Summary
Denne metoden introduserer en enkel teknikk for påvisning av endogen monoaminfrigjøring ved hjelp av akutte hjerneskiver. Oppsettet bruker en 48-brønns plate som inneholder en vevsholder for monoaminfrigjøring. Frigjort monoamin analyseres av HPLC kombinert med elektrokjemisk deteksjon. I tillegg gir denne teknikken en screeningmetode for narkotikaoppdagelse.
Abstract
Monoamin nevrotransmittere er forbundet med mange nevrologiske og psykiatriske plager. Dyremodeller av slike forhold har vist endringer i monoamin nevrotransmitter frigjøring og opptaksdynamikk. Teknisk komplekse metoder som elektrofysiologi, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), avbildning, in vivo mikrodialyse, optogenetikk eller bruk av radioaktivitet er nødvendig for å studere monoaminfunksjon. Metoden som presenteres her er en optimalisert to-trinns tilnærming for å oppdage monoaminfrigjøring i akutte hjerneskiver ved hjelp av en 48-brønns plate som inneholder vevsholdere for å undersøke monoaminfrigjøring, og høyytelses væskekromatografi kombinert med elektrokjemisk deteksjon (HPLC-ECD) for monoaminfrigjøringsmåling. Kort sagt ble rottehjerneseseksjoner som inneholder interesseregioner, inkludert prefrontal cortex, hippocampus og dorsal striatum oppnådd ved hjelp av en vevsskive eller vibratom. Disse interesseområdene ble dissekert fra hele hjernen og inkubert i en oksygenert fysiologisk buffer. Levedyktighet ble undersøkt gjennom hele det eksperimentelle tidsforløpet, med 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse. De akutt dissekerte hjerneregionene ble inkubert under varierende narkotikatilstander som er kjent for å indusere monoaminfrigjøring gjennom transportøren (amfetamin) eller gjennom aktivering av eksocytotisk vesikulær frigjøring (KCl). Etter inkubasjon ble de utgitte produktene i supernatanten samlet og analysert gjennom et HPLC-ECD-system. Her oppdages basal monoaminfrigjøring av HPLC fra akutte hjerneskiver. Disse dataene støtter tidligere in vivo- og in vitro-resultater som viser at AMPH og KCl induserer monoaminfrigjøring. Denne metoden er spesielt nyttig for å studere mekanismer forbundet med monoamintransportøravhengig frigjøring og gir en mulighet til å screene forbindelser som påvirker monoaminfrigjøring på en rask og rimelig måte.
Introduction
En mengde nevrologiske og psykiatriske sykdommer er forbundet med dysregulering eller utilstrekkelig vedlikehold av monoamin nevrotransmitter (dopamin [DA], serotonin [5-HT], noradrenalin [NE]) homeostase1,2,3. Disse forholdene inkluderer, men er ikke begrenset til, depresjon1,2, schizofreni2, angst2, avhengighet4, overgangsalder5,6,7, smerte8 og Parkinsons sykdom3. For eksempel har flere rottemodeller av overgangsalderen vist at dysregulering eller reduksjon av monoaminer i hippocampus, prefrontal cortex og striatum kan være forbundet med både depresjon og kognitiv nedgang, som ses hos kvinner som opplever overgangsalderen. Dysreguleringen av monoaminer i disse modellene har blitt grundig undersøkt ved hjelp av HPLC-ECD, selv om studiene ikke diskriminerte mellom målt nevrotransmitterinnhold kontra nevrotransmitterutløsning5,6,7. Monoaminer slippes klassisk ut i det ekstracellulære rommet gjennom Ca2 +-avhengig vesikulær frigjøring9, og resirkuleres tilbake gjennom deres respektive plasmamembranreopptakssystem (dopamintransportør, DAT; serotonintransportør, SERT; noradrenalintransportør, NET)10,11. På den annen side tyder data på at disse transportørene er i stand til å frigjøre eller efluksmonaminer, siden rusmidler som amfetamin (AMPH) og 3,4-Metylendioxymethamfetamin (MDMA) er kjent for å frigjøre HENHOLDSVIS DA og 5-HT gjennom sine transportørsystemer12,13,14,15,16,17 . Dermed er en riktig mekanistisk forståelse av monoaminfrigjøringsdynamikk avgjørende for å utvikle spesifikke og målrettede farmakoterapier.
Et bredt spekter av teknikker har blitt brukt til å studere monoaminutgivelse som Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV)18, in vivo microdialysis13, imaging19, preincubation med radiomerket monoaminer20, optogenetikk og mer nylig genetisk kodede fluorescerende sensorer og fotometri21,22 . FSCV og in vivo mikrodialyse er de primære teknikkene som brukes for å studere monoaminfrigjøring. FSCV brukes til å studere den stimulerte eksocytotiske frigjøringen av, først og fremst, DA i akutte hjerneskiver og in vivo23. Fordi FSCV bruker elektroder for å stimulere eller fremkalle frigjøring, er den primære kilden til nevrotransmitterutløsning Ca2 +-avhengig vesikulær frigjøring18,24,25,26,27,28,29,30,31 . In vivo mikrodialyse kombinert med HPLC måler endringer i ekstracellulære nevrotransmitternivåer ved hjelp av en sonde plassert i et hjerneområde av interesse13,32. I likhet med FSCV er en stor begrensning for in vivo-mikrodialyse vanskeligheten med å bestemme kilden til nevrotransmitterfrigjøring: Ca2 + avhengig vesicular release eller transportøravhengig. Bemerkelsesverdig tillater begge metodene direkte måling av monoaminfrigjøring. Gjennom den nylige utviklingen av optogenetikk viser forskning deteksjon av 5-HT og DA-utgivelse på kort tid med utsøkt celletypespesifisitet21,22. Disse strategiene krever imidlertid komplekse og kostbare teknikker og utstyr, og måler indirekte monoaminfrigjøring, spesielt gjennom monoaminbinding til reseptorer. Videre brukes radiomerkede monoaminer også til å studere monoamindynamikk. Radiomerkede monoaminer kan forhåndslastes i ulike modellsystemer som heterologe celler som overekspresserer hver monoamintransportør20,33,34,35,36,37,38,39,40, primære nevroner20, synaptosomer33,39,41, 42, og akutte hjerneskiver43,44. Imidlertid utgjør radioaktivitet potensiell skade på eksperimentet, og de tritium-merkede analyttene kan ikke trofast rekapitulere endogen monoamindynamikk45,46. Superfusjonssystemer kombinert med off-line deteksjonsmetoder som HPLC-ECD har tillatt påvisning av monoaminer fra flere vevskilder. Her gir denne protokollen som en optimalisert og rimelig, enkel og presis metode ved hjelp av akutte hjerneskiver for å direkte måle endogen basal og stimulert monoaminfrigjøring.
