Summary
이 방법은 급성 뇌 슬라이스를 사용하여 내인성 모아민 방출의 검출을위한 간단한 기술을 소개합니다. 설정은 모노아민 방출을 위한 조직 홀더를 포함하는 48웰 플레이트를 사용합니다. 방출된 모노아민은 HPLC에 의해 전기화학적 검출과 결합하여 분석된다. 또한,이 기술은 약물 발견을위한 스크리닝 방법을 제공합니다.
Abstract
모노 아민 신경 전달 물질은 수많은 신경 및 정신 질환과 관련 된. 이러한 조건의 동물 모델은 모노 아민 신경 전달 물질 릴리스 및 섭취 역학에 변화를 보여 주었다. 전기 생리학, 빠른 스캔 순환 볼탐법 (FSCV), 이미징, 생체 내 미세 투석, 광유전학 또는 방사능 사용과 같은 기술적으로 복잡한 방법은 모노아민 기능을 연구하는 데 필요합니다. 여기서 제시된 방법은 모노아민 방출을 검사하기 위한 조직 홀더를 포함하는 48웰 플레이트를 사용하여 급성 뇌 슬라이스에서 모노아민 방출을 검출하기 위한 최적화된 2단계 접근법이며, 모노아민 방출 측정을 위한 전기화학적 검출(HPLC-ECD)과 결합된 고성능 액체 크로마토그래피입니다. 간략하게, 전두엽 피질, 해마 및 등삼 조각을 포함하는 관심 영역을 포함하는 쥐 뇌 단면은 조직 슬라이서 또는 진동을 사용하여 수득하였다. 관심의 이 지역은 전체 두뇌에서 해부되고 산소생리완에서 배양되었습니다. 생존력은 실험 시간 과정 전반에 걸쳐 3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석으로 조사되었다. 급성 해부 된 뇌 영역은 수송기 (암페타민)를 통해 또는 외세포 성 성 혈관 방출 (KCl)의 활성화를 통해 모노 아민 방출을 유도하는 것으로 알려진 다양한 약물 조건에서 배양되었다. 인큐베이션 후, 슈퍼나탄에서 출시된 제품은 HPLC-ECD 시스템을 통해 수집 및 분석되었다. 여기에서, 기저 모노아민 방출은 급성 두뇌 조각에서 HPLC에 의해 검출됩니다. 이 데이터는 AMPH와 KCl이 모노아민 방출을 유도한다는 것을 보여주는 생체 내 및 체외 결과를 지원합니다. 이 방법은 모노아민 수송기 의존방출과 관련된 메커니즘을 연구하는 데 특히 유용하며, 신속하고 저렴한 방식으로 모노아민 방출에 영향을 미치는 화합물을 선별할 수 있는 기회를 제공한다.
Introduction
신경 및 정신 질환의 과다 한 소화 장애 또는 단일 아민 신경 전달 물질의 부족 한 유지 보수와 관련 된 (도파민 [DA], 세로토닌 [5-HT], 노르 피 네 프 린 [NE]) 항상성1,2,3. 이러한 조건은 우울증을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다1,2, 정신 분열증, 불안2, 중독4, 폐경5,6,7, pain8, 및 파킨슨 병3. 예를 들면, 폐경의 몇몇 쥐 모형은 해마 내의 단색민의 난독증 또는 감소, 전두엽 피질 및 striatum가 폐경을 경험하는 여자에서 보인 불경기 및 인식 쇠퇴 둘 다와 연관될 수 있다는 것을 보여주었습니다. 이 모형에 있는 monoamines의 dysregulation는 HPLC-ECD를 사용하여 광범위하게 검토되었습니다, 연구 결과는 신경 전달물질 릴리스 대 측정된 신경 전달물질 함량 사이에서 차별하지 않았지만 5,6,7. 모노아민은 고전적으로 Ca2+의존성 성 산하 제19을 통해 세포외 공간으로 방출되며, 각각의 플라즈마 멤브레인 재업 시스템(도파민 수송기, DAT; 세로토닌 수송기, SERT; 노르피네프린 수송기, NET)10,11을 통해 다시 재활용된다. 반대로, 데이터는 암페타민 (AMPH)과 3,4-메틸렌디옥시메탐페타민 (MDMA)과 같은 남용약물이 각각 수송 시스템을 통해 DA와 5-HT를 방출하는 것으로 알려져 있기 때문에 이러한 수송기는 모노아민을 방출하거나 efflux 할 수 있음을 시사합니다 16,16,167 . 따라서, 모노아민 방출 역학의 적절한 기계론적 이해는 특정 및 표적 약리요법을 개발하는 데 중요합니다.
