Software, Inc | Statistical Analysis | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Lysis buffer |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Lysis buffer |
| HPLC, Decade Amperometric | Anetc | HPLC, LC-EC system | |
| HPLC | Amuza | HPLC HTEC-510. | |
| L-Asrobic Acid | Sigma Aldrich | A5960 | Dissection Buffer |
| Magnesium Sulfate | Sigma | 7487-88-9 | KH Buffer |
| Microcentrifuge Filter Units UltraFree | Millipore | C7554 | Assay - 6 to fit in 48 well plate |
| MTT | Thermo Fisher | M6494 | MTT Assay |
| Nanosep | VWR | 29300-606 | Assay; protein assay |
| Octanesulfonic acid | Sigma Aldrich | V800010 | Mobile Phase |
| Pargyline Clorohydrate | Sigma Aldrich | P8013 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Phosphoric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| Potassium Chloride | Sigma | 12636 | KH Buffer |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | 1001655559 | KH Buffer |
| Precisonary VF-21-0Z | Precissonary | Compresstome | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P2714 | Lysis buffer. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | KH Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | Lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | MTT Assay / Lysis buffer |
References
- Jesulola, E., Micalos, P., Baguley, I. J. Understanding the pathophysiology of depression: From monoamines to the neurogenesis hypothesis model - are we there yet. Behavioural Brain Research. 341, 79-90 (2018).
- Krystal, J. H., D'Souza, D. C., Sanacora, G., Goddard, A. W., Charney, D. S. Current perspectives on the pathophysiology of schizophrenia, depression, and anxiety disorders. Medical Clinics of North America. 85 (3), 559-577 (2001).
- Barone, P. Neurotransmission in Parkinson's disease: beyond dopamine. European Journal of Neurology. 17 (3), 364-376 (2010).
- Howell, L. L., Kimmel, H. L. Monoamine transporters and psychostimulant addiction. Biochemical Pharmacology. 75 (1), 196-217 (2008).
- Kirshner, Z. Z., et al. Impact of estrogen receptor agonists and model of menopause on enzymes involved in brain metabolism, acetyl-CoA production and cholinergic function. Life Sciences. 256, 117975 (2020).
- Long, T., et al. Comparison of transitional vs surgical menopause on monoamine and amino acid levels in the rat brain. Molecular and Cellular Endocrinology. 476, 139-147 (2018).
- Long, T., et al. Estradiol and selective estrogen receptor agonists differentially affect brain monoamines and amino acids levels in transitional and surgical menopausal rat models. Molecular and Cellular Endocrinology. 496, 110533 (2019).
- Burke, N. N., et al. Enhanced nociceptive responding in two rat models of depression is associated with alterations in monoamine levels in discrete brain regions. Neuroscience. 171 (4), 1300-1313 (2010).
- Lane, J. D., Aprison, M. H. Calciumm-dependent release of endogenous serotonin, dopamine and norepinephrine from nerve endings. Life Sciences. 20 (4), 665-671 (1977).
- Ramamoorthy, S., Shippenberg, T. S., Jayanthi, L. D. Regulation of monoamine transporters: Role of transporter phosphorylation. Pharmacology and Therapeutics. 129 (2), 220-238 (2011).
- Torres, G. E., Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Plasma membrane monoamine transporters: structure, regulation and function. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (1), 13-25 (2003).
- Hilber, B., et al. Serotonin-transporter mediated efflux: A pharmacological analysis of amphetamines and non-amphetamines. Neuropharmacology. 49 (6), 811-819 (2005).
- Mauna, J. C., et al. G protein βγ subunits play a critical role in the actions of amphetamine. Translational Psychiatry. 9 (1), 81 (2019).
- Sitte, H. H., Freissmuth, M. Amphetamines, new psychoactive drugs and the monoamine transporter cycle. Trends in Pharmacological Sciences. 36 (1), 41-50 (2015).
- Johnson, L. A., Guptaroy, B., Lund, D., Shamban, S., Gnegy, M. E. Regulation of amphetamine-stimulated dopamine efflux by protein kinase C β. Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 10914-10919 (2005).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3495-3500 (2005).
- Kantor, L., Hewlett, G. H. K., Gnegy, M. E. Enhanced amphetamine- and K+ -mediated dopamine release in rat striatum after repeated amphetamine: differential requirements for Ca 2+ - and calmodulin-dependent phosphorylation and synaptic vesicles. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 3801-3808 (2018).
- Brodnik, Z. D., et al. Susceptibility to traumatic stress sensitizes the dopaminergic response to cocaine and increases motivation for cocaine. Neuropharmacology. 125, 295-307 (2017).
