Summary
本手稿描述了一种详细的方案，用于生成3D人骨骼肌微系统和微创下游功能原位测定阵列，包括收缩力和钙处理分析。
Abstract
骨骼肌的三维（3D）体外模型是生物医学研究的宝贵进步，因为它们提供了以可扩展格式研究骨骼肌改造和功能的机会，该格式适合实验操作。3D肌肉培养系统是可取的，因为它们使科学家能够在人类细胞的背景下离体研究骨骼肌。3D体外模型密切模仿成人骨骼肌天然组织结构的各个方面。然而，它们的普遍应用受到平台可用性的限制，这些平台易于制造，成本高，用户友好，并且产生相对大量的人体骨骼肌组织。此外，由于骨骼肌在许多疾病状态下起着重要的功能作用，随着时间的推移会受损，因此当微创钙瞬时和收缩力测量可以直接在平台本身内进行微创钙瞬时和收缩力测量时，微组织研究的实验平台是最实用的。在该协议中，描述了称为"MyoTACTIC"的96孔平台的制造，以及大规模生产3D人体骨骼肌微组织（hMMTs）。此外，还报告了微创电刺激应用的方法，该方法能够随着时间的推移重复测量每个微量组织的骨骼肌力和钙处理。
Introduction
骨骼肌是人体最丰富的组织之一，支持关键的身体功能，如运动，热稳态和新陈代谢1。从历史上看，动物模型和二维（2D）细胞培养系统已被用于研究生物过程和疾病发病机制，以及用于测试药物治疗骨骼肌疾病的药理化合物2，3。虽然动物模型大大提高了我们对健康和疾病骨骼肌的了解，但它们的转化影响受到高成本，伦理考虑和种间差异的阻碍2，4。在转向基于人类细胞的系统来研究骨骼肌时，2D细胞培养系统由于其简单性而具有优势。但是，存在限制。这种格式通常无法概括体内自然发生的细胞 - 细胞和细胞外基质相互作用5，6。在过去的几年中，三维（3D）骨骼肌模型已成为整个动物模型和传统2D培养系统的强大替代品，因为它允许对离体7，8的生理和病理学相关过程进行建模。事实上，大量研究报告了以生物人工3D培养格式1模拟人体骨骼肌的策略。许多这些研究的一个局限性是，在从培养平台上去除肌肉组织并附着在力传感器上之后，主动力是定量的，这是破坏性的，因此，仅限于作为终点测定9，10，11，12，13，14，15，16，17，18 ，19，20，21.其他人已经设计了允许非侵入性方法测量主动力的培养系统，但并非所有方法都适合高内涵分子测试应用7，8，9，10，14，18，22，23，24，25，26，27，28 ，29.
该协议描述了在骨骼肌（Myo）微Tissue Array deviCe中制造人类肌肉微组织（hMMTs）的详细方法，以研究forCe（MyoTACTIC）平台;支持批量生产3D骨骼肌微系统的96孔板设备30。MyoTACTIC板制造方法能够在单个铸造步骤中生成96孔聚二甲基硅氧烷（PDMS）培养板和所有相应的孔特征，因此每个孔需要相对较少的细胞来形成微组织。在MyoTACTIC中形成的微组织包含对齐，条纹和多核的肌管，这些肌管可以从设备的孔到孔重复，并且在成熟时可以对原位的化学和电刺激做出反应30。本文概述并讨论了从聚氨酯（PU）复制品制造PDMS肌定向培养板装置的技术，实现永生化人肌原祖细胞以制造hMMT的优化方法，以及工程hMMT力产生和钙处理特性的功能评估。
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Protocol
1. PDMS肌定向板制造
注：PDMS肌定向板制造需要PU负模，其制造方式可如前所述30。用于 MyoTACTIC 板设计的计算机辅助设计 （CAD） SolidWorks 文件已在 GitHub （https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file） 上提供。
- 使用有机硅弹性体试剂盒中的组分，以1：15的比例在一次性塑料杯中以单体与固化剂的比例制备〜110g PDMS聚合物溶液。使用5 mL一次性血清移液管搅拌聚合物溶液2-3分钟，直到完全混合和均匀。
注意：避免PDMS聚合物溶液与皮肤和眼睛接触;并避免吸入。处理液体PDMS混合物时，请始终穿着实验室外套和一次性手套，并参考安全数据表（SDS）了解特定的安全协议。
注意：在PDMS聚合物溶液溢出的情况下，用一次性覆盖物保护设备表面（例如，秤，台面等）。 - 通过将杯子放在与标准负载干真空泵相连的台式真空室中约30分钟，或直到所有气泡被除去，在室温下对混合物进行脱气。每5-10分钟打破真空，以帮助脱气。根据需要，使用空的50 mL注射器筒将空气浸入并吹出聚合物混合物表面上的任何剩余气泡。
注：一块6.35 mm内径管可用于将P1250移液器吸头连接到滚筒，以提高气流的速度和精度。 - 当PDMS聚合物溶液脱气时，用干纸巾轻轻擦拭边缘和表面，以清除粘附在PU负极模具上的任何剩余PDMS碎片。使用设施压缩空气，设置为70-100 kPag以去除剩余的细颗粒。
注意：将PU负极模具放入可密封的塑料袋中并将其存放在实验室交通保护的抽屉中，以保护PU负极模具免受损坏和颗粒积聚。 - 将PU模具放在用一次性覆盖物保护的化学罩中。将模具水平放置至~75°，并用均匀的脱模剂喷涂活性表面。从上到下喷涂模具，然后从左到右，同时将罐头保持在距离模具15-20厘米处，并使用流体来回扫地运动。将模具旋转180°并重复喷洒，然后让PU模具在化学罩中放置10-15分钟以干燥。