Akutte hjerneskiver gjør det mulig å teste mekanistiske hypoteser, først og fremst når de bevarer in vivo anatomisk mikromiljø, og opprettholder intakte synapser47,48,49,50,51,52. I noen få studier har akutte hjerneskiver eller hakket hjernevev blitt brukt i forbindelse med en superfusjonsteknikk ved hjelp av KCl for å stimulere Ca2 + mediert release53,54,55,56. Superfusjonssystemer har vært avgjørende for å fremme feltets forståelse av nevrotransmitterutløsningsmekanismer, inkludert monoaminer. Imidlertid er disse systemene relativt dyre, og antall kamre tilgjengelig for vevsanalyse varierer fra 4-12. Til sammenligning er metoden som presenteres her billig, tillater måling av 48 vevsprøver, og kan raffineres til å bruke opptil 96 vevsprøver. Hver brønn i 48-brønnsplaten inneholder vevsholdere som bruker filtre for å skille det frigjorte produktet fra vevet, og frigjorte monoaminer samles deretter inn og analyseres av HPLC-ECD. Viktigst, denne metoden tillater samtidig måling av 5-HT, DA og NE-frigjøring fra forskjellige hjerneområder som prefrontal cortex, hippocampus og dorsal striatum etter behandling med farmakologiske midler som modulerer monoaminfrigjøring. Dermed kan eksperimentet svare på flere spørsmål ved hjelp av et billig multi-brønnsystem som øker antall prøver som er testet og dermed reduserer antall dyr som brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter, inkludert dyrehåndtering og vevsinnsamling, ble utført i samsvar med University of Florida og City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), etter den godkjente protokollen 201508873 (UF) og 1071 (CCNY). For reagenser og buffer, se tilleggsfilen.
1. Forbered akutte rottehjerneskiver
MERK: I dette eksperimentet ble voksne hannrotter (250-350 g) brukt. Dette oppsettet er imidlertid funksjonelt for forskjellige utviklingspunkter, kvinnelige rotter og andre arter. Hvis du bruker et mindre dyr, for eksempel mus, kan eksperimentet justere seg for å optimalisere protokollen ved å bruke et annet antall hjerneskiver eller slag per tilstand. Disseksjonsbufferen vil bli referert til som Buffer 1. efflux-bufferen vil bli referert til som Buffer 2.
- Forbered buffer 1 som nevnt i tilleggsfilen. Mette Buffer 1 med oksygen ved å boble med 95%/5% (O2/CO2) i 20 min på is. Fjern 50 ml Buffer 1, og slapp av på isen i et lite beger eller en Petri-tallerken. Denne bufferen brukes til å holde den akutt høstede hele hjernen.
- Bedøv en eller to voksne rotter (250-350 g) med 1% -2% isofluran, halshugge dem ved hjelp av giljotin, og fjern raskt hjernen. Plasser umiddelbart hjernen i iskald oksygenert buffer 1 i beholderen fra trinn 1.1.
MERK: Sørg for at isofluran og giljotin brukes på en sikker måte. Åpne isofluran under en avtrekkshette. - Bruk en vibratom eller kompressomi, kutt 300 μm koronal hjerneseksjoner fra hver interesseregion (figur 1). Boblebuffer 1 må være til stede mens det foretas seksjoner. Bruk en spatel i rustfritt stål til å overføre hjerneskiver forsiktig og umiddelbart til en ny Petri-tallerken fylt med iskald oksygenert buffer 1 (figur 2).
- Dissekerer videre hjerneskiver (f.eks. slag, skjærer ut) ved å flytte skivene forsiktig til glasssklier (figur 1G) ved hjelp av rottehjerneatlas57. For eksempel, identifiser dorsal striatum basert på sin mørke, strikkede struktur, og identifiser hippocampus basert på sin nærhet til cortex og unik spiralstruktur. Høyre og venstre halvkule kan separeres for bruk som kontroll og eksperimentelle skiver (figur 2G - H). Her ble dorsal striatum ytterligere dissekert i 2 mm slag (figur 1G).
- Bruk en plastoverføringspipette med spissen avskåret, overfør skiver eller hjernestanser i små beholdere nedsenket i oksygenert iskald Buffer 1 med oksygenboblende. Disse beholderne kan være netting i rustfritt stål, eller små Petri-retter fylt med buffer (figur 1H).
2. Ex-vivo endogen monoaminfrigjøring fra hjerneskiver eller slag
MERK: Apparatet som brukes til dette avsnittet består av en 48-brønnsplate og en vevsholder laget av seks mikrocentrifugefilterenheter uten innfelte filtre koblet til en karbogenlinje (figur 2). For å lage holderen, bruk en solid plaststang (f.eks. fra en celleskraper) og lim mikrosentrifugefilterenhetene superfritt uten innfellingsfiltrene til den. La det tørke i 1-2 dager. Tiden som kreves for det endogene monoaminfrigjøringseksperimentet og konsentrasjonene av amfetamin, fluoksetin og kokain er basert på gjeldende litteratur og tidligere protokoller13,20,58.
-
Aktivering av vev
- Overfør hjernevevet fra trinn 1.1.5 til hver brønn i efflukskammeret og tillat utvinning i 30-50 min ved 37 °C på en skredvarmer i 0,5-1 ml oksygenert buffer 2, med konstant, skånsom boblering (figur 2B1).
- Under denne inkubasjonen fortynner du stoffene til ønsket konsentrasjon for eksperimentet. Alle legemidler må oppløses i buffer 2, og konsentrasjonene er basert på dagens litteratur.