빠른 스캔 사이클릭 볼탐법 (FSCV)18, 생체 내 미세 투석13, 이미징19, 방사선 표지 모노 아민20, 광유전학, 그리고 최근에는 유전적으로 색소로 인코딩된 형광 센서 및 광미측정221,221,211과 같은 모노아민 방출을 연구하기 위해 다양한 기술이 사용되었습니다. . FSCV 및 생체 내 마이크로 투석은 모노아민 방출을 연구하는 데 사용되는 주요 기술입니다. FSCV는 급성 뇌 슬라이스와 생체 내 DA의 자극된 외세포 방출을 연구하는 데 사용됩니다. FSCV는 방출을 자극하거나 깨우기 위하여 전극을 이용하기 때문에, 신경 전달물질 방출의 1차 근원은 Ca2+의존성 성혈관 방출18,24,25,26,27,28,29,30,31입니다 . HPLC와 결합 된 생체 내 미세 투약은 관심의 뇌 영역에 배치 된 프로브를 사용하여 세포 외 신경 전달 물질 수준에 변화를 측정13,32. FSCV와 유사, 생체 내 마이크로 투석에 대한 주요 제한은 신경 전달 물질 방출의 소스를 결정하는 어려움입니다 : Ca2+ 의존성 혈관 방출 또는 수송에 의존. 주목할 만하지만 두 방법 모두 모노아민 방출을 직접 측정할 수 있습니다. 최근 광유전학의 발전을 통해, 연구는 절묘한 세포 모형 특이성21,22와 짧은 기간에 있는 5-HT 및 DA 방출의 검출을 보여줍니다. 그러나, 이러한 전략은 복잡하고 비용이 많이 드는 기술과 장비를 필요로하고, 간접적으로 단일 아민 방출을 측정, 특히 수용체에 단일 아민 바인딩을 통해. 또한, 방사성 표지 모노아민은 또한 모노아민 역학을 연구하는 데 사용됩니다. 방사선 표지 모노아민은 각 모노아민 수송기 20,33,34,35,36,37,38,39,40, 1차 뉴런20, 시냅토좀3,39,41, 이종세포 와 같은 다양한 모델 시스템에 미리 로드될 수 있다. 42, 급성 뇌 슬라이스43,44. 그러나, 방사능은 실험자에게 잠재적인 해를 초래하고, 트리튬 라벨된 유리분해는 내인성 monoamine dynamics45,46을 충실하게 되풀이하지 않을 수 있습니다. HPLC-ECD와 같은 오프라인 검출 방법과 결합된 슈퍼퓨전 시스템은 여러 조직 소스에서 모노아민검출을 허용했습니다. 여기서 이 프로토콜은 급성 뇌 슬라이스를 사용하여 내인성 기저 및 자극된 모노아민 방출을 직접 측정하기 위해 최적화되고 저렴한 비용, 간단하고 정확한 방법을 제공합니다.
급성 뇌 슬라이스는 주로 생체 내 해부학 적 미세 환경을 보존할 때 기계론 적 가설을 테스트할 수 있으며, 그대로 시냅스47,48,49,50,51,52를 유지합니다. 몇 가지 연구에서, 급성 뇌 슬라이스 또는 다진 뇌 조직 Ca2+ 매개 릴리스를 자극 하는 KCl을 사용 하 여 과융합 기술과 함께 사용 되었습니다53,54,55,56. 과류 시스템은 모노아민을 포함한 신경 전달 물질 방출 메커니즘에 대한 현장의 이해를 증진하는 데 매우 중요합니다. 그러나, 이들 시스템은 비교적 비싸며, 조직 분석에 사용할 수 있는 챔버의 수는 4-12사이이다. 이에 비해, 여기에 제시된 방법은 저렴하고, 48개의 조직 샘플을 측정할 수 있으며, 최대 96개의 조직 샘플을 사용하도록 정제될 수 있다. 48웰 플레이트 내에 있는 각 우물에는 필터를 사용하여 방출된 제품을 조직으로부터 분리하는 조직 홀더가 포함되어 있으며, 방출된 모노아민은 HPLC-ECD에 의해 수집 및 분석됩니다. 중요한 것은, 이 방법은 전두엽 피질, 해마 및 등쪽 줄무늬와 같은 다른 뇌 영역에서 5-HT, DA 및 NE 방출을 동시에 측정할 수 있도록 하는 약리학제제로 치료후 모노아민 방출을 조절한다. 따라서, 실험자는 테스트된 샘플의 수를 증가시켜 사용되는 동물의 수를 줄이는 저렴한 멀티웰 시스템을 사용하여 여러 질문에 답할 수 있다.
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Protocol
동물 취급 및 조직 수집을 포함한 모든 실험은 플로리다 대학과 뉴욕 시 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 승인 된 프로토콜 201508873 (UF) 및 1071 (CCNY)에 따라 수행되었습니다. 시약 및 버퍼의 경우 보충 파일을 참조하십시오.
1. 급성 쥐 뇌 슬라이스 준비
참고:이 실험에서 성인 수컷 쥐(250-350 g)가 사용하였다. 그러나, 이 설정은 다른 발달 점, 암컷 쥐 및 그밖 종에 대한 기능적이다. 마우스와 같은 작은 동물을 사용하는 경우, 실험자는 조건당 다른 수의 뇌 슬라이스 또는 펀치를 사용하여 프로토콜을 최적화하도록 조정할 수 있다. 해부 버퍼를 버퍼 1이라고 합니다. efflux 버퍼를 버퍼 2라고 합니다.