注意：确保在化学通风橱内使用脱模剂，避免接触皮肤和眼睛，并参考安全数据表（SDS）了解特定的安全协议
注意：薄膜需要完全覆盖活性表面，但过多的涂层可能会在下一步转移到PDMS，这反过来又会对hMMT播种产生负面影响。表面应该感觉光滑，但不是湿的。 - 将100克PDMS均匀倒入PU模具中，并放入与旋片真空泵相连的真空室中。对PDMS填充的模具进行脱气约45分钟，在前20分钟内每5-10分钟打破真空密封以加速该过程。留在真空室中，直到PDMS混合物完全没有所有气泡。
注：旋片真空泵用于实现较低的真空度并减少此步骤所需的时间。PDMS填充模具的脱气可以使用台式真空室和标准负荷型干式真空泵进行，但是，排空所有气泡混合物的时间会更长。至关重要的是去除PDMS聚合物溶液中的所有气泡，特别是在那些注定要成为hMMT锚杆的区域。该区域的气泡将导致锚固后断裂，培养井的损失，进而导致一小块PDMS残留在模具中。 - 将脱气的PDMS填充PU模具转移到65°C的烘箱中，孵育过夜以固化液体橡胶。
- 从烘箱中取出固化的PDMS正极板，并在室温下冷却板至少30分钟。
- 使用无刃手术刀，通过在PDMS和模具壁之间运行手柄背面，轻轻地将固化的PDMS与PU模具分离。沿着上边缘开始并分离所有4个侧面，然后向下推到模具的底部并分离此部分。当手柄的背面在PDMS和PU模具的所有4壁之间平稳运行时，此步骤就完成了。
注意：使用无刀片手术刀缓慢小心地工作，以防止PU模具破裂或撕裂PDMS。此步骤应需要15-20分钟。 - 从一端开始，使用无刃手术刀抬起PDMS的边缘，并在固化的PDMS培养板和PU模具之间工作手指。然后，用双手将手指进一步推到板下方，慢慢剥离并离开PU模具。
注意：慢慢操作，用双手均匀地剥离盘子。尽量减少弯曲，以减少锚后断裂的可能性。此步骤应需要5-10分钟。 - 使用单刃剃须刀片将板切割成6±2个MyoTACTIC孔（图1）的组，用于组织接种目的。将完整的MyoTACTIC板或板部分放入仪器灭菌袋中并在120°C和100-140 kPag下高压灭菌25分钟干循环（20分钟灭菌时间和5分钟干燥时间）。
2. 永生化人成肌细胞祖细胞培养
注意：本方案中使用的永生化成肌细胞是从Myologie研究所（法国巴黎）获得的31。
- 从液氮杜瓦瓶中获得一小瓶冷冻细胞，并在37°C水浴中快速解冻小瓶（不到1分钟）。以7.5×105 个细胞的密度冷冻每1mL冷冻培养基，包括90%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）。
- 将小瓶的内容物轻轻转移到含有9 mL预热洗涤介质的15 mL锥形管中，该洗涤介质由89%DMEM 1x，10%FBS和1%Pen / Strep组成，以稀释DMSO。以400×g旋转15mL锥形管10分钟，然后吸走培养基，小心避免细胞沉淀。
- 将沉淀重悬于1mL生长培养基中，该培养基由84%骨骼肌细胞基底培养基与骨骼肌细胞生长培养基补充剂混合物，15%FBS和1%Pen / Strep组成，然后转移到具有29mL生长培养基的50mL锥形管中。
- 将含有约2.5 x 105 个细胞的10 mL培养基转移到100 mm x 20 mm细胞培养皿中。用剩余的20mL细胞溶液重复此步骤。然后将细胞培养皿转移到设置为37°C和5%CO2的加湿细胞培养箱中。
- 每隔一天刷新培养基。培养细胞，直到它们达到约70%-80%的汇合度（通常为4-5天），此时细胞准备好进行接种。1.5 x 105 个细胞来生成每个hMMT。因此，根据需要传代细胞以达到所需数量的细胞。
注意：在将细胞接种到MyoTACTIC孔中，传代细胞或制备冷冻储备之前，永生化的肌母细胞祖细胞系不应超过80%的汇合度。由汇合度超过80%的细胞制造的hMMTs通常无法达到收缩成熟度。传代过程与下面步骤 3 中描述的方法相同。
3. 使用 MyoTACTIC 播种工程 hMMT
- 制备用于hMMT接种的MyoTACTIC培养孔和试剂。
注意：此协议提供了产生 6 个 hMMT 的特定详细信息。- 在细胞接种前2-3小时，将6孔MyoTACTIC板部分放入10cm细胞培养皿中。通过将100μL5%Pluronic F-127溶液加入每个孔中来制备每个单独的MyoTACTIC培养孔。将盖子放在10厘米培养皿上，用石蜡密封10厘米培养皿和盖子之间的空间，然后将含有MyoTACTIC部分的10厘米板放入装有板旋转适配器的离心机中。
注意：如果没有离心机板旋转适配器，可以使用p20移液器吸头小心地从柱子后面去除气泡，从而确保整个培养表面均匀涂覆。 - 以1，550×g离心1分钟，以除去培养井内的所有气泡，特别是在柱子后面。将含有含有Pluronic F-127溶液的MyoTACTIC板部分的10cm细胞培养皿储存在4°C，直到细胞准备好进行接种。
注意：Pluronic F-127涂层可以应用短至2小时至24小时。例如，可以在一天结束时用Pluronic F-127溶液填充孔，以便在第二天使用。不要超过24小时，因为这会对hMMT重塑产生负面影响，并且无法形成达到收缩成熟的健康组织。 - 在培养罩内的冰上缓慢解冻一个50μL基底膜提取物等分试样和一个10μL凝血酶等分试样（100 U / mL储备溶液）。
