Summary
Diese Methode führt eine einfache Technik zum Nachweis der endogenen Monoaminfreisetzung unter Verwendung akuter Hirnschnitte ein. Das Setup verwendet eine 48-Well-Platte, die einen Gewebehalter für die Monoaminfreisetzung enthält. Freigesetztes Monoamin wird mittels HPLC in Verbindung mit elektrochemischem Nachweis analysiert. Darüber hinaus bietet diese Technik eine Screening-Methode für die Arzneimittelentdeckung.
Abstract
Monoamin-Neurotransmitter sind mit zahlreichen neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen verbunden. Tiermodelle solcher Zustände haben Veränderungen in der Freisetzungs- und Aufnahmedynamik von Monoamin-Neurotransmittern gezeigt. Technisch komplexe Methoden wie Elektrophysiologie, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), Bildgebung, In-vivo-Mikrodialyse, Optogenetik oder die Verwendung von Radioaktivität sind erforderlich, um die Monoaminfunktion zu untersuchen. Die hier vorgestellte Methode ist ein optimierter zweistufiger Ansatz zum Nachweis der Monoaminfreisetzung in akuten Hirnschnitten unter Verwendung einer 48-Well-Platte mit Gewebehaltern zur Untersuchung der Monoaminfreisetzung und einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit elektrochemischer Detektion (HPLC-ECD) zur Messung der Monoaminfreisetzung. Kurz gesagt, Rattenhirnschnitte, die Regionen von Interesse enthielten, einschließlich präfrontaler Kortex, Hippocampus und dorsales Striatum, wurden mit einem Gewebeschneider oder Vibratom erhalten. Diese interessanten Regionen wurden aus dem gesamten Gehirn seziert und in einem mit Sauerstoff angereicherten physiologischen Puffer inkubiert. Die Lebensfähigkeit wurde während des gesamten Versuchszeitraums durch 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay untersucht. Die akut sezierten Hirnregionen wurden unter verschiedenen Medikamentenbedingungen inkubiert, von denen bekannt ist, dass sie die Monoaminfreisetzung durch den Transporter (Amphetamin) oder durch die Aktivierung der exozytotischen vesikulären Freisetzung (KCl) induzieren. Nach der Inkubation wurden die freigesetzten Produkte im Überstand gesammelt und durch ein HPLC-ECD-System analysiert. Hier wird die basale Monoaminfreisetzung mittels HPLC aus akuten Hirnschnitten nachgewiesen. Diese Daten unterstützen frühere In-vivo- und In-vitro-Ergebnisse, die zeigen, dass AMPH und KCl die Monoaminfreisetzung induzieren. Diese Methode ist besonders nützlich für die Untersuchung von Mechanismen, die mit einer von Monoamintransportern abhängigen Freisetzung verbunden sind, und bietet die Möglichkeit, Verbindungen, die die Monoaminfreisetzung beeinflussen, schnell und kostengünstig zu screenen.
Introduction
Eine Vielzahl von neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen ist mit einer Dysregulation oder unzureichenden Aufrechterhaltung des Monoamin-Neurotransmitters (Dopamin [DA], Serotonin [5-HT], Noradrenalin [NE]) der Homöostase verbunden1,2,3. Zu diesen Erkrankungen gehören unter anderem Depressionen1,2, Schizophrenie2, Angstzustände2, Sucht4, Menopause5,6,7, Schmerzen8 und Parkinson3. Zum Beispiel haben mehrere Rattenmodelle der Menopause gezeigt, dass die Dysregulation oder Reduktion von Monoaminen im Hippocampus, im präfrontalen Kortex und im Striatum sowohl mit Depressionen als auch mit kognitivem Verfall verbunden sein kann, was bei Frauen in den Wechseljahren beobachtet wird. Die Dysregulation von Monoaminen in diesen Modellen wurde ausführlich mit HPLC-ECD untersucht, obwohl die Studien nicht zwischen dem gemessenen Neurotransmittergehalt und der Freisetzung von Neurotransmittern unterschieden5,6,7. Monoamine werden klassischerweise durch Ca2+-abhängige vesikuläre Freisetzung9 in den extrazellulären Raum freigesetzt und durch ihr jeweiliges Plasmamembran-Wiederaufnahmesystem (Dopamintransporter, DAT; Serotonintransporter, SERT; Noradrenalintransporter, NET) wieder recycelt 10,11. Umgekehrt deuten die Daten darauf hin, dass diese Transporter in der Lage sind, Monoamine freizusetzen oder auszuströmen, da für Missbrauchsdrogen wie Amphetamin (AMPH) und 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA) bekannt ist, dass sie DA bzw. 5-HT über ihre Transportersysteme freisetzen12,13,14,15,16,17 . Daher ist ein richtiges mechanistisches Verständnis der Monoaminfreisetzungsdynamik entscheidend für die Entwicklung spezifischer und zielgerichteter Pharmakotherapien.
