Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

בסיס בסיס צלחת למדידת שחרור מונואמין אנדוגני בפרוסות מוח חריפות

Published: August 11, 2021 doi: 10.3791/62127
Automatic Translation
*1, *2, 3, 2
1Department of Medicine, School of Medicine, Universidad de Atacama, 2Department of Molecular, Cellular, and Biomedical Sciences, City University of New York School of Medicine at City College, 3Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

שיטה זו מציגה טכניקה פשוטה לזיהוי של שחרור מונואמין אנדוגני באמצעות פרוסות מוח חריפות. ההתקנה משתמשת בלוח 48 באר המכיל מחזיק רקמות לשחרור מונואמין. מונואמין ששוחרר מנותח על ידי HPLC יחד עם זיהוי אלקטרוכימי. בנוסף, טכניקה זו מספקת שיטת סינון לגילוי סמים.

Abstract

נוירוטרנסמיטורים מונואמין קשורים ל מחלות נוירולוגיות ופסיכיאטריות רבות. מודלים בעלי חיים של תנאים כאלה הראו שינויים בשחרור נוירוטרנסמיטר מונואמין דינמיקה ספיגה. שיטות מורכבות מבחינה טכנית כגון אלקטרופיזיולוגיה, סקירה מהירה ולטמטריה מחזורית (FSCV), הדמיה, מיקרודיאליזה ויוו, אופטוגנטיקה, או שימוש רדיואקטיביות נדרשים ללמוד תפקוד מונואמין. השיטה המוצגת כאן היא גישה דו-שלבית ממוטבת לזיהוי שחרור מונואמין בפרוסות מוח חריפות באמצעות צלחת 48 באר המכילה מחזיקי רקמות לבחינת שחרור מונואמין, וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשילוב עם זיהוי אלקטרוכימי (HPLC-ECD) למדידת שחרור מונואמין. בקצרה, חלקים במוח חולדה המכילים אזורים של עניין, כולל קליפת המוח הקדם מצחית, היפוקמפוס, וסטריאטום שרירי אל-קדם הושגו באמצעות פורס רקמות או ויברטום. אזורים מעניינים אלה נותחו מכל המוח ודגרו במאגר פיזיולוגי מחומצן. הכדאיות נבדקה לאורך כל קורס הזמן הניסיוני, על ידי בדיקה 3-(4,5-דימתילתיאזול-2-yl)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT). אזורי המוח ניתחו באופן חריף דוגרו בתנאי סמים שונים הידועים כמזינים לשחרור מונואמין באמצעות המשגר (אמפטמין) או באמצעות הפעלה של שחרור אופניים אקסוציאוטיים (KCl). לאחר הדגירה, המוצרים שפורסמו בסופרנט נאספו ונותחו באמצעות מערכת HPLC-ECD. כאן, שחרור מונואמין בזאלי מזוהה על ידי HPLC מפרוסות מוח חריפות. נתונים אלה תומכים בתוצאות קודמות של vivo ו- in vitro המראים כי AMPH ו- KCl גורמים לשחרור מונואמין. שיטה זו שימושית במיוחד לחקר מנגנונים הקשורים לשחרור תלוי מונואמין טרנספורטר ומספקת הזדמנות לסנן תרכובות המשפיעות על שחרור מונואמין באופן מהיר ובעלות נמוכה.

Introduction

שפע של מחלות נוירולוגיות ופסיכיאטריות קשורות dysregulation או תחזוקה מספקת של נוירוטרנסמיטר מונואמין (דופמין [DA], סרוטונין [5-HT], נוראדרנלין [NE]) הומאוסטזיס1,2,3. תנאים אלה כוללים, אך אינם מוגבלים, דיכאון1,2, סכיזופרניה2, חרדה2, התמכרות4, גיל המעבר5,6,7, pain8, ומחלת פרקינסון3. לדוגמה, מספר מודלים חולדה של גיל המעבר הראו כי dysregulation או הפחתת מונומינים בתוך ההיפוקמפוס, קליפת המוח הקדם מצחית, סטריאטום עשוי להיות קשור הן דיכאון וירידה קוגניטיבית, אשר נראה אצל נשים חווה גיל המעבר. dysregulation של מונומינים בדגמים אלה נבדקו בהרחבה באמצעות HPLC-ECD, אם כי המחקרים לא להפלות בין תוכן נוירוטרנסמיטר נמדד לעומת שחרור נוירוטרנסמיטר 5,6,7. מונומינים משתחררים באופן קלאסי לחלל החוץ-תאי באמצעות שחרור רכבים תלוי Ca2+, והם ממוחזרים בחזרה דרך מערכת ספיגה מחדש של קרום הפלזמה שלהם (משגר דופמין, DAT; טרנספורטר סרוטונין, SERT; משגר נוראדרנלין, NET)10,11. לעומת זאת, הנתונים מצביעים על כך שמשגרים אלה מסוגלים לשחרר או efflux monoamines, שכן תרופות של התעללות כגון אמפטמין (AMPH) ו 3,4-מתילנדיוקסימטאמפטמין (MDMA) ידועים לשחרר DA ו 5-HT, בהתאמה באמצעות מערכות טרנספורטר שלהם12,13,14,15,16,17 . לכן, הבנה מכנית נכונה של דינמיקת שחרור מונואמין חיונית לפיתוח תרופות ספציפיות וממוקחות.

מגוון רחב של טכניקות שימשו לחקר שחרור מונואמין כגון Voltammetry מחזורי סריקה מהירה (FSCV)18, ב microdialysis vivo13, הדמיה19, דגירה מוקדמת עם מונומימינים radiolabeled20, אופטוגנטיקה, ולאחרונה, חיישנים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית ו photometry21,22 . FSCV ו- in vivo microdialysis הן הטכניקות העיקריות המשמשות לחקר שחרור מונואמין. FSCV משמש לחקר שחרור אקסוציאוטי מגורה של, בעיקר, DA בפרוסות מוח חריפה ב- vivo23. מכיוון ש- FSCV משתמש באלקטרודות כדי לעורר או לעורר שחרור, המקור העיקרי לשחרור נוירוטרנסמיטר הוא שחרור רכבים תלוי Ca2+18,24,25,26,27,28,29,30,31 . במיקרודיאליזה של Vivo בשילוב עם HPLC מודדים שינויים ברמות הנוירוטרנסמיטר החוץ-תאי באמצעות בדיקה הממוקמת באזור מוח של עניין13,32. בדומה ל- FSCV, מגבלה מרכזית למיקרודיאליזה של ויוו היא הקושי לקבוע את מקור שחרור הנוירוטרנסמיטר: שחרור רכב תלוי Ca2+ או טרנספורטר תלוי. ראוי לציון, שתי השיטות מאפשרות מדידה ישירה של שחרור מונואמין. באמצעות ההתקדמות האחרונה של אופטוגנטיקה, המחקר מדגים זיהוי של שחרור 5-HT ו DA ב- תוחלת זמן קצרה עם ספציפיות מעולה סוג תא21,22. עם זאת, אסטרטגיות אלה דורשות טכניקות וציוד מורכבים ויקרים, ולמדוד בעקיפין שחרור מונואמין, במיוחד באמצעות מונואמין מחייב קולטנים. יתר על כן, מונמינים radiolabeled משמשים גם לחקר דינמיקת מונואמין. מונומינים Radiolabeled עשוי להיות טעון מראש לתוך מערכות מודל שונות כגון תאים הטרולוגיים overexpressing כל משגר מונואמין20,33,34,35,36,37,38,39,40, נוירונים ראשוניים20, synaptosomes33,39,41, 42, ופרוסות מוח חריפות43,44. עם זאת, רדיואקטיביות מהווה נזק פוטנציאלי לנסיין, וייתכן שהניתוחים המסומנים על ידי טריטיום לא יתמכו בנאמנות על דינמיקת מונואמין אנדוגני45,46. מערכות Superfusion בשילוב עם שיטות זיהוי לא קו כגון HPLC-ECD אפשרו זיהוי של מונומינים ממקורות רקמות מרובים. כאן, פרוטוקול זה מספק כשיטה ממוטבת ובעלות נמוכה, פשוטה ומדויקת באמצעות פרוסות מוח חריפות כדי למדוד ישירות את שחרור הבזל אנדוגני ומונואמין מגורה.