注意：不要重新冷冻基底膜提取物等分试样。它们是一次性使用的。凝血酶等分试样可重复使用，因此，使用后可重新冷冻多达5次。 - 在1.5mL微量离心管中称取〜7mg粉末状纤维蛋白原，然后转移到细胞培养罩中。在水（或盐水溶液）中加入700μL0.9%（重量/体积）NaCl溶液，以达到10mg / mL最终浓度溶液。不要涡旋纤维蛋白原溶解，而是将管置于37°C细胞培养箱中3-5分钟。
- 取出并轻轻拂管，然后在台式小型离心机（微型离心机）中脉冲旋转溶解的溶液并返回培养罩。使用配备0.22μm注射器过滤器的1mL注射器过滤纤维蛋白原溶液。将溶解的纤维蛋白原溶液转移到基底膜提取物和凝血酶等分试样的冰中。
- 最后，准备hMMT播种培养基，该培养基将在组织播种后引入培养井。该培养基含有骨骼肌细胞基础培养基，其中补充了20%FBS，1%P / S和3%6-氨基己酸（ACA;1.5mg / mL最终浓度是通过从50mg / mL储备溶液稀释来实现的;%表示为v / v）。使用前将培养基预热至37°C。
- 在细胞接种前2-3小时，将6孔MyoTACTIC板部分放入10cm细胞培养皿中。通过将100μL5%Pluronic F-127溶液加入每个孔中来制备每个单独的MyoTACTIC培养孔。将盖子放在10厘米培养皿上，用石蜡密封10厘米培养皿和盖子之间的空间，然后将含有MyoTACTIC部分的10厘米板放入装有板旋转适配器的离心机中。
- 制备用于hMMT接种的细胞。
- 从培养箱中收集细胞培养板。从每个培养板中吸出培养基，然后通过在每个培养板中加入5mL D-PBS来用D-PBS洗涤细胞一次。接下来吸出D-PBS并通过在每个培养皿中加入1mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA来分离细胞。置于细胞培养箱中3分钟。
- 通过向培养皿中加入3mL洗涤培养基（1x DMEM + 10%FBS + 1%Pen / Strep的89%）来停止胰蛋白酶。将细胞溶液转移到适当大小的锥形管中，然后通过以400×g离心10分钟来沉淀细胞。 吸出培养基，小心避免细胞沉淀。然后将细胞沉淀重悬于1mL洗涤培养基中。
- 在明场显微镜下使用血细胞计数器和台盼蓝染料计数细胞。
如果使用多块细胞板，这种细胞悬浮液将非常浓缩。根据需要在计数之前稀释细胞悬浮液。 - 由于每个组织需要将150，000个细胞重悬于15μL细胞外基质（ECM）混合物中，因此6个组织需要900，000个细胞在90μL ECM混合物中。为了解释在制备过程中由于气泡形成或移液器丢失而发生的细胞 - ECM溶液损失，准备额外的细胞 - ECM混合物（即，8个组织，或120μLECM中的1，200，000个细胞）。将含有1，200，000个细胞的细胞悬浮液的体积转移到新的锥形管中。用洗涤介质将体积增加到10 mL，并以400×g旋转10分钟。
- 当细胞向下旋转时，使用以下配方在1.5mL微量离心管中制备150μL ECM混合物。首先加入60μLDMEM（40%体积），然后加入60μL纤维蛋白原10mg / mL溶液（40%体积），最后加入30μL基底膜提取物（20%体积）。将ECM混合物储存在冰上直至使用。
注意：使用含有基底膜提取物的溶液时，始终使用在-20°C下预冷的吸头。ECM混合物含有4毫克/毫升纤维蛋白原。
- 播种氢甲基熊果糖
- 收集含有旋转下来的细胞的锥形管并吸出培养基，小心避免细胞沉淀。用戴着手套的手指用力轻拂管的末端以移开沉淀并继续轻拂，直到沉淀显示为细胞浆液。
注意：重要的是要吸出尽可能多的洗涤介质，以确保细胞 ECM 悬浮液处于所需的稀释度。如果需要，请使用移液器去除剩余的洗涤介质。 - 将120μL的ECM溶液转移到含有细胞沉淀的管中。上下移液以完全重悬ECM内的细胞以产生单个细胞悬浮液。缓慢而小心地移液，以避免引入气泡，这将减少工作体积。然后，将细胞 ECM 溶液放在冰上直至使用。
- 从4°C冰箱中检索含有Pluronic F-127包被的MyoTACTIC孔的MyoTACTIC平板部分，并将含有MyoTACTIC孔的10cm培养皿放在细胞培养罩内的冰袋顶部。
- 从每个孔中吸出Pluronic F-127溶液。PDMS是多孔的，将吸收Pluronic F-127溶液，特别是如果用离心机旋转板。让残留的Pluronic F-127溶液释放并沉降到井底，让孔静置5分钟，然后再次吸出。
注意：吸气Pluronic F-127溶液时，使用巴斯德移液器，末端连接p1250吸头，p200吸头覆盖p1250吸头。这将提高精度，以防止柱子结构的意外抽吸。避免用移液器刮擦孔底部的椭圆形池状细胞接种区域，因为这会破坏Pluronic F-127涂层并干扰hMMT自组织过程。正确的技术是将移液器吸头悬停在椭圆形池上，同时吸出Pluronic F-127溶液。 - 小心地移液细胞-ECM悬浮液，以重悬任何可能已经沉入管底的细胞。然后将105μL细胞ECM悬浮液转移到新鲜的预冷1.5mL管中。小心抓住靠近顶部的管子，以防止溶液变暖。