Zur Untersuchung der Monoaminfreisetzung wurde eine breite Palette von Techniken eingesetzt, wie z. B. Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV)18, In-vivo-Mikrodialyse13, Bildgebung19, Präinkubation mit radioaktiv markierten Monoaminen20, Optogenetik und in jüngerer Zeit genetisch kodierte Fluoreszenzsensoren und Photometrie21,22 . FSCV und In-vivo-Mikrodialyse sind die primären Techniken zur Untersuchung der Monoaminfreisetzung. FSCV wird verwendet, um die stimulierte exozytotische Freisetzung von hauptsächlich DA in akuten Hirnschnitten und in vivo23 zu untersuchen. Da FSCV Elektroden verwendet, um die Freisetzung zu stimulieren oder hervorzurufen, ist die primäre Quelle der Freisetzung von Neurotransmittern die Ca2 +-abhängige vesikuläre Freisetzung18,24,25,26,27,28,29,30,31 . Die In-vivo-Mikrodialyse in Verbindung mit HPLC misst Veränderungen der extrazellulären Neurotransmitterspiegel mit einer Sonde, die in einem Hirnareal von Interesse platziert wird13,32. Ähnlich wie bei FSCV ist eine wesentliche Einschränkung der In-vivo-Mikrodialyse die Schwierigkeit, die Quelle der Neurotransmitterfreisetzung zu bestimmen: Ca2+-abhängige vesikuläre Freisetzung oder Transporterabhängigkeit. Bemerkenswert ist, dass beide Methoden die direkte Messung der Monoaminfreisetzung ermöglichen. Durch die jüngste Weiterentwicklung der Optogenetik zeigt die Forschung den Nachweis einer 5-HT- und DA-Freisetzung in kurzer Zeit mit exquisiter Zelltypspezifität21,22. Diese Strategien erfordern jedoch komplexe und kostspielige Techniken und Geräte und messen indirekt die Monoaminfreisetzung, insbesondere durch Monoaminbindung an Rezeptoren. Darüber hinaus werden radioaktiv markierte Monoamine auch zur Untersuchung der Monoamindynamik verwendet. Radioaktiv markierte Monoamine können in verschiedene Modellsysteme vorgeladen werden, wie z.B. heterologe Zellen, die jeden Monoamintransporter überexprimieren20,33,34,35,36,37,38,39,40, primäre Neuronen20, Synaptosomen33,39,41, 42 und akute Hirnschnitte43,44. Radioaktivität stellt jedoch einen potenziellen Schaden für den Experimentator dar, und die tritiummarkierten Analyten rekapitulieren möglicherweise nicht getreu die endogene Monoamindynamik45,46. Superfusionssysteme in Kombination mit Offline-Nachweismethoden wie HPLC-ECD haben den Nachweis von Monoaminen aus mehreren Gewebequellen ermöglicht. Hier bietet dieses Protokoll als optimierte und kostengünstige, einfache und präzise Methode unter Verwendung akuter Hirnschnitte, um die endogene basale und stimulierte Monoaminfreisetzung direkt zu messen.
Akute Hirnschnitte ermöglichen das Testen mechanistischer Hypothesen, vor allem, da sie die anatomische In-vivo-Mikroumgebung erhalten und intakte Synapsen beibehalten47,48,49,50,51,52. In einigen Studien wurden akute Hirnschnitte oder gehacktes Hirngewebe in Verbindung mit einer Superfusionstechnik verwendet, bei der KCl zur Stimulierung der Ca2+-vermittelten Freisetzung verwendet wurde53,54,55,56. Superfusionssysteme waren entscheidend, um das Verständnis der Freisetzungsmechanismen von Neurotransmittern, einschließlich Monoaminen, voranzutreiben. Diese Systeme sind jedoch relativ teuer, und die Anzahl der für die Gewebeanalyse verfügbaren Kammern reicht von 4 bis 12. Im Vergleich dazu ist die hier vorgestellte Methode kostengünstig, ermöglicht die Messung von 48 Gewebeproben und kann auf bis zu 96 Gewebeproben verfeinert werden. Jede Vertiefung innerhalb der 48-Well-Platte enthält Gewebehalter, die Filter verwenden, um das freigesetzte Produkt vom Gewebe zu trennen, und freigesetzte Monoamine werden dann gesammelt und durch HPLC-ECD analysiert. Wichtig ist, dass diese Methode die gleichzeitige Messung der 5-HT-, DA- und NE-Freisetzung aus verschiedenen Gehirnbereichen wie dem präfrontalen Kortex, dem Hippocampus und dem dorsalen Striatum nach behandlung mit pharmakologischen Wirkstoffen ermöglicht, die die Monoaminfreisetzung modulieren. So kann der Experimentator mehrere Fragen mit einem kostengünstigen Multi-Well-System beantworten, das die Anzahl der getesteten Proben erhöht und dadurch die Anzahl der verwendeten Tiere reduziert.
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Protocol
Alle Experimente, einschließlich tierexperimenteller Handhabung und Gewebeentnahme, wurden in Übereinstimmung mit der University of Florida und dem City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) nach den genehmigten Protokollen 201508873 (UF) und 1071 (CCNY) durchgeführt. Reagenzien und Puffer entnehmen Sie bitte der Ergänzungsdatei.
1. Bereiten Sie akute Rattenhirnschnitte vor
ANMERKUNG: In diesem Versuch wurden erwachsene männliche Ratten (250-350 g) verwendet. Diese Anordnung ist jedoch für verschiedene Entwicklungspunkte, weibliche Ratten und andere Arten funktionsfähig. Wenn Sie ein kleineres Tier wie Mäuse verwenden, kann der Experimentator das Protokoll optimieren, indem er eine andere Anzahl von Gehirnschnitten oder Schlägen pro Bedingung verwendet. Der Dissektionspuffer wird als Puffer 1 bezeichnet. Efflux-Puffer wird als Puffer 2 bezeichnet.