פרוסות מוח חריפות מאפשרות לבחון השערות מכאניסטיות, בעיקר כאשר הן משמרות את המיקרו-סביבה האנטומית, ושומרות על סינפסות שלמות47,48,49,50,51,52. במספר מחקרים, פרוסות מוח חריפות או רקמת מוח קצוצה שימשו בשילוב עם טכניקת superfusion באמצעות KCl כדי לעורר Ca2 + שחרור מתווך53,54,55,56. מערכות Superfusion היו קריטיות כדי לקדם את ההבנה של השדה של מנגנוני שחרור נוירוטרנסמיטר, כולל מונונמינים. עם זאת, מערכות אלה יקרות יחסית, ומספר התאים הזמינים לניתוח רקמות נע בין 4-12. לשם השוואה, השיטה המוצגת כאן היא זולה, מאפשרת מדידה של 48 דגימות רקמה, וניתן לזקק אותו לשימוש עד 96 דגימות רקמה. כל באר בתוך צלחת 48-well מכיל מחזיקי רקמות המשתמשים במסננים כדי להפריד את המוצר ששוחרר מן הרקמה, מונמינים משוחררים נאספים לאחר מכן מנותחים על ידי HPLC-ECD. חשוב לציין, שיטה זו מאפשרת מדידה סימולטנית של 5-HT, DA, ו- NE לשחרר מאזורים שונים במוח כגון קליפת המוח הקדם מצחית, ההיפוקמפוס, ואת סטריאטום געש לאחר טיפול עם סוכנים פרמקולוגיים המווסתים שחרור מונואמין. לכן, הנסיין יכול לענות על שאלות מרובות באמצעות מערכת רב-באר זולה המגבירה את מספר הדגימות שנבדקו ובכך מפחיתה את מספר בעלי החיים המשמשים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים, כולל טיפול בבעלי חיים ואיסוף רקמות, בוצעו בהתאם לאוניברסיטת פלורידה ולוועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של המכללה העירונית של ניו יורק (IACUC), בעקבות הפרוטוקול המאושר 201508873 (UF) ו- 1071 (CCNY). עבור ריאגנטים ומאגר אנא עיין בקובץ המשלים.

1. הכן פרוסות מוח חולדה חריפה

הערה: בניסוי זה חולדות זכר מבוגר (250-350 גרם) שימשו. עם זאת, מערך זה פונקציונלי עבור נקודות התפתחותיות שונות, חולדות נקבה, ומינים אחרים. אם משתמשים בחיה קטנה יותר, כגון עכברים, הנסיין עשוי להתאים את עצמו כדי לייעל את הפרוטוקול באמצעות מספר שונה של פרוסות מוח או אגרופים לכל תנאי. מאגר הניתח ייקרא Buffer 1; מאגר שפכים ייקרא מאגר 2.

  1. הכן מאגר 1 כפי שצוין בקובץ המשלים. חוצץ רווי 1 עם חמצן על ידי מבעבע עם 95%/5% (O2/CO2) למשך 20 דקות על קרח. מוציאים 50 מ"ל של Buffer 1, ומצננים על קרח בכוס קטנה או צלחת פטרי. חוצץ זה משמש כדי להחזיק את המוח כולו שנקטף בחריפות.
  2. להרדים חולדה בוגרת אחת או שתיים (250-350 גרם) עם 1%-2% איזופלוראן, לערוף את ראשן באמצעות גיליוטינה ולהסיר במהירות את מוחם. מיד למקם את המוח במאגר מחומצן קרח 1 במיכל מ שלב 1.1.
    הערה: ודא איזופלוראן גיליוטינה משמשים בבטחה. פתח איזופלוראן מתחת למכסה המנוע.
  3. בעזרת ויברטום או דחיסה, חתכו מקטעי מוח קורורליים של 300 מיקרומטר מכל אזור מעניין (איור 1). מאגר מבעבע 1 חייב להיות נוכח בעת נעשה מקטעים. בעזרת מרית נירוסטה, מעבירים בזהירות ובמיידי פרוסות מוח לצלחת פטרי חדשה מלאה במאגר מחומצן קר כקרח 1 (איור 2).
  4. ניתוח נוסף של פרוסות המוח (למשל, אגרופים, חיתוך) על-ידי הזזה זהירה של הפרוסות לשקופיות זכוכית (איור 1G) באמצעות אטלס מוח חולדה57. לדוגמה, לזהות את הסטריאטום של הגעש המבוסס על המבנה הכהה והמפוסך שלו, ולזהות את ההיפוקמפוס בהתבסס על קרבתו לקליפת המוח ומבנה הספירלה הייחודי. ניתן להפריד את האונה הימנית והשמאלית לשימוש כפרוסות שליטה וניסוי (איורים 2G - H). כאן, הסטריאטום של החזרה נותח עוד יותר לאגרופים של 2 מ"מ (איור 1G).
  5. באמצעות פיפטה העברת פלסטיק עם קצה חתוך, להעביר פרוסות או אגרופים במוח לתוך מיכלים קטנים שקועים חוצץ קר קרח מחומצן 1 עם חמצן מבעבע. מיכלים אלה עשויים להיות רשת נירוסטה, או מנות פטרי קטנות מלאות חוצץ (איור 1H).

2. שחרור מונואמין אנדוגני Ex-vivo מפרוסות מוח או אגרופים

הערה: ההתקן המשמש עבור סעיף זה מורכב מצלחת של 48 באר ומחזיק רקמות העשוי משש יחידות סינון מיקרו-צנטריפוגה ללא מסנני החדירה המחוברים לקו קרבוגן (איור 2). כדי להפוך את המחזיק, להשתמש מוט פלסטיק יציב (למשל, מגרד תא) וסופר להדביק את יחידות מסנן microcentrifuge ללא מסנני inset אליו. תן לו להתייבש במשך 1-2 ימים. הזמן הנדרש לניסוי שחרור מונואמין אנדוגני וריכוזים של אמפטמין, פלואוקסטין וקוקאין מבוססים על הספרות הנוכחית והפרוטוקולים הקודמים13,20,58.