- 将0.84μL100 U / mL凝血酶储备溶液加入105μL细胞ECM悬浮液中，以达到0.2 U / mg纤维蛋白原的最终浓度。快速、小心、彻底地移液以混合，同时避免引入气泡。
注意：凝血酶启动纤维蛋白原的快速转化为纤维蛋白凝块。因此，在添加凝血酶时播种组织的时间有限。为了避免在将细胞-ECM混合物转移到培养孔中之前过早凝血，在加入凝血酶之前将p20移液器设置为15μL。使用预冷的吸头或将移液器吸头浸入冰冷的DMEM中几秒钟，然后将15μL细胞 - ECM混合物收集并转移到每个孔中。制备细胞-ECM混合物等分试样是一种最佳实践，这样一次接种的hMMT不超过6个。 - 为了接种组织，向每个孔中加入15μL细胞 - ECM混合物（即150，000个细胞）。小心地将细胞 -ECM混合物添加到椭圆形池的中心，避免将移液器尖端压入孔的底部。然后，通过两个轻动作，将细胞悬浮液散布在孔中每个柱子后面。一旦表面均匀地涂覆在细胞ECM悬浮液中，然后移动到下一个孔。
注意：有效工作，以避免在所有组织接种之前将细胞 - ECM混合物过早凝胶化在管中。在播种孔时，避免转移气泡非常重要，因为气泡会干扰hMMT的重塑，使hMMT无法使用。 - 将盖子放在含有接种孔的10cm培养板上，然后转移到37°C组织培养箱中约5分钟。
注意：将含有残留细胞-ECM混合物的微量离心管放入培养箱中，以确认凝胶聚合过程。 - 细胞 - ECM混合物聚合后，向每个MyoTACTIC孔中加入200μL预热的hMMT接种培养基。盖上10厘米培养皿的盖子，并将10厘米培养皿内的MyoTACTIC平板部分返回培养箱。此时间点称为第 -2 天。在下一步之前不要打扰组织。
- 收集含有旋转下来的细胞的锥形管并吸出培养基，小心避免细胞沉淀。用戴着手套的手指用力轻拂管的末端以移开沉淀并继续轻拂，直到沉淀显示为细胞浆液。
- 区分氢甲基熊猫
- 孵育2天后，使用移液管小心地除去hMMT播种培养基，并用200μL含有2%马血清，1%Pen / Strep，4%ACA（即，2mg / mL终浓度从50mg / mL的储备浓度;%表示为v / v）和10μg/ mL人重组胰岛素在DMEM中替换。此时间点称为分化的第 0 天。
- 此后每隔一天，用新鲜的分化培养基交换一半的培养基，直到分化的第12天，培养的最后一天（图2a）。
注意：使用原代人肌母细胞制造hMMT的协议细节已在其他地方发表30。如果存在接种后细胞活力的担忧，则用钙黄素和碘化丙啶孵育hMMTs以量化活力。
4. hMMT诱导后偏转的电刺激与分析
- 在倒置显微镜上设置透明底部玻璃或塑料载物台支架，并使用显微镜相机支架将智能手机相机连接到显微镜目镜。将使用10倍放大倍率的相差显微镜（图3a）。
注：任何配备10倍放大镜的倒置相差显微镜都是合适的。PDMS井结构将从10厘米的培养皿中取出，直接放置在透明的底台支架上，从而向空气开放。用70%乙醇对所有表面和设备进行消毒，并最大限度地减少实验过程中该区域的交通流量。 - 为了准备电刺激电极，切下约30厘米的锡涂层铜线。然后，从25 G常规斜面针的轮毂开始，将约10厘米的电线紧紧缠绕在上半部分，留下约20厘米的多余电线。重复第二根针，然后将轮毂从每根针上切下。
注意：导线必须紧紧地缠绕在针周围，以确保它不会移动，并且电极的导线缠绕部分不得接触PDMS，因为这会阻碍电场的产生。 - 将 BNC 连接到鳄鱼夹连接器电缆，连接到波形发生器上的输出通道，并设置占空比为 20%、振幅为 5 V（电场强度为 10 V/cm）的方形脉冲通道。抽搐和破伤风收缩的频率将分别在0.5 Hz和20 Hz之间变化。
注：波形发生器设置可能需要针对具体实验进行优化 - 将含有hmMT的MyoTACTIC板部分放在显微镜载物台上，并将每个电极斜角端轻轻地插入椭圆形池中每个柱子的正后方PDMS中。小心地将20厘米的多余导线部分用胶带粘到显微镜载物台上，以使针保持垂直，并且每根导线的约10厘米保持自由连接（图3a）。
注意：切勿将裸露的手指放在电极的两端。确保食指上戴着顶针，以便在插入PDMS时对电极施加轻压。 - 将显微镜的视野聚焦在两个柱子中的一个上，使得焦点在最靠近电极的柱边缘上清晰。然后，将智能手机摄像头的焦点锁定在柱子最清晰的区域。这对于下游分析非常重要，因为在记录时焦点的改变会干扰分析。
- 通过鳄鱼钳将胶带导线的自由端连接到波形发生器（图3a）。
- 在智能手机摄像头上开始视频录制，然后打开频道输出以启动刺激。诱导 hMMT 经历 3 次抽搐和 3 次破伤风收缩，在抽搐和破伤风刺激系列之间休息 2 分钟。
- 关闭通道输出，从镀锡铜线上取下鳄鱼夹，从电线上取下胶带，并用70%乙醇擦拭每个电极，然后再插入后续的hMMT孔中。对所有 hMMT 重复步骤 4.5 中的步骤。
注意：通过一次刺激不超过3个组织来限制hMMT在培养箱外花费的时间。如果MyoTACTIC板部分内的其他hMMT仍有待分析，请将板返回培养箱10分钟，以使hMMTs返回至37°C。 - 要分析后偏转以计算 hMMT 力生成，请使用自定义脚本，该脚本已在 GitHub 上提供（https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC）。按照 README.md 中的说明设置并启动脚本，然后打开每个帖子跟踪视频以执行力分析。
- 沿柱边选择要跟踪柱位移的感兴趣区域 （ROI）。按Enter确认 ROI，然后再次按 Enter运行脚本（补充视频 1）。
注：大偏转会导致智能设备出现故障。如果跟踪器在收缩期间发生故障，则可以增加ROI大小以使跟踪不那么敏感，但允许跟踪大偏转。代码中提供了三种大小，可以通过调整脚本注释进行调整。 - 该脚本以两个输入要求结束。首先，输入 y 以确认视频包含多个收缩。其次，输入 y（ 是）或 n（ 否）以将结果导出到 .CSV 文件 （补充视频 1）.
- 确保将后偏转结果报告为每次收缩的位移（以像素为单位）。将显微镜10倍放大倍率设置的像素转换为μm值。然后，通过将值（μm）乘以2.36μN / μm的力 - 位移转换因子，将位移后数转换为绝对收缩力（μN），这对应于MyoTACTIC制造中使用的PDMS的1：15固化剂与单体之比30。
5. 使用电刺激进行钙瞬态分析
注意：对于钙处理实验，如前面所述，用MHCK7-GCAMP6报告器稳定地转导了永生化成肌细胞11，12。转导细胞被FACS分选为GFP以获得阳性群体，然后用于制造hMMTs。钙成像的替代方法，例如使用比例度量染料，如Fura-2 AM和Indo-1或钙指示剂的荧光寿命成像（例如，Fluo-4或Oregon Green BAPTA1）可能适合我们的系统。
- 如前所述，设置显微镜载物台和刺激设备（电极，波形发生器等）。对于此实验，请使用 4 倍放大倍率。
注：需要一个暗室和一台配备CCD相机的落射荧光显微镜。 - 启动显微镜成像软件，选择 FITC滤光片通道 （蓝光），然后选择 动画录制功能。设置为曝光 500 毫秒，分辨率为 680 x 510（分档 2x2）。
注：成像软件可能会有所不同，曝光由用户手动设置。注意避免在刺激前过度暴露于hMMT。在休息时，带有自发荧光的深色组织轮廓/阴影是正常的，而清晰的组织图像过度暴露（补充视频2）。确保实验中所有hmMT的暴露是一致的。 - 关闭显微镜快门并保持 FITC 通道关闭，直到准备好记录钙处理情况。
- 设置完所有设备和软件后，检索包含要分析的hmMT的MyoTACTIC板部分，并将其直接设置在显微镜载物台上。然后，插入和连接电极，如前面的步骤4所述。
- 使用明场将视野聚焦在所选 hMMT 的中心。然后，关闭灯。
- 打开显微镜 FITC 通道快门，确认蓝光亮起，然后在软件中选择" 短片记录 "。
- 打开波形发生器上的输出以启动电刺激。诱导 hMMT 经历 8 次抽搐和 8 次破伤风收缩。在抽搐和破伤风刺激系列之间等待2分钟的休息，在此期间，FITC快门处于关闭位置。
注意：在电刺激之前和之后允许10秒的自发活动，以记录最小荧光，以便进行计算和数据分析。 - 关闭通道输出，从镀锡铜线上取下鳄鱼夹，从电线上取下胶带，并用70%乙醇擦拭每个电极，然后再插入后续的hMMT孔中。对所有hMMT重复刺激和记录程序。
- 以TIFF文件格式保存短片，以便在ImageJ或其他成像软件中进行分析。
注意：通过一次刺激不超过3个组织来限制hMMT在培养箱外花费的时间。如果MyoTACTIC板部分内的其他hMMT仍有待分析，请将设备返回培养箱10分钟，以使hMMTs返回至37°C。 - 要分析钙瞬态数据，请先打开ImageJ。选择分析 ，然后选择设置测量值 ，然后选择平均灰度值并取消选择所有其他选项。完成后，打开钙（.tiff）视频（补充视频2）。
- 使用多边形选择工具勾勒出微组织的边框，并将此区域另存为ROI（补充视频2）。在"ROI 管理器"窗口中的"更多"下，选择"多重测量"，并在每个切片一行处测量所有文件切片的荧光强度（补充视频 2）。
- 将所有测量值（包括切片数（帧））复制到电子表格中，并使用 ΔF/F0 = （F即刻 - F最小值）/F最小值 （补充视频 2）将每个切片的荧光强度与文件中的最小自发荧光强度进行比较。
- 通过将短片记录帧速度乘以切片数（帧）来计算每帧的时间，并绘制hMMT钙瞬态响应对刺激的ΔF / F0与时间的关系（补充视频2）。
- 选择6个连续收缩和平均值中每个峰值钙瞬时信号，以计算每个hMMT的相对平均峰值荧光强度变化（补充视频2）。
注意：始终从整体分析中排除由第一次抽搐收缩引起的数据。GitHub（https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-）上提供了一个名为"钙处理模板.xlsx"的电子表格，以方便hMMT钙瞬态分析。要输入值和输入的可填充单元格以灰色突出显示。确保调整峰值选择数字，因为这只是帮助选择峰值的指南（补充视频2）。
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Representative Results
本文描述的方法是从PU模具中铸造基于96孔PDMS的MyoTACTIC培养平台，以制造hMMT复制组织阵列，并分析培养装置内hMMT功能的两个方面 - 力生成和钙处理。图1提供了在hMMT播种前制备MyoTACTIC培养孔的示意图。PDMS是一种广泛使用的有机硅基聚合物，可以很容易地模塑成复杂的器件32。基于PDMS的协议旨在从制造的负PU模具30中铸造无限数量的96孔培养装置。最终固化的PDMS正极板是柔性的，可以借助单刃剃须刀片轻松切割成较小尺寸的功能单元（图1）。这允许用户扩展器件以满足特定于其实验设计的hMMT副本需求。这些较小的功能单元也有利于克服与快速聚合的ECM支架（例如纤维蛋白水凝胶）一起工作的限制，通过轻松调整孔的数量以匹配用户的细胞接种速度。此外，PDMS易于高压灭菌，可以无限期储存。最后，从物流的角度来看，完整的MyoTACTIC板可以被任何标准的96孔板盖覆盖，并且MyoTACTIC板部分的尺寸和轮廓适合在10cm培养板内孵育，以确保hMMT培养无菌。在细胞接种之前进行Pluronic F-127溶液包衣具有双重作用，即提供额外的培养孔灭菌措施，并作为非离子表面活性剂，防止细胞粘附，有利于均匀的细胞 - ECM重塑（图1）。
当永生化的肌原祖细胞群准备好进行实验时，然后将细胞封装在由纤维蛋白原和基底膜提取物组成的水凝胶中。然后将细胞 - ECM混合物均匀地沉积在每个MyoTACTIC孔底部的椭圆形池中，然后在14天的培养期内，细胞在这两个垂直柱上在空间上自组织，形成一个3D微组织，填充有一床对齐的，多核的，横纹肌管，类似于天然组织组织的各个方面（图2a，g，h）。在重塑过程中，在两个锚固点之间产生单轴张力，这引导组织自组织过程反过来驱动致密组织的形成。在分化期间，由来自健康患者的成肌细胞构建的hMMTs的宽度保持相当一致。然而，在发生干扰hMMT重塑的错误事件中，这种均匀性会丢失（图2a-f），这使得这个简单的指标在hMMT质量控制评估中很有用。例如，过度热衷于混合细胞 - ECM悬浮液可导致气泡的形成。气泡延续到MyoTACTIC井阻碍了hMMT的重塑。在这种情况下，气泡将部分或全部成肌细胞从气泡占据的区域移位，最终在最终的hMMT中形成一个缝隙（图2b;见红色箭头）。另一个例子涉及油井中Pluronic F-127涂层的完整性。Pluronic F-127是一种非离子表面活性剂，可防止细胞粘附在MyoTACTIC井上。如果在抽吸过程中涂层被刮掉，成肌细胞将粘附在MyoTACTIC孔的表面上，形成新的锚固点，并导致肌管在两个柱子上不对齐（图2c）。其他错误也可能导致hMMT重塑异常，如图 2d-f所示。接种后的细胞活力也可以使用基于钙黄素/碘化丙啶的染色测定法进行评估。当避免这些技术错误时，hMMT由一组对齐和多核的肌管填充，这些肌管延伸到每个hMMT的长度（图2g）。肌管在其长度和不同hmMT之间的大小相当均匀（图2h-i）。肌管的特征在于肌节条纹的存在，其通过肌节α - 肌动蛋白（SAA; 图 2h）。
也可以在hMMT中检查功能特性，从分化约7天开始。完成这些功能研究的实验设置如图3a所示。显微镜设置在振动机台的顶部;但是，完成功能调查并不需要这样做。在功能研究中，如方案的电刺激部分所述产生的电极入 PDMS 中，使得电极位于柱子后面。在插入电极之前，重要的是要对柱子区域进行良好的可视化，因为需要重新插入可能导致组织从柱子上移位。正确插入电极对于获得柱子的清晰焦点也很重要，以便随后可以使用python脚本跟踪后偏转。图3b显示了MyoTACTIC孔板柱响应于低（抽搐，0.5 Hz）和高（破伤风，20Hz）频率hMMT电刺激的代表性位移。后位移的量化可用于计算hmMT的诱导收缩力（图3c）。当该信息与hMMT横截面积相结合时，比力可以确定为30。此外，钙瞬时在肌肉收缩中起重要作用。骨骼肌成肌母细胞的稳定转导具有遗传编码的钙指示剂，如GCaMP6 12，30，33，34，能够实时监测钙瞬变12，30，34。使用上述电刺激装置分析钙瞬变，以刺激第12天的hMMTs，这些hMMTs由表达MHCK7-GCAMP6报告基因的永生化成肌细胞产生（图4a），并量化为低（抽搐，0.5 Hz）和高（破伤风，20Hz）频率电刺激期间的平均峰值荧光强度（图4b）。观察到，在不同实验中测量的hMMT钙处理特性相对一致（图4b）。偏转后和钙处理的定量方法在补充视频1和补充视频2中概述。
图1：在hMMT播种前制备MyoTACTIC PDMS板。 称为MyoTACTIC的96孔平台是通过在负性聚氨酯（PU）模具中首先固化聚二甲基硅氧烷（PDMS）来制造的。然后，将基于PDMS的培养平台从负PU模具中仔细剥离。在学术环境中，PDMS设备被切割成包含6个±2个功能孔的较小单元。然后将这些孔放入灭菌袋中，高压灭菌并储存直至使用。在使用前一天，将所需数量的设备部分放置在10厘米培养板内，并将Pluronic F-127添加到每个孔中。加入10厘米的碟盖，边缘用石板密封，然后将板在4°下孵育2-24小时 。
图2：MyoTACTIC支持hMMT自组织和对齐肌管的形成。 （a）（上图） hMMT自组织以及随后的肌管成熟在14天培养期间的示意图。（底部）具有代表性的4倍相差图像，以说明永生化成肌细胞在两个垂直柱上的自组织动力学，从而导致3D hMMT的形成。比例尺，500μm.（b-f）在分化的第12天具有代表性的hMMTs的4倍相差图像，显示hMMT结果由（b）细胞内的气泡 - 接种时的ECM（红色箭头指向气泡诱导hMMT损伤），（c）Pluronic F-127溶液涂层的错误吸入和（d-f）引起的hMMT结果）hMMT过度重塑，可能表明ECM凝胶化不当，培养基中缺乏ACA活性，对成肌细胞亲本系的不当护理等。比例尺，500 μm.（g）以 10 倍放大倍率拍摄的 Day 12 hMMT 的代表性平铺和扁平共聚焦图像。将hmMT直接固定在PDMS模具中，然后小心地取出并放置在96孔培养板中进行染色。肉瘤α肌动蛋白（SAA）以洋红色显示，Hoechst 33342核复染以青色显示。比例尺，500 μm. （h）第12天hMMT在40倍放大倍率下的代表性共聚焦图像。hMMT肌管和细胞核通过SAA（品红色）的免疫染色和Hoechst 33342（青色）的复染来可视化。比例尺，50μm.（i）分化第12天平均hMMT肌管直径的点图图。n = 来自3个生物重复 ±的8个hMMT，以符号形状区分，从而分析每个hMMT至少30个肌管。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：MyoTACTIC平台内收缩力的原位测量（a）电刺激布置的表示（左）。虽然在此设置中如图所示，但不需要振动台。智能手机摄像头和支架安装在配备荧光灯的倒置显微镜的目镜上，用于记录hMMTs电刺激位移后的视频（左）。25 G针用镀锡铜线（右下角）包裹，连接到BNC到鳄鱼夹连接器电缆（右上），并固定在任意波形发生器上。电刺激期间电极的位置显示在右下角。（b） 从分化第12天从hMMT获得的偏转后视频中拍摄的代表性快照。视频以10倍放大倍率拍摄。当 hMMT 放松时，白色实心垂直线显示柱位，而白色虚线垂直线显示高（破伤风 20 Hz）或低 （0.5 Hz） 频率刺激后的后置换。比例尺，100μm.（c）平均hMMT抽搐（0.5 Hz）和破伤风（20 Hz）诱导的收缩力在分化第12天的点图图。n = 来自 3 个生物重复的 9 个 hMMT，由符号形状区分，报告为均± SEM 值。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：MyoTACTIC平台内钙处理的原位测量（a）来自4倍放大倍率视频记录的代表性图像，记录自发GCaMP6+钙瞬变和钙瞬变响应于低（抽搐收缩，0.5 Hz）和高（破伤风收缩，20赫兹）频率电刺激。hMMT由黄色虚线勾勒出轮廓。比例尺，200 μm.（b）点图图，显示低（抽搐收缩，0.5 Hz）和高（破伤风收缩，20 Hz）频率电刺激后每个 hMMT 的平均峰值荧光强度的量化。n = 来自 3 个生物重复的 9 个 hMMT，由符号形状区分，报告为均± SEM 值。请点击此处查看此图的放大版本。
补充视频 1：演示分析挠度后数据的方法。 破伤风刺激期间由自定义脚本跟踪的第12天偏转后分析的代表性视频。首先，直接在后期跟踪脚本中选择 ROI 大小。接下来，通过选择播放按钮来运行脚本来打开视频。选择帖子的清晰聚焦区域作为ROI，并放置蓝色帖子跟踪框。 按 Enter 可锁定 ROI，然后再次按下 Enter 以运行脚本。输入"y"作为对提示"多个收缩视频？[Y/N]"，则输入"n"作为对提示"将帖子位置导出为.csv文件？[是/否]"。以像素为单位的相对位移后偏转是最终输出。 请点击此处下载此视频。
补充视频2：分析GCaMP6钙瞬态数据的方法演示。 破伤风刺激期间分化第12天的落射荧光钙处理分析的代表性视频。首先，在ImageJ中打开了钙瞬变的视频（保存为一系列tiff图像），并且用户在帧中导航，直到hMMT可见。然后，确认所需的分析测量"平均灰度值"，并使用多边形绘图工具勾勒出hMMT的轮廓。该轮廓被保存为感兴趣区域，并使用多重测量分析每个视频切片的荧光强度。这些测量值被复制到电子表格"钙处理模板"中，并填写并确认帧数据和钙瞬态峰值。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
本手稿描述了制造和分析3D hMMT培养模型的方法，该模型可应用于基础肌肉生物学，疾病建模或候选分子测试的研究。MyoTACTIC平台成本友好，易于制造，并且需要相对较少的细胞来产生骨骼肌微组织。在MyoTACTIC培养平台内形成的hMMTs由对齐，多核和横纹肌管组成，并通过启动触发收缩的钙瞬变来响应电刺激（图2，图3，图4）。先前的研究表明，hMMTs对生化刺激提供类似的反应，并且可以达到与较大格式3D骨骼肌模型12，30中报告的成熟水平相匹配。
在整个MyoTACTIC板制造和hMMT生成过程中，一个关键的主题是确保防止气泡，并且如果形成，则将其去除。为了便于单步铸造可操作的PDMS模具，在Afshar等人先前描述的初始3D打印塑料模具的下游已经生成了PU模具。已经生成的PU模具允许用户生产96孔的PDMS模具，其中最多96个孔是功能性的（包含两个柱子），如PU模具制造步骤所规定的那样。在制造PDMS MyoTACTIC板的过程中，新用户经常会错过液体PDMS中残留的较小气泡，即使在脱气后也是如此。定位到与锚固柔性柱结构相对应的PU模具区域的气泡将导致PU模具与PDMS培养板分离后断裂，并且在此过程中，在PU模具中留下一小块固化的PDMS。压缩空气可用于去除这些固化的PDMS残留物，如果不这样做，将有效地减少可用于未来板式铸件的功能井的数量。因此，在PDMS板固化之前确保所有气泡都被除去至关重要，因为该平台的一个优点是它是一个独立的设备，因此板的所有特征都在一个步骤中铸造，而不是要求手动将每个单独的微组织锚点引入培养井35， 36，37.大多数学术实验室研究不需要整个MyoTACTIC培养板。为了最大限度地利用每个PMDS板，它被手动切割成6±2个MyoTACTIC孔的组。为了改进这一过程，允许用户剥离6±2个MyoTACTIC孔的功能单元的PU模具可以完全消除此板切割步骤。此外，在混合时或在组织接种过程中引入细胞ECM溶液中的大气泡将损害适当的组织形成。这些大气泡将细胞从气泡占据的区域移位，通常导致hMMT具有具有很少肌管的区域，这些区域将屈服于收缩应激并在电刺激期间折断。
MyoTACTIC的一个显着优点是能够原位量化主动力的产生和钙处理特性。这是许多其他3D培养系统面临的挑战，其中研究3D组织收缩力在从培养设备12，37中移除组织后作为终点测定实现。因此，MyoTACTIC非常适合支持纵向研究，例如，了解药物治疗对骨骼肌的时间影响。本文所述的用于原位定量活性力产生和钙处理特性的方法的一个局限性是手动放置电极，这限制了该系统在高内涵分子测试应用中的使用。一种可能的解决方案是设计一个透明的电极盖，设置为一个平行电路，可以直接插入一组标准化的功能孔中，从而能够同时对多个组织进行电刺激。或者，使用稳定表达通道视紫红质构建体的肌原祖细胞系将允许肌肉细胞膜去极化，从而允许由蓝光照射诱导的组织收缩。此外，在视频中捕获主动力，因为通过使用自定义的半自动python脚本来跟踪短视频中的偏转后，可以无偏的方式对主动收缩力进行后偏转和量化。因此，MyoTACTIC30能够对受激的收缩力进行无偏的纵向评估。为了提高数据分析的效率，智能手机应用程序旨在测量力，同时捕获后偏转的视频，是提高吞吐量的理想选择。
最后，该平台的价值也曾在其准确预测药物反应的能力中得到描述。与临床结果类似，我们之前已经报道过，用肌毒性化合物（地塞米松，西伐他汀）治疗hMMTs（由原代成肌细胞制成）诱导肌管萎缩并降低活性收缩力30。此外，MyoTACTIC产生的hMMTs的预测价值通过表明用于治疗胰腺癌（一种通常与恶病质2相关的疾病）的化疗药物的临床相关剂量显着降低了hMMT质量和收缩力30来验证。因此，MyoTACTIC的简单制造及其在3D hMT生成中的易用性显示出高内涵数据捕获的许多优势，其在结构和功能输出方面的可靠性证明了这一点。基于PDMS的细胞培养设备的一般局限性是PDMS吸附蛋白质。本文中描述的方法利用含血清的培养基，其通过"阻断"装置并允许观察分子和药物治疗的作用来克服这一限制。然而，由于这种局限性，应避免关于分子剂量的明确结论，并鼓励剂量反应曲线。相反，该平台不适合无血清微量培养物，因为添加剂会吸附到PDMS上，从而阻碍组织的健康和发育。未来，集成3D生物打印和/或自动化液体处理等技术将提高制造hMMT培养物的通量。
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Disclosures
作者没有利益冲突要声明。
Acknowledgments
我们要感谢Mohammad Afshar，Haben Abraha，Mohsen Afshar-Bakooshli和Sadegh Davoudi为MyoTACTIC培养平台的发明做出了贡献，并建立了本文所述的制造和分析方法。HL获得了自然科学与工程研究委员会（NSERC）器官芯片工程和创业奖学金培训计划和多伦多大学野猫研究生奖学金的资助。PMG是加拿大内源性修复研究主席，并获得了安大略省再生医学研究所，干细胞网络和加拿大第一研究卓越计划Medicine by Design对这项研究的支持。逻辑示意图是使用 BioRender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma - Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma - Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma - Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma - Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma - Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope - Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma - Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma - Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
References
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