- 보충 파일에 설명한 대로 버퍼 1을 준비합니다. 얼음에 20 분 동안 95 %/5 %(O2 / CO2)로 버블링하여 산소로 버퍼 1을 포화. 버퍼 1 50mL을 제거하고 작은 비커 또는 페트리 접시에 얼음을 식힙니다. 이 버퍼는 급성 수확 된 전체 뇌를 보유하는 데 사용됩니다.
- 1%-2%의 이소플루란으로 한두 마리의 성인 쥐(250-350 g)를 마취시키고, 기요틴을 사용하여 그들을 참수하고, 뇌를 빠르게 제거합니다. 즉시 1.1 단계에서 용기에 얼음 차가운 산소 버퍼 1에 뇌를 배치합니다.
참고: 이소플루란과 기요틴을 안전하게 사용할 수 있도록 하십시오. 연기 후드 아래에 이소플루란을 엽니다. - 진동 또는 압축을 사용하여 각 관심 영역에서 300 μm 관상 동맥 뇌 섹션을 잘라냅니다(그림 1). 섹션이 만들어지는 동안 버블링 버퍼 1이 있어야 합니다. 스테인레스 스틸 주걱을 사용하여, 신중하고 즉시 얼음 차가운 산소 버퍼 1로 채워진 새로운 페트리 접시로 뇌 조각을 전송 (그림 2).
- 또한 쥐 두뇌 atlas57을 사용하여 조각을 유리 슬라이드 (그림 1G)로 조심스럽게 이동하여 뇌 슬라이스 (예 : 펀치, 잘라내기)를 해부합니다. 예를 들어, 어둡고 잘절된 구조를 기반으로 하는 등산 줄무늬를 식별하고 피질과 독특한 나선형 구조에 대한 근접성을 기반으로 해마를 식별합니다. 좌우 반구는 제어 및 실험 슬라이스로 사용하기 위해 분리될 수 있다(그림 2G - H). 여기서, 등쪽 줄무늬는 2mm 펀치로 더 해부되었다 (그림 1G).
- 팁이 잘린 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 산소 버블링이 있는 산소냉식 버퍼 1에 담근 작은 용기에 슬라이스 나 뇌 펀치를 전달합니다. 이러한 용기는 스테인레스 스틸 메쉬 또는 버퍼로 채워진 작은 페트리 접시일 수 있습니다(그림 1H).
2. 뇌 슬라이스 또는 펀치에서 전 생체 내인성 모노아민 방출
참고: 이 섹션에 사용되는 장치는 카보겐 라인에 연결된 인셋 필터없이 6 개의 미세 원심 분리기 필터 단위로 만든 48 웰 플레이트 및 조직 홀더로 구성됩니다 (그림 2). 홀더를 만들려면 튼튼한 플라스틱 막대(예: 셀 스크레이퍼)를 사용하고 인셋 필터없이 미세 센심 분리기 필터 장치를 슈퍼 접착제로 만듭니다. 1-2 일 동안 건조하십시오. 내인성 모노아민 방출 실험 및 암페타민, 플루옥세틴 및 코카인농도에 필요한 시간은 현재 문헌 및 이전 프로토콜13,20,58을 기반으로 한다.
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조직 활성화
- 뇌 조직을 1.1.5 단계에서 각 웰씩 옮기고 37°C에서 30-50분 동안 산소가 공급되는 버퍼 2의 0.5-1mL의 슬라이드 워머에서 일정한 부드러운 버블링(그림 2B1)으로 회복할 수 있습니다.
- 이 배양 동안, 실험을 위해 원하는 농도로 약물을 희석. 모든 약물은 버퍼 2에 용해되어야하며, 농도는 현재 문헌을 기반으로합니다.
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첫 번째 인큐베이션
- 산소 버퍼 2의 500 μL을 포함하는 우물에 뇌 조직과 조직 홀더를 이동하고 37 ° C에서 20 분 동안 배양. 초과 버퍼가 홀더에 없을 때까지 웰 가장자리의 홀더를 눌러 버퍼를 최소한으로 전송하지 않도록 합니다.
- 모노아민 수송억제제와 같은 약리학제실험에서, 산소완충2에서 희석된 약물로 조직 샘플을 배양한다(예를 들어, 10μM 플루옥세틴, 40 μM 코카인; 도 2B2 참조). 각 우물의 최종 부피는 500 μL입니다.
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두 번째 인큐베이션
- 각 약물의 원하는 농도 유무에 관계없이 500 μL 총 버퍼 2를 포함하는 새로운 우물 세트로 조직을 가진 홀더를 이동합니다. 남은 버퍼가 없는지 확인합니다. 각 웰은 실험 조건에 대한 n = 1을 나타냅니다. 각 실험 조건은 삼중에서 수행됩니다.
- 하나는 잘 산소 버퍼 2, 다음 10-30 μM AMPH를 포함하고, 최종 우물은 10-30 μM AMPH 플러스 모노 아민 수송 억제제를 포함한다. 각 약물은 산소 버퍼 2에 용해된다.
- 약물 조건의 500 μL로 37 °C에서 20 분 동안 조직을 배양하십시오.