- Bereiten Sie Puffer 1 wie in der Ergänzungsdatei erwähnt vor. Puffer 1 mit Sauerstoff sättigen, indem Sie mit 95%/5% (O2/CO2) für 20 min auf Eis sprudeln. Entfernen Sie 50 ml Puffer 1 und kühlen Sie auf Eis in einem kleinen Becherglas oder einer Petrischale. Dieser Puffer wird verwendet, um das akut geerntete ganze Gehirn zu halten.
- Betäuben Sie eine oder zwei erwachsene Ratten (250-350 g) mit 1% -2% Isofluran, enthaupten Sie sie mit einer Guillotine und entfernen Sie schnell ihr Gehirn. Legen Sie das Gehirn sofort in eiskalten, mit Sauerstoff angereicherten Puffer 1 in den Behälter aus Schritt 1.1.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Isofluran und Guillotine sicher verwendet werden. Öffnen Sie Isofluran unter einem Abzug. - Schneiden Sie mit einem Vibratom oder Kompresstom 300 μm koronale Hirnschnitte aus jeder Region von Interesse (Abbildung 1). Bubbling Buffer 1 muss vorhanden sein, während Abschnitte erstellt werden. Mit einem Edelstahlspatel vorsichtig und sofort Gehirnscheiben in eine neue Petrischale geben, die mit eiskaltem, sauerstoffhaltigem Puffer 1 gefüllt ist (Abbildung 2).
- Weitere sezieren Sie Gehirnschnitte (z. B. Stempel, ausgeschnitten), indem Sie die Scheiben vorsichtig zu Glasobjektträgern bewegen (Abbildung 1G) mit Hilfe des Rattengehirnatlas57. Identifizieren Sie zum Beispiel das dorsale Striatum basierend auf seiner dunklen, gestreiften Struktur und identifizieren Sie den Hippocampus basierend auf seiner Nähe zum Kortex und seiner einzigartigen Spiralstruktur. Die rechte und linke Hemisphäre können getrennt werden, um sie als Kontroll- und Versuchsscheiben zu verwenden (Abbildungen 2G - H). Hier wurde das dorsale Striatum weiter in 2 mm Stempel zerlegt (Abbildung 1G).
- Mit einer Kunststoff-Transferpipette mit abgeschnittener Spitze werden Scheiben oder Gehirnstempel in kleine Behälter übertragen, die in sauerstoffhaltigen eiskalten Puffer 1 mit sauerstoffsprudelndem Sauerstoff eingetaucht sind. Diese Behälter können aus Edelstahlgewebe oder kleinen Petrischalen bestehen, die mit Puffer gefüllt sind (Abbildung 1H).
2. Ex-vivo endogene Monoaminfreisetzung aus Hirnschnitten oder -schlägen
HINWEIS: Das für diesen Abschnitt verwendete Gerät besteht aus einer 48-Well-Platte und einem Gewebehalter aus sechs Mikrozentrifugenfiltereinheiten, ohne dass die Einschubfilter an eine Carbogen-Linie angeschlossen sind (Abbildung 2). Um den Halter herzustellen, verwenden Sie einen stabilen Kunststoffstab (z. B. aus einem Zellabstreifer) und kleben Sie die Mikrozentrifugenfiltereinheiten ohne die Einschubfilter darauf. Lassen Sie es 1-2 Tage trocknen. Die für das endogene Monoaminfreisetzungsexperiment erforderliche Zeit und die Konzentrationen von Amphetamin, Fluoxetin und Kokain basieren auf der aktuellen Literatur und früheren Protokollen13,20,58.
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Gewebeaktivierung
- Übertragen Sie das Hirngewebe von Schritt 1.1.5 in jede Vertiefung der Austrittskammer und ermöglichen Sie die Erholung für 30-50 min bei 37 ° C auf einem Objektträgerwärmer in 0,5-1 ml sauerstoffreichem Puffer 2 mit konstantem, sanftem Blubbern (Abbildung 2B1).
- Verdünnen Sie während dieser Inkubation die Arzneimittel auf die für das Experiment gewünschte Konzentration. Alle Medikamente müssen in Puffer 2 gelöst werden, und die Konzentrationen basieren auf der aktuellen Literatur.
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Erste Inkubation
- Den Gewebehalter mit Hirngewebe zu Vertiefungen mit 500 μL sauerstoffreichem Puffer 2 bewegen und 20 min bei 37 °C inkubieren. Stellen Sie sicher, dass ein minimaler bis gar kein Puffer transportiert wird, indem Sie auf den Halter am Rand des Bohrlochs klopfen, bis sich kein überschüssiger Puffer mehr im Halter befindet.
- In Experimenten mit pharmakologischen Wirkstoffen wie Monoamintransporter-Inhibitoren werden die Gewebeproben mit den in sauerstoffhaltigem Puffer 2 verdünnten Arzneimitteln (z. B. 10 μM Fluoxetin, 40 μM Kokain; siehe Abbildung 2B2) inkubiert. Das Endvolumen in jeder Vertiefung beträgt 500 μL.
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Zweite Inkubation
- Bewegen Sie den Halter mit dem Gewebe zu einem neuen Satz von Vertiefungen, die 500 μL Gesamtpuffer 2 mit oder ohne die gewünschte Konzentration jedes Arzneimittels enthalten. Stellen Sie sicher, dass kein überschüssiger Puffer übrig bleibt. Jede Vertiefung stellt ein n = 1 für experimentelle Bedingungen dar. Jede Versuchsbedingung wird in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
- Eine Vertiefung enthält einen sauerstoffhaltigen Puffer 2, die nächste 10-30 μM AMPH und die letzte Vertiefung enthält 10-30 μM AMPH plus Monoamintransporterinhibitoren. Jedes Medikament ist in sauerstoffhaltigem Puffer 2 gelöst.