- Henke, A., et al. Toward serotonin fluorescent false neurotransmitters: development of fluorescent dual serotonin and vesicular monoamine transporter substrates for visualizing serotonin neurons. ACS Chemical Neuroscience. 9 (5), 925-934 (2018).
- Garcia-Olivares, J., et al. Gβγ subunit activation promotes dopamine efflux through the dopamine transporter. Molecular Psychiatry. 22 (12), 1673-1679 (2017).
- Xiao, N., Privman, E., Venton, B. J. Optogenetic control of serotonin and dopamine release in Drosophila larvae. ACS Chemical Neuroscience. 5 (8), 666-673 (2014).
- Bass, C. E., et al. Optogenetic control of striatal dopamine release in rats. Journal of Neurochemistry. 114 (5), 1344-1352 (2010).
- Stamford, J. A. Fast cyclic voltammetry: measuring transmitter release in "real time". Journal of Neuroscience Methods. 34 (1-3), 67-72 (1990).
- Brodnik, Z. D., Ferris, M. J., Jones, S. R., España, R. A. Reinforcing doses of intravenous cocaine produce only modest dopamine uptake inhibition. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 281-289 (2017).
- Brodnik, Z. D., España, R. A. Dopamine uptake dynamics are preserved under isoflurane anesthesia. Neuroscience Letters. 606, 129-134 (2015).
- Ferris, M. J., Calipari, E. S., Yorgason, J. T., Jones, S. R. Examining the complex regulation and drug-induced plasticity of dopamine release and uptake using voltammetry in brain slices. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 693-703 (2013).
- Siciliano, C. A., Calipari, E. S., Ferris, M. J., Jones, S. R. Biphasic mechanisms of amphetamine action at the dopamine terminal. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (16), 5575-5582 (2014).
- Rice, M. E., et al. Direct monitoring of dopamine and 5-HT release in substantia nigra and ventral tegmental area in vitro. Experimental Brain Research. 100 (3), 395-406 (1994).
- Bunin, M. A., Prioleau, C., Mailman, R. B., Wightman, R. M. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1077-1087 (1998).
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
- Park, J., Bhimani, R. V., Bass, C. E. In vivo electrochemical measurements of norepinephrine in the brain: current status and remaining challenges. Journal of the Electrochemical Society. 165 (12), 3051-3056 (2018).
- Butcher, S. P., Fairbrother, I. S., Kelly, J. S., Arbuthnott, G. W. Amphetamine-induced dopamine release in the rat striatum: an in vivo microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 50 (2), 346-355 (1988).
- Garcia-Olivares, J., et al. Inhibition of dopamine transporter activity by G protein βγ subunits. PLoS One. 8 (3), 1-9 (2013).
- Carneiro, A. M. D., Blakely, R. D. Serotonin-, protein kinase C-, and Hic-5-associated redistribution of the platelet serotonin transporter. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24769-24780 (2006).
- Rajamanickam, J., et al. Akt-mediated regulation of antidepressant-sensitive serotonin transporter function, cell-surface expression and phosphorylation. The Biochemical Journal. 468 (1), 177-190 (2015).
- Egaña, L. A., et al. Physical and functional interaction between the dopamine transporter and the synaptic vesicle protein synaptogyrin-3. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (14), 4592-4604 (2009).
- Guptaroy, B., Fraser, R., Desai, A., Zhang, M., Gnegy, M. E. Site-directed mutations near transmembrane domain 1 alter conformation and function of norepinephrine and dopamine transporters. Molecular Pharmacology. 79 (3), 520-532 (2011).
- Ordway, G. A., et al. Norepinephrine transporter function and desipramine: Residual drug effects versus short-term regulation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 217-225 (2005).
- Steinkellner, T., et al. Amphetamine action at the cocaine- and antidepressant-sensitive serotonin transporter is modulated by CaMKII. Journal of Neuroscience. 35 (21), 8258-8271 (2015).
- Guptaroy, B., et al. A juxtamembrane mutation in the N terminus of the dopamine transporter induces preference for an inward-facing conformation. Molecular Pharmacology. 75 (3), 514-524 (2009).
- Carpenter, C., et al. Direct and systemic administration of a CNS-permeant tamoxifen analog reduces amphetamine-induced dopamine release and reinforcing effects. Neuropsychopharmacology. 42 (10), 1940-1949 (2017).
- Aquino-Miranda, G., Escamilla-Sánchez, J., González-Pantoja, R., Bueno-Nava, A., Arias-Montaño, J. -A. Histamine H3 receptor activation inhibits dopamine synthesis but not release or uptake in rat nucleus accumbens. Neuropharmacology. 106, 91-101 (2016).