-
Første inkubasjon
- Flytt vevsholderen med hjernevev til brønner som inneholder 500 μL oksygenert buffer 2 og inkuber i 20 min ved 37 °C. Påse at minimal til ingen buffer transporteres over ved å trykke på holderen på kanten av brønnen til det ikke er noen overflødig buffer i holderen.
- I eksperimenter med farmakologiske midler som monoamintransportatorhemmere, inkuber vevsprøvene med legemidlene fortynnet i oksygenert buffer 2 (f.eks. 10 μM fluoksetin, 40 μM kokain; se figur 2B2). Det endelige volumet i hver brønn vil være 500 μL.
-
Andre inkubasjon
- Flytt holderen med vevet til et nytt sett med brønner som inneholder 500 μL total buffer 2 med eller uten ønsket konsentrasjon av hvert legemiddel. Kontroller at det ikke er overflødig buffer igjen. Hver brønn representerer en n = 1 for eksperimentelle forhold. Hver eksperimentell tilstand utføres i triplikat.
- En brønn inkluderer en oksygenert buffer 2, den neste 10-30 μM AMPH, og den endelige brønnen inkluderer 10-30 μM AMPH pluss monoamintransportoratorer. Hvert legemiddel oppløses i oksygenert buffer 2.
- Inkuber vevet i 20 min ved 37 °C med 500 μL av legemiddeltilstanden.
MERK: Ytterligere brønner kan omfatte en oksygenert høy K+ Buffer 2 med eller uten monoamintransportørhemmere. Løs opp hvert legemiddel i den oksygenerte bufferen 2 (500 μL). - Under denne andre inkubasjonen på 20 min, samle løsningen fra brønnene fra den første inkubasjonen i trinn 2.2.1 og overfør til mikrocentrifugerør som inneholder 50 μL 1 N perklorsyre eller fosforsyre (avhengig av type HPLC, sluttkonsentrasjon 0,1 N). Det endelige volumet av prøven vil være 550 μL. Vedlikehold mikrocentrifugerør på is, og merk rørene #1.
- Etter den andre inkubasjonen på 20 min, flytt vevsholderen med hjerneseksjoner eller slag til en tom brønn og vedlikehold platen på is. Overfør supernatanten til mikrocentrifugerør som inneholder 50 μL 1 N perklorsyre eller fosforsyre. Det endelige volumet av prøven vil være 550 μL. Vedlikehold mikrosenterrør på is, og merk rørene #2.
- Tilsett 1 ml iskald buffer 1 til hver brønn som inneholder vev. Samle alt vevet ved hjelp av små pinsett, og overfør til rene mikrocentrifuge rør.
- Opprettholde rør med hjernevev ved -80 °C. Kast buffer 1 ml 1 (figur 2B4).
- Filterløsninger hentet fra hver inkubasjon ved hjelp av mikrosentrifugefilterrør (0,22 μm) ved 2500 x g i 2min. Bruk filtratet til å bestemme monoamininnhold ved hjelp av HPLC med elektrokjemisk deteksjon (figur 2B5).
3. Vev levedyktighet
- MTT-analyse
MERK: En betydelig bekymring for dette eksperimentelle oppsettet er vev levedyktighet, da vevet kan brukes i opptil flere timer59. En MTT-analyse60,61 brukes til å bestemme vev levedyktighet ved slutten av eksperimenteringen. Denne analysen er basert på konvertering av det gule tetrazoliumsaltet MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) til lilla formazankrystaller av levedyktige celler med tilstrekkelig metabolisme.- Post eksperiment opprettholder en egen gruppe vevsprøver og deler dem i to grupper.
- Inkuber en gruppe i 20 min ved 37 °C i Triton X-100 (1 %) oppløst i buffer 2 som kontroll. Triton X-100 behandling resulterer i celledød. Oppretthold den andre gruppen i Buffer 2, og ikke inkuber i Triton X-100 (vevs levedyktighetskontroll).
- Tilsett MTT (lageroppløsning 5 mg/ml i PBS, pH 7,4) i begge gruppene i den oksygenerte bufferen 2 i en endelig konsentrasjon på 0,5 mg/ml.
- Inkuber vevsprøvene i 20 min ved 37 °C, vask med PBS og overfør til mikrocentrifugerør som inneholder 250 μL av en blanding av SDS (10 %, m/v), DMF (25 %, v/v) og vann for å løse opp formazankrystallene.
- Inkuber prøvene i 24 timer.
- Sentrifuger rørene på 10.000 x g i 10 min og mål absorbansen til supernatanten (200 μL) ved 562 nm og 690 nm ved hjelp av en mikroplateleser. Vev levedyktighet beregnes som følger: (A562-A690)/vevsvekt.
4. HPLC-analyse av monoaminer
- Kvantifisere monoaminfrigjøring fra hver eksperimentelle tilstand ved hjelp av HPLC-ECD i henhold til tidligere protokoller13,44, ved hjelp av en omvendt fasekolonne.
- Klargjør den mobile fasen som kreves for deteksjon. Dette består av 100 mM fosforsyre, 100 mM sitronsyre, 0,1 mM EDTA-Na2, 600 mg/l oktansulfonsyre, 8% v/v acetonitril (endelig pH 6,0). Sammensetningen av den mobile fasen er avhengig av type HPLC og kolonne som brukes.
- Sett potensialet til den elektrokjemiske detektoren (2 mm glassaktig karbonelektrode), til 0,46 V, og sett strømningshastigheten til 0,05 ml/min.
- Last inn 5 μL av hver prøve, inkludert nevrotransmitterstandarder i HPLC for autoinjeksjon og deteksjon. Mengden av hver prøve som legges til, avhenger av hvilken type HPLC som brukes.
- Når HPLC har fullført kjøringen, bruker du den gitte HPLC-analyseprogramvaren til å skaffe og analysere kromatografidataene.
- Analyser monoamininnhold ved hjelp av en standardkurve som består av hvert monoamin (Dopamin: DA, Norepinefrin: NE og Serotonin: 5-HT; Figur 2C). Bruk de resulterende kromatogrammene for å få området under kurven (AUC) basert på produsentens retningslinjer.