참고: 추가 우물에는 단일 아민 수송 억제제유유무에 산소가 공급되는 높은 K+ 버퍼 2가 포함될 수 있다. 각 약물을 산소 버퍼 2(500 μL)에 용해합니다. - 20분의 이 두 번째 배양 동안, 2.2.1 단계에서 첫 번째 배양에서 우물에서 용액을 수집하고 1N 과염산 또는 인산의 50 μL을 포함하는 미세 센트심분리기 튜브로 이송(HPLC의 종류에 따라 달라, 최종 농도 0.1 N). 샘플의 최종 부피는 550 μL입니다. 얼음에 미세 원심 분리기를 유지하고 튜브 #1에 레이블을 지정합니다.
- 20 분의 두 번째 잠복 후, 뇌 섹션또는 펀치와 조직 홀더를 빈 우물로 이동하고 얼음에 접시를 유지합니다. 1 N 과염소산 또는 인산의 50 μL을 포함하는 미세 원심 분리관으로 상체를 전달합니다. 샘플의 최종 부피는 550 μL입니다. 얼음에 미세 원심 분리기를 유지하고 튜브 #2에 레이블을 지정합니다.
- 조직을 포함하는 각 웰에 얼음 차가운 버퍼 1 1mL을 추가합니다. 작은 핀셋을 사용하여 모든 조직을 수집하고 미세 원심 분리 튜브를 청소하기 위해 전달합니다.
- -80°C에서 뇌 조직으로 튜브를 유지합니다. 버퍼 1의 1mL를 폐기합니다(그림 2B4).
- 2분 동안 2,500 x g 에서 마이크로센심분리기 필터 튜브(0.22 μm)를 사용하여 각 배양에서 얻은 필터 솔루션. 전기 화학 적 검출HPLC를 사용하여 단일 아민 함량을 결정하기 위해 여과를 사용합니다 (도 2B5).
3. 조직 생존가능성
- MTT 분석
참고: 이 실험적인 설치에 관하여 중요한 관심사는 조직이 최대 몇 시간59에 이용될 수 있기 때문에 조직 생존성입니다. MTT 분석사60,61은 실험이 끝날 때까지 조직 생존가능성을 결정하는 데 사용된다. 이 분석서는 적절한 대사를 가진 실행 가능한 세포에 의해 보라색 포르마잔 결정으로 노란색 테트라졸륨 염 MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)의 변환을 기반으로 합니다.- 사후 실험은 별도의 조직 샘플 그룹을 유지하고 두 그룹으로 분리합니다.
- 트리톤 X-100(1%)에서 37°C에서 20분 동안 1군을 배양하여 버퍼 2에 대조군으로 용해한다. 트리톤 X-100 치료는 세포 사멸을 초래한다. 버퍼 2에서 두 번째 그룹을 유지 하 고 트리톤 X-100 (조직 생존 능력 제어)에서 배양 하지 마십시오.
- MTT를 추가 (주식 용액 5 PBS에서 mg/mL, pH 7.4) 산소 버퍼2의 두 그룹에 0.5 mg/mL의 최종 농도.
- 37°C에서 20분 동안 조직 샘플을 배양하고, PBS로 세척하고, SDS(10%, w/v), DMF(25%, v/v) 및 물을 혼합한 250μL를 포함하는 마이크로센심심분리기 튜브로 이송하여 포마잔 결정을 용해시한다.
- 24h에 대한 샘플을 배양한다.
- 10분 동안 10,000 x g의 원심분리기와 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 562nm 및 690 nm에서 상류체(200 μL)의 흡광도를 측정합니다. 조직 생존력은 다음과 같이 계산됩니다: (A562-A690)/조직 중량.
4. 모노아민의 HPLC 분석
- 이전 프로토콜에 따라 HPLC-ECD를 사용하여 각 실험 조건에서 모노아민 방출을 정량화13,44, 역상 열을 사용하여.
- 감지에 필요한 모바일 단계를 준비합니다. 이는 100mM인산, 100mMM의 구연산, 0.1m EDTA-Na2, 600 mg/L 옥탄설포닉산, 8% v/v 아세토닐릴(최종 pH 6.0)으로 구성된다. 모바일 단계의 구성은 사용되는 HPLC 및 열 유형에 따라 다릅니다.
- 전기화학 검출기(2mm 유리 탄소 전극)의 전위를 0.46V로 설정하고 유량을 0.05mL/min으로 설정합니다.
- 자가 주입 및 검출을 위해 HPLC에 신경 전달 물질 표준을 포함하여 각 샘플의 5 μL을 적재합니다. 추가된 각 샘플의 양은 사용된 HPLC 유형에 따라 다릅니다.
- HPLC가 실행을 완료하면 지정된 HPLC 분석 소프트웨어를 사용하여 크로마토그래프 데이터를 획득하고 분석합니다.
- 각 모노아민(도파민: DA, 노르에피네프린: NE, 세로토닌: 5-HT) 및 세로토닌으로 구성된 표준 곡선을 사용하여 모노아민 함량을 분석합니다. 그림 2C). 생성된 크로마토그램을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 곡선(AUC) 아래 영역을 얻습니다.