- Reddy, I. A., et al. Glucagon-like peptide 1 receptor activation regulates cocaine actions and dopamine homeostasis in the lateral septum by decreasing arachidonic acid levels. Translational Psychiatry. 6 (5), 809 (2016).
- Koutzoumis, D. N., et al. Alterations of the gut microbiota with antibiotics protects dopamine neuron loss and improve motor deficits in a pharmacological rodent model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 325, 113159 (2020).
- Herdon, H., Strupish, J., Nahorski, S. R. Differences between the release of radiolabelled and endogenous dopamine from superfused rat brain slices: Effects of depolarizing stimuli, amphetamine and synthesis inhibition. Brain Research. 348 (2), 309-320 (1985).
- Thongsaard, W., Kendall, D. A., Bennett, G. W., Marsden, C. A. A simple method for measuring dopamine release from rat brain slices. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 37 (3), 143-148 (1997).
- Dorris, D. M., Hauser, C. A., Minnehan, C. E., Meitzen, J. An aerator for brain slice experiments in individual cell culture plate wells. Journal of Neuroscience Methods. 238, 1-10 (2014).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Papouin, T., Haydon, P.
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 5-9 (1995).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. Journal of Neurochemistry. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Buskila, Y., et al.
- Kako, H., Fukumoto, S., Kobayashi, Y., Yokogoshi, H. Effects of direct exposure of green odour components on dopamine release from rat brain striatal slices and PC12 cells. Brain Research Bulletin. 75 (5), 706-712 (2008).
- McBride, W. J., Murphy, J. M., Lumeng, L., Li, T. -K. Effects of ethanol on monoamine and amino acid release from cerebral cortical slices of the alcohol-preferring P line of rats. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 10 (2), 205-208 (1986).
- Chen, J. C., Turiak, G., Galler, J., Volicer, L. Effect of prenatal malnutrition on release of monoamines from hippocampal slices. Life Sciences. 57 (16), 1467-1475 (1995).
- Becker, J. B., Castañeda, E., Robinson, T. E., Beer, M. E. A simple in vitro technique to measure the release of endogenous dopamine and dihydroxyphenylacetic acid from striatal tissue using high performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Neuroscience Methods. 11 (1), 19-28 (1984).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. London. (2007).
- Dailey, J. W., Reith, M. E. A., Steidley, K. R., Milbrandt, J. C., Jobe, P. C. Carbamazepine-induced release of serotonin from rat hippocampus in vitro. Epilepsia. 39 (10), 1054-1063 (1998).
- Buskila, Y., et al.
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice-A model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Rönicke, R., et al. AB mediated diminution of MTT reduction - An artefact of single cell culture. PLoS One. 3 (9), (2008).
- Ihalainen, J. A., Riekkinen, P., Feenstra, M. G. P. Comparison of dopamine and noradrenaline release in mouse prefrontal cortex, striatum and hippocampus using microdialysis. Neuroscience Letters. 277 (2), 71-74 (1999).
- Richards, D. A., Obrenovitch, T. P., Symon, L., Curzon, G. Extracellular dopamine and serotonin in the rat striatum during transient ischaemia of different severities: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 60 (1), 128-136 (1993).
- Fog, J. U., et al. Calmodulin kinase II interacts with the dopamine transporter C terminus to regulate amphetamine-induced reverse transport. Neuron. 51 (4), 417-429 (2006).
- Balázsa, T., Bíró, J., Gullai, N., Ledent, C., Sperlágh, B. CB1-cannabinoid receptors are involved in the modulation of non-synaptic [3H]serotonin release from the rat hippocampus. Neurochemistry International. 52 (1), 95-102 (2008).
- Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 282 (1), 262-270 (1997).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Molecular and Cellular Neuroscience. 39 (2), 211-217 (2008).
- Bowyer, J. F., et al. Interactions of MK-801 with glutamate-, glutamine- and methamphetamine-evoked release of [3H]dopamine from striatal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 257 (1), 262-270 (1991).
- Perszyk, R. E., et al. GluN2D-containing N-methyl-D-aspartate receptors mediate synaptic transmission in hippocampal interneurons and regulate interneuron activity. Molecular Pharmacology. 90 (6), 689-702 (2016).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 4029-4034 (1998).
- Jedema, H. P., Narendran, R., Bradberry, C. W. Amphetamine-induced release of dopamine in primate prefrontal cortex and striatum: striking differences in magnitude and timecourse. Journal of Neurochemistry. 130, 490-497 (2014).
- Buchmayer, F., et al. Amphetamine actions at the serotonin transporter rely on the availability of phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11642-11647 (2013).