5. Forbereder vevslytter for protein kvantifisering
-
Proteinanalyse
- Tilsett iskald lysisbuffer pluss proteasehemmere (0,1 g/1 ml) i hvert mikrosenterrør som inneholder hjerneseksjoner/slag og homogeniser ved hjelp av en pestle homogenisator. Mikrosentrifugerørene må opprettholdes på is mens homogeniseres for å forhindre proteinforringelse.
- Inkuber vev homogenater i 1 time ved 4 °C med lysrotasjon.
- Sentrifugevev homogenater ved 16.000 x g i 15 min ved 4 °C og gjenvinne supernatanten.
- Bestem proteinkonsentrasjon i supernatantene, med bovint serumalbumin (BSA) som standard.
- Normaliser monoamininnholdet i hver hjerneprøve til det totale innholdet av protein (μg) målt i 250 μL hjernevev lysed. Bruk formelen nedenfor til å bestemme nmol monoamin/g-proteinet. df = fortynningsfaktor.
6. Statistisk analyse
- Analyser monoaminfrigjøring (nmol/g) ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Sidaks multippel sammenligningstest for post-hoc-sammenligninger.
- Analyser vevs levedyktighet ved hjelp av en uparret student t-test for uavhengige grupper (kontroll vs. 1% Triton X-100).
- For alle statistiske analyser setter du alfanivået til ≤ 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne teknikken beskriver bruken av hjerneskiver for å måle frigjøring av endogene monoaminer ved hjelp av HPLC med elektrokjemisk deteksjon basert i en 48-brønns plate med en indre vevsholder. Eksperimentelt oppsett er avbildet i figur 1 og figur 2. I utgangspunktet, for å sikre vev levedyktighet ved slutten av eksperimenteringen, ble en MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, en tetrazole) analyse utført. Etter funksjonelle eksperimenter er de akutte hjerneskivene metabolsk aktive og holder seg levedyktige sammenlignet med de som inkuberes med 1% Triton X-100, en tilstand av celledød (figur 3).
Akutt, 20 min, behandling av hippocampal og prefrontal cortex hjerne seksjoner med AMPH induserer en betydelig økning i ekstracellulære nivåer av hver monoamin (Figur 4A, B). AMPH (30 μM) økte nivået av ekstracellulær 5-HT fra hippocampal skiver og prefrontal cortex skiver med 220-fold og 64-fold, ekstracellulær NE av 19-fold og 8-fold, og ekstracellular DA med henholdsvis 8-fold og 7-fold, henholdsvis. Lignende eksperimenter ble utført i nærvær av fluoksetin (10 μM), en selektiv serotoninopptakshemmer. Hemming av SERT med fluoksetin forhindrer økningen av ekstracellulær 5-HT indusert av AMPH i både hippocampus og prefrontal cortex. Fluoksetin påvirker derimot ikke effekten av AMPH på ekstracellulær DA eller NE i de samme hjerneområdene, i samsvar med selektiviteten for SERT (figur 4A, B). Alle eksperimentelle forhold ble utført i triplikat.
Frigjøringen av monoaminer fra 2 mm dorsale striatumslag ble deretter målt. Akutt, 20 min, behandling av dorsale striatum slag med AMPH (10 μM) induserer en 35 ganger økning i ekstracellulære nivåer av DA (Figur 4C) over basale nivåer. DA-deteksjon var fokusert i dorsal striatum på grunn av de lavere basale nivåene av 5-HT og NE tidligere rapportert i denne regionen62,63. Dermed induserer AMPH en mindre doseavhengig økning i ekstracellulær 5-HT sammenlignet med ekstracellulære DA-nivåer indusert av AMPH (data ikke vist). Inkubasjon av dorsale striatumslag med kokain (40 μM), en monoamintransporterblokkering, resulterte i en betydelig hemming av AMPH-indusert ekstracellulær DA sammenlignet med slag inkubert utelukkende med AMPH (figur 4C). Disse dataene støtter videre tidligere funn som indikerer at AMPH induserte DA-efflux gjennom DAT16.
Til slutt, for å demonstrere eksocytotisk frigjøring av monoaminer, ble hjerneseksjoner inkubert med KCl (40 mM). Å øke konsentrasjonen av ekstracellulær KCl for å fremkalle membrandepolarisering via inkubasjon med 40 mM KCl er tilstrekkelig til å indusere eksocytotisk frigjøring av monoaminer sammenlignet med kontrollforhold (figur 5). Verken fluoksetin eller kokain blokkerer økningen i de ekstracellulære nivåene av monoaminer forårsaket av KCl-membrandepolarisering.