  1. הפעלת רקמות
    1. העבר את רקמת המוח מצעד 1.1.5 לכל באר של תא השפכים ואפשר התאוששות למשך 30-50 דקות ב-37 °C (37 °C) על מחמם שקופיות ב-0.5-1 מ"ל של Buffer 2 מחומצן, עם מבעבע מתמיד ועדין (איור 2B1).
    2. במהלך דגירה זו, לדלל את התרופות לריכוז הרצוי לניסוי. כל התרופות חייבות להיות מומסות במאגר 2, והריכוזים מבוססים על הספרות הנוכחית.
  2. דגירה ראשונה
    1. הזז את מחזיק הרקמה עם רקמת המוח לבארות המכילות 500 μL של חוצץ מחומצן 2 ודגרה במשך 20 דקות ב 37 °C (57 °F). ודא כי מאגר מינימלי עד ללא מועבר על ידי הקשה על המחזיק בקצה הבאר עד שאין מאגר עודף במחזיק.
    2. בניסויים עם חומרים פרמקולוגיים כגון מעכבי משגר מונואמין, דגירה על דגימות הרקמות עם התרופות המדוללות במאגר מחומצן 2 (למשל, 10 מיקרומטר פלואוקסטין, 40 מיקרומטר קוקאין; ראו איור 2B2). הנפח הסופי בכל באר יהיה 500 μL.
  3. דגירה שנייה
    1. העבר את המחזיק עם הרקמה לסט חדש של בארות המכילות 500 μL סה"כ Buffer 2 עם או בלי הריכוז הרצוי של כל תרופה. ודא שאין שאריות מאגר עודפות. כל באר מייצגת n = 1 עבור תנאי ניסוי. כל מצב ניסיוני מבוצע במשולש.
    2. באר אחת כוללת חוצץ מחומצן 2, הבא 10-30 μM AMPH, ואת הבאר הסופית כוללת 10-30 μM אמפר בתוספת מעכבי משגר מונואמין. כל תרופה מומסת במאגר מחומצן 2.
    3. לדגור את הרקמה במשך 20 דקות ב 37 °C (500 μL) של מצב התרופה.
      הערה: בארות נוספות עשויות לכלול מאגר K+ גבוה מחומצן 2 עם או בלי מעכבי טרנספורטר מונואמין. להמיס כל תרופה במאגר מחומצן 2 (500 μL).
    4. במהלך הדגירה השנייה של 20 דקות, לאסוף את הפתרון מן בארות מן הדגירה הראשונה בשלב 2.2.1 ולעבור צינורות microcentrifuge המכיל 50 μL של 1 N חומצה פרכלורית או חומצה זרחתית (תלוי בסוג של HPLC, ריכוז סופי 0.1 N). הנפח הסופי של המדגם יהיה 550 μL. לשמור על צינורות microcentrifuge על קרח, ולתייג את הצינורות #1.
    5. לאחר הדגירה השנייה של 20 דקות, להזיז את מחזיק הרקמה עם מקטעי מוח או אגרופים לבאר ריקה ולשמור על הצלחת על קרח. העבר את supernatant לצינורות microcentrifuge המכיל 50 μL של 1 N חומצה פרכלורית או חומצה זרחתית. הנפח הסופי של המדגם יהיה 550 μL. לשמור על צינורות microcentrifuge על קרח, ולתייג את הצינורות #2.
    6. יש להוסיף מ"ל אחד של Buffer 1 קר כקרח לכל רקמה המכילה היטב. לאסוף את כל הרקמה באמצעות פינצטה קטנה, ולהעביר צינורות microcentrifuge נקי.
    7. לשמור על צינורות עם רקמת המוח ב -80 °C (80 °F). השלך את 1 מ"ל של מאגר 1 (איור 2B4).
    8. פתרונות סינון המתקבלים מכל דגירה באמצעות צינורות מסנן microcentrifuge (0.22 מיקרומטר) ב 2,500 x g עבור 2 דקות. השתמש בסינון כדי לקבוע תוכן מונואמין באמצעות HPLC עם זיהוי אלקטרוכימי (איור 2B5).

3. כדאיות רקמות

  1. MTT אסייד
    הערה: חשש משמעותי לגבי התקנה ניסיונית זו היא כדאיות רקמות כמו הרקמה עשויה לשמש עד כמה שעות59. בדיקת MTT 60,61 משמשת לקביעת כדאיות הרקמות עד סוף הניסוי. מבדק זה מבוסס על ההמרה של מלח טטרזוליום צהוב MTT (3-(4,5-דימתילתיאזול-2-yl)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד) לגבישי פורמזן סגולים על ידי תאים ברי קיימא עם חילוף חומרים נאות.
    1. לאחר הניסוי לשמור על קבוצה נפרדת של דגימות רקמה ולהפריד אותם לשתי קבוצות.
    2. לדגור קבוצה אחת במשך 20 דקות ב 37 °C ב Triton X-100 (1%) מומס במאגר 2 כפקד. טריטון X-100 טיפול תוצאות מוות תאים. שמור על הקבוצה השנייה במאגר 2, ואל תידגר בטריטון X-100 (בקרת כדאיות רקמות).
    3. הוסף MTT (פתרון מלאי 5 מ"ג / מ"ל ב PBS, pH 7.4) לשתי הקבוצות במאגר מחומצן 2 לריכוז סופי של 0.5 מ"ג / מ"ל.
    4. לדגור את דגימות הרקמה במשך 20 דקות ב 37 °C ,, לשטוף עם PBS, ולהעביר לתוך צינורות microcentrifuge המכילים 250 μL של תערובת של SDS (10%, w / v), DMF (25%, v / v), ומים כדי להמיס את גבישי formazan.
    5. לדגור את הדגימות עבור 24 שעות.
    6. צנטריפוגות הצינורות ב 10,000 x g במשך 10 דקות ולמדוד את הספיגה של supernatant (200 μL) ב 562 ננומטר ו 690 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוח. כדאיות הרקמות מחושבת כדלקמן: (A562-A690)/משקל רקמות.

4. ניתוח HPLC של מונומינים

  1. כימות שחרור מונואמין מכל מצב ניסיוני באמצעות HPLC-ECD בהתאם לפרוטוקולים קודמים13,44, באמצעות עמודת שלב הפוך.
    1. הכן את השלב הנייד הנדרש לזיהוי. זה מורכב 100 mM חומצה זרחתית, 100 mM חומצת לימון, 0.1 mM EDTA-Na2, 600 מ"ג / L חומצה אוקטנסולפונית, 8% v / v acetonitrile (pH סופי 6.0). הרכב השלב הנייד תלוי בסוג HPLC ובעמודה בהם נעשה שימוש.
    2. הגדר את הפוטנציאל של הגלאי האלקטרוכימי (אלקטרודת פחמן מזוגגת 2 מ"מ,) ל 0.46 V, והגדיר את קצב הזרימה ל 0.05 מ"ל / דקה.
    3. טען 5 μL של כל דגימה, כולל תקני נוירוטרנסמיטר לתוך HPLC עבור autoinjection וזיהוי. כמות כל דגימה שנוספה תלויה בסוג HPLC המשמש.
    4. לאחר ש-HPLC השלים את ההפעלה, השתמש בתוכנת הניתוח הנתונה HPLC כדי לרכוש ולנתח את נתוני הכרומטוגרפיה.
    5. לנתח תוכן מונואמין באמצעות עקומה סטנדרטית המורכבת מכל מונואמין (דופמין: DA, נוראדרנלין: NE, וסרוטונין: 5-HT; איור 2C). השתמש בכרומטוגרמה המתקבלת כדי להשיג את האזור שמתחת לעקומה (AUC) בהתבסס על הנחיות היצרן.

5. הכנת רקמות לכימות חלבונים

  1. חלבון אסייד
    1. הוסיפו חיץ תמוגה קר כקרח בתוספת מעכבי פרוטאז (0.1 גרם/1 מ"ל) לכל צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל מקטעי מוח/אגרופים והומוגניזציה באמצעות הומוגניזר עלה. צינורות microcentrifuge חייב להישמר על קרח תוך הומוגניזציה כדי למנוע השפלת חלבון.
    2. רקמת דגירה הומוגנטים עבור 1 שעות ב 4 °C (70 °F) עם סיבוב אור.
    3. רקמת צנטריפוגה הומוגנטית ב 16,000 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (55 °F) לשחזר את supernatant.
    4. קבע ריכוז חלבון בסופרנטאנטים, עם אלבומין בסרום בקר (BSA) כסטנדרט.
    5. לנרמל את התוכן מונואמין בכל דגימת מוח לתכולה הכוללת של חלבון (מיקרוגרם) נמדד 250 μL של רקמת המוח lysed. השתמש בנוסחה שלהלן כדי לקבוע את חלבון nmol מונואמין/g. df = גורם דילול.

Equation 1

6. ניתוח סטטיסטי

  1. לנתח שחרור מונואמין (nmol/g) באמצעות ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן השוואות מרובות של Sidak להשוואות שלאחר הוק.
  2. לנתח את הכדאיות של הרקמות באמצעות מבחן t של סטודנט לא מנוצל לקבוצות עצמאיות (בקרה לעומת 1% טריטון X-100).
  3. עבור כל הניתוחים הסטטיסטיים, הגדר את רמת האלפא ≤ 0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

טכניקה זו מתארת את השימוש בפרוסות המוח כדי למדוד את שחרורם של מונומינים אנדוגניים באמצעות HPLC עם זיהוי אלקטרוכימי המבוסס על צלחת 48 באר עם מחזיק רקמות פנימי. מערך ניסיוני מתואר באיור 1 ובאיור 2. בתחילה, כדי להבטיח את הכדאיות של הרקמה עד סוף הניסוי, בוצעה בדיקת MTT (3-(4,5-דימתילתיאזול-2-yl)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד, בדיקת טטרזול). לאחר ניסויים פונקציונליים, פרוסות המוח החריפות פעילות מטבולית ונשארות ברות קיימא בהשוואה לאלה שדוחרות עם 1% טריטון X-100, מצב של מוות תאי (איור 3).

טיפול אקוטי, 20 דקות, בחלקי מוח היפוקמפוס וקדם-מצחית עם אמפאט גורם לעלייה משמעותית ברמות החוץ-תאיות של כל מונואמין (איור 4A, B). AMPH (30 מיקרומטר) הגדיל את רמת ה-5-HT החוץ-תאי מפרוסות ההיפוקמפוס ופרוסות קליפת המוח הקדם-מצחית פי 220 ו-64 פי 64, NE חוץ-תאי פי 19 ופי 8, ו-DA חוץ-תאי פי 8 ופי 7, בהתאמה. ניסויים דומים בוצעו בנוכחות פלואוקסטין (10 מיקרומטר), מעכב ספיגה חוזרת של סרוטונין סלקטיבי. עיכוב של SERT עם פלואוקסטין מונע את הגידול של 5-HT חוץ תאי המושרה על ידי AMPH הן בהיפוקמפוס והן בקליפת המוח הקדם מצחית. לעומת זאת, פלואוקסטין אינו משפיע על ההשפעה של AMPH על DA או NE חוץ-תאיים באותם אזורי מוח, בהתאם לסלקטיביות שלו עבור SERT (איור 4A,B). כל התנאים הניסיוניים בוצעו במשולש.

שחרורו של מונומינים מ 2 מ"מ אגרופים סטריאטום גדש נמדדו הבא. חריפה, 20 דקות, טיפול אגרופים סטריאטום הגב עם AMPH (10 מיקרומטר) גורם לעלייה של פי 35 ברמות החוץ תאיות של DA (איור 4C) על פני רמות בזאלי. זיהוי DA התמקד בסטריאטום גב בשל רמות בזאלי נמוכות יותר של 5-HT ו- NE שדווחו בעבר באזור זה62,63. לכן, AMPH לגרום לעלייה מינון מינון קל 5-HT חוץ תאי לעומת רמות DA חוץ תאי המושרה על ידי AMPH (נתונים לא הראו). דגירה של אגרופי סטריאטום עם קוקאין (40 מיקרומטר), חוסם משגר מונואמין, הביאה לעיכוב משמעותי של DA חוץ-תאי המושרה על ידי אמפא בהשוואה לאגרופים שדגרו אך ורק עם AMPH (איור 4C). נתונים אלה תומכים עוד יותר בממצאים קודמים המצביעים על כך ש- AMPH המושרה על ידי DA שפכים באמצעות DAT16.

לבסוף, כדי להדגים שחרור אקסוציאוטי של מונומינים, מקטעי המוח דוגרו עם KCl (40 מ"מ). די בהגדלת הריכוז של KCl חוץ-תאי כדי לעורר דה-קוטביות של הממברנה באמצעות דגירה עם 40 מ"מ של KCl כדי לגרום לשחרור אקסוציאוטי של מונומינים בהשוואה לתנאי שליטה (איור 5). לא פלואוקסטין ולא קוקאין חוסם את העלייה ברמות החוץ תאיות של מונומינים הנגרמים על ידי depolarization קרום KCl.

