Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

मानव कंकाल मांसपेशी माइक्रोटिस्यूस में कंकाल मांसपेशी स्वास्थ्य के कार्यात्मक मैट्रिक्स का आकलन

Published: February 18, 2021 doi: 10.3791/62307
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

Summary

यह पांडुलिपि 3 डी मानव कंकाल मांसपेशी माइक्रोटिस्यूज की सरणी का उत्पादन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करती है और अनुबंध बल और कैल्शियम हैंडलिंग विश्लेषण सहित कार्य के सीटू परख में न्यूनतम आक्रामक डाउनस्ट्रीम है।

Abstract

कंकाल की मांसपेशी के विट्रो मॉडल में त्रि-आयामी (3 डी) जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक मूल्यवान उन्नति है क्योंकि वे कंकाल मांसपेशियों में सुधार और एक स्केलेबल प्रारूप में कार्य करने का अवसर प्रदान करते हैं जो प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए उत्तरदायी है। 3 डी मांसपेशी संस्कृति प्रणालियां वांछनीय हैं क्योंकि वे वैज्ञानिकों को मानव कोशिकाओं के संदर्भ में कंकाल मांसपेशी पूर्व वीवो का अध्ययन करने में सक्षम बनाते हैं। 3 डी इन विट्रो मॉडल वयस्क कंकाल की मांसपेशियों की देशी ऊतक संरचना के पहलुओं की बारीकी से नकल करते हैं। हालांकि, उनका सार्वभौमिक अनुप्रयोग उन प्लेटफार्मों की उपलब्धता से सीमित है जो निर्माण, लागत और उपयोगकर्ता के अनुकूल सरल हैं, और मानव कंकाल मांसपेशियों के ऊतकों की अपेक्षाकृत उच्च मात्रा में उपज देते हैं। इसके अतिरिक्त, चूंकि कंकाल की मांसपेशी एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक भूमिका निभाती है जो कई रोग राज्यों में समय के साथ बिगड़ा हुआ है, माइक्रोटिस्यूई अध्ययन के लिए एक प्रयोगात्मक मंच सबसे व्यावहारिक है जब न्यूनतम आक्रामक कैल्शियम क्षणिक और अनुबंध बल माप सीधे मंच के भीतर ही आयोजित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, एक 96-अच्छी मंच का निर्माण जिसे 'मायोटैक्टिक' के नाम से जाना जाता है, और 3 डी मानव कंकाल मांसपेशी माइक्रोटिस्यूज़ (एचएमएमटीएस) के सामूहिक उत्पादन का वर्णन किया गया है। इसके अलावा, विद्युत उत्तेजना के न्यूनतम आक्रामक अनुप्रयोग के तरीके जो कंकाल की मांसपेशियों के बल और समय के साथ प्रत्येक माइक्रोटिस्यू के कैल्शियम हैंडलिंग के दोहराए गए माप को सक्षम बनाता है।

Introduction

कंकाल की मांसपेशी मानव शरीर में सबसे प्रचुर मात्रा में ऊतकों में से एक है और लोकोमोशन, हीट होमोस्टेसिस और मेटाबोलिज्म जैसे प्रमुख शरीर के कार्यों का समर्थन करती है1। ऐतिहासिक रूप से, पशु मॉडल और दो आयामी (2डी) सेल संस्कृति प्रणालियों का उपयोग जैविक प्रक्रियाओं और रोग रोगजनकों का अध्ययन करने के साथ-साथ कंकाल मांसपेशियों की बीमारियों के उपचार में औषधीय यौगिकों के परीक्षण के लिए किया गया है2,3। जबकि पशु मॉडलों ने स्वास्थ्य और रोग में कंकाल की मांसपेशियों के बारे में हमारे ज्ञान में बहुत सुधार किया है, उनके अनुवादीय प्रभाव को उच्च लागत, नैतिक विचारों और अंतरप्रजातिमतभेदों 2,4से बाधित किया गया है। कंकाल की मांसपेशियों का अध्ययन करने के लिए मानव कोशिका आधारित प्रणालियों की ओर मुड़ने में, 2डी सेल संस्कृति प्रणालियां उनकी सादगी के कारण अनुकूल हैं। हालांकि इसकी एक सीमा भी है। यह प्रारूप अक्सर कोशिका-कोशिका और सेल-एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स इंटरैक्शन को फिर से काटने में विफल रहता है जो शरीर के भीतर स्वाभाविक रूप से होते हैं5,6. पिछले कई वर्षों में, तीन आयामी (3 डी) कंकाल मांसपेशी मॉडल शारीरिक और रोग प्रासंगिक प्रक्रियाओं पूर्व वीवो7,8 के मॉडलिंग की अनुमति देकर पूरे पशु मॉडल और पारंपरिक 2 डी संस्कृति प्रणालियों के लिए एक शक्तिशाली विकल्प के रूप मेंउभराहै । दरअसल, अध्ययनों की अधिकता एक जैव कलानीय 3 डी संस्कृति प्रारूप1में मानव कंकाल मांसपेशी मॉडल के लिए रणनीतियों की सूचना दी है । इनमें से कई अध्ययनों के लिए एक सीमा यह है कि संस्कृति प्लेटफार्मों से मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने और एक बल ट्रांसड्यूसर के प्रति लगाव के बाद सक्रिय बल की मात्रा निर्धारित की जाती है, जो विनाशकारी हैऔर इसलिए, एक अंत बिंदु परख9,10, 11,12,13,14,15,17, 18के रूप में सेवा करने तक सीमित है ,19,20,21. अन्य लोगों ने संस्कृति प्रणालियों को डिजाइन किया है जो सक्रिय बल को मापने के गैर-आक्रामक तरीकों की अनुमति देते हैं, लेकिन सभी उच्च सामग्री अणु परीक्षण अनुप्रयोगों7, 8,9,10,14, 18,22, 23,24,25,26,27, 28के लिए उत्तरदायी नहीं हैं ,29.

यह प्रोटोकॉल कंकाल की मांसपेशी (मायो) माइक्रोटिस्यू सरणी वसीयत में मानव मांसपेशी माइक्रोटिस्यूस (एचएमएमटीएस) बनाने के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है ताकि फोर्स (MyoTACTIC) मंच की जांच की जा सके; एक 96 वेल प्लेट डिवाइस 3 डी कंकाल मांसपेशी माइक्रोटिस्यूज30के थोक उत्पादन का समर्थन करता है . MyoTACTIC प्लेट निर्माण विधि एक 96 अच्छी तरह से पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) संस्कृति प्लेट की पीढ़ी को सक्षम बनाती है और एक ही कास्टिंग चरण में सभी समान अच्छी तरह से सुविधाओं को सक्षम बनाती है, जिससे प्रत्येक अच्छी तरह से माइक्रोटिस्यूई गठन के लिए अपेक्षाकृत कम संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। MyoTACTIC के भीतर गठित माइक्रोटिस्यूस में गठबंधन, स्ट्रिएटेड और बहुनीय मायोट्यूब होते हैं जो डिवाइस के अच्छी तरह से अच्छी तरह से पुन: उत्पन्न होते हैं, और परिपक्वता पर, सीटू30में रासायनिक और विद्युत उत्तेजनाओं का जवाब दे सकते हैं। इसके साथ ही, पॉलीयूरेथेन (पीयू) प्रतिकृति से पीडीएमएस मायोटेक्टिक कल्चर प्लेट डिवाइस का निर्माण करने की तकनीक, एचएमएमटी बनाने के लिए अमर मानव मायोजेनिक प्रोजेनिटर कोशिकाओं को लागू करने के लिए एक अनुकूलित विधि, और इंजीनियर एचएमएमटी बल उत्पादन और कैल्शियम हैंडलिंग गुणों के कार्यात्मक मूल्यांकन को रेखांकित और चर्चा की जाती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. पीडीएमएस MyoTACTIC प्लेट निर्माण

नोट: PDMS MyoTACTIC प्लेट निर्माण के लिए एक पीयू नकारात्मक मोल्ड की आवश्यकता होती है, जिसे पहले वर्णित30के रूप में निर्मित किया जा सकता है। MyoTACTIC प्लेट डिजाइन के लिए कंप्यूटर-एडेड डिजाइन (सीएडी) सॉलिडवर्क्स फाइल गिटहब (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file) पर उपलब्ध कराया गया है।

  1. सिलिकॉन इलास्टोमर किट में घटकों का उपयोग करके एजेंट के इलाज के लिए मोनोमर के 1:15 अनुपात में एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक कप में पीडीएमएस बहुलक समाधान के ~ 110 ग्राम तैयार करें। पूरी तरह से मिश्रित और समरूप होने तक 5 एमएल डिस्पोजेबल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके 2-3 मिनट के लिए बहुलक समाधान हिलाएं।
    सावधानी: त्वचा और आंखों के साथ पीडीएमएस बहुलक समाधान संपर्क से बचें; और साँस लेने से बचें। तरल पीडीएमएस मिश्रण को संभालते समय हमेशा एक प्रयोगशाला कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें और विशिष्ट सुरक्षा प्रोटोकॉल के लिए सुरक्षा डेटा शीट (एसडीएस) का उल्लेख करें।
    नोट: पीडीएमएस बहुलक समाधान रिसाव के मामले में डिस्पोजेबल कवर के साथ उपकरण सतहों (जैसे, स्केल, बेंच टॉप, आदि) की रक्षा करें।
  2. एक बेंचटॉप वैक्यूम कक्ष के भीतर कप रखने के द्वारा कमरे के तापमान पर मिश्रण डेगास ~ 30 मिनट के लिए एक मानक शुल्क सूखी वैक्यूम पंप से जुड़े, या जब तक सभी बुलबुले हटा रहे हैं । degassing में सहायता करने के लिए हर 5-10 मिनट वैक्यूम तोड़ें। हवा को डुबकी लगाने और जरूरत के अनुसार बहुलक मिश्रण की सतह पर किसी भी शेष बुलबुले को उड़ाने के लिए एक खाली 50 एमएल सिरिंज बैरल का उपयोग करें।
    नोट: 6.35 मिमी आईडी ट्यूबिंग का एक टुकड़ा हवा धारा के वेग और सटीकता में सुधार करने के लिए बैरल के लिए एक P1250 पिपेट टिप को जोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. जबकि पीडीएमएस बहुलक समाधान degassing है, पीडीएमएस के किसी भी बचे हुए टुकड़े को हटा दें पीयू नकारात्मक मोल्ड का पालन धीरे से नीचे किनारों और सतह एक सूखी कागज तौलिया के साथ पोंछते । शेष बारीक कणों को हटाने के लिए 70-100 kPag के लिए सेट सुविधा संकुचित हवा का उपयोग करें।
    नोट: पीयू नकारात्मक मोल्ड को नुकसान से बचाते हैं और इसे सील करने योग्य प्लास्टिक बैग में रखकर और प्रयोगशाला यातायात से संरक्षित दराज के भीतर भंडारण करके कण संचय से बचाते हैं।
  4. पीयू मोल्ड को केमिकल हुड में रखें जिसे डिस्पोजेबल कवरिंग से सुरक्षित रखा गया हो। ~ 75° पर क्षैतिज मोल्ड खड़े हो जाओ और रिलीज एजेंट की एक भी परत के साथ सक्रिय सतह स्प्रे। मोल्ड को ऊपर से नीचे तक स्प्रे करें, फिर बाएं से दाएं, मोल्ड से 15-20 सेमी पकड़ सकते हैं और आगे और पीछे व्यापक गति का उपयोग कर सकते हैं। मोल्ड को 180° घुमाएं और स्प्रे दोहराएं, फिर पीयू मोल्ड को सूखने के लिए 10-15 मिनट के लिए रासायनिक हुड में बैठने दें।
    सावधानी: सुनिश्चित करें कि रिलीज एजेंट का उपयोग रासायनिक धुएं हुड के भीतर किया जाता है, त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें, और विशिष्ट सुरक्षा प्रोटोकॉल के लिए सुरक्षा डेटा शीट (एसडीएस) का उल्लेख करें
    नोट: एक पतली फिल्म को पूरी तरह से सक्रिय सतह को कवर करने की जरूरत है, लेकिन अत्यधिक कोटिंग अगले चरण में पीडीएमएस को स्थानांतरित किया जा सकता है, जो बदले में एचएमएमटी सीडिंग को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। सतह को स्पर्श करने के लिए चालाक महसूस करना चाहिए लेकिन गीला नहीं।
  5. पीडीएमएस के 100 ग्राम को समान रूप से पीयू मोल्ड में डालें और रोटरी वेन वैक्यूम पंप से जुड़े वैक्यूम चैंबर के भीतर रखें। इस प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए पहले 20 मिनट के लिए वैक्यूम सील हर 5-10 मिनट को तोड़ते हुए ~ 45 मिनट के लिए पीडीएमएस से भरे मोल्ड को डेगास करें। वैक्यूम कक्ष के भीतर छोड़ दें जब तक कि पीडीएमएस मिश्रण सभी बुलबुले से पूरी तरह से शून्य न हो जाए।
    नोट: एक रोटरी फली वैक्यूम पंप एक कम वैक्यूम प्राप्त करने और इस कदम के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है । पीडीएमएस से भरे मोल्ड का डेगासिंग बेंचटॉप वैक्यूम चैंबर और मानक शुल्क शुष्क वैक्यूम पंप का उपयोग करके किया जा सकता है, हालांकि, सभी बुलबुले के मिश्रण को शून्य करने का समय लंबा होगा। क्या आवश्यक है पीडीएमएस बहुलक समाधान से सभी बुलबुले को हटाने, विशेष रूप से उन क्षेत्रों में hMMT प्रस्तोता पदों बनने के लिए किस्मत में है । इस क्षेत्र में बुलबुले लंगर पोस्ट टूटना में परिणाम होगा, संस्कृति कुओं के नुकसान, और बदले में PDMS का एक छोटा सा टुकड़ा में परिणाम मोल्ड में अंकित शेष ।
  6. डिगैस्ड पीडीएमएस से भरे पीयू मोल्ड को 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में स्थानांतरित करें, तरल रबर को ठीक करने के लिए रात भर इनक्यूबेटिंग करें।
  7. ओवन से ठीक पीडीएमएस पॉजिटिव प्लेट निकालें और कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट को ठंडा करें।
  8. ब्लेडलेस स्केलपेल के साथ, धीरे-धीरे पीडीएमएस और मोल्ड की दीवारों के बीच हैंडल के पीछे चलकर पीयू मोल्ड से पीडीएमएस को अलग कर दिया। ऊपरी किनारे के साथ शुरू करें और मोल्ड के आधार पर नीचे धकेलने और इस हिस्से को अलग करने से पहले सभी 4 पक्षों को अलग करें। यह कदम तब पूरा होता है जब हैंडल का पिछला हिस्सा पीडीएमएस और पीयू मोल्ड की सभी 4 दीवारों के बीच सुचारू रूप से चलता है।
    नोट: पीयू मोल्ड को क्रैक करने या पीडीएमएस को फाड़ने से रोकने के लिए ब्लेडलेस स्केलपेल के साथ धीरे-धीरे और सावधानी से काम करें। यह कदम 15-20 मिनट उठाना चाहिए।
  9. एक छोर से शुरू, पीडीएमएस के किनारे को उठाने और ठीक पीडीएमएस कल्चर प्लेट और पीयू मोल्ड के बीच काम करने वाली उंगलियों को उठाने के लिए ब्लेडलेस स्केलपेल का उपयोग करें। फिर, दोनों हाथों का उपयोग करके, प्लेट के नीचे उंगलियों को आगे बढ़ाएं, धीरे-धीरे पीयू मोल्ड से ऊपर और बाहर छीलने लगे।
    नोट: धीरे-धीरे काम करें और प्लेट को समान रूप से छीलने के लिए दोनों हाथों का उपयोग करें। एंकर पोस्ट टूटना की संभावना को कम करने के लिए झुकने को कम करें। यह कदम 5-10 मिनट उठाना चाहिए।
  10. ऊतक सीडिंग उद्देश्यों के लिए प्लेट को 6 ± 2 MyoTACTIC कुओं(चित्रा 1)के समूहों में काटने के लिए एक एकल किनारे रेजर ब्लेड का उपयोग करें। पूर्ण MyoTACTIC प्लेटें, या प्लेट भागों, एक उपकरण नसबंदी बैग में रखें और 120 डिग्री सेल्सियस और 100-140 kPag पर 25 मिनट शुष्क चक्र (नसबंदी समय के 20 मिनट, और 5 मिनट शुष्क समय) के लिए ऑटोक्लेव रखें।

2. अमर मानव मायोब्लास्ट जनक कोशिकाओं की संस्कृति

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अमर मायोब्लास्ट इंस्टीटयूट डी मायोलोजी (पेरिस, फ्रांस)31से प्राप्त किए गए थे।

  1. तरल नाइट्रोजन देवर से जमे हुए कोशिकाओं की एक शीशी प्राप्त करें और 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान (1 मिनट से कम समय में) में शीशी को जल्दी गल लें। कोशिकाओं को 7.5 x 10 5 कोशिकाओं प्रति1 मिली लीटर ठंड मीडिया के घनत्व पर जमे हुए हैं जिसमें 90% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 10% डिमेथाइल सल्फॉक्साइड (डीएमएसओ) शामिल हैं।
  2. धीरे-धीरे शीशी की सामग्री को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें जिसमें 9 एमएल पूर्व-गर्म धोने के माध्यम से 89% डीएमईएम 1x, 10% एफबीएस और 1% पेन/स्ट्रीप शामिल हैं। 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर 15 एमएल शंकु नली स्पिन और फिर दूर सेल गोली से बचने के लिए ध्यान ले मीडिया आकांक्षी।
  3. ग्रोथ मीडिया के 1 एमसीएल में गोली को फिर से रीसस्ट करें जिसमें कंकाल मांसपेशी सेल ग्रोथ मीडियम सप्लीमेंट मिक्स, 15% एफबीएस और 1% पेन/स्ट्रेप के साथ 84% कंकाल मांसपेशी सेल बेसल मीडियम शामिल हैं और फिर 29 एमएल ग्रोथ मीडिया के साथ 50 एमएल शंकु नली में ट्रांसफर करें।
  4. 100 मिमी x 20 मिमी सेल कल्चर डिश में लगभग 2.5 x10 5 कोशिकाओं वाले मीडिया के 10 एमएल को स्थानांतरित करें। सेल समाधान के शेष 20 एमएल के साथ इस कदम को दोहराएं। फिर सेल कल्चर डिश को ह्यूमियटिफाइड सेल कल्चर इनक्यूबेटर में ट्रांसफर करें जो 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर सेट है ।
  5. हर दूसरे दिन संस्कृति मीडिया को ताज़ा करें। कोशिकाओं को तब तक संस्कृति दें जब तक कि वे ~ 70%-80% संकुचन (आमतौर पर 4-5 दिन) प्राप्त नहीं करते, जिस बिंदु पर कोशिकाओं को सीडिंग के लिए तैयार किया जाता है। प्रत्येक एचएमएमटी उत्पन्न करने के लिए 1.5 x10 5 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इसलिए, कोशिकाओं की अपेक्षित संख्या को प्राप्त करने के लिए आवश्यकतानुसार कोशिकाओं को पारित करना।
    नोट: अमर myoblast जनक कोशिका लाइनों MyoTACTIC कुओं में कोशिकाओं बोने से पहले ८०% की मजबूती से अधिक नहीं होना चाहिए, कोशिकाओं passaging, या फ्रीजर स्टॉक तैयार । 80% से अधिक क्षमता वाले कोशिकाओं से निर्मित एचएमएमटी अक्सर संकुचन परिपक्वता तक पहुंचने में विफल रहते हैं। पासेजिंग प्रक्रियाएं चरण 3 में नीचे वर्णित तरीकों के समान हैं।

3. मायोटैक्टिक के साथ सीडिंग इंजीनियर एचएमएमटीएस

  1. एचएमएमटी सीडिंग के लिए मायोटैक्टिक कल्चर वेल्स और रिएजेंट्स की तैयारी।
    नोट: यह प्रोटोकॉल 6 एचएमएमटीएस का उत्पादन करने के लिए विशिष्ट विवरण प्रदान करता है।
    1. सेल सीडिंग से पहले 2-3 घंटे, 10 सेमी सेल कल्चर डिश में 6 अच्छी तरह से मायोटैक्टिक प्लेट भाग रखें। प्रत्येक अच्छी तरह से 5% प्लेरोनिक एफ-127 समाधान के 100 माइक्रोल जोड़कर प्रत्येक व्यक्ति MyoTACTIC संस्कृति को अच्छी तरह से तैयार करें। 10 सेमी कल्चर डिश पर ढक्कन लगाएं, 10 सेमी डिश और ढक्कन के बीच की जगह को सील करने के लिए पैराफिन लगाएं, और फिर 10 सेमी प्लेट को एक प्लेट स्पिनर एडाप्टर के साथ आउटफिट एक अपकेंद्रित्र भाग में रखें।
      नोट: यदि एक अपकेंद्रित्र प्लेट स्पिनर एडाप्टर उपलब्ध नहीं है, तो पदों के पीछे से बुलबुले को ध्यान से हटाने के लिए एक p20 पिपेट टिप का उपयोग किया जा सकता है, जिससे यह सुनिश्चित होता है कि पूरी संस्कृति की सतह समान रूप से लेपित है।
    2. संस्कृति कुओं के भीतर सभी बुलबुले को हटाने के लिए, विशेष रूप से पदों के पीछे, 1 मिनट के लिए 1,550 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। 10 सेमी सेल कल्चर डिश को स्टोर करें जिसमें मायोटैक्टिक प्लेट भाग होता है जिसमें प्लूरोनिक एफ-127 समाधान होता है, जब तक कि कोशिकाएं सीडिंग के लिए तैयार न हो जाएं।
      नोट: Pluronic F-127 कोटिंग के रूप में छोटे रूप में 2 घंटे के रूप में 24 घंटे के रूप में लंबे समय के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कुओं को अगले दिन उपयोग के लिए दिन के अंत में प्लूरोनिक एफ-127 समाधान से भरा जा सकता है। 24 घंटे से अधिक न करें क्योंकि इससे एचएमएमटी रीमॉडलिंग पर नकारात्मक प्रभाव पड़ेगा और स्वस्थ ऊतक बनाने में विफल हो जाएगा जो अनुबंधित परिपक्वता तक पहुंचते हैं।
    3. धीरे-धीरे संस्कृति हुड के भीतर बर्फ पर एक 50 माइक्रोन तहखाने झिल्ली निकालने एलिकोट और एक 10 μL थ्रोम्बिन एलिकोट (100 यू/
      नोट: तहखाने झिल्ली निकालने aliquots फिर से फ्रीज मत करो। वे एकल उपयोग कर रहे हैं। थ्रोम्बिन एलिकोट पुन: प्रयोज्य होते हैं, इसलिए, उपयोग के बाद 5 बार फिर से फ्रीज करें।
    4. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में ~ 7 मिलीग्राम पाउडर फाइब्रिनोजन का वजन करें और फिर सेल कल्चर हुड में स्थानांतरित करें। 10 मिलीग्राम/एमएल अंतिम एकाग्रता समाधान पर पहुंचने के लिए पानी (या खारा समाधान) में 0.9% (wt/vol) एनएसीएल समाधान के 700 माइक्रोन जोड़ें। भंग करने के लिए भंवर फाइब्रिनोजेन न रखें, इसके बजाय ट्यूब को 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।
    5. ट्यूब को धीरे-धीरे निकालें और झटका दें, फिर पल्स एक बेंचटॉप मिनी सेंट्रलाइज (माइक्रोफ्यूज) में भंग समाधान को स्पिन करें और संस्कृति हुड पर लौटें। 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ आउटफिट किए गए 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके फाइब्रिनोजेन समाधान को फ़िल्टर करें। तहखाने झिल्ली निकालने और थ्रोम्बिन एलिकोट्स के साथ बर्फ में घुलित फाइब्रिनोजेन समाधान स्थानांतरित करें।
    6. अंत में, एचएमएमटी सीडिंग मीडिया तैयार करें जिसे ऊतकों के बोने के बाद संस्कृति कुओं में पेश किया जाएगा। इस मीडिया में कंकाल मांसपेशी सेल बेसल माध्यम 20% एफबीएस, 1% पी/एस और 3% 6-अमीनोकाप्रोइक एसिड (एसीए; १.५ मिलीग्राम/एमएल अंतिम एकाग्रता के साथ पूरक होता है ५० मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान से कमजोर करके प्राप्त किया जाता है; % v/v के रूप में व्यक्त किया जाता है । उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया को पहले से गर्म करें।
  2. एचएमएमटी सीडिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी।
    1. संस्कृति इनक्यूबेटर से सेल कल्चर प्लेट्स ले लीजिए। प्रत्येक प्लेट से मीडिया को एस्पिरेट करें, फिर प्रत्येक संस्कृति प्लेट में डी-पीबीएस के 5 एमएल जोड़कर डी-पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धोएं। इसके बाद डी-पीबीएस को अलग करते हैं और प्रत्येक संस्कृति डिश में 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 1 एमसीएल जोड़कर कोशिकाओं को अलग करते हैं। 3 मिनट के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।
    2. कल्चर डिश में 3 एमएल वॉश मीडियम (1x डीएमईएम + 10% एफबीएस + 1% पेन/स्ट्रेप का 89%) जोड़कर ट्राइप्सिन को रोकें। सेल समाधान को उचित आकार की शंकु नली में स्थानांतरित करें, और फिर कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करके गोली दें। सेल पैलेट से बचने के लिए मीडिया को ध्यान में रखते हुए एस्पिरेट करें। इसके बाद वॉश मीडियम के 1 एमएल में सेल पेलेट को रिस् पेंड करें।
    3. ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी के तहत हीमोसाइटोमीटर और ट्राइपैन ब्लू डाई का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
      यदि कोशिकाओं की कई प्लेटों का उपयोग कर, इस सेल निलंबन बहुत केंद्रित हो जाएगा । आवश्यकतानुसार गिनती से पहले पतला सेल निलंबन।
    4. चूंकि प्रत्येक ऊतक को बाह्राश मैट्रिक्स (ईसीएम) मिश्रण के 15 माइक्रोन में 150,000 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, इसलिए 6 ऊतकों के लिए ईसीएम मिश्रण के 90 माइक्रोन में 900,000 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। बुलबुला गठन या पिपेट हानि के कारण तैयारी प्रक्रिया के दौरान होने वाले सेल-ईसीएम समाधान हानि के लिए खाते में, अतिरिक्त सेल-ईसीएम मिश्रण (यानी, 8 ऊतक, या ईसीएम के 120 μL में 1,200,000 कोशिकाएं)। 1,200,000 कोशिकाओं वाले सेल निलंबन की मात्रा को एक नई शंकु नली में स्थानांतरित करें। वॉश मीडियम के साथ वॉल्यूम को 10 एमएल तक बढ़ाएं और 10 मिनट के लिए 400 एक्स जी पर स्पिन करें।
    5. जबकि कोशिकाएं नीचे घूम रही हैं, निम्नलिखित नुस्खा का उपयोग करके 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 150 माइक्रोल ईसीएम मिश्रण तैयार करें। पहले डीएमईएम (40% वॉल्यूम) के 60 माइक्रोन जोड़ें, फिर फिब्रिनोजेन 10 मिलीग्राम/एमएल समाधान (40% वॉल्यूम) के 60 माइक्रोन जोड़ें और अंत में बेसमेंट झिल्ली निकालने (20% मात्रा) के 30 माइक्रोन जोड़ें। उपयोग होने तक बर्फ पर ईसीएम मिश्रण स्टोर करें।
      नोट: हमेशा बेसमेंट झिल्ली निकालने वाले समाधानों के साथ काम करते समय -20 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-ठंडा युक्तियों का उपयोग करें। ईसीएम मिश्रण में फाइब्रिनोजेन का 4 मिलीग्राम/एमएल होता है।
  3. सीडिंग एचएमएमटीएस
    1. काता नीचे कोशिकाओं युक्त शंकु ट्यूब ले लीजिए और सेल गोली से बचने के लिए ध्यान रखते हुए मीडिया आकांक्षी। गोली को उखाड़ फेंकने के लिए एक दस्ताने उंगली के साथ ट्यूब के अंत को सख्ती से झटका दें और जब तक गोली एक सेल घोल के रूप में दिखाई देती है तब तक फ्लिकिंग जारी रखें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए जितना संभव हो उतना वॉश मीडिया को एस्पिरेट करना महत्वपूर्ण है कि सेल-ईसीएम निलंबन वांछित कमजोर पड़ने पर हो। यदि आवश्यक हो तो शेष वॉश मीडिया को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
    2. सेल पेलेट युक्त ट्यूब में ईसीएम समाधान के 120 माइक्रोन स्थानांतरित करें। एक एकल कोशिका निलंबन उत्पन्न करने के लिए ईसीएम के भीतर कोशिकाओं को अच्छी तरह से पुनर्सुखने के लिए पिपेट ऊपर और नीचे। पिपेट धीरे-धीरे और सावधानी से बुलबुले पेश करने से बचने के लिए, जो काम करने की मात्रा को कम करेगा। फिर, उपयोग होने तक सेल-ईसीएम समाधान को बर्फ पर रखें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से प्लूरोनिक एफ-127 लेपित MyoTACTIC कुओं वाले MyoTACTIC प्लेट भागों को पुनः प्राप्त करें और सेल कल्चर हुड के अंदर एक आइस पैक के शीर्ष पर मायोटैक्टिक कुओं वाले 10 सेमी पकवान रखें।
    4. प्रत्येक कुएं से प्लूरोनिक एफ-127 समाधान को एस्पिरेट करें। पीडीएमएस असुरक्षित है और प्लूरोनिक एफ-127 समाधान को सोख लेगा, खासकर यदि प्लेटें एक अपकेंद्रित्र के साथ नीचे घूमती थीं। अवशिष्ट Pluronic एफ-१२७ समाधान जारी करने के लिए और दे कुओं 5 मिनट के लिए बैठते हैं, तो फिर से आकांक्षी द्वारा कुएं के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें ।
      नोट: अंत में संलग्न p1250 टिप के साथ एक पाश्चातर पिपेट का उपयोग करें, और प्लूरोनिक एफ-127 समाधान को एस्पिरेशन करते समय p1250 टिप पर एक p200 टिप। यह पोस्ट संरचनाओं की आकस्मिक आकांक्षा को रोकने के लिए सटीक सुधार करेगा। पिपेट के साथ कुएं के तल पर अंडाकार पूल के आकार के सेल सीडिंग क्षेत्र को स्क्रैप करने से बचें क्योंकि यह प्लूरोनिक एफ-127 कोटिंग को बाधित करता है और एचएमएमटी स्व-संगठन प्रक्रिया में हस्तक्षेप करता है। उचित तकनीक के लिए सिर्फ अंडाकार पूल पर पिपेट टिप मंडराना है, जबकि Pluronic एफ-१२७ समाधान aspirating ।
    5. पिपेट सेल-ईसीएम निलंबन ध्यान से किसी भी कोशिकाओं है कि ट्यूब के नीचे करने के लिए डूब सकता है resuspend करने के लिए । फिर सेल-ईसीएम निलंबन के 105 माइक्रोन को एक ताजा, पूर्व-ठंडा 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। वार्मिंग से समाधान को रोकने के लिए शीर्ष के करीब ट्यूब को समझने का ख्याल रखें।
    6. 105 माइक्रोन सेल-ईसीएम सस्पेंशन के लिए 100 यू/एमएल थ्रोम्बिन स्टॉक सॉल्यूशन के 0.84 माइक्रोन जोड़ें, जो 0.2 यू/मिलीग्राम फिब्रिनोजेन की अंतिम एकाग्रता पर पहुंचें। बुलबुले की शुरूआत से बचते हुए, तेजी से, ध्यान से और अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए पिपेट।
      नोट: थ्रोम्बिन फिब्रिनोजेन के तेजी से रूपांतरण को फाइब्रिन क्लॉट में शुरू करता है। जैसे, थ्रोम्बिन इसके अलावा पर ऊतकों को बीज करने के लिए सीमित समय है। सेल-ईसीएम मिश्रण को संस्कृति कुओं में स्थानांतरित करने से पहले समय से पहले थक्के से बचने के लिए, थ्रोम्बिन जोड़ने से पहले 15 माइक्रोन के लिए एक p20 पिपेट सेट करें। प्री-ठंडा युक्तियों का उपयोग करें या प्रत्येक कुएं में सेल-ईसीएम मिश्रण के 15 माइक्रोन को इकट्ठा करने और स्थानांतरित करने से पहले कुछ सेकंड के लिए पिपेट टिप को बर्फ के ठंडे डीएमईएम में डुबोएं। सेल-ईसीएम मिश्रण को तैयार करना एक सर्वोत्तम अभ्यास है ताकि एक समय में 6 से अधिक एचएमएमटी वरीयता प्राप्त न हों।
    7. ऊतकों को बीज करने के लिए, प्रत्येक व्यक्ति को अच्छी तरह से सेल-ईसीएम मिश्रण (यानी, 150,000 कोशिकाओं) के 15 माइक्रोन जोड़ें। ध्यान से अंडाकार पूल के केंद्र में सेल-ईसीएम मिश्रण जोड़ें और पिपेट टिप को कुएं के नीचे दबाने से बचें। फिर, दो प्रकाश गति के साथ, अच्छी तरह से प्रत्येक पोस्ट के पीछे सेल निलंबन फैलाएं। एक बार सतह समान रूप से सेल-ईसीएम निलंबन में लेपित है, अगले कुएं पर चलते हैं ।
      नोट: सभी ऊतकों को वरीयता प्राप्त करने से पहले ट्यूब में सेल-ईसीएम मिश्रण के समय से पहले जेलेशन से बचने के लिए कुशलतापूर्वक काम करें। कुओं को सीडिंग करते समय, बुलबुले को स्थानांतरित करने से बचना बेहद महत्वपूर्ण है क्योंकि बुलबुला एचएमएमटी के रीमॉडलिंग में हस्तक्षेप करेगा, जो एचएमएमटी अनुपयोगी होगा।
    8. बीज वाले कुओं वाले 10 सेमी कल्चर प्लेट पर ढक्कन रखें और लगभग 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
      नोट: जेल बहुलकीकरण प्रक्रिया की पुष्टि के रूप में अवशिष्ट सेल-ईसीएम मिश्रण के साथ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को इनक्यूबेटर में रखें।
    9. सेल-ईसीएम मिश्रण के पॉलीमराइज्ड होने के बाद, प्रत्येक मायोटेक्टिक में प्रीवार्म्ड एचएमएमटी सीडिंग मीडिया के 200 माइक्रोन को अच्छी तरह से जोड़ें। 10 सेमी डिश पर ढक्कन को बदलें और इनक्यूबेटर को 10 सेमी डिश के भीतर MyoTACTIC प्लेट पोर्शन वापस करें। इस बार प्वाइंट को डे-2 कहा जाता है। अगले चरण तक ऊतकों को परेशान न करें।
  4. एचएमएमटीएस में अंतर
    1. इनक्यूबेशन के 2 दिनों के बाद, एचएमएमटी सीडिंग मीडिया को ध्यान से एक पिपेट का उपयोग करके हटा दें और 2% घोड़े सीरम वाले प्रीवार्मेड विभेदन मीडिया के 200 माइक्रोन के साथ बदलें, 1% पेन/स्ट्रीप, 4% एसीए (यानी, 2 मिलीग्राम/एमएल अंतिम एकाग्रता से 50 मिलीग्राम/एमएल की स्टॉक एकाग्रता से; % v/v के रूप में व्यक्त किया जाता है) और डीएमईएम में 10 μg/mL मानव recombinant इंसुलिन । इस बार बिंदु को भेदभाव के दिन 0 के रूप में संदर्भित किया जाता है ।
    2. हर दूसरे दिन के बाद, भेदभाव के दिन 12 तक ताजा भेदभाव मीडिया के साथ मीडिया के आधे विनिमय, संस्कृति के अंतिम दिन(चित्रा 2a)।
      नोट: प्राथमिक मानव मायोब्लास्ट का उपयोग करके एचएमएमटी बनाने के लिए प्रोटोकॉल विवरण30अन्यत्र प्रकाशित किए गए हैं । यदि कोशिका व्यवहार्यता पोस्ट सीडिंग के लिए चिंताएं हैं, तो व्यवहार्यता को निर्धारित करने के लिए कैल्सीन और प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ एचएमएमटी को इनक्यूबेट करें।

4. विद्युत उत्तेजना और एचएमएमटी-प्रेरित पोस्ट विक्षेप का विश्लेषण

  1. एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर एक स्पष्ट नीचे ग्लास या प्लास्टिक स्टेज माउंट सेट करें और माइक्रोस्कोप-कैमरा माउंट का उपयोग करके माइक्रोस्कोप आईपीस में एक स्मार्टफोन कैमरा संलग्न करें। 10x आवर्धन पर चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाएगा(चित्रा 3a)।
    नोट: 10x आवर्धन उद्देश्य के साथ आउटफिट किया गया कोई भी उल्टे चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप उचित होगा। पीडीएमएस अच्छी तरह से निर्माण 10 सेमी डिश से हटा दिया जाएगा और सीधे स्पष्ट नीचे चरण माउंट पर रखा जाएगा, और इसलिए, हवा के लिए खुला । 70% इथेनॉल के साथ सभी सतहों और उपकरणों को स्टरलाइज करें और प्रयोग के दौरान क्षेत्र में यातायात को कम करें।
  2. विद्युत उत्तेजना इलेक्ट्रोड तैयार करने के लिए, टिन-लेपित तांबे के तार के ~ 30 सेमी काटें। फिर, 25 जी नियमित रूप से बेवेल सुई के हब से शुरू, शीर्ष आधे के चारों ओर कसकर तार के ~ 10 सेमी लपेटें, ~ 20 सेमी अतिरिक्त तार छोड़ दें। एक दूसरी सुई के लिए दोहराएं और फिर प्रत्येक सुई से हब काट लें।
    नोट: तार सुई के आसपास तंग होना चाहिए यह सुनिश्चित करने के लिए यह कदम नहीं है और इलेक्ट्रोड के तार लिपटे हिस्से PDMS को छूने के रूप में यह बिजली के क्षेत्र में उत्पादन में बाधा डाल सकते हैं नहीं होना चाहिए ।
  3. वेवफॉर्म जनरेटर पर एक आउटपुट चैनल के लिए मगरमच्छ क्लिप कनेक्टर केबल के लिए बीएनसी संलग्न करें और 20% शुल्क चक्र, 5 वी आयाम (10 V/सेमी की विद्युत क्षेत्र शक्ति) के साथ वर्ग दालों के लिए चैनल सेट करें। आवृत्ति क्रमशः चिकोटी और टेटनस संकुचन के लिए 0.5 हर्ट्ज और 20 हर्ट्ज के बीच बदल जाएगी।
    नोट: वेवफॉर्म जेनरेटर सेटिंग के लिए प्रयोग-विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है
  4. माइक्रोस्कोप चरण पर एचएमएमटी युक्त एक MyoTACTIC प्लेट भाग रखें और धीरे-धीरे प्रत्येक इलेक्ट्रोड बेवेल अंत को अंडाकार पूल में प्रत्येक पोस्ट के पीछे सीधे पीडीएमएस में डालें। माइक्रोस्कोप चरण में अतिरिक्त तार के 20 सेमी वर्गों को ध्यान से टेप करें ताकि सुई ऊर्ध्वाधर बनी रहे और प्रत्येक तार का ~ 10 सेमी कनेक्शन(चित्रा 3 ए)के लिए मुफ्त रहता है।
    सावधानी: इलेक्ट्रोड के दोनों छोर पर कभी भी नंगे उंगली न रखें। सुनिश्चित करें कि पीडीएमएस में सम्मिलन पर इलेक्ट्रोड पर हल्का दबाव लागू करने के लिए इंडेक्स फिंगर पर एक थिम्बल पहना जाता है।
  5. दो पदों में से एक पर देखने के माइक्रोस्कोप क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करें, जैसे कि इलेक्ट्रोड के निकटतम पोस्ट एज पर ध्यान केंद्रित किया जाता है। फिर, स्मार्टफोन कैमरा पोस्ट के स्पष्ट क्षेत्र में ध्यान केंद्रित करें। यह डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि फोकस में बदलाव के रूप में रिकॉर्डिंग विश्लेषण में हस्तक्षेप करेगी।
  6. मगरमच्छ क्लैंप(चित्रा 3a)के माध्यम से तरंग जनरेटर के लिए टेप तारों के मुक्त सिरों को कनेक्ट करें ।
  7. स्मार्टफोन कैमरे पर वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करें, और फिर उत्तेजना शुरू करने के लिए चैनल आउटपुट चालू करें। एचएमएमटी को चिकोटी और टिटनेस उत्तेजना श्रृंखला के बीच 2 मिनट के आराम के साथ 3 चिकोटी और 3 टेटनस संकुचन से गुजरने के लिए प्रेरित करें।
  8. चैनल आउटपुट बंद करें, टिन-लेपित तांबे के तारों से मगरमच्छ क्लिप अलग करें, तारों से टेप हटा दें, और बाद के एचएमएमटी कुओं में डालने से पहले प्रत्येक इलेक्ट्रोड को 70% इथेनॉल के साथ मिटा दें। सभी एचएमएमटीएस के लिए चरण 4.5 से प्रक्रिया दोहराएं।
    नोट: एक समय में 3 से अधिक ऊतकों को उत्तेजित करके एचपीएमटीएक के बाहर खर्च होने वाले समय को सीमित करें। यदि MyoTACTIC प्लेट भाग के भीतर अतिरिक्त एचएमएमटी का विश्लेषण किया जाना बाकी है, तो प्लेट को 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस करें ताकि एचएमएमटीएस को 37 डिग्री सेल्सियस पर लौटने की अनुमति दी जा सके।
  9. पोस्ट विक्षेप का विश्लेषण करने के लिए ताकि एचएमएमटी बल उत्पादन की गणना की जा सके, कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग करें, जिसे गिटहब (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC) पर उपलब्ध कराया गया है। स्क्रिप्ट को सेट करने और लॉन्च करने के लिए README.md में दिए गए निर्देशों का पालन करें, फिर बल विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक पोस्ट ट्रैकिंग वीडियो खोलें।
  10. पोस्ट विस्थापन के लिए ट्रैक किए जाने वाले पोस्ट एज के साथ ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र का चयन करें। आरओआई की पुष्टि करने के लिए प्रेस एंटर करें और स्क्रिप्ट(पूरक वीडियो 1)चलाने के लिए फिर से दर्ज करें।
    नोट: बड़े विक्षेपों के कारण ट्रैकर विफल हो जाता है। यदि ट्रैकर संकुचन के दौरान विफल रहता है, तो ट्रैकिंग को कम संवेदनशील बनाने के लिए आरओआई आकार बढ़ाया जा सकता है लेकिन बड़े विक्षेपों की ट्रैकिंग की अनुमति देता है। कोड में तीन आकार प्रदान किए जाते हैं और स्क्रिप्ट टिप्पणियों को समायोजित करके ट्यून किए जा सकते हैं।
  11. स्क्रिप्ट दो इनपुट आवश्यकताओं के साथ समाप्त होती है। सबसे पहले, वीडियो में कई संकुचन होने की पुष्टि करने के लिए वाई दर्ज करें। दूसरा, एक को परिणाम निर्यात करने के लिए y (हां) या n (नहीं) दर्ज करें । सीएसवी फाइल(पूरक वीडियो 1)।
  12. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक संकुचन के लिए पिक्सल में विस्थापन के रूप में पोस्ट विक्षेप परिणामों की सूचना दी जाती है। माइक्रोस्कोप 10x आवर्धन सेटिंग के लिए पिक्सल को माइक्रोन मानों में परिवर्तित करें। फिर, पोस्ट विस्थापन संख्या को 2.36 μN/μm के बल-विस्थापन रूपांतरण कारक द्वारा मूल्यों (μm) गुणा करके पूर्ण संकुचन बलों (μN) में परिवर्तित करें, जो 1:15 इलाज एजेंट से मेल खाती है जो MyoTACTIC फैब्रिकेशन30में उपयोग किए जाने वाले पीडीएमएस के मोनोमर अनुपात से मेल खाती है।

5. विद्युत उत्तेजना का उपयोग कर कैल्शियम क्षणिक विश्लेषण

नोट: कैल्शियम हैंडलिंग प्रयोगों के लिए, अमर मायोब्लास्ट को MHCK7-GCAMP6 रिपोर्टर के साथ स्थिर रूप से स्थानांतरित किया गया था जैसा कि पहले11,12वर्णित था । ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं को सकारात्मक आबादी प्राप्त करने के लिए जीएफपी के लिए हल किया गया था, और फिर एचएमएमटीएस बनाने के लिए उपयोग किया जाता था। कैल्शियम इमेजिंग के लिए वैकल्पिक तरीके जैसे अनुपात-मीट्रिक रंगों जैसे फ्यूरा-2 एएम और इंडो-1 या फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग कैल्शियम संकेतकों (जैसे, फ्लूओ-4 या ओरेगन ग्रीन बप्टा1) हमारी प्रणाली के लिए उत्तरदायी हो सकते हैं।

  1. माइक्रोस्कोप चरण और उत्तेजना उपकरण (इलेक्ट्रोड, तरंग जनरेटर, आदि) की स्थापना के रूप में पहले चरण 4 में वर्णित है । इस प्रयोग के लिए, 4x आवर्धन का उपयोग करें।
    नोट: सीसीडी कैमरे से लैस एक अंधेरे कमरे और एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होगी।
  2. माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर लॉन्च करें, फिटसी फिल्टर चैनल (नीली रोशनी) का चयन करें, और मूवी रिकॉर्डिंग फ़ंक्शनका चयन करें। 500 एमएस के एक्सपोजर पर सेट करें और 680 x 510 (बिनिंग 2x2) का रेजोल्यूशन।
    नोट: इमेजिंग सॉफ्टवेयर भिन्न हो सकता है और उपयोगकर्ता द्वारा एक्सपोजर मैन्युअल रूप से सेट किया जाता है। उत्तेजना से पहले जोखिम पर एचएमएमटी से बचने के लिए ध्यान रखें। आराम से, एक अंधेरे ऊतक रूपरेखा/सहज फ्लोरेसेंस के साथ छाया सामान्य है, जबकि एक स्पष्ट ऊतक छवि जोखिम से अधिक है(पूरक वीडियो 2)। सुनिश्चित करें कि एक्सपोजर एक प्रयोग के भीतर सभी एचएमएमटी के लिए सुसंगत है।
  3. माइक्रोस्कोप शटर बंद करें और कैल्शियम हैंडलिंग रिकॉर्ड करने के लिए तैयार होने तक फिटसी चैनल को बंद रखें।
  4. जब सभी उपकरण और सॉफ्टवेयर स्थापित हो जाते हैं, तो विश्लेषण करने के लिए एचएमएमटी युक्त MyoTACTIC प्लेट भाग को पुनः प्राप्त करें और इसे सीधे माइक्रोस्कोप चरण पर सेट करें। फिर, पहले चरण 4 में वर्णित इलेक्ट्रोड डालें और कनेक्ट करें।
  5. चयनित एचएमएमटी के केंद्र पर देखने के क्षेत्र को ध्यान केंद्रित करने के लिए ब्राइटफील्ड का उपयोग करें। इसके बाद दीपक बंद कर दें।
  6. माइक्रोस्कोप फिटसी चैनल शटर खोलें, पुष्टि करें कि नीली रोशनी चालीन है, और फिर सॉफ्टवेयर में मूवी रिकॉर्ड का चयन करें।
  7. विद्युत उत्तेजना शुरू करने के लिए तरंग जनरेटर पर आउटपुट चालू करें। एचएमएमटी को 8 चिकोटी और 8 टिटनेस संकुचन से गुजरने के लिए प्रेरित करें। चिकोटी और टेटनस उत्तेजना श्रृंखला के बीच 2 मिनट के आराम के लिए अनुमति दें, जिसके दौरान फिटसी शटर बंद स्थिति में है।
    नोट: गणना और डेटा विश्लेषण उद्देश्यों के लिए न्यूनतम फ्लोरेसेंस रिकॉर्ड करने के लिए विद्युत उत्तेजना से पहले और बाद में 10 एस सहज गतिविधि के लिए अनुमति दें।
  8. चैनल आउटपुट बंद करें, टिन-लेपित तांबे के तारों से मगरमच्छ क्लिप अलग करें, तारों से टेप हटा दें, और बाद के एचएमएमटी कुओं में डालने से पहले प्रत्येक इलेक्ट्रोड को 70% इथेनॉल के साथ मिटा दें। सभी एचएमएमटीएस के लिए उत्तेजना और रिकॉर्डिंग प्रक्रिया दोहराएं।
  9. इमेजजे, या वैकल्पिक इमेजिंग सॉफ्टवेयर में विश्लेषण के लिए झगड़ा फ़ाइल प्रारूप में फिल्मों को सहेजें।
    नोट: एक समय में 3 से अधिक ऊतकों को उत्तेजित करके एचपीएमटीएक के बाहर खर्च होने वाले समय को सीमित करें। यदि MyoTACTIC प्लेट भाग के भीतर अतिरिक्त एचएमएमटी का विश्लेषण किया जाना बाकी है, तो डिवाइस को 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस करें ताकि एचएमएमटी को 37 डिग्री सेल्सियस पर लौटने की अनुमति दी जा सके।
  10. कैल्शियम क्षणिक डेटा का विश्लेषण करने के लिए, पहले इमेजजे खोलें। विश्लेषण का चयनकरें, फिर माप निर्धारित करें,फिर मीन ग्रे वैल्यू का चयन करें और अन्य सभी विकल्पों का चयन करें। पूरा होने पर, कैल्शियम (.tiff) वीडियो(पूरक वीडियो 2) खोलें।
  11. बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करके माइक्रोटिस्यू की सीमा की रूपरेखा तैयार करें और इस क्षेत्र को आरओआई(पूरक वीडियो 2)के रूप में बचाएं। आरओआई प्रबंधक विंडो में अधिक के तहत, मल्टी उपाय का चयन करें और एक पंक्ति प्रति स्लाइस(पूरक वीडियो 2)पर सभी फ़ाइल स्लाइस के लिए फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापें।
  12. स्लाइस नंबर (फ्रेम) सहित सभी मापों को एक स्प्रेडशीट में कॉपी करें और प्रत्येक स्लाइस की फ्लोरोसेंट तीव्रता की तुलना फाइल सेन्यूनतम सहज फ्लोरोसेंट तीव्रता से करें, जिसमें इसका उपयोग किया गया है।
  13. स्लाइस नंबर (फ्रेम) द्वारा फिल्म रिकॉर्डिंग फ्रेम गति गुणा करके प्रत्येक फ्रेम के लिए समय की गणना करें, और उत्तेजना(पूरक वीडियो 2)के लिए एचएमएमटी कैल्शियम क्षणिक प्रतिक्रिया के लिए समय के खिलाफ प्लॉट ΤF/F0।
  14. प्रत्येक एचएमएमटी(पूरक वीडियो 2)के सापेक्ष मतलब पीक फ्लोरोसेंट तीव्रता परिवर्तन की गणना करने के लिए लगातार 6 संकुचन और औसत मूल्यों में से प्रत्येक के लिए पीक कैल्शियम क्षणिक संकेत का चयन करें।
    नोट: हमेशा समग्र विश्लेषण से पहले चिकोटी संकुचन से उत्पन्न होने वाले डेटा को बाहर करें। एचएमएमटी कैल्शियम क्षणिक विश्लेषण की सुविधा के लिए गिटहब (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) पर "कैल्शियम हैंडलिंग टेम्पलेट.xlsx नामक एक स्प्रेडशीट प्रदान की गई है। फिलेबल कोशिकाओं जहां मूल्यों और आदानों में प्रवेश किया जाना है ग्रे में प्रकाश डाला जाता है । पीक चयन संख्याओं को समायोजित करना सुनिश्चित करें क्योंकि यह केवल पीक चयन(पूरक वीडियो 2)में सहायता करने के लिए एक गाइड है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहां वर्णित एक पीयू मोल्ड से एक 96-अच्छी तरह से पीडीएमएस आधारित MyoTACTIC संस्कृति मंच कास्ट करने के तरीके हैं, एचएमएमटी प्रतिकृति ऊतकों की सरणी बनाने के लिए, और संस्कृति डिवाइस-बल पीढ़ी और कैल्शियम हैंडलिंग के भीतर एचएमएमटी फ़ंक्शन के दो पहलुओं का विश्लेषण करने के लिए। चित्रा 1 एचएमएमटी सीडिंग से पहले MyoTACTIC संस्कृति कुओं की तैयारी का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन प्रदान करता है। पीडीएमएस एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला सिलिकॉन-आधारित बहुलक है, जिसे जटिल उपकरणों को32बनाने के लिए आसानी से ढाला जा सकता है। एक पीडीएमएस आधारित प्रोटोकॉल एक निर्मित नकारात्मक पीयू मोल्ड30से ९६-अच्छी संस्कृति उपकरणों की एक असीमित संख्या में कास्ट करने के लिए डिजाइन किया गया था । अंतिम ठीक पीडीएमएस सकारात्मक प्लेट लचीला है और आसानी से एक किनारे रेजर ब्लेड(चित्रा 1)की सहायता से छोटे आकार की कार्यात्मक इकाइयों में कटौती की जा सकती है । यह उपयोगकर्ता को अपने प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए विशिष्ट एचएमएमटी प्रतिकृति को पूरा करने के लिए डिवाइस को स्केल करने की अनुमति देता है। ये छोटी कार्यात्मक इकाइयां एक ईसीएम पाड़ के साथ काम करने की सीमा पर काबू पाने के लिए भी फायदेमंद हैं जो उपयोगकर्ता की सेल सीडिंग गति से मेल खाने के लिए आसानी से कुओं की संख्या को ट्यूनिंग करके, फाइब्रिन हाइड्रोगेल जैसे तेजी से बहुलक होती है। इसके अलावा, पीडीएमएस आसानी से ऑटोक्लेवेबल है और इसे अनिश्चित अवधि के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। अंत में, एक रसद दृष्टिकोण से, एक पूर्ण MyoTACTIC प्लेट किसी भी मानक 96-अच्छी तरह से प्लेट ढक्कन द्वारा कवर किया जा सकता है, और आयाम और MyoTACTIC प्लेट भागों के प्रोफ़ाइल एक 10 सेमी संस्कृति प्लेट के भीतर इनक्यूबेशन करने के लिए उत्तरदायी हैं, hMMT संस्कृति बंध्यपन सुनिश्चित करने के लिए। सेल सीडिंग के आगे प्लूरोनिक एफ-127 समाधान कोटिंग संस्कृति अच्छी तरह से नसबंदी का एक अतिरिक्त उपाय प्रदान करने की दोहरी भूमिका निभाता है, और एक गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट के रूप में, समान सेल के पक्ष में सेल आसंजन को रोकता है - ईसीएम रिमॉडलिंग(चित्रा 1)।

जब अमर मायोजेनिक जनक कोशिका आबादी प्रयोग के लिए तैयार होती है, तो कोशिकाओं को फाइब्रिनोजेन और बेसमेंट झिल्ली निकालने के शामिल हाइड्रोजेल में समझाया जाता है। सेल-ईसीएम मिश्रण को तब समान रूप से प्रत्येक MyoTACTIC के तल पर अंडाकार पूल में अच्छी तरह से जमा किया जाता है, और फिर 14 दिन की संस्कृति अवधि में, कोशिकाएं इन दो ऊर्ध्वाधर पदों पर स्वयं को व्यवस्थित करती हैं ताकि गठबंधन, बहुनीय, स्ट्रिएटेड मायोट्यूब के बिस्तर के साथ आबादी वाले 3डी माइक्रोटिस्यूब को बनाया जा सके जो देशी ऊतक संगठन(चित्रा 2a, चित्रा 2a)के पहलुओं जैसा दिखताहै। जी, एच)। रीमॉडलिंग प्रक्रिया पर, दो एंकरिंग बिंदुओं के बीच एकात्मक तनाव उत्पन्न होता है, और यह ऊतक आत्म-संगठन प्रक्रिया को एक कॉम्पैक्ट ऊतक के गठन को चलाने के लिए मार्गदर्शन करता है। भेदभाव अवधि के दौरान, स्वस्थ रोगियों से प्राप्त मायोब्लास्ट से निर्मित एचएमएमटीएस की चौड़ाई काफी सुसंगत बनी हुई है। हालांकि, एचएमएमटी रीमॉडलिंग में हस्तक्षेप करने वाली त्रुटियों की घटनाओं में, यह एकरूपता खो जाती है(चित्रा 2a-f),जिससे यह सरल मीट्रिक एचएमएमटी गुणवत्ता नियंत्रण मूल्यांकन में उपयोगी हो जाता है। उदाहरण के लिए, सेल का अति उत्साही मिश्रण - ईसीएम निलंबन के परिणामस्वरूप बुलबुले का निर्माण हो सकता है। बुलबुले MyoTACTIC अच्छी तरह से बाधा एचएमएमटी रीमॉडलिंग के लिए किया । ऐसे उदाहरणों में, बुलबुले बुलबुले द्वारा कब्जे वाले क्षेत्र से कुछ या सभी मायोब्लास्ट को विस्थापित करते हैं, अंततः अंतिम एचएमएमटी(चित्रा 2b;लाल तीर देखें) में एक दरार बनाते हैं। एक अन्य उदाहरण कुओं में प्लूरोनिक एफ-127 कोटिंग की अखंडता से संबंधित है। प्लूरोनिक एफ-127 एक गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट है जो कोशिकाओं को मायोटैक्टिक का अच्छी तरह से पालन करने से रोकता है। यदि आकांक्षा के दौरान कोटिंग को स्क्रैप किया जाता है, तो मायोब्लास्ट्स मायोटाक्टिक कुओं की सतह का पालन करेगा, नए एंकरेज अंक बनाएगा और जिसके परिणामस्वरूप मायोट्यूब्स होते हैं जो दो पदों(चित्रा 2c)में गठबंधन नहीं होते हैं। अतिरिक्त त्रुटियों के परिणामस्वरूप एबररेंट एचएमएमटी रिमॉडलिंग भी हो सकती है, जैसा कि चित्रा 2डी-एफमें देखा गया है। सेल जीवन शक्ति पोस्ट सीडिंग का मूल्यांकन कैल्सेइन/प्रोपिडियम आयोडाइड-आधारित धुंधला परख का भी मूल्यांकन किया जा सकता है । जब इन तकनीकी त्रुटियों से बचा जाता है, तो एचएमएमटी गठबंधन और बहुनीय मायोट्यूब के बिस्तर से आबाद होते हैं जो प्रत्येक एचएमएमटी(चित्रा 2जी)की लंबाई में विस्तारित होते हैं। मायोट्यूब उनकी लंबाई में आकार में और विभिन्न एचएमएमटीएस(चित्रा 2h-i)के बीच काफी समान हैं। मायोट्यूब को सारकोमरे स्ट्रीशन की उपस्थिति की विशेषता है जो सारकोमरिक α - ऐक्टिनिन (एसएए) के लिए इम्यूनोस्टेटिंग द्वारा कल्पना की जाती है। चित्रा 2h)।

लगभग 7 दिनों के भेदभाव से शुरू होने वाले एचएमएमटीएस में कार्यात्मक गुणों की भी जांच की जा सकती है। इन कार्यात्मक अध्ययनों को पूरा करने के लिए स्थापित प्रायोगिक चित्र 3एमें दर्शाया गया है । माइक्रोस्कोपी सेटअप एक वाइब्रेप्लेन टेबल के शीर्ष पर चित्र है; हालांकि, कार्यात्मक जांच को पूरा करने के लिए इसकी आवश्यकता नहीं है। कार्यात्मक अध्ययनों में, प्रोटोकॉल के विद्युत उत्तेजना अनुभाग में वर्णित इलेक्ट्रोड पीडीएमएस में डाले जाते हैं, जैसे कि इलेक्ट्रोड पदों के पीछे रहते हैं। इलेक्ट्रोड डालने से पहले पोस्ट क्षेत्र का अच्छा दृश्य होना महत्वपूर्ण है क्योंकि पुन: स्थापित करने की आवश्यकता के परिणामस्वरूप पोस्ट से ऊतक का विस्थापन हो सकता है। पोस्ट का तेज ध्यान प्राप्त करने के लिए इलेक्ट्रोड का उचित सम्मिलन भी महत्वपूर्ण है ताकि बाद में अजगर लिपि के साथ विक्षेप को ट्रैक किया जा सके। चित्रा 3b कम (चिकोटी, 0.5 हर्ट्ज) और उच्च (टेटनस, 20Hz) आवृत्ति एचएमएमटी विद्युत उत्तेजना के जवाब में MyoTACTIC वेल प्लेट पोस्ट के एक प्रतिनिधि विस्थापन से पता चलता है। पोस्ट विस्थापन के क्वांटिफिकेशन का उपयोग एचएमएमटीएस(चित्रा 3सी)के प्रेरित अनुबंध बल की गणना करने के लिए किया जा सकता है। जब इस जानकारी को एचएमएमटी क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र के साथ जोड़ा जाता है, तो विशिष्ट बल30निर्धारित किया जा सकता है। इसके अलावा, कैल्शियम यात्रियों मांसपेशियों के संकुचन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। कंकाल की मांसपेशी का स्थिर ट्रांसडक्टिशन जीसीएएमपी 612,30 , 33,34जैसे आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक के साथ कैल्शियम यात्रियों की लाइव निगरानी में सक्षम बनाता है12,30,34. कैल्शियम यात्रियों को 12 घंटे तक को उत्तेजित करने के लिए उपर्युक्त विद्युत उत्तेजना सेटअप का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था, जो MHCK7-GCAMP6 रिपोर्टर(चित्रा 4a)को व्यक्त करते हुए अमर myoblasts के साथ उत्पन्न होता है, और कम (चिकोटी, ०.५ हर्ट्ज) और उच्च (टिटनेस, 20Hz) आवृत्ति विद्युत उत्तेजना(चित्रा 4b)के दौरान मतलब पीक फ्लोरोसेंट तीव्रता के रूप में मात्रा निर्धारित करता है । यह देखा गया है कि विभिन्न प्रयोगों में मापा गया एचएमएमटी कैल्शियम हैंडलिंग गुण अपेक्षाकृत सुसंगत हैं(चित्रा 4b)। पोस्ट डिफ्लेक्शन और कैल्शियम हैंडलिंग के लिए क्वांटिफिकेशन तरीके सप्लीमेंट्री वीडियो 1 और सप्लीमेंट्री वीडियो 2में बताए गए हैं ।

Figure 1
चित्रा 1:एचएमएमटी सीडिंग से पहले मायोटेक्टिक पीडीएमएस प्लेट की तैयारी। मायोटैक्टिक के रूप में जाना जाने वाला 96-वेल प्लेटफॉर्म एक नकारात्मक पॉलीयूरेथेन (पीयू) मोल्ड के भीतर पॉलीडिमेथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) के पहले इलाज द्वारा निर्मित है। पीडीएमएस आधारित संस्कृति मंच तो ध्यान से नकारात्मक पीयू मोल्ड से खुली है । एक अकादमिक सेटिंग में, पीडीएमएस डिवाइस को 6 ± 2 कार्यात्मक कुओं वाली छोटी इकाइयों में काट दिया जाता है। इन कुओं को तो एक नसबंदी थैली में रखा जाता है, autoclaved और उपयोग तक संग्रहीत । उपयोग से एक दिन पहले तक, डिवाइस भागों की वांछित संख्या 10 सेमी संस्कृति प्लेट के भीतर रखी जाती है और प्लूरोनिक एफ-127 प्रत्येक कुएं में जोड़ा जाता है। 10 सेमी डिश ढक्कन जोड़ा जाता है, किनारे को 2-24 घंटे के लिए 4 डिग्री पर प्लेट को इनक्यूबेटिंग करने से पहले पैराफिल्म के साथ सील कर दिया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:MyoTACTIC HMMT आत्म संगठन और गठबंधन myotubes के गठन का समर्थन करता है । (ए)(शीर्ष) HMMT स्वयं संगठन की योजनाबद्ध समय रेखा और बाद में एक 14 दिन की संस्कृति अवधि में myotube परिपक्वता । (नीचे) प्रतिनिधि 4x चरण-विपरीत छवियां दो ऊर्ध्वाधर पदों पर अमर myoblasts स्वयं संगठन के काइनेटिक्स को चित्रित करने के लिए, जिसके परिणामस्वरूप 3 डी एचएमएमटी का गठन होता है। स्केल बार, 500 माइक्रोन(बी-एफ)प्रतिनिधि 4x चरण-भेदभाव के दिन 12 पर एचएमएमटी के विपरीत छवियां(ख)कोशिका के भीतर एक बुलबुला के कारण होने वाले एचएमएमटी परिणामों को दिखा रही हैं - सीडिंग के समय ईसीएम (लाल तीर पॉइंट्स टू बबल प्रेरित एचएमएमटी क्षति),(सी)प्लूरोनिक एफ-127 समाधान कोटिंग की गलत आकांक्षा, और(डी-एफ ) एचएमएमटी ओवर-रीमॉडलिंग जो अनुचित ईसीएम जेलेशन, कल्चर मीडिया में एसीए गतिविधि की कमी, मायोब्लास्ट पैरेंटल लाइन की अनुचित देखभाल आदि का संकेत दे सकता है। स्केल बार, 500 माइक्रोन(जी)प्रतिनिधि टाइल और चपटा कॉन्फोकल छवि एक दिन 12 एचएमएमटी 10x आवर्धन पर लिया गया। एचएमएमटीएस को सीधे पीडीएमएस मोल्ड में तय किया जाता है, फिर ध्यान से हटा दिया जाता है और धुंधला करने के लिए 96 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में रखा जाता है। सारकोमरिक α-ऐक्टिनिन (एसएए) मजेंटा में दिखाया गयाहै, और होचस्ट ३३३४२ परमाणु काउंटरटाइन सियान में दिखाया गया है । स्केल बार, 500 माइक्रोन (ज)40x आवर्धन पर एक दिन 12 hMMT के प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवि। एचएमएमटी मायोट्यूब और नाभिक को एसएए (मैजेंटा) के लिए इम्यूनोस्टेपिंग और होचस्ट 33342 (सियान) के साथ काउंटरस्टैनिंग द्वारा कल्पना की जाती है। स्केल बार, 50 माइक्रोन (i)भेदभाव के दिन 12 में मतलब एचएमएमटी मायोट्यूब व्यास का डॉट प्लॉट ग्राफ। मानों को 3 जैविक प्रतिकृति से मतलब ± एसईएम के रूप में सूचित किया जाता है = 8 एचएमएमटी, प्रतीक आकार से प्रतिष्ठित, जिससे प्रति एचएमएमटी न्यूनतम 30 मायोट्यूब का विश्लेषण किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:MyoTACTIC मंच के भीतर संकुचन बल के सीटू माप में। (क)विद्युत उत्तेजना व्यवस्था का प्रतिनिधित्व (बाएं) । हालांकि इस सेटअप में चित्र, एक वाइब्रेप्लेन टेबल की आवश्यकता नहीं है। एक स्मार्टफोन कैमरा और माउंट को एचएमएमटीएस विद्युत उत्तेजना पोस्ट विस्थापन (बाएं) की वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए फ्लोरेसेंस लैंप से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप के आईपीस को आउटफिट किया गया था। 25 जी सुइयों टिन लेपित तांबे के तारों (नीचे सही), मगरमच्छ क्लिप कनेक्टर केबल (ऊपर सही) के लिए एक BNC से जुड़े और एक मनमाने ढंग से तरंग जनरेटर को चिपका रहे थे के साथ लपेटा गया । विद्युत उत्तेजना के दौरान इलेक्ट्रोड की नियुक्ति नीचे दाईं ओर दिखाई जाती है। (ख)भेदभाव के दिन 12 पर एचएमएमटीएस से प्राप्त पोस्ट विक्षेप वीडियो से लिए गए प्रतिनिधि स्नैपशॉट । वीडियो 10x आवर्धन पर कब्जा कर लिया गया । ठोस सफेद ऊर्ध्वाधर लाइनें पोस्ट प्लेसमेंट दिखाती हैं जब एचएमएमटी आराम कर रहे होते हैं, जबकि बिंदीदार सफेद ऊर्ध्वाधर लाइनें उच्च (टेटनस 20 हर्ट्ज) या कम (0.5 हर्ट्ज) आवृत्ति उत्तेजना के बाद विस्थापन के बाद दिखाती हैं। स्केल बार, 100 माइक्रोन (ग)औसत एचएमएमटी चिकोटी (0.5 हर्ट्ज) का डॉट प्लॉट ग्राफ- और टिटनेस (20 हर्ट्ज) - विभेदन के दिन 12 पर प्रेरित संकुचन बल। मानों को 3 जैविक प्रतिकृति से मतलब ± एसईएम एन = 9 एचएमएमटी के रूप में सूचित किया जाता है, जो प्रतीक आकृतियों से प्रतिष्ठित होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:MyoTACTIC मंच के भीतर कैल्शियम हैंडलिंग के सीटू माप में । (क)सहज GCaMP6+ कैल्शियम यात्रियों और कैल्शियम यात्रियों की एक 4x आवर्धन वीडियो रिकॉर्डिंग से प्रतिनिधि छवियों कम (चिकोटी संकुचन, ०.५ Hz) और उच्च (टेटनस संकुचन, 20 हर्ट्ज) आवृत्ति विद्युत उत्तेजना के जवाब में । एचएमएमटीएस को बिंदीदार पीली रेखा द्वारा रेखांकित किया जाता है। स्केल बार, 200 माइक्रोन(ख)डॉट प्लॉट ग्राफ कम (चिकोटी संकुचन, 0.5 हर्ट्ज) और उच्च (टिटनेस संकुचन, 20 हर्ट्ज) आवृत्ति विद्युत उत्तेजना के बाद प्रति एचएमएमटी औसत पीक फ्लोरोसेंट तीव्रता का मात्राकरण दिखाता है। मानों को 3 जैविक प्रतिकृति से मतलब ± एसईएम एन = 9 एचएमएमटी के रूप में सूचित किया जाता है, जो प्रतीक आकृतियों से प्रतिष्ठित होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक वीडियो 1: पोस्ट-डिफ्लेक्शन डेटा का विश्लेषण करने के तरीकों का प्रदर्शन। टिटनेस उत्तेजना के दौरान कस्टम स्क्रिप्ट द्वारा ट्रैक किए जा रहे भेदभाव के दिन 12 पर पोस्ट विक्षेप विश्लेषण का एक प्रतिनिधि वीडियो। सबसे पहले आरओआई आकार सीधे पोस्ट ट्रैकिंग स्क्रिप्ट के भीतर चुना जाता है। इसके बाद स्क्रिप्ट चलाने के लिए प्ले बटन का चयन कर वीडियो खोला जाता है। पोस्ट के एक तेज केंद्रित क्षेत्र को आरओआई के रूप में चुना जाता है और ब्लू पोस्ट ट्रैकिंग बॉक्स रखा जाता है। दर्ज करें आरओआई को लॉक करने के लिए दबाया जाता है और स्क्रिप्ट चलाने के लिए फिर से दबाया जाता है। "y" शीघ्र "कई संकुचन वीडियो के जवाब के रूप में दर्ज की गई है? [Y/N]", तो 'एन' त्वरित "निर्यात पोस्ट स्थानों के रूप में .csv फ़ाइल के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में दर्ज की गई है? [Y/N]" । पिक्सल में सापेक्ष विस्थापन के रूप में पोस्ट विक्षेप अंतिम आउटपुट है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक वीडियो 2: GCaMP6 कैल्शियम क्षणिक डेटा का विश्लेषण करने के तरीकों का प्रदर्शन। टिटनेस उत्तेजना के दौरान भेदभाव के दिन 12 में एपिफ्लोरेसेंस कैल्शियम हैंडलिंग विश्लेषण का एक प्रतिनिधि वीडियो। सबसे पहले, इमेजजे में कैल्शियम यात्रियों (टि्वट छवियों की एक श्रृंखला के रूप में सहेजा गया) का एक वीडियो खोला गया है और उपयोगकर्ता ने एचएमएमटी दिखाई देने तक फ्रेम के माध्यम से नेविगेट किया है। फिर, आवश्यक विश्लेषण माप "मतलब ग्रे मूल्य" की पुष्टि की है और एचएमएमटी को बहुभुज ड्राइंग टूल का उपयोग करके रेखांकित किया जाता है। यह रूपरेखा ब्याज के क्षेत्र के रूप में सहेजी जाती है और प्रत्येक वीडियो स्लाइस की फ्लोरोसेंट तीव्रता बहु-माप का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। इन मापों को फ्रेम डेटा और कैल्शियम क्षणिक पीक मूल्यों में भरे और पुष्टि के साथ स्प्रेडशीट "कैल्शियम हैंडलिंग टेम्पलेट" में कॉपी किया जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह पांडुलिपि एक 3 डी एचएमएमटी संस्कृति मॉडल बनाने और विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करती है जिसे बुनियादी मांसपेशी जीव विज्ञान, रोग मॉडलिंग, या उम्मीदवार अणु परीक्षण के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है। MyoTACTIC प्लेटफ़ॉर्म लागत के अनुकूल, निर्माण में आसान है, और कंकाल मांसपेशी माइक्रोटिस्यूस का उत्पादन करने के लिए अपेक्षाकृत कम संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। MyoTACTIC संस्कृति मंच के भीतर गठित एचएमएमटी में गठबंधन, बहुनीय और स्ट्र्रेटेड मायोट्यूब्स शामिल हैं, और कैल्शियम यात्रियों को शुरू करके विद्युत उत्तेजनाओं का जवाब देते हैं जो संकुचन को ट्रिगर करते हैं(चित्रा 2, चित्र 3, चित्रा 4)। पूर्व अध्ययनों से पता चला है कि एचएमएमटीएस जैव रासायनिक उत्तेजनाओं के समान प्रतिक्रिया प्रदान करता है और बड़े प्रारूप में रिपोर्ट किए गए परिपक्वता स्तर तक पहुंच सकता है 3 डी कंकाल मांसपेशी मॉडल12,30।

MyoTACTIC प्लेट निर्माण और एचएमएमटी पीढ़ी में एक महत्वपूर्ण विषय यह सुनिश्चित कर रहा है कि बुलबुले को रोका जाए, और यदि गठन किया गया है तो हटा दिया गया है। एक ऑपरेशनल पीडीएमएस मोल्ड के एकल चरण कास्टिंग को सुविधाजनक बनाने के लिए, एक पीयू मोल्ड को पहले अफशर एट अल30द्वारा वर्णित प्रारंभिक 3डी-मुद्रित प्लास्टिक मोल्ड के डाउनस्ट्रीम उत्पन्न किया गयाथा। पीयू मोल्ड जो उत्पन्न किया गया है, उपयोगकर्ताओं को पीडीएमएस मोल्ड के 96 अच्छी तरह से पदचिह्न का उत्पादन करने की अनुमति देता है जिससे अधिकतम 96 कुएं कार्यात्मक होते हैं (दो पोस्ट होते हैं), जैसा कि पीयू मोल्ड निर्माण चरण द्वारा तय किया जाता है। पीडीएमएस MyoTACTIC प्लेट के निर्माण के दौरान, नए उपयोगकर्ता अक्सर छोटे बुलबुले याद करते हैं जो तरल पीडीएमएस में पीछे रहते हैं, यहां तक कि डीगैसिंग के बाद भी। बुलबुले जो पीयू मोल्ड के क्षेत्रों में स्थानीयकरण करते हैं, जो एंकरिंग फ्लेक्सिबल पोस्ट संरचनाओं के अनुरूप होते हैं, परिणामस्वरूप पीयू मोल्ड को पीडीएमएस कल्चर प्लेट से अलग करने पर पोस्ट ब्रेकेज होगा, और इस प्रक्रिया में, पीयू मोल्ड में ठीक पीडीएमएस के एक छोटे से टुकड़े को पीछे छोड़ देता है। संकुचित हवा का उपयोग इन ठीक पीडीएमएस अवशेषों को हटाने के लिए किया जा सकता है, और ऐसा करने में विफलता भविष्य की प्लेट कास्टिंग के लिए उपलब्ध कार्यात्मक कुओं की संख्या को प्रभावी ढंग से कम कर देगी। इसलिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि सभी बुलबुले पीडीएमएस प्लेट को इस मंच के लाभ के रूप में ठीक होने से पहले हटा दिया गया है, यह एक स्टैंड-अलोन डिवाइस है, जिसके तहत प्लेट की सभी विशेषताओं को एक ही कदम में डाला जाता है बजाय प्रत्येक व्यक्तिगत माइक्रोटिस्यू एंकरिंग पॉइंट की आवश्यकता होती है, जिसे संस्कृति मैनुअल वेल्स35में पेश किया जानाचाहिए, 36,37. अधिकांश अकादमिक प्रयोगशाला अध्ययनों के लिए एक संपूर्ण MyoTACTIC संस्कृति प्लेट की आवश्यकता नहीं है। प्रत्येक पीएमडीएस प्लेट के उपयोग को अधिकतम करने के लिए, इसे मैन्युअल रूप से 6 ± 2 MyoTACTIC कुओं के समूहों में काटा जाता है। इस प्रक्रिया को बेहतर बनाने के लिए एक पीयू मोल्ड जो उपयोगकर्ताओं को 6 ± 2 MyoTACTIC कुओं की कार्यात्मक इकाइयों को छीलने देता है, इस प्लेट काटने के कदम को पूरी तरह से खत्म कर सकता है। इसके अलावा, बड़े बुलबुले सेल-ईसीएम समाधान में पेश किए गए जबकि मिश्रण या ऊतक सीडिंग प्रक्रिया के दौरान उचित ऊतक गठन ख़राब हो जाएगा। ये बड़े बुलबुले क्षेत्र से कोशिकाओं को विस्थापित करते हैं बुलबुला रह रहे हैं, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर कुछ मायोट्यूब वाले क्षेत्रों के साथ एचएमएमटी होते हैं जो विद्युत उत्तेजना के दौरान अनुबंधित तनाव और स्नैप का शिकार होंगे।

MyoTACTIC का एक उल्लेखनीय लाभ सीटू में सक्रिय बल उत्पादन और कैल्शियम हैंडलिंग गुणों की मात्रा निर्धारित करने की क्षमता है। यह कई अन्य 3 डी संस्कृति प्रणालियों के सामने एक चुनौती है, जहां संस्कृति डिवाइस12,37 से ऊतक को हटाने के बाद 3 डी ऊतक अनुबंध बल की जांच को एंडपॉइंट परख के रूप में लागू कियाजाताहै। इसलिए, MyoTACTIC देशांतर अध्ययनों का समर्थन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, उदाहरण के लिए, कंकाल की मांसपेशियों पर दवा उपचार के लौकिक प्रभावों को समझना। सीटू में सक्रिय बल उत्पादन और कैल्शियम हैंडलिंग गुणों की मात्रा निर्धारित करने के लिए यहां वर्णित विधि की एक सीमा इलेक्ट्रोड का मैनुअल प्लेसमेंट है, जो उच्च सामग्री अणु परीक्षण अनुप्रयोगों के लिए इस प्रणाली के उपयोग को सीमित करता है। एक संभावित समाधान एक समानांतर सर्किट के रूप में स्थापित इलेक्ट्रोड के एक स्पष्ट ढक्कन को इंजीनियर करना होगा जिसे सीधे कार्यात्मक कुओं के मानकीकृत सेट में डाला जा सकता है जिससे एक बार में कई ऊतकों की विद्युत उत्तेजना को सक्षम किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक मायोजेनिक प्रोजेनिटर सेल लाइन का उपयोग एक चैनलरोडोप्सिन निर्माण को व्यक्त करने से मांसपेशियों की कोशिका झिल्ली डिपोलराइजेशन की अनुमति मिलेगी, और इसलिए, ऊतक संकुचन नीले प्रकाश जोखिम से प्रेरित होगा। इसके अलावा, सक्रिय बल को वीडियो में कैप्चर किया जाता है क्योंकि पोस्ट विक्षेप और सक्रिय संकुचन बल की मात्रा निष्पक्ष तरीके से आयोजित की जा सकती है, जिसमें एक कस्टम अर्ध-स्वचालित अजगर स्क्रिप्ट का उपयोग करके छोटे वीडियो में विक्षेप को ट्रैक किया जा सकता है। इसलिए, उत्तेजित संकुचन बल का निष्पक्ष देशांतर मूल्यांकन MyoTACTIC30द्वारा सक्षम है। डेटा विश्लेषण की दक्षता में सुधार करने के लिए, स्मार्टफोन एप्लिकेशन जो पोस्ट विक्षेप के वीडियो को एक साथ कैप्चर करते हुए बल को मापने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, थ्रूपुट बढ़ाने के लिए आदर्श हैं।

अंत में, इस मंच के मूल्य को भी पहले दवा प्रतिक्रिया की सटीक भविष्यवाणी करने की क्षमता में वर्णित किया गया है । नैदानिक परिणामों के समान, हमने पहले बताया है कि मायोटोकिक यौगिकों (डेक्सामेथासोन, सेरिवास्टिन) के साथ एचएमएमटीएस (प्राथमिक मायोब्लास्ट्स के साथ बनाया गया) का उपचार मायोट्यूब शोष को प्रेरित करता है और सक्रिय संकुचन बल30में कमी आई है। इसके अलावा, MyoTACTIC जनित एचएमएमटी के भविष्य कहनेवाला मूल्य को यह दिखाकर मान्य किया गया था कि अग्नाशय के कैंसर के इलाज के लिए उपयोग की जाने वाली कीमोथैरेपी की एक चिकित्सकीय प्रासंगिक खुराक, एक बीमारी जो अक्सर कैशक्सिया2से जुड़ी होती है, एचएमएमटी की गुणवत्ता और अनुबंध बल30में काफी कम हो जाती है। इसलिए, MyoTACTIC के सरल निर्माण और 3 डी एचएमएमटीएस की पीढ़ी में उपयोग में आसानी से संरचनात्मक और कार्यात्मक आउटपुट के संबंध में इसकी विश्वसनीयता द्वारा प्रदर्शित उच्च सामग्री डेटा कैप्चर के लिए कई फायदे दिखाई देते हैं। पीडीएमएस आधारित सेल कल्चर उपकरणों की एक सामान्य सीमा यह है कि पीडीएमएस सोज़ोर्ब प्रोटीन। यहां वर्णित विधि सीरम युक्त संस्कृति मीडिया का उपयोग करती है, जो डिवाइस को 'ब्लॉक' करने और अणु और दवा उपचार के प्रभावों को देखे जाने की अनुमति देकर इस सीमा पर काबू पा देती है। हालांकि, इस सीमा के कारण, अणु खुराक के बारे में निश्चित निष्कर्ष से बचा जाना है, और खुराक प्रतिक्रिया घटता प्रोत्साहित किया जाता है । इसके विपरीत, यह मंच सीरम-मुक्त माइक्रोटिस्यूई संस्कृति के लिए उपयुक्त नहीं है क्योंकि एडिटिव्स पीडीएमएस को सोखेंगे, जिससे ऊतक स्वास्थ्य और विकास में बाधा आएगी। भविष्य में, 3 डी बायोप्रिंटिंग और/या स्वचालित तरल हैंडलिंग जैसी तकनीकों को एकीकृत करने से एचएमएमटी संस्कृतियों के निर्माण में थ्रूपुट में सुधार होगा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों को घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम मोहम्मद अफशर, हाबेन अबराहा, मोहसेन अफशर-बकोशली और सैदेग दावौदी को MyoTACTIC संस्कृति मंच के आविष्कार में योगदान देने और यहां वर्णित निर्माण और विश्लेषण विधियों की स्थापना के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । एचएल को ऑर्गन-ऑन-ए-चिप इंजीनियरिंग एंड एंटरप्रेन्योरशिप और यूनिवर्सिटी ऑफ टोरंटो वाइल्डकैट ग्रेजुएट स्कॉलरशिप में नेचुरल साइंसेज एंड इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल (एनएसईआरसी) ट्रेनिंग प्रोग्राम से फंडिंग मिली । पीएमजी एंडोजेनस रिपेयर में कनाडा रिसर्च चेयर है और इसे ओंटारियो इंस्टीट्यूट फॉर रिजेनरेटिव मेडिसिन, स्टेम सेल नेटवर्क और मेडिसिन से डिजाइन, कनाडा फर्स्ट रिसर्च एक्सीलेंस प्रोग्राम से इस अध्ययन के लिए समर्थन प्राप्त हुआ। BioRender.com के साथ योजनाबद्ध आरेख बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Saline Solution, Sterile House Brand 1010 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C
25G Needle BD, Medstore, University of Toronto 2548-CABD305127
6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder Sigma - Aldrich A2504-100G A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
6.35 mm ID Tubing VWR 60985-528
AB1167 Myoblast Cell Line Institut de Myologie (Paris, France)
Arbitrary Waveform Generator Rigol DG1022Z
Basement Membrane Extract (Geltrex) Thermo Fisher Scientific A14132-02 Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C
Benchtop Vacuum Chamber Sigma - Aldrich D2672
BNC to Aligator Clip Cable Ordered from Amazon
Culture Plastics Sarstedt Includes culture plates, serological pipettes, etc
Dimethyl Sulfoxide Sigma - Aldrich D8418-250ML
DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium Thermo Fisher Scientific 21600069
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Gibco 11995-065 This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10437028
Fibrinogen from Bovine Plasma Sigma - Aldrich F8630-5G Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C
Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size Sarstedt 83.1826.001
Horse Serum Gibco 16050-122
Human Recombinant Insulin Sigma - Aldrich 91077C Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C
Image Acquisition Software Olympus cellSens Dimension
Image Processing Software National Institutes of Health ImageJ
Isotemp Oven Thermo Fisher Scientific 201
Microscope Olympus IX83
Microscope - Camera Mount Labcam Labcam for iPhone Ordered from Amazon
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122
Plastic Disposable Syringes, 1cc BD 2606-309659
Plastic Disposable Syringes, 50cc BD 2612-309653
Pluronic F-127, Powder, BioReagent Sigma - Aldrich P2443-250G A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) Dow 4019862 Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.
Polyurethane Negative Mold In House
Release Agent Mann Release Technologies 200
Rotary Vane Vacuum Pump Edwards A65401906
Scalpel Almedic, Medstore, University of Toronto 2586-M36-0100
Single Edge Razor Blade VWR 55411-050
Skeletal Muscle Cell Basal Medium Promocell C-23260 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C.
Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) Promocell C-23060 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C.
Smartphone (iPhone) Apple SE
Standard Duty Dry Vacuum Pump Welch 2546B-01
Sterilization Bag Alliance 211-SCM2
Thimble Igege Ordered from Amazon
Thrombin from human plasma Sigma - Aldrich T6884-250UN 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C.
Tin coated copper wire Arco B8871K48 Ordered from Amazon
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Scientific 15250061
Trypsin-EDTA, 0.25% Thermo FIsher Scientific 25200072
Vacuum Chamber 2 SP Bel-Art F42027-0000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
  3. Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
  4. DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
  5. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  6. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  7. Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  8. Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
  9. Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
  10. Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  11. Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
  12. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
  13. Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
  14. Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
  15. Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
  16. Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
  17. Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  18. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
  19. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  20. Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
  21. Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
  22. Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
  23. Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
  24. Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
  25. Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
  26. Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
  27. Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
  28. Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
  29. Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
  30. Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
  31. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
  32. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  33. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  34. Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
  35. Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
  36. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  37. Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 168 मानव कंकाल मांसपेशी विद्युत उत्तेजना कैल्शियम हैंडलिंग बल माप अमर मायोजेनिक प्रोजेनिटर कोशिकाएं न्यूनतम आक्रामक ऊतक इंजीनियरिंग उच्च सामग्री त्रि-आयामी कोशिका संस्कृति पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन
मानव कंकाल मांसपेशी माइक्रोटिस्यूस में कंकाल मांसपेशी स्वास्थ्य के कार्यात्मक मैट्रिक्स का आकलन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lad, H., Musgrave, B., Ebrahimi, M., … More

Lad, H., Musgrave, B., Ebrahimi, M., Gilbert, P. M. Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues. J. Vis. Exp. (168), e62307, doi:10.3791/62307 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter