Ein plattenbasierter Assay zur Messung der endogenen Monoaminfreisetzung in akuten Hirnschnitten

Jose A. Pino; Nora Awadallah; Alessandra M. Norris; Gonzalo E. Torres

doi:10.3791/62127

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Methodenartikel

Ein plattenbasierter Assay zur Messung der endogenen Monoaminfreisetzung in akuten Hirnschnitten

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DOI:

10.3791/62127

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11. August 2021

Jose A. Pino^*¹ , Nora Awadallah^*² , Alessandra M. Norris³ , Gonzalo E. Torres²

¹Department of Medicine, School of Medicine, Universidad de Atacama, ²Department of Molecular, Cellular, and Biomedical Sciences, City University of New York School of Medicine at City College, ³Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Methode führt eine einfache Technik zum Nachweis der endogenen Monoaminfreisetzung unter Verwendung akuter Hirnschnitte ein. Das Setup verwendet eine 48-Well-Platte, die einen Gewebehalter für die Monoaminfreisetzung enthält. Freigesetztes Monoamin wird mittels HPLC in Verbindung mit elektrochemischem Nachweis analysiert. Darüber hinaus bietet diese Technik eine Screening-Methode für die Arzneimittelentdeckung.

Zusammenfassung

Monoamin-Neurotransmitter sind mit zahlreichen neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen verbunden. Tiermodelle solcher Zustände haben Veränderungen in der Freisetzungs- und Aufnahmedynamik von Monoamin-Neurotransmittern gezeigt. Technisch komplexe Methoden wie Elektrophysiologie, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), Bildgebung, In-vivo-Mikrodialyse, Optogenetik oder die Verwendung von Radioaktivität sind erforderlich, um die Monoaminfunktion zu untersuchen. Die hier vorgestellte Methode ist ein optimierter zweistufiger Ansatz zum Nachweis der Monoaminfreisetzung in akuten Hirnschnitten unter Verwendung einer 48-Well-Platte mit Gewebehaltern zur Untersuchung der Monoaminfreisetzung und einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit elektrochemischer Detektion (HPLC-ECD) zur Messung der Monoaminfreisetzung. Kurz gesagt, Rattenhirnschnitte, die Regionen von Interesse enthielten, einschließlich präfrontaler Kortex, Hippocampus und dorsales Striatum, wurden mit einem Gewebeschneider oder Vibratom erhalten. Diese interessanten Regionen wurden aus dem gesamten Gehirn seziert und in einem mit Sauerstoff angereicherten physiologischen Puffer inkubiert. Die Lebensfähigkeit wurde während des gesamten Versuchszeitraums durch 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay untersucht. Die akut sezierten Hirnregionen wurden unter verschiedenen Medikamentenbedingungen inkubiert, von denen bekannt ist, dass sie die Monoaminfreisetzung durch den Transporter (Amphetamin) oder durch die Aktivierung der exozytotischen vesikulären Freisetzung (KCl) induzieren. Nach der Inkubation wurden die freigesetzten Produkte im Überstand gesammelt und durch ein HPLC-ECD-System analysiert. Hier wird die basale Monoaminfreisetzung mittels HPLC aus akuten Hirnschnitten nachgewiesen. Diese Daten unterstützen frühere In-vivo- und In-vitro-Ergebnisse, die zeigen, dass AMPH und KCl die Monoaminfreisetzung induzieren. Diese Methode ist besonders nützlich für die Untersuchung von Mechanismen, die mit einer von Monoamintransportern abhängigen Freisetzung verbunden sind, und bietet die Möglichkeit, Verbindungen, die die Monoaminfreisetzung beeinflussen, schnell und kostengünstig zu screenen.

Einleitung

Eine Vielzahl von neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen ist mit einer Dysregulation oder unzureichenden Aufrechterhaltung des Monoamin-Neurotransmitters (Dopamin [DA], Serotonin [5-HT], Noradrenalin [NE]) der Homöostase ^{verbunden1,2,3}. Zu diesen Erkrankungen gehören unter anderem ^{Depressionen1,2}, ^{Schizophrenie2}, ^{Angstzustände2}, ^Sucht4, ^{Menopause5,6,7}^<....