Figure 1
איור 1: פרוסת מוח חולדה חריפה והכנת חתך. (א) מוח חולדה ממוקם במטריצה במוח. חתך מעולה מציין את החלק העליון של כיאסם אופטי; החתך הנחות הוא 3 מ"מ אחורי של הבסיס של ההיפותלמוס. חתכים נעשו כדי להסיר את ההיפוקמפוס והסטריאטום, ולהבטיח בסיס אופקי להדביק את הדגימה לדחיסה או רטט בבטחה לפני חיתוך. (בי-די) דבק העל היה מפוזר סביב בסיס הבמה, המוחות הודבקו, כוסו מיד באגרוז, והאגורוז התגבש באמצעות המלחציים הקפואים (D). (E-F) דחיסה שימשה להכנת פרוסות 300 מיקרומטר למוח החולדה, ופרוסות הונחו במאגר מחומצן עד לשימוש. (ז) חלקים הונחו על שקופית ו 2 מ"מ אגרופים של סטריאטום גב נעשו. (ז) אגרופים של סטריאטום גב (למעלה), חתכים של ההיפוקמפוס (באמצע), חתכים של קליפת המוח (התחתון) נשמרים ב 4 °C (C בחץ ניתוח מחומצן לפני תחילת ניסויים פונקציונליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ערכו ניסויים לניסוי שפכים. (A) תא השפכים מורכב מצלחת תרבית רקמות של 48 באר ומגש מחזיק רקמות המחובר לקו הקרבוגן. (B) תרשים המציג את העיצוב הניסיוני לניסוי המונואמין שפכים אנדוגני שבו מוצגת הפעלת הרקמה (B1), טרום דגירה עם/בלי מעכבי משגר מונואמין (B2), ניסוי שפכים (B3) ועיבוד הדגימה הסופי מוצגים (B4-B5). (C) הלוח השמאלי מתאר נסיין שטוען את ההסתה לתוך HPLC כהכנה להזרקה אוטומטית. החלונית הימנית מציגה כרומטוגרמה מייצגת המציינת את הפסגות הסטנדרטיות של המונואמין. האזור שמתחת לעקומה (AUC) נמדד עבור כל תקן מונואמין ודגימות מוח. לאחר הכיול, AUC נמדד עבור כל דגימת מוח מומר לריכוז nM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פרוסות מוח חריפות היו מעשיות עד סוף הניסוי. בדיקת MTT בוצעה כדי לקבוע את הכדאיות של הרקמות בהשוואה לטריטון X-100 1%, מה שגרם למוות תאי. התוצאה של בדיקת MTT הראתה כי עד סוף 6 שעות, דגימות רקמה היו עדיין קיימא. התוצאות מתבטאות כ-SEM ± הממוצע (N = 6). P < 0.0001, t מבחן לא משוחזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אמפטמין גורם לשחרור מונואמין בפרוסות מוח חריפות מההיפוקמפוס, קליפת המוח הקדם-מצחית והאגרופים של הסטריאטום הגבי. (A-B) פרוסות היפוקמפול וקליפת המוח הקדם-מצחית דוגרות ב-30 מיקרומטר אמפאץ' ומביאות לעלייה משמעותית בשחרור של 5-HT, DA ו-NE. פלואוקסטין מעכב באופן משמעותי שחרור 5-HT, אבל אין לו השפעה על שחרור DA או NE באזורים אלה. (C) 2 מ"מ אגרופים סטריאטום גדור היו דגירה בקוקאין (40 מיקרומטר) או AMPH (30 מיקרומטר). אמפאץ' עורר שחרור DA טיפול מראש עם קוקאין הוביל להפחתה משמעותית של שחרור DA המושרה AMPH. כל המדידות הן ב-nmol/g של חלבון. הסטטיסטיקה מייצגת ANOVA בכיוון אחד ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של Sidak. התוצאות מתבטאות כ-SEM ± הממוצע (N = 6). סטטיסטיקה מייצגת ANOVA בכיוון אחד עם מבחן ההשוואה המרובה של Sidak (** p = 0.01, *** p = 0.001, **** p = 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תוצאות גבוהות של K+ חוץ-תאי בשחרור מונואמין באמצעות דה-קוטביות של הממברנה. (א-ב) KCl (40 מ"מ) גורם לדה-קוטביות של הממברנה ולשחרור כל שלושת המונומינים ב- HPC וב- PFC. בשני אזורי המוח, טיפול מקדים עם פלואוקסטין (10 מיקרומטר) אינו משפיע על ההשפעה של KCl על שחרור מונואמין חוץ תאי. (C) KCl (40 מ"מ) גורם לפירוק קרום ושחרור DA בסטריאטום הגבי, ו טיפול מקדים בקוקאין (40 מיקרומטר) אינו משפיע על ההשפעה של KCl על שחרור DA. הסטטיסטיקה מייצגת ANOVA בכיוון אחד ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של Sidak. התוצאות מתבטאות כ-SEM ± הממוצע (N = 6). סטטיסטיקה מייצגת ANOVA בכיוון אחד עם מבחן ההשוואה המרובה של Sidak (***p < 0.001, ****p < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים: מתכונים למאגרים ופתרונות. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מדידות שחרור מונואמין בוצעו במשך שנים במספר מערכות כגון תאים הטרולוגיים, תרביות עצביות, סינפטוזומים במוח, פרוסות מוח חריפות ex vivo, ובעלי חיים שלמים13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 . תכשירים כאלה אפשרו לתחום מדעי המוח לחקור מנגנוני שחרור מוליכים עצביים בסיסיים שעלולים להוביל לגילוי סוכנים פרמקולוגיים חדשניים להפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות שבהן מונומינים ממלאים תפקיד. למרות השימוש הנרחב בשיטות כאלה, ישנן מגבלות מסוימות לגבי המקור ו/או כמות שחרור המונואמין האנדוגני, במיוחד בהליכים רדיואקטיביים. בנוסף, תכשירי פרוסות מוח אקוטיים ex vivo היו בשימוש נרחב בשילוב עם אלקטרופיזיולוגית, פרמקולוגית, גנטית, מולקולרית, אימונוציטוכימית וגישות אחרות18,24,25,47,50,51,59,69,70 כאשר הם משמרים את ארכיטקטורת הרקמה, ושומרים הן על פעילות עצבית והן על קשרים סינפטיים., לכן, פרוסות במוח מציעות יתרונות יוצאי דופן בהשוואה למודלים במבחנה אחרים כגון מערכות הטרולוגיות, נוירונים בתרבית ראשונית וסינפטומוזומים. במידה רבה, היתרון שלהם הוא כי מערכות אלה יכולים לשחזר היבטים רבים של סביבת in vivo.

חיישנים אלקטרופיזיולוגיים, אופטוגנטיים, פלואורסצנטיים וגישות וולטמטריות מציעים רזולוציה זמנית ומרחבית מעולה לבחינת מנגנונים הקשורים לשחרור מונואמין, במיוחד DA. עם זאת, הנחת היסוד לשימוש בגישות אלה היא כי גירוי חשמלי או אור המושרה של נוירונים מעורר את הקלאסי, ומתועד היטב סידן תלוי ריסקולים שחרור של נוירוטרנסמיטורים18,21,22,24,27,30. אחת המגבלות הבולטות יותר של גישות אלה היא כי מונומינים המשתחררים באמצעות מנגנונים חלופיים (כלומר, שחרור שאינו ריסקול) אינם מזוהים על ידי טכניקות אלה. מולקולות נוירוטרנסמיטר Radiolabeled שימשו גם כדי לחקור שחרור מונואמין, אבל גישה זו יש מגבלות משמעותיות. תאים או דגימות רקמה עמוסים בריכוזים לא פיזיולוגיים של נוירוטרנסמיטורים מסומנים שאינם מסכמים בנאמנות את הסביבה המקומית20,42,46. מעניין, כמה מחקרים מתעדים את השימוש בפרוסות במוח במערכות superfusion כדי לבחון שחרור מונואמין אנדוגני53,54,56. עם זאת, מחקרים אלה משתמשים נוירוטרנסמיטורים רדיואקטיביים, ואלה לבחון את הנוירוטרנסמיטר אנדוגני להתמקד רק K + ותנאים שאינם פיזיולוגיים כדי לגרום לשחרור נוירוטרנסמיטר.