- Inkubieren Sie das Gewebe für 20 min bei 37 ° C mit 500 μL des Arzneimittelzustands.
HINWEIS: Zusätzliche Vertiefungen können einen sauerstoffhaltigen hohen K+ Puffer 2 mit oder ohne die Monoamintransporterinhibitoren enthalten. Lösen Sie jedes Medikament in dem mit Sauerstoff angereicherten Puffer 2 (500 μL) auf. - Während dieser zweiten Inkubation von 20 min wird die Lösung aus den Vertiefungen aus der ersten Inkubation in Schritt 2.2.1 gesammelt und in Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 μL 1 N Perchlorsäure oder Phosphorsäure (abhängig von der Art der HPLC, Endkonzentration 0,1 N) überführt. Das Endvolumen der Probe beträgt 550 μL. Halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und beschriften Sie die Röhrchen Nr. 1.
- Nach der zweiten Inkubation von 20 min den Gewebehalter mit Hirnschnitten oder Schlägen zu einem leeren Brunnen bewegen und die Platte auf Eis halten. Den Überstand in Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 μL 1 N Perchlorsäure oder Phosphorsäure überführen. Das Endvolumen der Probe beträgt 550 μL. Halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und beschriften Sie die Röhrchen Nr. 2.
- Fügen Sie 1 ml eiskalten Puffer 1 zu jedem Vertiefungsgewebe hinzu, das Gewebe enthält. Sammeln Sie das gesamte Gewebe mit einer kleinen Pinzette und übertragen Sie es in saubere Mikrozentrifugenröhrchen.
- Schläuche mit Hirngewebe bei -80 °C halten. Verwerfen Sie die 1 ml Puffer 1 (Abbildung 2B4).
- Filterlösungen, die aus jeder Inkubation unter Verwendung von Mikrozentrifugenfilterröhrchen (0,22 μm) bei 2.500 x g für 2 minuten erhalten werden. Verwenden Sie das Filtrat, um den Monoamingehalt mittels HPLC mit elektrochemischem Nachweis zu bestimmen (Abbildung 2B5).
3. Lebensfähigkeit des Gewebes
- MTT-Assay
HINWEIS: Ein wesentliches Problem in Bezug auf diesen Versuchsaufbau ist die Lebensfähigkeit des Gewebes, da das Gewebe bis zu mehreren Stunden verwendet werden kann59. Ein MTT-Assay60,61 wird verwendet, um die Lebensfähigkeit des Gewebes am Ende des Experiments zu bestimmen. Dieser Assay basiert auf der Umwandlung des gelben Tetrazoliumsalzes MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) in violette Formazankristalle durch lebensfähige Zellen mit ausreichendem Metabolismus.- Halten Sie nach dem Experiment eine separate Gruppe von Gewebeproben aufrecht und teilen Sie sie in zwei Gruppen auf.
- Inkubieren einer Gruppe für 20 min bei 37 °C in Triton X-100 (1%), gelöst in Puffer 2 als Kontrolle. Die Behandlung mit Triton X-100 führt zum Zelltod. Behalten Sie die zweite Gruppe in Puffer 2 bei und inkubieren Sie nicht in Triton X-100 (Gewebelebensfähigkeitskontrolle).
- MTT (Stammlösung 5 mg/ml in PBS, pH 7,4) zu beiden Gruppen im sauerstoffhaltigen Puffer 2 bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml gegeben.
- Die Gewebeproben für 20 min bei 37 °C inkubieren, mit PBS waschen und in Mikrozentrifugenröhrchen mit 250 μL einer Mischung aus SDS (10%, w/v), DMF (25%, v/v) und Wasser überführen, um die Formazankristalle aufzulösen.
- Inkubieren Sie die Proben für 24 h.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 x g für 10 min und messen Sie die Absorption des Überstands (200 μL) bei 562 nm und 690 nm mit einem Mikrotiterplattenleser. Die Lebensfähigkeit des Gewebes wird wie folgt berechnet: (A562-A690) / Gewebegewicht.
4. HPLC-Analyse von Monoaminen
- Quantifizieren Sie die Monoaminfreisetzung aus jeder experimentellen Bedingung unter Verwendung von HPLC-ECD gemäß früheren Protokollen13,44 unter Verwendung einer Umkehrphasensäule.
- Bereiten Sie die für die Erkennung erforderliche mobile Phase vor. Diese besteht aus 100 mM Phosphorsäure, 100 mM Zitronensäure, 0,1 mM EDTA-Na2, 600 mg/L Oktansulfonsäure, 8% v/v Acetonitril (End-pH 6,0). Die Zusammensetzung der mobilen Phase ist abhängig von der Art der HPLC und der verwendeten Säule.
- Stellen Sie das Potential des elektrochemischen Detektors (2 mm glasige Kohlenstoffelektrode) auf 0,46 V und den Durchfluss auf 0,05 ml/min ein.
- Laden Sie 5 μL jeder Probe, einschließlich Neurotransmitterstandards, in die HPLC für die Autoinjektion und den Nachweis. Die Menge jeder zugesetzten Probe hängt von der Art der verwendeten HPLC ab.
- Sobald die HPLC den Lauf abgeschlossen hat, verwenden Sie die angegebene HPLC-Analysesoftware, um die Chromatographendaten zu erfassen und zu analysieren.
- Analysieren Sie den Monoamingehalt anhand einer Standardkurve, die aus jedem Monoamin besteht (Dopamin: DA, Noradrenalin: NE und Serotonin: 5-HT; Abbildung 2C). Verwenden Sie die resultierenden Chromatogramme, um die Fläche unter der Kurve (AUC) basierend auf den Richtlinien des Herstellers zu erhalten.
5. Vorbereitung von Gewebelysaten für die Proteinquantifizierung
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Protein-Assay
- Fügen Sie eisgekühlten Lysepuffer plus Proteaseinhibitoren (0,1 g/1 ml) zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, das Gehirnabschnitte / Stempel enthält, und homogenisieren Sie es mit einem Stößelhomogenisator. Die Mikrozentrifugenröhrchen müssen während der Homogenisierung auf Eis gehalten werden, um den Proteinabbau zu verhindern.
- Inkubationsgewebe homogenisiert für 1 h bei 4 °C mit leichter Rotation.
- Zentrifugengewebe homogenisiert bei 16.000 x g für 15 min bei 4 °C und gewinnt den Überstand zurück.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration in den Überständen mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard.
- Normalisieren Sie den Monoamingehalt in jeder Gehirnprobe auf den Gesamtgehalt an Protein (μg), gemessen in 250 μL des lysierten Hirngewebes. Verwenden Sie die folgende Formel, um das nmol-Monoamin/g-Protein zu bestimmen. df = Verdünnungsfaktor.
6. Statistische Auswertung
- Analysieren Sie die Monoaminfreisetzung (nmol / g) unter Verwendung einer Einweg-ANOVA, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest für Post-hoc-Vergleiche.
- Analysieren Sie die Lebensfähigkeit des Gewebes mit einem t-Test eines ungepaarten Schülers für unabhängige Gruppen (Kontrolle vs. 1% Triton X-100).
- Legen Sie für alle statistischen Analysen den Alpha-Wert auf ≤ 0,05 fest.
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Representative Results
Diese Technik beschreibt die Verwendung von Hirnschnitten zur Messung der Freisetzung von endogenen Monoaminen mittels HPLC mit elektrochemischer Detektion basierend auf einer 48-Well-Platte mit einem internen Gewebehalter. Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes bis zum Ende der Experimente sicherzustellen, wurde zunächst ein MTT-Assay (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, ein Tetrazol) durchgeführt. Nach funktionellen Experimenten sind die akuten Hirnschnitte metabolisch aktiv und bleiben lebensfähig im Vergleich zu denen, die mit 1% Triton X-100, einer Erkrankung des Zelltods, inkubiert werden (Abbildung 3).
Akute, 20 min, Behandlung von Hippocampus- und präfrontalen Kortex-Hirnschnitten mit AMPH induziert einen signifikanten Anstieg der extrazellulären Spiegel jedes Monoamins (Abbildung 4A,B). AMPH (30 μM) erhöhte den Gehalt an extrazellulärem 5-HT aus Hippocampus-Scheiben und präfrontalen Kortex-Scheiben um das 220-fache und 64-fache, extrazelluläre NE um das 19-fache und 8-fache und extrazelluläre DA um das 8- bzw. 7-fache. Ähnliche Experimente wurden in Gegenwart von Fluoxetin (10 μM), einem selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer, durchgeführt. Die Hemmung von SERT mit Fluoxetin verhindert den Anstieg des extrazellulären 5-HT, der durch AMPH sowohl im Hippocampus als auch im präfrontalen Kortex induziert wird. Im Gegensatz dazu beeinflusst Fluoxetin nicht die Wirkung von AMPH auf extrazelluläre DA oder NE in den gleichen Hirnarealen, was mit seiner Selektivität für SERT übereinstimmt (Abbildung 4A,B). Alle Versuchsbedingungen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
Als nächstes wurde die Freisetzung von Monoaminen aus 2 mm dorsalen Striatumstempeln gemessen. Akute, 20 min, Behandlung von dorsalen Striatum-Schlägen mit AMPH (10 μM) induziert eine 35-fache Erhöhung der extrazellulären DA-Spiegel (Abbildung 4C) über die Basalspiegel. Der DA-Nachweis konzentrierte sich auf das dorsale Striatum aufgrund der niedrigeren Basalspiegel von 5-HT und NE, die zuvor in dieser Region berichtet wurden62,63. Somit induziert AMPH einen geringfügigen dosisabhängigen Anstieg des extrazellulären 5-HT im Vergleich zu extrazellulären DA-Spiegeln, die durch AMPH induziert werden (Daten nicht gezeigt). Die Inkubation von dorsalen Striatumstempeln mit Kokain (40 μM), einem Monoamintransporterblocker, führte zu einer signifikanten Hemmung der AMPH-induzierten extrazellulären DA im Vergleich zu Stempeln, die ausschließlich mit AMPH inkubiert wurden (Abbildung 4C). Diese Daten unterstützen auch frühere Ergebnisse, die darauf hindeuten, dass AMPH da-Efflux durch DAT16 induziert hat.
Um die exozytotische Freisetzung von Monoaminen nachzuweisen, wurden schließlich Hirnschnitte mit KCl (40 mM) inkubiert. Die Erhöhung der Konzentration von extrazellulärem KCl zur Heraufbeschwörung der Membrandepolarisation durch Inkubation mit 40 mM KCl reicht aus, um die exozytotische Freisetzung von Monoaminen im Vergleich zu Kontrollbedingungen zu induzieren (Abbildung 5). Weder Fluoxetin noch Kokain blockieren den Anstieg der extrazellulären Monoaminespiegel, der durch KCl-Membrandepolarisation induziert wird.