5. 단백질 정량화를 위한 조직 용해 제고
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단백질 분석
- 얼음 차가운 용해 버퍼플러스 프로테아제 억제제(0.1 g/1 mL)를 뇌 섹션/펀치를 함유한 각 미세원심분리기 튜브에 추가하고 유봉 균질화를 사용하여 균질화합니다. 마이크로원심분리기 튜브는 단백질 분해를 방지하기 위해 균질화하는 동안 얼음 위에 유지되어야 합니다.
- 배양 조직은 빛 회전과 4 °C에서 1 시간 균질화합니다.
- 원심분리기 조직은 4°C에서 15분 동안 16,000 x g 에서 균질화하고 상류체를 회복합니다.
- 소 세럼 알부민(BSA)을 표준으로 사용하여 수퍼나티제에서 단백질 농도를 결정합니다.
- 각 뇌 샘플의 모노아민 함량을 250 μL의 뇌 조직 용액으로 측정한 단백질(μg)의 총 함량으로 정규화한다. 아래 포뮬러를 사용하여 nmol 모노아민/g 단백질을 결정합니다. df = 희석 계수입니다.
6. 통계 분석
- 단방향 ANOVA를 사용하여 모노아민 방출(nmol/g)을 분석하고, 시다크의 여러 비교 테스트는 포스트 호크 비교를 위해 시험한다.
- 독립적 인 그룹에 대한 짝을 이루는 학생의 t-테스트를 사용하여 조직 생존 가능성을 분석하십시오 (제어 대 1 % Triton X-100).
- 모든 통계 해석의 경우 알파 수준을 ≤ 0.05로 설정합니다.
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Representative Results
이 기술은 내부 조직 홀더가있는 48 웰 플레이트에 기반을 둔 전기 화학 적 검출을 가진 HPLC를 사용하여 내인성 모아민의 방출을 측정하기 위해 뇌 슬라이스의 사용을 설명합니다. 실험 설정은 그림 1 과 도 2에 묘사됩니다. 초기에는 실험이 끝날 때까지 조직의 생존가능성을 보장하기 위해 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드, 테트라졸) 분석이 수행되었다. 기능적 실험 후, 급성 뇌 슬라이스는 대사활성이며 세포 사멸의 상태인 트리톤 X-100 1%로 배양된 것과 비교하여 생존할 수 있다(도 3).
급성, 20 분, AMPH와 해마와 전두엽 피질 뇌 섹션의 치료는 각 모노 아민의 세포 외 수준에 상당한 증가를 유도 (그림 4A, B). AMPH(30 μM)는 해마 슬라이스와 전두엽 피질 슬라이스로부터 세포외 5-HT 의 수준을 각각 220배 및 64배, 세포외 NE가 19배, 8배, 세포외 DA를 각각 8배와 7배 증가시켰습니다. 유사한 실험은 선택적 세로토닌 재uptake 억제제인 플루옥세틴(10 μM)의 존재에서 수행되었다. 플루옥세틴을 가진 SERT의 억제는 해마와 전두엽 피질 둘 다에 있는 AMPH에 의해 유도된 세포외 5-HT의 증가를 방지합니다. 대조적으로, 플루옥세틴은 SERT에 대한 선택성과 일치, 같은 뇌 영역에서 세포 외 DA 또는 NE에 AMPH의 효과에 영향을 미치지 않습니다 (그림 4A, B). 모든 실험 조건은 삼중에서 수행되었다.
2mm 등쪽 조각탄 펀치에서 모노아민의 방출은 다음 측정되었다. 급성, 20 분, AMPH (10 μM)를 가진 등쪽 줄무늬 펀치의 치료는 기저 수준 보다 DA (도 4C)의 세포 외 수준이 35 배 증가합니다. DA 검출은 이전에 이 지역에서 보고된 5-HT 및 NE의 낮은 기저 수준으로 인해 등쪽 줄무늬에 집중되었다62,63. 따라서, AMPH는 AMPH에 의해 유도된 세포외 DA 수준에 비해 세포외 5-HT의 경미한 투여 의존적 증가를 유도한다(데이터는 도시되지 않음). 모노아민 수송기 차단제인 코카인(40 μM)을 가진 등쪽 스트루아텀 펀치의 배양은 AMPH(도 4C)로만 배양된 펀치와 비교할 때 AMPH 유도 세포 DA의 현저한 억제를 초래하였다. 이 데이터는 AMPH가 DAT16을 통해 DA efflux를 유도했음을 나타내는 이전 연구 결과를 더욱 지원합니다.
마지막으로, 모노아민의 외세포 방출을 입증하기 위해 뇌 섹션은 KCl(40mMM)으로 배양되었다. KCl의 40mM를 가진 배양을 통해 막 탈극화를 유발하는 세포외 KCl의 농도를 증가시키는 것은 대조군 조건에 비해 모노아민의 외세포 방출을 유도하기에 충분하다(도 5). 플루옥세틴이나 코카인은 KCl 막 탈극화에 의해 유도된 모노아민의 세포외 수치의 증가를 차단하지도 않습니다.
그림 1: 급성 쥐 뇌 슬라이스 및 단면 준비. (A) 쥐 뇌는 뇌 매트릭스에 배치됩니다. 우수한 컷은 광학 치아즘의 상단을 나타냅니다; 열등감컷은 시상하부 기저의 3mm 후방이다. 절단은 해마와 줄무늬를 제거하고, 슬라이스하기 전에 단단히 압축또는 진동에 표본을 붙이는 수평 염기를 보장하기 위해 만들어졌다. (B-D) 슈퍼 접착제는 무대 의 기지 주위에 확산되었다, 뇌에 붙어 있었다, 즉시 아가로즈로 덮여, 아가로스는 (D)에 냉동 클램프를 사용하여 고화되었다. (E-F) 압축절은 쥐 두뇌를 위한 300 μm 조각을 만들기 위하여 이용되고, 슬라이스는 사용될 때까지 산소완충에 두었습니다. (G) 단면은 슬라이드에 배치되었고 등쪽 조각의 2mm 펀치가 만들어졌습니다. (G) 등쪽 줄무늬(상단), 해마(middle)의 컷아웃, 피질(아래)의 컷아웃은 기능실험을 시작하기 전에 산소화해부 버퍼에서 4°C로 유지된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: efflux 실험을 위한 실험 설정. (A) efflux 챔버는 48웰 조직 배양 플레이트와 카보겐 라인에 연결된 조직 홀더 트레이로 구성된다. (B) 조직 활성화(B1), 모노아민 수송억제제(B2), efflux 실험(B3) 및 최종 시료 처리가 제시되는 내인성 모노아민 efflux 실험에 대한 실험 설계를 보여주는 다이어그램이다. (C) 좌측 패널은 자동 주입을 준비하기 위해 허혈구를 HPLC에 적재하는 실험자를 묘사한다. 오른손 패널은 모노아민 표준 피크를 나타내는 대표적인 크로마토그램을 보여줍니다. 곡선(AUC) 아래 영역은 각 모노아민 표준 및 뇌 샘플에 대해 측정됩니다. 교정 후, 각 뇌 샘플에 대해 측정된 AUC는 nM 농도로 변환됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 급성 뇌 슬라이스는 실험이 끝날 때까지 실행 가능했습니다. MTT 분석은 조직 생존가능성을 결정하기 위해 수행되었고 세포 사멸을 유도하는 Triton X-100 1%에 비해 수행되었다. MTT 분석의 결과는 6 h의 끝까지, 조직 견본이 아직도 실행 가능하다는 것을 보여주었습니다. 결과는 평균 ± SEM(N = 6)으로 표현됩니다. P < 0.0001, 페어링되지 않은 t 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 암페타민은 해마, 전두엽 피질 및 등쪽 점막 의 펀치에서 급성 뇌 슬라이스에서 모노아민 방출을 유도합니다. (A-B) 해마 및 전두엽 피질 슬라이스가 30 μM AMPH에서 배양되어 5-HT, DA 및 NE 방출이 크게 증가합니다. 플루옥세틴은 5-HT 방출을 현저히 억제하지만, 이러한 지역에서 DA 또는 NE 방출에 영향을 미치지 않는다. (C) 2mm 등쪽 조각탄 펀치는 코카인(40 μM) 또는 AMPH(30 μM)로 배양되었다. AMPH자극 DA 방출 및 코카인과 전처리A유도 DA 방출의 상당한 감소로 이어졌다. 모든 측정은 단백질의 nmol/g에 있습니다. 통계는 단방향 ANOVA를 나타내며 시다크의 여러 비교 테스트가 뒤따릅니다. 결과는 평균 ± SEM(N = 6)으로 표현됩니다. 통계는 Sidak의 다중 비교 테스트 (** p = 0.01, *** p = 0.001, **** p = 0.0001)와 단방향 ANOVA를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 세포외 외 K+는 막 탈극화를 통해 단일화 방출을 초래합니다. (A-B) KCl(40mM)은 HPC와 PFC모두에서 3개의 모노아민의 막 탈극화를 유도합니다. (C) KCl(40mM)은 등쪽 점막 에서 의극화 및 DA의 방출을 유도하고, 코카인(40 μM)을 가진 전처리는 DA 방출에 대한 KCl의 효과에 영향을 미치지 않는다. 통계는 단방향 ANOVA를 나타내며 시다크의 여러 비교 테스트가 뒤따릅니다. 결과는 평균 ± SEM(N = 6)으로 표현됩니다. 통계는 Sidak의 다중 비교 테스트 (***p < 0.001, ****p < 0.0001)와 단방향 ANOVA를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
모노아민 방출 측정은 이종 세포, 신경 배양, 뇌 시냅토좀, 전 생체 내 급성 뇌 슬라이스, 및 전체 동물 13,20,41,42,58,65,65,67,67,68 과 같은 여러 시스템에서 수년간 수행되었습니다. . 이러한 준비는 신경 과학의 분야를 탐색 하는 기본 신경 전달 물질 릴리스 메커니즘단일 화 증을 통해 신경 학 및 정신 장애에 대 한 새로운 약리학 에이전트의 발견으로 이어질 수 있는 모노 아민 제 역할을. 이러한 방법의 광범위한 사용에도 불구하고, 특히 방사성 절차에서 내인성 모노 아민 방출의 소스 및 / 또는 양에 관한 특정 제한이 있습니다. 또한, 전 생체 내 급성 뇌 슬라이스 제제는 전기생리학, 약리학, 유전, 분자, 면역 세포화학 및 기타 접근법 18,24,25,47,50,51,59,69,70과 함께 널리 사용되었습니다. , 그들은 조직 아키텍처를 보존으로, 신경 활동과 시 냅 스 연결을 유지. 따라서 뇌 슬라이스는 이종 시스템, 1차 배양 뉴런 및 시냅토좀과 같은 다른 체외 모델과 비교할 때 탁월한 이점을 제공합니다. 대체로 이러한 시스템은 생체 내 환경의 여러 측면을 재현할 수 있다는 장점이 있습니다.