השיטה המוצגת כעת יכולה לשמש כדי לבחון שחרור מונואמין בתיווך טרנספורטר מרקמה מקומית. זה מאפשר לנסיין להתגבר על המגבלות של נוירוטרנסמיטורים משולשים. בנוסף, גישה זו מספקת הגדרה פשוטה למדידת שחרור מונואמין אנדוגני בצורה מדויקת יותר באמצעות זיהוי ישיר של מונומינים ולא המדידה העקיפה בעת שימוש בחיישני פלואורסצנטי או מונואמין radiolabeled. זה מבוסס היטב כי אמפטמין פועל כסוכן שחרור משגר מונואמין בקליפת המוח הקדם מצחית71, סטריאטום געש56,72, ואזורי המוח היפוקמפול39. ממצאים אלה אושרו באמצעות מערכת לוחות 48-well זה. בנוסף, שיטה זו עשויה להתברר כתוספת לשיטות הנמצאות בשימוש כיום המודדות את תכולת המונואמין הכוללת באמצעות HPLC-ECD אך לא בדקו את שחרור המונואמין5,6,7. שיטה זו מספקת מנחה חדשני שנועד למדוד את השחרור האנדוגני של מונומינים מפרוסות מוח חריפות באמצעות HPLC בשילוב עם זיהוי אלקטרוכימי.

בעת שימוש בשיטה זו, זה קריטי כי רקמות המוח נשמרים קרים במאגר מחומצן במהלך הניסוי כדי למנוע הידרדרות. בנוסף, חיוני כי הרקמות המשמשות מופעלות במאגר המכיל pargyline כדי למנוע השפלה מונואמין. יתר על כן, הנסיין עשוי להיות צריך לפתור היבטים מרובים של שיטה זו. ראשית, בהתאם לנקודת הזמן ההתפתחותית או למין של החיה, ייתכן שיהיה צורך ליצור קטעים קטנים או גדולים יותר או להשתמש פחות או יותר בקטעים, פרוסות או אגרופים לכל תנאי. שנית, בהתאם לאזור המוח של עניין, יהיו כמויות שונות של כל נוירוטרנסמיטר. שלישית, בעוד זה קריטי כדי להבטיח מבעבע עקבי של חמצן כאשר צוין, הנסיין חייב להיות זהיר לא לספק חמצון עודף כמו זה עלול להוביל הסרה בשוגג של רקמות מן הבאר. לבסוף, מכיוון שיש סוגים שונים של התקני HPLC ועמודות הפרדה שונות, הנסיין יצטרך לקבוע, בהתבסס על הספרות, איזה מכשיר או עמודה יעבדו בצורה הטובה ביותר לניסוי שלהם.

למרות שיטה זו מספקת את הנסיין עם היכולת להשיג במהירות ובדיוק נתונים ex-vivo על שחרור של מונומינים אנדוגני, יש מגבלות שיש לזכור. מכיוון שמדובר בגישה של ex vivo, רשתות וחיבורים מנותקים, ולכן הפרוסות או האגרופים אינם מייצגים מערכת שלמה. מגבלה חשובה נוספת של גישה זו היא היעדר רזולוציה זמנית, ופתרון מרחבי כמו שחרור מונואמין נמדד בסולם זמן של דקות, ומאוכלוסייה של אתרי שחרור. שיפור עתידי של הגישה עשוי לאפשר אופטימיזציה של רזולוציית זמן ומרחב. ניסויים נוספים יבחנו גם את המנגנונים הקשורים לאירועי שחרור. לאחר שהדגימו את תוקפה של השיטה הנוכחית, ניסויים עתידיים ידרשו לנתח את האירועים המולקולריים המובילים לשחרור מונואמין. ניסויים נוספים יכללו מאגר שפכים ללא Ca2+, ומעכבים סלקטיביים של שחרור דרכים כפקדים נוספים. כמו ההפצה האזורית של המונומינים והמשגרים שלהם הם שלושה אירועים עצמאיים, ניסויים עתידיים חייבים לשלב פרמקולוגיה נרחבת יותר ומחקר של קורס זמן, שכן תנאי תרופות שונים עשויים לדרוש זמני דגירה קצרים או ארוכים יותר. לדוגמה, בהתבסס על הפצה אזורית או סוג של רקמה בשימוש, ניסויים נוספים עשויים להשתמש חוסמי פרמקולוגיה ספציפיים יותר עבור NET, SERT, או DAT כגון desipramine, פלואוקסטין, ו GBR12909, בהתאמה. יתר על כן, למרות הרקמה נשאר קיימא לאורך כל הניסוי, הנסיין אינו מסוגל לשלול את האפשרות כי פונקציית טרנספורטר מונואמין אולי הושפע במהלך כל התהליך. הציוד הנדרש עבור שיטה זו הוא בעלות נמוכה, עם זאת, יש צורך בגישה ל- HPLC-ECD יקר. מתקני ליבה עשויים להקל על כך, שכן לרבים מהם יש כיום גישה ל-HPLC-ECD לשימוש משותף. למרות מגבלות כאלה, השיטה הנוכחית מספקת הליך בסיסי, אשר עשוי להיות מניפולציה נוספת לחקור שחרור מונואמין.