Figur 1: Akutt rottehjerneskive og seksjoneringspreparat. (A) En rottehjerne plasseres i en hjernematrise. Et overlegent kutt betegner toppen av den optiske chiasmen; det dårligere kuttet er 3 mm bakre av bunnen av hypothalamus. Det ble laget kutt for å fjerne hippocampus og striatum, og for å sikre en horisontal base for å lime prøven til kompresstomet eller vibratomet sikkert før kutting. (BD) Superlim ble spredt rundt bunnen av scenen, hjernene ble limt på, umiddelbart dekket med agarose, og agarose ble størknet ved hjelp av den frosne klemmen i (D). (E-F) En kompresstom ble brukt til å lage 300 μm skiver for rottehjernen, og skiver ble plassert i oksygenert buffer til bruk. (G) Seksjoner ble plassert på en sklie og 2 mm slag av dorsal striatum ble laget. (G) Slag av dorsal striatum (topp), cut-outs av hippocampus (midten), og cut-outs av cortex (bunn) opprettholdes ved 4 °C i oksygenert disseksjon buffer før initiere funksjonelle eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksperimentelt oppsett for efflukseksperiment. (A) Efesekammeret består av en 48-brønns vevskulturplate og et vevsholderbrett koblet til karbogenlinjen. (B) Et diagram som viser eksperimentell design for endogene monoaminutløpsforsøk der vevsaktiveringen (B1), pre-inkubasjon med/uten monoamintransportatorhemmere (B2), effluxeksperiment (B3) og den endelige prøvebehandlingen presenteres (B4-B5). (C) Panelet til venstre viser en eksperimenterer som laster perfusatet inn i HPLC som forberedelse til automatisk injeksjon. Høyre panel viser et representativt kromatogram som betegner monoaminstandardtoppene. Området under kurven (AUC) måles for hver monoaminstandard og hjerneprøver. Etter kalibrering konverteres AUC målt for hver hjerneprøve til nM-konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Akutte hjerneskiver var levedyktige ved slutten av eksperimenteringen. En MTT-analyse ble utført for å bestemme vevs levedyktighet og sammenlignet med Triton X-100 1%, noe som induserer celledød. Resultatet av MTT-analysen viste at vevsprøver ved utgangen av 6 timer fortsatt var levedyktige. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittlig ± SEM (N = 6). P < 0.0001, uparret t test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Amfetamin induserer monoaminutslipp i akutte hjerneskiver fra hippocampus, prefrontal cortex og slag av dorsal striatum. (A-B) Hippocampal og prefrontal cortex skiver inkubert i 30 μM AMPH resulterer i en betydelig økning i 5-HT, DA, og NE utgivelse. Fluoksetin hemmer signifikant 5-HT-frigjøring, men har ingen innvirkning på DA- eller NE-utslipp i disse regionene. (C) 2 mm dorsale striatumslag ble inkubert i kokain (40 μM) eller AMPH (30 μM). AMPH stimulerte DA-frigjøring og forbehandling med kokain førte til en betydelig reduksjon av AMPH-indusert DA-frigjøring. Alle målinger er i nmol/g protein. Statistikk representerer en enveis ANOVA etterfulgt av Sidaks multippel sammenligningstest. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittlig ± SEM (N = 6). Statistikk representerer en enveis ANOVA med Sidaks multippel sammenligningstest (** p = 0,01, *** p = 0,001, **** p = 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Høy ekstracellulær K+ resulterer i monoaminfrigjøring gjennom membrandepolarisering. (A-B) KCl (40 mM) induserer membrandepolarisering og frigjøring av alle tre monoaminer i HPC og PFC. I begge hjerneområdene påvirker forbehandling med fluoksetin (10 μM) ikke effekten av KCl på ekstracellulær monoaminfrigjøring. (C) KCl (40 mM) induserer membrandepolarisering og frigjøring av DA i dorsal striatum, og forbehandling med kokain (40 μM) påvirker ikke effekten av KCl på DA-frigjøring. Statistikk representerer en enveis ANOVA etterfulgt av Sidaks multippel sammenligningstest. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittlig ± SEM (N = 6). Statistikk representerer en enveis ANOVA med Sidaks multisammenligningstest (***p < 0,001, ****p < 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil: Oppskrifter på buffere og løsninger. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Monoaminfrigjøringsmålinger har blitt utført i årevis i en rekke systemer som heterologe celler, nevronkulturer, hjernesynaptosomer, ex vivo akutte hjerneskiver og hele dyr13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 . Slike preparater har gjort det mulig for nevrovitenskap å utforske grunnleggende nevrotransmitterutløsningsmekanismer som kan føre til oppdagelsen av nye farmakologiske midler for nevrologiske og psykiatriske lidelser der monoaminer spiller en rolle. Til tross for den brede bruken av slike metoder, er det visse begrensninger angående kilden og / eller mengden endogen monoaminfrigjøring, spesielt i radioaktive prosedyrer. I tillegg har ex vivo akutte hjerneskivepreparater blitt mye brukt i forbindelse med elektrofysiologiske, farmakologiske, genetiske, molekylære, immunocytokjemiske og andre tilnærminger18,24,25,47,50,51,59,69,70 , da de bevarer vevsarkitekturen, og beholder både nevronaktivitet og synaptiske forbindelser. Dermed gir hjerneskiver eksepsjonelle fordeler sammenlignet med andre in vitro-modeller som heteroologe systemer, primærkulturerte nevroner og synaptosomer. I stor grad er deres fordel at disse systemene kan reprodusere mange aspekter av in vivo-miljøet.
Elektrofysiologiske, optogenetiske, fluorescerende sensorer og voltametriske tilnærminger tilbyr utsøkt tidsmessig og romlig oppløsning for å undersøke mekanismer forbundet med monoaminfrigjøring, spesielt DA. Den grunnleggende forutsetningen for bruk av disse tilnærmingene er imidlertid at den elektriske eller lysinduserte stimuleringen av nevroner induserer den klassiske, og veldokumenterte kalsiumavhengige eksocytotiske vesikulære frigjøringen av nevrotransmittere18,21,22,24,27,30. En av de mer merkbare begrensningene ved disse tilnærmingene er at monoaminer utgitt via alternative mekanismer (dvs. ikke-vesikulær frigjøring) ikke oppdages av disse teknikkene. Radiomerkede nevrotransmittermolekyler har også blitt brukt til å studere monoaminfrigjøring, men denne tilnærmingen har betydelige begrensninger. Celler eller vevsprøver er lastet med ikke-fysiologiske konsentrasjoner av merkede nevrotransmittere som ikke trofast rekapitulerer det opprinnelige miljøet20,42,46. Interessant nok dokumenterer noen få studier bruken av hjerneskiver i superfusjonssystemer for å undersøke endogen monoaminfrigjøring53,54,56. Imidlertid bruker disse studiene radioaktive nevrotransmittere, og de som undersøker den endogene nevrotransmitteren fokuserer bare på K + og ikke-fysiologiske forhold for å indusere nevrotransmitterfrigjøring.
Den nåværende presenterte metoden kan brukes til å undersøke transportermediert monoaminfrigjøring fra innfødt vev. Dette gjør at eksperimentet kan overvinne begrensningene til tritierte nevrotransmittere. I tillegg gir denne tilnærmingen et enkelt oppsett for å måle endogen monoaminutløsning mer nøyaktig gjennom en direkte deteksjon av monoaminer i stedet for den indirekte målingen ved bruk av fluorescerende sensorer eller radiomerket monoamin. Det er veletablert at amfetamin fungerer som et monoamintransporterutløsningsmiddel i prefrontal cortex71, dorsal striatum56,72 og hippocampal39 hjerneregioner. Disse funnene ble bekreftet ved hjelp av dette 48-brønns platesystemet. I tillegg kan denne metoden vise seg å være et supplement til for tiden brukte metoder som måler totalt monoamininnhold ved hjelp av HPLC-ECD, men som ikke har undersøkt monoaminfrigjøring5,6,7. Denne metoden gir en ny luftfilter designet for å måle den endogene frigjøringen av monoaminer fra akutte hjerneskiver ved hjelp av HPLC kombinert med elektrokjemisk deteksjon.
Når du bruker denne metoden, er det viktig at hjernevevet holdes kaldt i oksygenert buffer under eksperimentet for å forhindre forverring. I tillegg er det avgjørende at vevet som brukes aktiveres i en buffer som inneholder pargylin for å forhindre monoaminforringelse. Videre kan det hende at eksperimentet må feilsøke flere aspekter av denne metoden. For det første, avhengig av dyrets utviklingstidspunkt eller art, kan det hende man må opprette mindre eller større seksjoner eller bruke mer eller mindre seksjoner, skiver eller slag per tilstand. For det andre, avhengig av hjerneregionen av interesse, vil det være varierende mengder av hver nevrotransmitter. For det tredje, mens det er viktig å sikre konsekvent boblende oksygen når det er notert, må eksperimentatoren være forsiktig med å ikke gi overflødig oksygenering, da dette kan føre til utilsiktet fjerning av vev fra brønnen. Til slutt, da det finnes forskjellige typer HPLC-enheter og forskjellige separasjonskolonner, må eksperimentet bestemme, basert på litteraturen, hvilken enhet eller kolonne som vil fungere best for eksperimentet.
Selv om denne metoden gir eksperimentet muligheten til raskt og presist å skaffe ex-vivo-data om frigjøring av endogene monoaminer, er det begrensninger som må huskes. Siden dette er en ex vivo-tilnærming, blir nettverk og tilkoblinger kuttet, og dermed er skiver eller slag ikke representative for et intakt system. En annen viktig begrensning i denne tilnærmingen er mangelen på tidsmessig, og romlig oppløsning som monoaminfrigjøring måles i en tidsskala av minutter, og fra en befolkning av utgivelsessteder. Fremtidig forbedring av tilnærmingen kan tillate optimalisering av tids- og romoppløsning. Ytterligere eksperimenter vil også undersøke mekanismene knyttet til utgivelseshendelser. Etter å ha demonstrert gyldigheten av den nåværende metoden, vil fremtidige eksperimenter kreve å dissekere de molekylære hendelsene som fører til monoaminfrigjøring. Ytterligere eksperimenter vil inkludere Ca2 +-fri effluxbuffer, og selektive hemmere av vesikulær frigjøring som tilleggskontroller. Siden den regionale fordelingen av monoaminer og deres transportører er tre uavhengige hendelser, må fremtidige eksperimenter inneholde mer omfattende farmakologi og en tidskursstudie, da ulike narkotikaforhold kan kreve kortere eller lengre inkubasjonstider. Basert på regional distribusjon eller type vev som brukes, kan for eksempel ytterligere eksperimenter bruke mer spesifikke farmakologiske blokkere for henholdsvis NET, SERT eller DAT, for eksempel desipramin, fluoksetin og GBR12909. Videre, selv om vevet forble levedyktig gjennom hele eksperimentet, er eksperimentet ikke i stand til å utelukke muligheten for at monoamintransporterfunksjon kan ha blitt påvirket i løpet av hele prosessen. Utstyret som kreves for denne metoden er rimelig, men det er behov for å ha tilgang til en dyr HPLC-ECD. Dette kan reduseres av kjernefasiliteter, da mange for tiden har tilgang til HPLC-ECDer for felles bruk. Til tross for slike begrensninger gir den nåværende metoden en grunnleggende prosedyre, som kan manipuleres ytterligere for å undersøke monoaminfrigjøring.
Generelt gir denne metoden en enkel, høy gjennomstrømning og rimelig to-trinns prosedyre for å evaluere samtidig frigjøring av monoaminer fra voksne gnagerevroner ved hjelp av ex vivo akutte hjerneskiver fra forskjellige hjerneregioner. Ideelt sett kan denne metoden kombineres med in vivo-protokoller, og den gir foreløpige data slik at eksperimentet kan redusere antall dyr som kreves i in vivo-modeller, som anbefalt i "tre Rs" (Erstatning, reduksjon og raffinement) av dyrevelferd. Dermed er det mulig å implementere denne ex vivo-plattformen for screening av potensielt terapeutiske molekyler med sikte på å oppdage nye farmakologiske midler for behandling av forhold forbundet med dereguleringer i monoamin homeostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd Fondecyt Initiation Fund N 11191049 til J.A.P. og NIH grant DA038598 til G.E.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 Well plate | NA | NA | Assay |
| Acetonitrile | Fischer Scientific | A998-1 | Mobile Phase |
| Calcium Chloride Ahydrous | Sigma Aldrich | C1016 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Clarity Software | Anetc | ||
| Citric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 1002608421 | Dissection Buffer |
| DMF | Sigma Aldrich | D4551 | MTT Assay |
| EDTA-Na2 | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| GraphPad Software | Graphpad Software, Inc | Statistical Analysis | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Lysis buffer |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Lysis buffer |
| HPLC, Decade Amperometric | Anetc | HPLC, LC-EC system | |
| HPLC | Amuza | HPLC HTEC-510. | |
| L-Asrobic Acid | Sigma Aldrich | A5960 | Dissection Buffer |
| Magnesium Sulfate | Sigma | 7487-88-9 | KH Buffer |
| Microcentrifuge Filter Units UltraFree | Millipore | C7554 | Assay - 6 to fit in 48 well plate |
| MTT | Thermo Fisher | M6494 | MTT Assay |
| Nanosep | VWR | 29300-606 | Assay; protein assay |
| Octanesulfonic acid | Sigma Aldrich | V800010 | Mobile Phase |
| Pargyline Clorohydrate | Sigma Aldrich | P8013 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Phosphoric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| Potassium Chloride | Sigma | 12636 | KH Buffer |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | 1001655559 | KH Buffer |
| Precisonary VF-21-0Z | Precissonary | Compresstome | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P2714 | Lysis buffer. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | KH Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | Lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | MTT Assay / Lysis buffer |
References
- Jesulola, E., Micalos, P., Baguley, I. J. Understanding the pathophysiology of depression: From monoamines to the neurogenesis hypothesis model - are we there yet. Behavioural Brain Research. 341, 79-90 (2018).
- Krystal, J. H., D'Souza, D. C., Sanacora, G., Goddard, A. W., Charney, D. S. Current perspectives on the pathophysiology of schizophrenia, depression, and anxiety disorders. Medical Clinics of North America. 85 (3), 559-577 (2001).
- Barone, P. Neurotransmission in Parkinson's disease: beyond dopamine. European Journal of Neurology. 17 (3), 364-376 (2010).
- Howell, L. L., Kimmel, H. L. Monoamine transporters and psychostimulant addiction. Biochemical Pharmacology. 75 (1), 196-217 (2008).
- Kirshner, Z. Z., et al. Impact of estrogen receptor agonists and model of menopause on enzymes involved in brain metabolism, acetyl-CoA production and cholinergic function. Life Sciences. 256, 117975 (2020).
- Long, T., et al. Comparison of transitional vs surgical menopause on monoamine and amino acid levels in the rat brain. Molecular and Cellular Endocrinology. 476, 139-147 (2018).
- Long, T., et al. Estradiol and selective estrogen receptor agonists differentially affect brain monoamines and amino acids levels in transitional and surgical menopausal rat models. Molecular and Cellular Endocrinology. 496, 110533 (2019).
- Burke, N. N., et al. Enhanced nociceptive responding in two rat models of depression is associated with alterations in monoamine levels in discrete brain regions. Neuroscience. 171 (4), 1300-1313 (2010).
- Lane, J. D., Aprison, M. H. Calciumm-dependent release of endogenous serotonin, dopamine and norepinephrine from nerve endings. Life Sciences. 20 (4), 665-671 (1977).
- Ramamoorthy, S., Shippenberg, T. S., Jayanthi, L. D. Regulation of monoamine transporters: Role of transporter phosphorylation. Pharmacology and Therapeutics. 129 (2), 220-238 (2011).
- Torres, G. E., Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Plasma membrane monoamine transporters: structure, regulation and function. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (1), 13-25 (2003).
- Hilber, B., et al. Serotonin-transporter mediated efflux: A pharmacological analysis of amphetamines and non-amphetamines. Neuropharmacology. 49 (6), 811-819 (2005).
- Mauna, J. C., et al. G protein βγ subunits play a critical role in the actions of amphetamine. Translational Psychiatry. 9 (1), 81 (2019).
- Sitte, H. H., Freissmuth, M. Amphetamines, new psychoactive drugs and the monoamine transporter cycle. Trends in Pharmacological Sciences. 36 (1), 41-50 (2015).
- Johnson, L. A., Guptaroy, B., Lund, D., Shamban, S., Gnegy, M. E. Regulation of amphetamine-stimulated dopamine efflux by protein kinase C β. Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 10914-10919 (2005).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3495-3500 (2005).
- Kantor, L., Hewlett, G. H. K., Gnegy, M. E. Enhanced amphetamine- and K+ -mediated dopamine release in rat striatum after repeated amphetamine: differential requirements for Ca 2+ - and calmodulin-dependent phosphorylation and synaptic vesicles. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 3801-3808 (2018).
- Brodnik, Z. D., et al. Susceptibility to traumatic stress sensitizes the dopaminergic response to cocaine and increases motivation for cocaine. Neuropharmacology. 125, 295-307 (2017).
- Henke, A., et al. Toward serotonin fluorescent false neurotransmitters: development of fluorescent dual serotonin and vesicular monoamine transporter substrates for visualizing serotonin neurons. ACS Chemical Neuroscience. 9 (5), 925-934 (2018).
- Garcia-Olivares, J., et al. Gβγ subunit activation promotes dopamine efflux through the dopamine transporter. Molecular Psychiatry. 22 (12), 1673-1679 (2017).
- Xiao, N., Privman, E., Venton, B. J. Optogenetic control of serotonin and dopamine release in Drosophila larvae. ACS Chemical Neuroscience. 5 (8), 666-673 (2014).
- Bass, C. E., et al. Optogenetic control of striatal dopamine release in rats. Journal of Neurochemistry. 114 (5), 1344-1352 (2010).
- Stamford, J. A. Fast cyclic voltammetry: measuring transmitter release in "real time". Journal of Neuroscience Methods. 34 (1-3), 67-72 (1990).
- Brodnik, Z. D., Ferris, M. J., Jones, S. R., España, R. A. Reinforcing doses of intravenous cocaine produce only modest dopamine uptake inhibition. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 281-289 (2017).
- Brodnik, Z. D., España, R. A. Dopamine uptake dynamics are preserved under isoflurane anesthesia. Neuroscience Letters. 606, 129-134 (2015).
- Ferris, M. J., Calipari, E. S., Yorgason, J. T., Jones, S. R. Examining the complex regulation and drug-induced plasticity of dopamine release and uptake using voltammetry in brain slices. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 693-703 (2013).
- Siciliano, C. A., Calipari, E. S., Ferris, M. J., Jones, S. R. Biphasic mechanisms of amphetamine action at the dopamine terminal. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (16), 5575-5582 (2014).
- Rice, M. E., et al. Direct monitoring of dopamine and 5-HT release in substantia nigra and ventral tegmental area in vitro. Experimental Brain Research. 100 (3), 395-406 (1994).
- Bunin, M. A., Prioleau, C., Mailman, R. B., Wightman, R. M. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1077-1087 (1998).
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
- Park, J., Bhimani, R. V., Bass, C. E. In vivo electrochemical measurements of norepinephrine in the brain: current status and remaining challenges. Journal of the Electrochemical Society. 165 (12), 3051-3056 (2018).
- Butcher, S. P., Fairbrother, I. S., Kelly, J. S., Arbuthnott, G. W. Amphetamine-induced dopamine release in the rat striatum: an in vivo microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 50 (2), 346-355 (1988).
- Garcia-Olivares, J., et al. Inhibition of dopamine transporter activity by G protein βγ subunits. PLoS One. 8 (3), 1-9 (2013).
- Carneiro, A. M. D., Blakely, R. D. Serotonin-, protein kinase C-, and Hic-5-associated redistribution of the platelet serotonin transporter. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24769-24780 (2006).
- Rajamanickam, J., et al. Akt-mediated regulation of antidepressant-sensitive serotonin transporter function, cell-surface expression and phosphorylation. The Biochemical Journal. 468 (1), 177-190 (2015).
- Egaña, L. A., et al. Physical and functional interaction between the dopamine transporter and the synaptic vesicle protein synaptogyrin-3. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (14), 4592-4604 (2009).
- Guptaroy, B., Fraser, R., Desai, A., Zhang, M., Gnegy, M. E. Site-directed mutations near transmembrane domain 1 alter conformation and function of norepinephrine and dopamine transporters. Molecular Pharmacology. 79 (3), 520-532 (2011).
- Ordway, G. A., et al. Norepinephrine transporter function and desipramine: Residual drug effects versus short-term regulation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 217-225 (2005).
- Steinkellner, T., et al. Amphetamine action at the cocaine- and antidepressant-sensitive serotonin transporter is modulated by CaMKII. Journal of Neuroscience. 35 (21), 8258-8271 (2015).
- Guptaroy, B., et al. A juxtamembrane mutation in the N terminus of the dopamine transporter induces preference for an inward-facing conformation. Molecular Pharmacology. 75 (3), 514-524 (2009).
- Carpenter, C., et al. Direct and systemic administration of a CNS-permeant tamoxifen analog reduces amphetamine-induced dopamine release and reinforcing effects. Neuropsychopharmacology. 42 (10), 1940-1949 (2017).
- Aquino-Miranda, G., Escamilla-Sánchez, J., González-Pantoja, R., Bueno-Nava, A., Arias-Montaño, J. -A. Histamine H3 receptor activation inhibits dopamine synthesis but not release or uptake in rat nucleus accumbens. Neuropharmacology. 106, 91-101 (2016).
- Reddy, I. A., et al. Glucagon-like peptide 1 receptor activation regulates cocaine actions and dopamine homeostasis in the lateral septum by decreasing arachidonic acid levels. Translational Psychiatry. 6 (5), 809 (2016).
- Koutzoumis, D. N., et al. Alterations of the gut microbiota with antibiotics protects dopamine neuron loss and improve motor deficits in a pharmacological rodent model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 325, 113159 (2020).
- Herdon, H., Strupish, J., Nahorski, S. R. Differences between the release of radiolabelled and endogenous dopamine from superfused rat brain slices: Effects of depolarizing stimuli, amphetamine and synthesis inhibition. Brain Research. 348 (2), 309-320 (1985).
- Thongsaard, W., Kendall, D. A., Bennett, G. W., Marsden, C. A. A simple method for measuring dopamine release from rat brain slices. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 37 (3), 143-148 (1997).
- Dorris, D. M., Hauser, C. A., Minnehan, C. E., Meitzen, J. An aerator for brain slice experiments in individual cell culture plate wells. Journal of Neuroscience Methods. 238, 1-10 (2014).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Papouin, T., Haydon, P.
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 5-9 (1995).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. Journal of Neurochemistry. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Buskila, Y., et al.
- Kako, H., Fukumoto, S., Kobayashi, Y., Yokogoshi, H. Effects of direct exposure of green odour components on dopamine release from rat brain striatal slices and PC12 cells. Brain Research Bulletin. 75 (5), 706-712 (2008).
- McBride, W. J., Murphy, J. M., Lumeng, L., Li, T. -K. Effects of ethanol on monoamine and amino acid release from cerebral cortical slices of the alcohol-preferring P line of rats. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 10 (2), 205-208 (1986).
- Chen, J. C., Turiak, G., Galler, J., Volicer, L. Effect of prenatal malnutrition on release of monoamines from hippocampal slices. Life Sciences. 57 (16), 1467-1475 (1995).
- Becker, J. B., Castañeda, E., Robinson, T. E., Beer, M. E. A simple in vitro technique to measure the release of endogenous dopamine and dihydroxyphenylacetic acid from striatal tissue using high performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Neuroscience Methods. 11 (1), 19-28 (1984).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. London. (2007).
- Dailey, J. W., Reith, M. E. A., Steidley, K. R., Milbrandt, J. C., Jobe, P. C. Carbamazepine-induced release of serotonin from rat hippocampus in vitro. Epilepsia. 39 (10), 1054-1063 (1998).
- Buskila, Y., et al.
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice-A model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Rönicke, R., et al. AB mediated diminution of MTT reduction - An artefact of single cell culture. PLoS One. 3 (9), (2008).
- Ihalainen, J. A., Riekkinen, P., Feenstra, M. G. P. Comparison of dopamine and noradrenaline release in mouse prefrontal cortex, striatum and hippocampus using microdialysis. Neuroscience Letters. 277 (2), 71-74 (1999).
- Richards, D. A., Obrenovitch, T. P., Symon, L., Curzon, G. Extracellular dopamine and serotonin in the rat striatum during transient ischaemia of different severities: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 60 (1), 128-136 (1993).
- Fog, J. U., et al. Calmodulin kinase II interacts with the dopamine transporter C terminus to regulate amphetamine-induced reverse transport. Neuron. 51 (4), 417-429 (2006).
- Balázsa, T., Bíró, J., Gullai, N., Ledent, C., Sperlágh, B. CB1-cannabinoid receptors are involved in the modulation of non-synaptic [3H]serotonin release from the rat hippocampus. Neurochemistry International. 52 (1), 95-102 (2008).
- Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 282 (1), 262-270 (1997).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Molecular and Cellular Neuroscience. 39 (2), 211-217 (2008).
- Bowyer, J. F., et al. Interactions of MK-801 with glutamate-, glutamine- and methamphetamine-evoked release of [3H]dopamine from striatal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 257 (1), 262-270 (1991).
- Perszyk, R. E., et al. GluN2D-containing N-methyl-D-aspartate receptors mediate synaptic transmission in hippocampal interneurons and regulate interneuron activity. Molecular Pharmacology. 90 (6), 689-702 (2016).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 4029-4034 (1998).
- Jedema, H. P., Narendran, R., Bradberry, C. W. Amphetamine-induced release of dopamine in primate prefrontal cortex and striatum: striking differences in magnitude and timecourse. Journal of Neurochemistry. 130, 490-497 (2014).
- Buchmayer, F., et al. Amphetamine actions at the serotonin transporter rely on the availability of phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11642-11647 (2013).