Abbildung 1: Akute Rattenhirnschnitte und Schnittvorbereitung. (A) Ein Rattengehirn wird in eine Gehirnmatrix eingeordnet. Ein überlegener Schnitt bezeichnet die Oberseite des optischen Chiasmas; der untere Schnitt ist 3 mm hinter der Basis des Hypothalamus. Es wurden Schnitte vorgenommen, um den Hippocampus und das Striatum zu entfernen und eine horizontale Basis zu gewährleisten, um die Probe vor dem Schneiden sicher auf das Kompresstom oder Vibratom zu kleben. (B-D) Sekundenkleber wurde um die Basis der Bühne verteilt, Gehirne wurden aufgeklebt, sofort mit Agarose bedeckt, und die Agarose wurde mit der gefrorenen Klemme in (D) verfestigt. (E-F) Ein Kompresstom wurde verwendet, um 300 μm-Scheiben für das Rattengehirn herzustellen, und die Scheiben wurden bis zur Verwendung in einen sauerstoffhaltigen Puffer gelegt. (G) Schnitte wurden auf einen Schlitten gelegt und 2 mm Stempel des dorsalen Striatums gemacht. (G) Schläge des dorsalen Striatums (oben), Ausschnitte des Hippocampus (Mitte) und Ausschnitte des Kortex (unten) werden bei 4 °C im sauerstoffhaltigen Dissektionspuffer gehalten, bevor funktionelle Experimente eingeleitet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Versuchsaufbau für Das Effluxexperiment. (A) Die Effluxkammer besteht aus einer 48-Well-Gewebekulturplatte und einer Gewebehalterschale, die mit der Carbogenlinie verbunden ist. (B) Ein Diagramm, das das Versuchsdesign für das endogene Monoamin-Efflux-Experiment zeigt, in dem die Gewebeaktivierung (B1), die Präinkubation mit/ohne Monoamintransporter-Inhibitoren (B2), das Efflux-Experiment (B3) und die endgültige Probenverarbeitung vorgestellt werden (B4-B5). (C) Das linke Feld zeigt einen Experimentator, der das Perfusat in Vorbereitung auf die Autoinjektion in die HPLC lädt. Das rechte Feld zeigt ein repräsentatives Chromatogramm, das die Monoamin-Standardpeaks bezeichnet. Die Fläche unter der Kurve (AUC) wird für jeden Monoaminstandard und jede Gehirnprobe gemessen. Nach der Kalibrierung wird die für jede Hirnprobe gemessene AUC in die nM-Konzentration umgerechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Akute Hirnschnitte waren am Ende der Experimente lebensfähig. Ein MTT-Assay wurde durchgeführt, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu bestimmen und mit Triton X-100 1% zu vergleichen, was den Zelltod induziert. Das Ergebnis des MTT-Assays zeigte, dass am Ende von 6 h gewebeproben noch lebensfähig waren. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM (N = 6) ausgedrückt. P < 0,0001, ungepaarter t-Test . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Amphetamin induziert die Monoaminfreisetzung in akuten Hirnschnitten aus dem Hippocampus, dem präfrontalen Kortex und Schlägen des dorsalen Striatums. (A-B) Hippocampus- und präfrontale Kortexschnitte, die in 30 μM AMPH inkubiert werden, führen zu einem signifikanten Anstieg der 5-HT-, DA- und NE-Freisetzung. Fluoxetin hemmt signifikant die 5-HT-Freisetzung, hat aber keinen Einfluss auf die DA- oder NE-Freisetzung in diesen Regionen. (C) 2 mm dorsale Striatumstempel wurden in Kokain (40 μM) oder AMPH (30 μM) inkubiert. AMPH stimulierte DA-Freisetzung und Vorbehandlung mit Kokain führten zu einer signifikanten Verringerung der AMPH-induzierten DA-Freisetzung. Alle Messungen erfolgen in nmol/g Protein. Statistiken stellen eine Einweg-ANOVA dar, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM (N = 6) ausgedrückt. Statistiken stellen eine Einweg-ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest dar (** p = 0,01, *** p = 0,001, **** p = 0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Ein hohes extrazelluläres K+ führt zu einer Monoaminfreisetzung durch Membrandepolarisation. (A-B) KCl (40 mM) induziert die Membrandepolarisation und die Freisetzung aller drei Monoamine im HPC und PFC. In beiden Hirnarealen hat die Vorbehandlung mit Fluoxetin (10 μM) keinen Einfluss auf die Wirkung von KCl auf die extrazelluläre Monoaminfreisetzung. (C) KCl (40 mM) induziert die Membrandepolarisation und die Freisetzung von DA im dorsalen Striatum, und die Vorbehandlung mit Kokain (40 μM) hat keinen Einfluss auf die Wirkung von KCl auf die DA-Freisetzung. Statistiken stellen eine Einweg-ANOVA dar, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM (N = 6) ausgedrückt. Statistiken stellen eine Einweg-ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest dar (***p < 0,001, ****p < 0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Datei: Rezepte für Puffer und Lösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Monoaminfreisetzungsmessungen werden seit Jahren in einer Reihe von Systemen wie heterologen Zellen, neuronalen Kulturen, Gehirnsynaposomen, ex vivo akuten Hirnschnitten und ganzen Tieren durchgeführt13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 . Solche Präparate haben es den Neurowissenschaften ermöglicht, grundlegende Neurotransmitter-Freisetzungsmechanismen zu erforschen, die zur Entdeckung neuartiger pharmakologischer Wirkstoffe für neurologische und psychiatrische Erkrankungen führen können, bei denen Monoamine eine Rolle spielen. Trotz des breiten Einsatzes solcher Methoden gibt es bestimmte Einschränkungen hinsichtlich der Quelle und/oder der Menge der endogenen Monoaminfreisetzung, insbesondere bei radioaktiven Verfahren. Darüber hinaus wurden ex vivo akute Hirnschnittpräparate in Verbindung mit elektrophysiologischen, pharmakologischen, genetischen, molekularen, immunzytochemischen und anderen Ansätzen weit verbreitet verwendet18,24,25,47,50,51,59,69,70 , da sie die Gewebearchitektur erhalten und sowohl die neuronale Aktivität als auch die synaptischen Verbindungen beibehalten. Daher bieten Hirnschnitte außergewöhnliche Vorteile im Vergleich zu anderen In-vitro-Modellen wie heterologen Systemen, primär kultivierten Neuronen und Synaptosomen. Ihr Vorteil besteht größtenteils darin, dass diese Systeme viele Aspekte der In-vivo-Umgebung reproduzieren können.
Elektrophysiologische, optogenetische, fluoreszierende Sensoren und voltametrische Ansätze bieten eine exquisite zeitliche und räumliche Auflösung, um Mechanismen zu untersuchen, die mit der Monoaminfreisetzung, insbesondere DA, verbunden sind. Die Grundvoraussetzung für die Verwendung dieser Ansätze ist jedoch, dass die elektrische oder lichtinduzierte Stimulation von Neuronen die klassische und gut dokumentierte calciumabhängige exozytotische vesikuläre Freisetzung von Neurotransmittern induziert18,21,22,24,27,30. Eine der erkennbareren Einschränkungen dieser Ansätze besteht darin, dass Monoamine, die über alternative Mechanismen (d. H. Nicht-vesikuläre Freisetzung) freigesetzt werden, durch diese Techniken nicht nachgewiesen werden. Radioaktiv markierte Neurotransmittermoleküle wurden auch verwendet, um die Monoaminfreisetzung zu untersuchen, aber dieser Ansatz hat erhebliche Einschränkungen. Zellen oder Gewebeproben sind mit nicht-physiologischen Konzentrationen markierter Neurotransmitter beladen, die die native Umgebung nicht getreu rekapitulieren20,42,46. Interessanterweise dokumentieren einige Studien die Verwendung von Hirnschnitten in Superfusionssystemen, um die endogene Monoaminfreisetzung zu untersuchen53,54,56. Diese Studien verwenden jedoch radioaktive Neurotransmitter, und diejenigen, die den endogenen Neurotransmitter untersuchen, konzentrieren sich nur auf K + und nicht-physiologische Bedingungen, um die Freisetzung von Neurotransmittern zu induzieren.
Die derzeit vorgestellte Methode kann verwendet werden, um die Transporter-vermittelte Monoaminfreisetzung aus nativem Gewebe zu untersuchen. Dies ermöglicht es dem Experimentator, die Einschränkungen von tritiierten Neurotransmittern zu überwinden. Darüber hinaus bietet dieser Ansatz einen einfachen Aufbau, um die endogene Monoaminfreisetzung durch einen direkten Nachweis von Monoaminen genauer zu messen als durch die indirekte Messung bei Verwendung von Fluoreszenzsensoren oder radioaktiv markiertem Monoamin. Es ist allgemein bekannt, dass Amphetamin als Monoamintransporter-Trennmittel in den Hirnregionen präfrontaler Kortex71, dorsales Striatum56,72 und Hippocampus39 wirkt. Diese Ergebnisse wurden mit diesem 48-Well-Plattensystem bestätigt. Darüber hinaus kann sich diese Methode als Ergänzung zu derzeit verwendeten Methoden erweisen, die den Gesamtmonamingehalt mittels HPLC-ECD messen, aber die Monoaminfreisetzung nicht untersucht haben5,6,7. Diese Methode bietet einen neuartigen Belüfter, der entwickelt wurde, um die endogene Freisetzung von Monoaminen aus akuten Hirnschnitten mittels HPLC in Verbindung mit elektrochemischem Nachweis zu messen.
Bei der Anwendung dieser Methode ist es wichtig, dass das Hirngewebe während des Experiments in einem mit Sauerstoff angereicherten Puffer kalt gehalten wird, um eine Verschlechterung zu verhindern. Darüber hinaus ist es entscheidend, dass die verwendeten Gewebe in einem pargylinhaltigen Puffer aktiviert werden, um den Monoaminabbau zu verhindern. Darüber hinaus muss der Experimentator möglicherweise mehrere Aspekte dieser Methode beheben. Erstens, abhängig vom Entwicklungszeitpunkt oder der Art des Tieres, muss man möglicherweise kleinere oder größere Abschnitte erstellen oder mehr oder weniger Abschnitte, Scheiben oder Stempel pro Bedingung verwenden. Zweitens, abhängig von der interessierenden Gehirnregion, wird es unterschiedliche Mengen von jedem Neurotransmitter geben. Drittens, während es wichtig ist, ein konsistentes Sprudeln von Sauerstoff zu gewährleisten, wenn es bemerkt wird, muss der Experimentator vorsichtig sein, keine übermäßige Sauerstoffversorgung bereitzustellen, da dies zur versehentlichen Entfernung von Gewebe aus dem Brunnen führen kann. Schließlich, da es verschiedene Arten von HPLC-Geräten und verschiedene Trennsäulen gibt, muss der Experimentator anhand der Literatur bestimmen, welches Gerät oder welche Säule für sein Experiment am besten geeignet ist.