באופן כללי, שיטה זו מספקת הליך דו-שלבי פשוט, בעל תפוקה גבוהה ובעלות נמוכה כדי להעריך את השחרור בו זמנית של מונומינים מתאי עצב מכרסמים בוגרים באמצעות פרוסות מוח חריפות ex vivo מאזורי מוח שונים. באופן אידיאלי, שיטה זו עשויה להיות משולבת עם פרוטוקולי in vivo, והיא מספקת נתונים ראשוניים ובכך מאפשרת לנסיין להקטין את מספר בעלי החיים הנדרשים במודלים של vivo, כפי שמומלץ ב"שלושה ר '" (החלפה, הפחתה ועידון) של רווחת בעלי החיים. לכן, זה אפשרי ליישם פלטפורמת ex vivo זו להקרנה של מולקולות טיפוליות פוטנציאליות במטרה לגלות סוכנים פרמקולוגיים חדשניים לטיפול בתנאים הקשורים להסרת פיקוח בהומאוסטזיס מונואמין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין גילויים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים קרן ייזום Fondecyt N 11191049 J.A.P. ו NIH מענק DA038598 ל- G.E.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48 Well plate NA NA Assay
Acetonitrile Fischer Scientific A998-1 Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous Sigma Aldrich C1016 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software Anetc
Citric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
D-(+)-Glucose Sigma 1002608421 Dissection Buffer
DMF Sigma Aldrich D4551 MTT Assay
EDTA-Na2 Sigma Aldrich Mobile Phase
GraphPad Software Graphpad Software, Inc Statistical Analysis
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Lysis buffer
HEPES Sigma Aldrich H3375 Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric Anetc HPLC, LC-EC system
HPLC Amuza HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid Sigma Aldrich A5960 Dissection Buffer
Magnesium Sulfate Sigma 7487-88-9 KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree Millipore C7554 Assay - 6 to fit in 48 well plate
MTT Thermo Fisher M6494 MTT Assay
Nanosep VWR 29300-606 Assay; protein assay
Octanesulfonic acid Sigma Aldrich V800010 Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate Sigma Aldrich P8013 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
Potassium Chloride Sigma 12636 KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic Sigma 1001655559 KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z Precissonary Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich P2714 Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761 Dissection Buffer
Sodium Chloride Sigma S3014 KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma Aldrich L3771 Lysis buffer
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787 MTT Assay / Lysis buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jesulola, E., Micalos, P., Baguley, I. J. Understanding the pathophysiology of depression: From monoamines to the neurogenesis hypothesis model - are we there yet. Behavioural Brain Research. 341, 79-90 (2018).
  2. Krystal, J. H., D'Souza, D. C., Sanacora, G., Goddard, A. W., Charney, D. S. Current perspectives on the pathophysiology of schizophrenia, depression, and anxiety disorders. Medical Clinics of North America. 85 (3), 559-577 (2001).
  3. Barone, P. Neurotransmission in Parkinson's disease: beyond dopamine. European Journal of Neurology. 17 (3), 364-376 (2010).
  4. Howell, L. L., Kimmel, H. L. Monoamine transporters and psychostimulant addiction. Biochemical Pharmacology. 75 (1), 196-217 (2008).
  5. Kirshner, Z. Z., et al. Impact of estrogen receptor agonists and model of menopause on enzymes involved in brain metabolism, acetyl-CoA production and cholinergic function. Life Sciences. 256, 117975 (2020).
  6. Long, T., et al. Comparison of transitional vs surgical menopause on monoamine and amino acid levels in the rat brain. Molecular and Cellular Endocrinology. 476, 139-147 (2018).
  7. Long, T., et al. Estradiol and selective estrogen receptor agonists differentially affect brain monoamines and amino acids levels in transitional and surgical menopausal rat models. Molecular and Cellular Endocrinology. 496, 110533 (2019).
  8. Burke, N. N., et al. Enhanced nociceptive responding in two rat models of depression is associated with alterations in monoamine levels in discrete brain regions. Neuroscience. 171 (4), 1300-1313 (2010).
  9. Lane, J. D., Aprison, M. H. Calciumm-dependent release of endogenous serotonin, dopamine and norepinephrine from nerve endings. Life Sciences. 20 (4), 665-671 (1977).
  10. Ramamoorthy, S., Shippenberg, T. S., Jayanthi, L. D. Regulation of monoamine transporters: Role of transporter phosphorylation. Pharmacology and Therapeutics. 129 (2), 220-238 (2011).
  11. Torres, G. E., Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Plasma membrane monoamine transporters: structure, regulation and function. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (1), 13-25 (2003).
  12. Hilber, B., et al. Serotonin-transporter mediated efflux: A pharmacological analysis of amphetamines and non-amphetamines. Neuropharmacology. 49 (6), 811-819 (2005).
  13. Mauna, J. C., et al. G protein βγ subunits play a critical role in the actions of amphetamine. Translational Psychiatry. 9 (1), 81 (2019).
  14. Sitte, H. H., Freissmuth, M. Amphetamines, new psychoactive drugs and the monoamine transporter cycle. Trends in Pharmacological Sciences. 36 (1), 41-50 (2015).
  15. Johnson, L. A., Guptaroy, B., Lund, D., Shamban, S., Gnegy, M. E. Regulation of amphetamine-stimulated dopamine efflux by protein kinase C β. Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 10914-10919 (2005).
  16. Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3495-3500 (2005).
  17. Kantor, L., Hewlett, G. H. K., Gnegy, M. E. Enhanced amphetamine- and K+ -mediated dopamine release in rat striatum after repeated amphetamine: differential requirements for Ca 2+ - and calmodulin-dependent phosphorylation and synaptic vesicles. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 3801-3808 (2018).
  18. Brodnik, Z. D., et al. Susceptibility to traumatic stress sensitizes the dopaminergic response to cocaine and increases motivation for cocaine. Neuropharmacology. 125, 295-307 (2017).
  19. Henke, A., et al. Toward serotonin fluorescent false neurotransmitters: development of fluorescent dual serotonin and vesicular monoamine transporter substrates for visualizing serotonin neurons. ACS Chemical Neuroscience. 9 (5), 925-934 (2018).
  20. Garcia-Olivares, J., et al. Gβγ subunit activation promotes dopamine efflux through the dopamine transporter. Molecular Psychiatry. 22 (12), 1673-1679 (2017).
  21. Xiao, N., Privman, E., Venton, B. J. Optogenetic control of serotonin and dopamine release in Drosophila larvae. ACS Chemical Neuroscience. 5 (8), 666-673 (2014).
  22. Bass, C. E., et al. Optogenetic control of striatal dopamine release in rats. Journal of Neurochemistry. 114 (5), 1344-1352 (2010).
  23. Stamford, J. A. Fast cyclic voltammetry: measuring transmitter release in "real time". Journal of Neuroscience Methods. 34 (1-3), 67-72 (1990).
  24. Brodnik, Z. D., Ferris, M. J., Jones, S. R., España, R. A. Reinforcing doses of intravenous cocaine produce only modest dopamine uptake inhibition. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 281-289 (2017).
  25. Brodnik, Z. D., España, R. A. Dopamine uptake dynamics are preserved under isoflurane anesthesia. Neuroscience Letters. 606, 129-134 (2015).
  26. Ferris, M. J., Calipari, E. S., Yorgason, J. T., Jones, S. R. Examining the complex regulation and drug-induced plasticity of dopamine release and uptake using voltammetry in brain slices. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 693-703 (2013).
  27. Siciliano, C. A., Calipari, E. S., Ferris, M. J., Jones, S. R. Biphasic mechanisms of amphetamine action at the dopamine terminal. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (16), 5575-5582 (2014).
  28. Rice, M. E., et al. Direct monitoring of dopamine and 5-HT release in substantia nigra and ventral tegmental area in vitro. Experimental Brain Research. 100 (3), 395-406 (1994).
  29. Bunin, M. A., Prioleau, C., Mailman, R. B., Wightman, R. M. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1077-1087 (1998).
  30. Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