전기 생리학, 광유전학, 형광 센서 및 볼트 접근법은 모노아민 방출, 특히 DA와 관련된 메커니즘을 검사하기 위해 절묘한 시간적 및 공간 해상도를 제공합니다. 그러나, 이러한 접근법의 사용을 위한 기본 전제는 뉴런의 전기 또는 빛 유도 자극이 고전적인 유도하고, 잘 문서화된 칼슘 의존성 외세포 성 육세포 방출을 신경 전달물질18,21,22,24,27,30. 이러한 접근법의 더 눈에 띄는 한계 중 하나는 대체 메커니즘(즉, 비-vesicular 방출)을 통해 방출되는 모노아민이 이러한 기술에 의해 검출되지 않는다는 것입니다. 방사선 표지 된 신경 전달 물질 분자 또한 모노 아 민 방출을 공부 하는 데 사용 되었습니다., 하지만이 접근 은 중요 한 제한이 있다. 세포 또는 조직 샘플은 기본 환경을 충실하게 재구성하지 않는 표지된 신경 전달물질의 비생리적 농도로 가득합니다20,42,46. 흥미롭게도, 몇 가지 연구는 내인성 모노아민 릴리스를 검사하기 위해 과류 시스템에 뇌 조각의 사용을 문서화53,54,56. 그러나, 이러한 연구는 방사성 신경 전달 물질을 사용 하 여, 그리고 내 인 성 신경 전달 물질만 신경 전달 물질 초점을 검사 하는 사람들 만 K+ 및 비 생리 적 조건 신경 전달 물질 릴리스를 유도.
현재 제시된 방법은 네이티브 조직에서 수송 매개 모노아민 방출을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 실험자가 삼각신경 전달물질의 한계를 극복할 수 있게 합니다. 또한, 이러한 접근법은 형광 센서 또는 방사성 표지 모노아민을 사용할 때 간접 측정보다는 모노아민의 직접 검출을 통해 내인성 모노아민 방출을 보다 정확하게 측정하는 간단한 설정을 제공한다. 암페타민이 전두엽 피질71, 등쪽 스트루아툼56,72, 그리고 해마39 뇌 영역에서 모노아민 수송제의 역할을 한다는 것이 잘 확립되어 있다. 이러한 사실 인정은 이 48웰 플레이트 시스템을 사용하여 확인되었습니다. 추가적으로, 이 방법은 HPLC-ECD를 사용하여 총 monoamine 콘텐츠를 측정하는 현재 사용되는 방법에 대한 보충으로 입증될 수 있지만 모노아민 릴리스를 검사하지 않은 5,6,7. 이 방법은 전기 화학 적 검출과 결합 된 HPLC를 사용하여 급성 뇌 슬라이스에서 모아민의 내인성 방출을 측정하도록 설계된 새로운 식기제를 제공합니다.
이 방법을 사용하는 동안, 뇌 조직이 악화를 방지하기 위해 실험 중에 산소 버퍼에 차가운 유지하는 것이 중요합니다. 또한 사용되는 조직이 단일 아민 분해를 방지하기 위해 pargyline을 포함하는 버퍼에서 활성화되는 것이 중요합니다. 또한, 실험자는 이 방법의 여러 측면을 문제 해결해야 할 수도 있다. 첫째, 동물의 발달 시점이나 종에 따라, 하나는 작거나 더 큰 섹션을 만들거나 조건 당 더 많거나 적은 섹션, 슬라이스 또는 펀치를 사용해야 할 수 있습니다. 둘째, 관심의 뇌 영역에 따라, 각 신경 전달 물질의 다양 한 금액이 있을 것입니다. 셋째, 지적될 때 산소의 일관된 버블링을 보장하는 것이 중요하지만, 실험자는 이 우물에서 조직의 우발적인 제거로 이어질 수 있으므로 과잉 산소를 제공하지 않도록주의해야합니다. 마지막으로 다양한 유형의 HPLC 장치와 다른 분리 열이 있기 때문에 실험자는 어떤 장치 또는 열이 실험에 가장 적합한지 문헌에 기초하여 결정해야 합니다.
이 방법은 실험자가 내인성 모노아민 방출에 대한 전 생체 내 데이터를 신속하고 정확하게 얻을 수 있는 기능을 제공하지만, 염두에 두어야 할 한계가 있습니다. 이것은 ex vivo 접근 방식이므로 네트워크와 연결이 끊어지므로 슬라이스 또는 펀치는 그대로 시스템을 대표하지 않습니다. 이 방법의 또 다른 중요한 한계는 시간적 부족이며, 모노아민 방출이 분 단위로 측정되고, 방출 사이트의 인구에서 공간 해상도가 측정된다는 것입니다. 향후 접근 방식을 개선하면 시간과 공간 해상도를 최적화할 수 있습니다. 추가 실험은 또한 릴리스 이벤트와 관련된 메커니즘을 검사합니다. 현재 방법의 타당성을 입증한 후, 미래의 실험은 모노아민 방출로 이어지는 분자 이벤트를 해부해야 합니다. 추가 실험에는 Ca2+-free efflux 버퍼, 추가 컨트롤로 VEsicular 방출의 선택적 억제제가 포함됩니다. 모노아민과 수송기의 지역 분포는 세 가지 독립적 인 사건이기 때문에, 미래의 실험은 다른 약물 조건이 짧거나 더 긴 잠복 시간을 필요로 할 수 있기 때문에, 더 광범위한 약리학 및 시간 과정 연구를 통합해야합니다. 예를 들어, 지역 분포 또는 사용되는 조직의 유형에 기초하여, 추가 실험은 desipramine, 플루옥세틴 및 GBR12909와 같은 NET, SERT 또는 DAT에 대해 보다 구체적인 약리학적 차단제를 각각 사용할 수 있다. 추가, 비록 조직 실험 을 통해 실행 가능한 남아, 실험자 단일 광산 수송 기능 전체 과정의 기간 동안 영향을 되었을 수 있습니다 가능성을 배제 할 수 없습니다. 이 방법에 필요한 장비는 저렴한 비용으로 비용이 많이 들지만 고가의 HPLC-ECD에 액세스 할 필요가 있습니다. 이는 현재 많은 사람들이 공동 사용을 위해 HPLC-ECD에 액세스할 수 있기 때문에 핵심 시설에 의해 완화될 수 있습니다. 이러한 한계에도 불구하고, 현재의 방법은 모노아민 방출을 조사하기 위해 추가로 조작 될 수있는 기본 절차를 제공합니다.
일반적으로,이 방법은 다른 뇌 영역에서 ex vivo 급성 뇌 조각을 사용하여 성인 설치류 뉴런에서 모노 아민의 동시 방출을 평가하기 위해 간단하고 높은 처리량 및 저렴한 2 단계 절차를 제공합니다. 이상적으로, 이 방법은 생체 내 프로토콜과 결합될 수 있고, 따라서 실험자가 동물 복지의 "3Rs"(교체, 감소 및 정제)에서 권장되는 바와 같이 생체 모델에서 요구되는 동물의 수를 감소시킬 수 있도록 예비 데이터를 제공한다. 따라서, 모야민 집약증에서 의변과 관련된 조건의 치료를 위한 새로운 약리학제를 발견하는 것을 목표로 잠재적으로 치료 분자의 검열을 위한 이 ex vivo 플랫폼을 구현하는 것이 가능하다.
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Disclosures
저자는 공개가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 J.A.P.에 폰데시트 개시 기금 N 11191049, NIH는 G.E.T.에 DA038598을 보조금으로 지원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 Well plate | NA | NA | Assay |
| Acetonitrile | Fischer Scientific | A998-1 | Mobile Phase |
| Calcium Chloride Ahydrous | Sigma Aldrich | C1016 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Clarity Software | Anetc | ||
| Citric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 1002608421 | Dissection Buffer |
| DMF | Sigma Aldrich | D4551 | MTT Assay |
| EDTA-Na2 | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| GraphPad Software | Graphpad Software, Inc | Statistical Analysis | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Lysis buffer |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Lysis buffer |
| HPLC, Decade Amperometric | Anetc | HPLC, LC-EC system | |
| HPLC | Amuza | HPLC HTEC-510. | |
| L-Asrobic Acid | Sigma Aldrich | A5960 | Dissection Buffer |
| Magnesium Sulfate | Sigma | 7487-88-9 | KH Buffer |
| Microcentrifuge Filter Units UltraFree | Millipore | C7554 | Assay - 6 to fit in 48 well plate |
| MTT | Thermo Fisher | M6494 | MTT Assay |
| Nanosep | VWR | 29300-606 | Assay; protein assay |
| Octanesulfonic acid | Sigma Aldrich | V800010 | Mobile Phase |
| Pargyline Clorohydrate | Sigma Aldrich | P8013 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Phosphoric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| Potassium Chloride | Sigma | 12636 | KH Buffer |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | 1001655559 | KH Buffer |
| Precisonary VF-21-0Z | Precissonary | Compresstome | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P2714 | Lysis buffer. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | KH Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | Lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | MTT Assay / Lysis buffer |
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