Obwohl diese Methode dem Experimentator die Möglichkeit gibt, schnell und präzise Ex-vivo-Daten über die Freisetzung von endogenen Monoaminen zu erhalten, gibt es Einschränkungen, die beachtet werden müssen. Da es sich um einen Ex-vivo-Ansatz handelt, werden Netzwerke und Verbindungen durchtrennt, so dass die Scheiben oder Stempel nicht repräsentativ für ein intaktes System sind. Eine weitere wichtige Einschränkung dieses Ansatzes ist der Mangel an zeitlicher und räumlicher Auflösung, da die Monoaminfreisetzung in einer Zeitskala von Minuten und aus einer Population von Freisetzungsstellen gemessen wird. Eine zukünftige Verfeinerung des Ansatzes könnte eine Optimierung der Zeit- und Raumauflösung ermöglichen. Zusätzliche Experimente werden auch die Mechanismen untersuchen, die mit Freisetzungsereignissen verbunden sind. Nachdem die Gültigkeit der aktuellen Methode nachgewiesen wurde, müssen zukünftige Experimente die molekularen Ereignisse sezieren, die zur Monoaminfreisetzung führen. Weitere Experimente umfassen Ca2+-freien Effluxpuffer und selektive Inhibitoren der vesikulären Freisetzung als zusätzliche Kontrollen. Da die regionale Verteilung der Monoamine und ihrer Transporter drei unabhängige Ereignisse sind, müssen zukünftige Experimente eine umfangreichere Pharmakologie und eine Zeitstudienstudie beinhalten, da unterschiedliche Arzneimittelbedingungen kürzere oder längere Inkubationszeiten erfordern können. Zum Beispiel können weitere Experimente basierend auf der regionalen Verteilung oder art des verwendeten Gewebes spezifischere pharmakologische Blocker für NET, SERT oder DAT wie Desipramin, Fluoxetin und GBR12909 verwenden. Obwohl das Gewebe während des gesamten Experiments lebensfähig blieb, kann der Experimentator nicht ausschließen, dass die Funktion des Monoamintransporters während der Gesamtentaktik beeinträchtigt worden sein könnte. Die für diese Methode erforderliche Ausrüstung ist kostengünstig, es besteht jedoch die Notwendigkeit, Zugang zu einem teuren HPLC-ECD zu haben. Dies kann durch Kerneinrichtungen gemildert werden, da viele derzeit Zugang zu HPLC-ECDs für den gemeinschaftlichen Gebrauch haben. Trotz solcher Einschränkungen bietet die derzeitige Methode ein grundlegendes Verfahren, das weiter manipuliert werden kann, um die Monoaminfreisetzung zu untersuchen.
Im Allgemeinen bietet diese Methode ein einfaches, hochdurchsatzreiches und kostengünstiges zweistufiges Verfahren zur Bewertung der gleichzeitigen Freisetzung von Monoaminen aus adulten Nagetierneuronen unter Verwendung von ex vivo akuten Hirnschnitten aus verschiedenen Gehirnregionen. Im Idealfall kann diese Methode mit In-vivo-Protokollen kombiniert werden und liefert vorläufige Daten, so dass der Experimentator die Anzahl der in in vivo-Modellen benötigten Tiere verringern kann, wie in den "drei Rs" (Replacement, Reduction, and Refinement) des Tierschutzes empfohlen. Somit ist es möglich, diese Ex-vivo-Plattform für das Screening potenziell therapeutischer Moleküle mit dem Ziel zu implementieren, neuartige pharmakologische Wirkstoffe für die Behandlung von Erkrankungen zu entdecken, die mit Deregulationen in der Monoaminhomöostase verbunden sind.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Offenlegungen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse Fondecyt Initiation Fund N 11191049 an J.A.P. und den NIH-Zuschuss DA038598 an G.E.T. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 Well plate | NA | NA | Assay |
| Acetonitrile | Fischer Scientific | A998-1 | Mobile Phase |
| Calcium Chloride Ahydrous | Sigma Aldrich | C1016 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Clarity Software | Anetc | ||
| Citric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 1002608421 | Dissection Buffer |
| DMF | Sigma Aldrich | D4551 | MTT Assay |
| EDTA-Na2 | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| GraphPad Software | Graphpad Software, Inc | Statistical Analysis | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Lysis buffer |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Lysis buffer |
| HPLC, Decade Amperometric | Anetc | HPLC, LC-EC system | |
| HPLC | Amuza | HPLC HTEC-510. | |
| L-Asrobic Acid | Sigma Aldrich | A5960 | Dissection Buffer |
| Magnesium Sulfate | Sigma | 7487-88-9 | KH Buffer |
| Microcentrifuge Filter Units UltraFree | Millipore | C7554 | Assay - 6 to fit in 48 well plate |
| MTT | Thermo Fisher | M6494 | MTT Assay |
| Nanosep | VWR | 29300-606 | Assay; protein assay |
| Octanesulfonic acid | Sigma Aldrich | V800010 | Mobile Phase |
| Pargyline Clorohydrate | Sigma Aldrich | P8013 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Phosphoric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| Potassium Chloride | Sigma | 12636 | KH Buffer |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | 1001655559 | KH Buffer |
| Precisonary VF-21-0Z | Precissonary | Compresstome | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P2714 | Lysis buffer. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | KH Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | Lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | MTT Assay / Lysis buffer |
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