  31. Park, J., Bhimani, R. V., Bass, C. E. In vivo electrochemical measurements of norepinephrine in the brain: current status and remaining challenges. Journal of the Electrochemical Society. 165 (12), 3051-3056 (2018).
  32. Butcher, S. P., Fairbrother, I. S., Kelly, J. S., Arbuthnott, G. W. Amphetamine-induced dopamine release in the rat striatum: an in vivo microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 50 (2), 346-355 (1988).
  33. Garcia-Olivares, J., et al. Inhibition of dopamine transporter activity by G protein βγ subunits. PLoS One. 8 (3), 1-9 (2013).
  34. Carneiro, A. M. D., Blakely, R. D. Serotonin-, protein kinase C-, and Hic-5-associated redistribution of the platelet serotonin transporter. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24769-24780 (2006).
  35. Rajamanickam, J., et al. Akt-mediated regulation of antidepressant-sensitive serotonin transporter function, cell-surface expression and phosphorylation. The Biochemical Journal. 468 (1), 177-190 (2015).
  36. Egaña, L. A., et al. Physical and functional interaction between the dopamine transporter and the synaptic vesicle protein synaptogyrin-3. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (14), 4592-4604 (2009).
  37. Guptaroy, B., Fraser, R., Desai, A., Zhang, M., Gnegy, M. E. Site-directed mutations near transmembrane domain 1 alter conformation and function of norepinephrine and dopamine transporters. Molecular Pharmacology. 79 (3), 520-532 (2011).
  38. Ordway, G. A., et al. Norepinephrine transporter function and desipramine: Residual drug effects versus short-term regulation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 217-225 (2005).
  39. Steinkellner, T., et al. Amphetamine action at the cocaine- and antidepressant-sensitive serotonin transporter is modulated by CaMKII. Journal of Neuroscience. 35 (21), 8258-8271 (2015).
  40. Guptaroy, B., et al. A juxtamembrane mutation in the N terminus of the dopamine transporter induces preference for an inward-facing conformation. Molecular Pharmacology. 75 (3), 514-524 (2009).
  41. Carpenter, C., et al. Direct and systemic administration of a CNS-permeant tamoxifen analog reduces amphetamine-induced dopamine release and reinforcing effects. Neuropsychopharmacology. 42 (10), 1940-1949 (2017).
  42. Aquino-Miranda, G., Escamilla-Sánchez, J., González-Pantoja, R., Bueno-Nava, A., Arias-Montaño, J. -A. Histamine H3 receptor activation inhibits dopamine synthesis but not release or uptake in rat nucleus accumbens. Neuropharmacology. 106, 91-101 (2016).
  43. Reddy, I. A., et al. Glucagon-like peptide 1 receptor activation regulates cocaine actions and dopamine homeostasis in the lateral septum by decreasing arachidonic acid levels. Translational Psychiatry. 6 (5), 809 (2016).
  44. Koutzoumis, D. N., et al. Alterations of the gut microbiota with antibiotics protects dopamine neuron loss and improve motor deficits in a pharmacological rodent model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 325, 113159 (2020).
  45. Herdon, H., Strupish, J., Nahorski, S. R. Differences between the release of radiolabelled and endogenous dopamine from superfused rat brain slices: Effects of depolarizing stimuli, amphetamine and synthesis inhibition. Brain Research. 348 (2), 309-320 (1985).
  46. Thongsaard, W., Kendall, D. A., Bennett, G. W., Marsden, C. A. A simple method for measuring dopamine release from rat brain slices. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 37 (3), 143-148 (1997).
  47. Dorris, D. M., Hauser, C. A., Minnehan, C. E., Meitzen, J. An aerator for brain slice experiments in individual cell culture plate wells. Journal of Neuroscience Methods. 238, 1-10 (2014).
  48. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  49. Papouin, T., Haydon, P. Obtaining acute brain slices. BIO-PROTOCOL. 8 (2), 477-491 (2018).
  50. Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 5-9 (1995).
  51. Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. Journal of Neurochemistry. 13 (12), 1333-1343 (1966).
  52. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4, 4-10 (2014).
  53. Kako, H., Fukumoto, S., Kobayashi, Y., Yokogoshi, H. Effects of direct exposure of green odour components on dopamine release from rat brain striatal slices and PC12 cells. Brain Research Bulletin. 75 (5), 706-712 (2008).
  54. McBride, W. J., Murphy, J. M., Lumeng, L., Li, T. -K. Effects of ethanol on monoamine and amino acid release from cerebral cortical slices of the alcohol-preferring P line of rats. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 10 (2), 205-208 (1986).
  55. Chen, J. C., Turiak, G., Galler, J., Volicer, L. Effect of prenatal malnutrition on release of monoamines from hippocampal slices. Life Sciences. 57 (16), 1467-1475 (1995).
  56. Becker, J. B., Castañeda, E., Robinson, T. E., Beer, M. E. A simple in vitro technique to measure the release of endogenous dopamine and dihydroxyphenylacetic acid from striatal tissue using high performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Neuroscience Methods. 11 (1), 19-28 (1984).
  57. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. London. (2007).
  58. Dailey, J. W., Reith, M. E. A., Steidley, K. R., Milbrandt, J. C., Jobe, P. C. Carbamazepine-induced release of serotonin from rat hippocampus in vitro. Epilepsia. 39 (10), 1054-1063 (1998).
  59. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4, 5309 (2014).
  60. Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice-A model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), (2012).
  61. Rönicke, R., et al. AB mediated diminution of MTT reduction - An artefact of single cell culture. PLoS One. 3 (9), (2008).
  62. Ihalainen, J. A., Riekkinen, P., Feenstra, M. G. P. Comparison of dopamine and noradrenaline release in mouse prefrontal cortex, striatum and hippocampus using microdialysis. Neuroscience Letters. 277 (2), 71-74 (1999).
  63. Richards, D. A., Obrenovitch, T. P., Symon, L., Curzon, G. Extracellular dopamine and serotonin in the rat striatum during transient ischaemia of different severities: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 60 (1), 128-136 (1993).
  64. Fog, J. U., et al. Calmodulin kinase II interacts with the dopamine transporter C terminus to regulate amphetamine-induced reverse transport. Neuron. 51 (4), 417-429 (2006).
  65. Balázsa, T., Bíró, J., Gullai, N., Ledent, C., Sperlágh, B. CB1-cannabinoid receptors are involved in the modulation of non-synaptic [3H]serotonin release from the rat hippocampus. Neurochemistry International. 52 (1), 95-102 (2008).
  66. Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 282 (1), 262-270 (1997).
  67. Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Molecular and Cellular Neuroscience. 39 (2), 211-217 (2008).
  68. Bowyer, J. F., et al. Interactions of MK-801 with glutamate-, glutamine- and methamphetamine-evoked release of [3H]dopamine from striatal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 257 (1), 262-270 (1991).
  69. Perszyk, R. E., et al. GluN2D-containing N-methyl-D-aspartate receptors mediate synaptic transmission in hippocampal interneurons and regulate interneuron activity. Molecular Pharmacology. 90 (6), 689-702 (2016).
  70. Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 4029-4034 (1998).
  71. Jedema, H. P., Narendran, R., Bradberry, C. W. Amphetamine-induced release of dopamine in primate prefrontal cortex and striatum: striking differences in magnitude and timecourse. Journal of Neurochemistry. 130, 490-497 (2014).
  72. Buchmayer, F., et al. Amphetamine actions at the serotonin transporter rely on the availability of phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11642-11647 (2013).

Tags

מדעי המוח גיליון 174 שחרור מונואמין פרוסות מוח חריפות מונומינים דופמין נוראדרנלין סרוטונין עצבית
בסיס בסיס צלחת למדידת שחרור מונואמין אנדוגני בפרוסות מוח חריפות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pino, J. A., Awadallah, N., Norris,… More

Pino, J. A., Awadallah, N., Norris, A. M., Torres, G. E. A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (174), e62127, doi:10.3791/62127 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter