Summary
Bu makalede, 3D insan iskelet kas mikrotleri dizileri ve kas gücü ve kalsiyum elleçleme analizleri de dahil olmak üzere minimal invaziv aşağı akış in situ fonksiyon tahlilleri üretmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
İskelet kasının üç boyutlu (3D) in vitro modelleri, iskelet kası reformunu inceleme ve deneysel manipülasyonlara uygun ölçeklenebilir bir formatta işlev bulma fırsatını sağladığı için biyomedikal araştırmalarda değerli bir ilerlemedir. 3D kas kültürü sistemleri, bilim adamlarının iskelet kası ex vivo'larını insan hücreleri bağlamında incelemelerini sağladığı için arzu edilir. 3D in vitro modeller, yetişkin iskelet kasının doğal doku yapısının yönlerini yakından taklit etti. Bununla birlikte, evrensel uygulamaları, üretimi basit, maliyetli ve kullanıcı dostu olan ve nispeten yüksek miktarlarda insan iskelet kası dokusu sağlayan platformların mevcudiyeti ile sınırlıdır. Ek olarak, iskelet kası birçok hastalık eyaletinde zamanla bozulan önemli bir fonksiyonel rol oynadığından, mikrotissue çalışmaları için deneysel bir platform, minimal invaziv kalsiyum geçici ve kontrtil kuvvet ölçümleri doğrudan platformun kendi içinde yapılabildiğinde en pratiktir. Bu protokolde, 'MyoTACTIC' olarak bilinen 96 kuyulu bir platformun imalatı ve 3D insan iskelet kas mikrotissuesinin (hMMTs) toplu üretimi açıklanmıştır. Ek olarak, iskelet kas kuvvetinin tekrarlanan ölçümlerini ve zaman içinde her mikrotissue'nin kalsiyum elleçlenmesini sağlayan elektriksel stimülasyonun minimal invaziv bir uygulaması için yöntemler bildirilmiştir.
Introduction
İskelet kası insan vücudundaki en bol dokulardan biridir ve lokomotion, ısı homeostazı ve metabolizma gibi temel vücut fonksiyonlarını destekler1. Tarihsel olarak, hayvan modelleri ve iki boyutlu (2D) hücre kültürü sistemleri biyolojik süreçleri ve hastalık patogenezini incelemek ve iskelet kas hastalıklarının tedavisinde farmakolojik bileşikleri test etmek için kullanılmıştır2,3. Hayvan modelleri sağlıkta ve hastalıkta iskelet kası bilgimizi büyük ölçüde geliştirmiş olsa da, çevirisel etkileri yüksek maliyetler, etik hususlar ve türler arası farklılıklar ile engellenmiştir2,4. İskelet kasını incelemek için insan hücre tabanlı sistemlere yönelen 2D hücre kültürü sistemleri, basitlikleri nedeniyle elverişlidir. Ancak, bir sınırlama vardır. Bu biçim genellikle vücut içinde doğal olarak meydana gelen hücre-hücre ve hücre dışı matris etkileşimlerini yeniden yakalayamaz5,6. Son birkaç yılda, üç boyutlu (3D) iskelet kası modelleri, fizyolojik ve patolojik olarak ilgili süreçlerin modellenebilmesine izin vererek tüm hayvan modellerine ve geleneksel 2D kültür sistemlerine güçlü bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır ex vivo7,8. Gerçekten de, çok sayıda çalışma, insan iskelet kasını biyoartificial 3D kültür formatında modelleme stratejileri bildirmiş1. Bu çalışmaların birçoğu için bir sınırlama, aktif kuvvetin kas dokularının kültür platformlarından çıkarılması ve yıkıcı olan bir kuvvet dönüştürücüye bağlanmasının ardından ölçülmesidir, bu da bir uç nokta olarak hizmet etmekle sınırlıdır9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Diğerleri aktif kuvveti ölçmek için non-invaziv yöntemlere izin veren kültür sistemleri tasarladılar, ancak hepsi yüksek içerikli molekül test uygulamaları 7 ,8,9, 10,14,18,22,23,24,25,26,27,28'euygundeğil. ,29.
Bu protokol, iskelet kası (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) platformunda insan kas mikrotissues (hMMTs) imal etmek için ayrıntılı bir yöntem açıklar; 3D iskelet kas mikrotissues 30 toplu üretimini destekleyen bir96kuyu plakası cihazı. MyoTACTIC plaka imalat yöntemi, 96 kuyu polidimetilsiloksisan (PDMS) kültür plakasının ve buna karşılık gelen tüm kuyu özelliklerinin tek bir döküm adımında üretilmesini sağlar, böylece her kuyu mikrotissue oluşumu için nispeten az sayıda hücre gerektirir. MyoTACTIC içinde oluşan mikrotissues, cihazın iyisinden iyisine tekrarlanabilir hizalanmış, çizgili ve çok irtiküle edilmiş miyotütler içerir ve olgunlaşma üzerine, kimyasal ve elektrik uyaranlarına yerinde yanıt verebilir30. Burada, bir poliüretan (PU) replikasından PDMS MyoTACTIC kültür plakası cihazı üretme tekniği, hMMT'leri üretmek için ölümsüzleştirilmiş insan miyojenik progenitör hücrelerini uygulamak için optimize edilmiş bir yöntem ve mühendislik hMMT kuvveti üretimi ve kalsiyum işleme özelliklerinin fonksiyonel değerlendirmesi özetlenmiş ve tartışılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PDMS MyoTACTIC plaka imalatı
NOT: PDMS MyoTACTIC plaka imalatı, daha önce açıklandığı gibi30üretilebilen bir PU negatif kalıp gerektirir. MyoTACTIC plaka tasarımı için bilgisayar destekli tasarım (CAD) SolidWorks dosyası GitHub'da (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file) kullanıma sunuldu.
- Silikon elastomer kitteki bileşenleri kullanarak kürleme maddesine 1:15 monomer oranında tek kullanımlık plastik bir kapta ~ 110 g PDMS polimer çözeltisi hazırlayın. Polimer çözeltisini tamamen karışana ve homojen olana kadar 5 mL tek kullanımlık serolojik pipet kullanarak 2-3 dakika karıştırın.
DİkKAT: PDMS polimer çözeltisinin cilt ve gözlerle temasından kaçının; ve solumaktan kaçının. Sıvı PDMS karışımını kullanırken her zaman bir laboratuvar önlüğü ve tek kullanımlık eldiven giyin ve belirli güvenlik protokolleri için Güvenlik Veri Sayfası'na (SDS) bakın.
NOT: PDMS polimer çözeltisinin dökülmesi durumunda ekipman yüzeylerini (örneğin, ölçek, tezgah üstü vb.) tek kullanımlık bir kaplama ile koruyun. - Fincanı standart bir tezgah kuru vakum pompasına bağlı bir tezgah üstü vakum odasına ~ 30 dakika boyunca veya tüm kabarcıklar çıkarılana kadar oda sıcaklığında gazdan arındırın. Gaz gidermeye yardımcı olmak için her 5-10 dakikada bir vakumu kırın. Havayı daldırmak ve polimer karışımının yüzeyinde kalan kabarcıkları gerektiği gibi üflemek için boş bir 50 mL şırınna namlu kullanın.
NOT : Hava akımının hızını ve doğruluğunu artırmak için bir P1250 pipet ucunu namluya bağlamak için 6,35 mm kimlik boru parçası kullanılabilir. - PDMS polimer çözeltisi gazdan arındırılırken, pürüzlü bir kağıt havlu ile kenarları ve yüzeyi hafifçe silerek PU negatif kalıbına yapıştığı PDMS artık parçalarını çıkarın. Kalan ince parçacıkları gidermek için 70-100 kPag'a ayarlanmış tesis basınçlı hava kullanın.
NOT: PU negatif kalıbı sızdırmaz plastik bir torbaya koyarak ve laboratuvar trafiğinden korunan bir çekmecede saklayarak hasardan ve partikül birikiminden koruyun. - PU kalıbını tek kullanımlık bir kaplama ile korunan kimyasal bir davlumbazın içine yerleştirin. Kalıbı ~75° yatay olarak bekletin ve aktif yüzeyi eşit bir serbest bırakma maddesi tabakasıyla püskürtün. Kalıbı yukarıdan aşağıya, sonra soldan sağa püskürtün, kalıbı kalıptan 15-20 cm uzakta tutun ve sıvı bir ileri geri süpürme hareketi kullanarak. Kalıbı 180° döndürün ve spreyleri tekrarlayın, ardından PU kalıbını kurumasını sağlamak için kimyasal kaputta 10-15 dakika bekletin.
DİkKAT: Serbest bırakma maddesinin kimyasal duman kaputunda kullanıldığından emin olun, cilt ve gözlerle temastan kaçının ve belirli güvenlik protokolleri için Güvenlik Veri Sayfası'na (SDS) bakın
NOT: İnce bir filmin aktif yüzeyi tamamen kaplaması gerekir, ancak bir sonraki adımda PDMS'ye aşırı kaplama aktarılabilir ve bu da hMMT tohumlamasını olumsuz yönde etkileyebilir. Yüzey dokunmaya kaygan hissetmeli, ancak ıslak olmamalıdır. - PU kalıbına eşit olarak 100 g PDMS dökün ve döner pervane vakum pompasına bağlı bir vakum odasına yerleştirin. PDMS dolu kalıbı ~45 dakika degas, işlemi hızlandırmak için ilk 20 dakika boyunca her 5-10 dakikada bir vakum contasını kırın. PDMS karışımı tüm kabarcıklardan tamamen void olana kadar vakum odasında bırakın.
NOT: Daha düşük bir vakum elde etmek ve bu adım için gereken süreyi azaltmak için döner pervane vakum pompası kullanılır. PDMS dolu kalıbın gazdan arındırılması tezgah üstü vakum odası ve standart görev kuru vakum pompası kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak tüm kabarcıkların karışımını geçersiz kılma süresi daha uzun olacaktır. Esas olan, özellikle hMMT bağlantı direkleri olmaya aday bölgelerde, tüm kabarcıkların PDMS polimer çözeltisinden çıkarılmasıdır. Bu bölgedeki kabarcıklar çapa direği kırılmasına, kültür kuyularının kaybına ve buna karşılık kalıpta sıkışmış küçük bir PDMS parçasına neden olacaktır. - Gazdan arındırılan PDMS dolu PU kalıbını 65 °C fırına aktarın, sıvı kauçuğun tedavisi için bir gecede inkübe edin.
- Kürlenmiş PDMS pozitif plakayı fırından çıkarın ve tabağı oda sıcaklığında en az 30 dakika soğutun.
- Bıçaksız bir neşterle, PDMS ile kalıbın duvarları arasındaki tutamağın arkasını çalıştırarak PDMS'yi PU kalıbından hafifçe ayırın. Üst kenar boyunca başlayın ve kalıbın tabanına itmeden ve bu kısmı ayırmadan önce 4 tarafı da ayırın. Bu adım, tutamacın arkası PDMS ile PU kalıbının 4 duvarı arasında sorunsuz çalıştığında tamamlanır.
NOT: PU kalıbını çatlatmamak veya PDMS'yi yırtmak için bıçaksız neşterle yavaşça ve dikkatli bir şekilde çalışın. Bu adım 15-20 dakika sürmelidir. - Bir uçtan başlayarak, PDMS'nin kenarını kaldırmak ve kürlenmiş PDMS kültür plakası ile PU kalıbı arasında parmakları çalışmak için bıçaksız neşteri kullanın. Daha sonra, her iki eli kullanarak, parmakları plakanın altına daha fazla itin, pu kalıbını yavaşça soyun ve dışarı çıkarın.
NOT: Yavaşça çalışın ve plakayı eşit şekilde soymak için iki ellerinizi de kullanın. Çapa direğinin kırılma olasılığını azaltmak için bükmeyi en aza indirin. Bu adım 5-10 dakika sürmelidir. - Plakayı doku tohumlama amacıyla 6 ± 2 MyoTACTIC kuyusu (Şekil 1) grupları halinde kesmek için tek kenarlı bir jilet kullanın. Tam MyoTACTIC plakalarını veya plaka kısımlarını bir cihaz sterilizasyon torbasına yerleştirin ve 120 °C ve 100-140 kPag'da 25 dakikalık bir kuru döngü (20 dakika sterilizasyon süresi ve 5 dakika kuru zaman) için otoklav.
2. Ölümsüzleştirilmiş insan miyelost progenitör hücrelerinin kültürü
NOT: Bu protokolde kullanılan ölümsüzleştirilmiş mioblastlar Institut de Myologie (Paris, Fransa)31.
- Sıvı azot dewar'dan bir şişe donmuş hücre elde edin ve şişeyi 37 °C'lik bir su banyosunda (1 dakikadan daha kısa bir sürede) hızlı bir şekilde çözün. Hücreler% 90 fetal sığır serumu (FBS) ve% 10 dimetil sülfit (DMSO) oluşan 1 mL donma ortamı başına 7,5 x 105 hücre yoğunluğunda dondurulur.
- Şişenin içeriğini, DMSO'yu seyreltmek için% 89 DMEM 1x,% 10 FBS ve% 1 Pen / Strep'den oluşan 9 mL önceden ısıtılmış yıkama ortamı içeren 15 mL konik bir tüpe hafifçe aktarın. 15 mL konik tüpü 400 x g'da 10 dakika döndürün ve ardından hücre peletinden kaçınmaya özen eden medyayı epire edin.
- Peleti, İskelet Kas Hücresi Büyüme Orta Takviye Karışımı ile% 84 İskelet Kas Hücresi Bazal Orta, % 15 FBS ve% 1 Pen / Strep ile oluşan 1 mL büyüme ortamında yeniden dürtmek ve daha sonra 29 mL büyüme ortamına sahip 50 mL konik bir tüpe aktarın.
- Yaklaşık 2,5 x 10 5 hücre içeren 10 mL ortamı 100 mm x 20 mm hücre kültürü çanağa aktarın. Bu adımı hücre çözeltisinin kalan 20 mL'si ile tekrarlayın. Daha sonra hücre kültürü yemeklerini 37 °C ve% 5 CO2olarak ayarlanmış nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın.
- Kültür medyasını iki günde bir yenileyin. Hücreleri ~ % 70-% 80 izdiah elde edene kadar kültüre edin (tipik olarak 4-5 gün), bu noktada hücreler tohumlama için hazırlanır. Her hMMT'yi oluşturmak için1,5 x 10 5 hücre gerekir. Bu nedenle, gerekli hücre sayısını elde etmek için hücreleri gerektiği gibi geçiştirin.
NOT: Ölümsüzleştirilmiş mioblast progenitör hücre hatları, hücreleri MyoTACTIC kuyularına tohumlamadan, hücreleri geçirmeden veya dondurucu stoklarını hazırlamadan önce asla% 80'i geçmemelidir. %80'i aşan hücrelerden üretilen hMMT'ler genellikle sözleşme olgunluğuna ulaşamaz. Geçiş prosedürleri, 3.
3. MyoTACTIC ile tohum mühendisliği hMMT'ler
- hMMT tohumlama için MyoTACTIC kültür kuyularının ve reaktiflerinin hazırlanması.
NOT: Bu protokol, 6 hMMT üretmek için özel ayrıntılar sağlar.- Hücre tohumlamadan önce 2-3 saat, 6 kuyu MyoTACTIC plaka kısmını 10 cm hücre kültürü kabına yerleştirin. Her kuyuya %5 Pluronic F-127 çözümünün 100 μL'sini ekleyerek her bir MyoTACTIC kültürünü iyi hazırlayın. Kapağı 10 cm'lik kültür kabına koyun, 10 cm'lik çanak ve kapak arasındaki boşluğu kapatmak için parafin uygulayın ve ardından MyoTACTIC kısmını içeren 10 cm'lik plakayı bir plaka spinner adaptörü ile donatılmış bir santrifüje yerleştirin.
NOT: Santrifüj plaka spinner adaptörü mevcut değilse, direklerin arkasındaki kabarcıkları dikkatlice çıkarmak ve böylece tüm kültür yüzeyinin eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için bir p20 pipet ucu kullanılabilir. - Kültür kuyularındaki, özellikle de direklerin arkasındaki tüm kabarcıkları çıkarmak için 1 dakika boyunca 1.550 x g'da santrifüj. Pluronic F-127 çözeltisi içeren MyoTACTIC plaka kısmını içeren 10 cm hücre kültürü çanağına, hücreler tohumlama için hazırlanana kadar 4 °C'de saklayın.
NOT: Pluronic F-127 kaplama 2 saat ile 24 saat arasında uygulanabilir. Örneğin, kuyular ertesi gün kullanılmak üzere günün sonunda Pluronic F-127 çözeltisi ile doldurulabilir. HMMT tadilatı olumsuz etkileyeceği ve kontrtil olgunluğa ulaşan sağlıklı dokular oluşturamayacağı için 24 saati aşmayın. - Kültür başlığı içindeki buz üzerinde bir adet 50 μL bodrum membran özü aliquot ve bir adet 10 μL trombin aliquot (100 U/mL stok çözeltisi) yavaşça çözün.
NOT: Bodrum zarı özü aliquots'ları yeniden çözmeyin. Tek kullanımlıktırlar. Trombin aliquots yeniden kullanılabilir, bu nedenle, kullanımdan sonra 5 kata kadar yeniden dondurun. - 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde ~7 mg toz fibrinojen tartın ve ardından hücre kültürü başlığına aktarın. 10 mg/mL'lik son konsantrasyon çözeltisine ulaşmak için suya (veya tuzlu su çözeltisine) 700 μL%0,9 (wt/vol) NaCl çözeltisi ekleyin. Çözünecek girdap fibrinojenini yapmayın, bunun yerine tüpü 3-5 dakika boyunca 37 °C hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
- Tüpü hafifçe çıkarın ve hareket ettirün, ardından çözünmüş çözeltiyi tezgah üstü mini santrifüjde (mikrofuge) döndürün ve kültür başlığına geri dönün. Fibrinojen çözeltisini 0,22 μm şırıng filtresi ile donatılmış 1 mL şırıng kullanarak filtreleyin. Çözünmüş fibrinojen çözeltisini bodrum membran özü ve trombin aliquots ile birlikte buza aktarın.
- Son olarak, dokuların tohumlanmasının ardından kültür kuyularına tanıtılacak hMMT tohumlama ortamını hazırlayın. Bu ortam% 20 FBS,% 1 P / S ve% 3 6-aminocaproik asit ile desteklenmiş İskelet Kas Hücresi Bazal Orta içerir (ACA; 1.5 mg / mL son konsantrasyonu 50 mg / mL stok çözeltisinden seyreltilerek elde edilir; % v / v olarak ifade edilir). Kullanmadan önce ortamı 37 °C'de önceden ısıtın.
- Hücre tohumlamadan önce 2-3 saat, 6 kuyu MyoTACTIC plaka kısmını 10 cm hücre kültürü kabına yerleştirin. Her kuyuya %5 Pluronic F-127 çözümünün 100 μL'sini ekleyerek her bir MyoTACTIC kültürünü iyi hazırlayın. Kapağı 10 cm'lik kültür kabına koyun, 10 cm'lik çanak ve kapak arasındaki boşluğu kapatmak için parafin uygulayın ve ardından MyoTACTIC kısmını içeren 10 cm'lik plakayı bir plaka spinner adaptörü ile donatılmış bir santrifüje yerleştirin.
- hMMT tohumlama için hücrelerin hazırlanması.
- Hücre kültürü plakalarını kültür inkübatöründen toplayın. Her plakadan medyayı epire edin, ardından her kültür plakasına 5 mL D-PBS ekleyerek hücreleri D-PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra D-PBS'yi aspire edin ve her kültür yemeğine% 0.25 Trypsin-EDTA'nın 1 mL'sini ekleyerek hücreleri ayırın. Hücre kültürü inkübatörüne 3 dakika yerleştirin.
- Kültür yemeğine 3 mL yıkama ortamı (1x DMEM'in %89'ı + %10 FBS + %1 Pen/Strep) ekleyerek tripsin'i durdurun. Hücre çözeltisini uygun boyutta konik bir tüpe aktarın ve ardından 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj yaparak hücreleri peletin. Hücre peletinden kaçınmak için medyanın özen göstermesini arzula. Daha sonra hücre peletini yıkama ortamının 1 mL'sinde yeniden ıslatır.
- Brightfield mikroskopisi altında hemositometre ve trypan mavi boya kullanarak hücreleri sayın.
Birden fazla hücre plakası kullanıyorsanız, bu hücre süspansiyonu çok konsantre olacaktır. Gerektiğinde saymadan önce hücre süspansiyonlarını seyreltin. - Her doku hücre dışı matris (ECM) karışımının 15 μL'sinde yeniden kullanılan 150.000 hücre gerektirdiğinden, 6 doku için 90 μL ECM karışımında 900.000 hücre gereklidir. Kabarcık oluşumu veya pipet kaybı nedeniyle hazırlık sürecinde meydana gelen hücre-ECM çözelti kaybını hesaba katmak için ekstra hücre-ECM karışımı hazırlayın (yani, 8 doku veya 120 μL ECM'de 1.200.000 hücre). 1.200.000 hücre içeren hücre süspansiyonunun hacmini yeni bir konik tüpe aktarın. Yıkama ortamı ile hacmi 10 mL'ye çıkarın ve 10 dakika boyunca 400 x g'da döndürün.
- Hücreler aşağı dönerken, aşağıdaki tarifi kullanarak 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 150 μL ECM karışımı hazırlayın. Önce 60 μL DMEM (%40 hacim) ekleyin, ardından 60 μL Fibrinojen 10 mg/mL çözelti (%40 hacim) ekleyin ve son olarak 30 μL bodrum membran özü (%20 hacim) ekleyin. ECM karışımını kullanıma kadar buz üzerinde saklayın.
NOT: Bodrum membran özü içeren çözeltilerle çalışırken her zaman -20 °C'de önceden soğutulmuş uçları kullanın. ECM karışımı 4 mg/mL fibrinojen içerir.
- Tohumlama hMMT'leri
- Spun aşağı hücreleri içeren konik tüpü toplayın ve hücre peletinden kaçınmak için medyayı özenerek aspire edin. Peleti yerinden çıkarmak için tüpün ucunun eldivenli bir parmakla kuvvetlice hafifçe vurun ve pelet bir hücre bulamacı olarak görünene kadar titremeye devam edin.
NOT: Hücre-ECM süspansiyonun istenen seyreltmede olduğundan emin olmak için mümkün olduğunca fazla yıkama ortamı aspire etmek önemlidir. Gerekirse kalan yıkama medyasını çıkarmak için bir pipet kullanın. - ECM çözeltisinin 120 μL'lik kısmını hücre peletini içeren tüpe aktarın. Pipet yukarı ve aşağı ecm içinde hücreleri iyice yeniden tek bir hücre süspansiyon oluşturmak için yeniden. Pipet, çalışma hacmini azaltacak kabarcıkların tanıtılmasını önlemek için yavaşça ve dikkatlice. Ardından, hücre-ECM çözeltisini kullanıma kadar buza yerleştirin.
- Pluronic F-127 kaplı MyoTACTIC kuyularını içeren MyoTACTIC plaka kısımlarını 4 °C buzdolabından alın ve MyoTACTIC kuyularını içeren 10 cm'lik tabağı hücre kültürü kaputunun içindeki bir buz torbasının üzerine yerleştirin.
- Pluronic F-127 solüsyon çözeltisini her kuyudan epire edin. PDMS gözenekli ve Pluronic F-127 çözeltisini emecek, özellikle plakalar bir santrifüjle döndürülmüşse. Artık Pluronic F-127 çözeltisinin, kuyuların 5 dakika bekletilmesine izin vererek kuyunun dibine salınmasına ve yerleşmesine izin verin, ardından tekrar aspire edin.
NOT: Pluronic F-127 çözeltisini pire ederken ucunda p1250 ucu takılı bir Pasteur pipet ve p1250 ucunun üzerinde bir p200 ucu kullanın. Bu, post yapılarının yanlışlıkla aspirasyonunu önlemek için hassasiyeti artıracaktır. Pluronic F-127 kaplamasını bozduğu ve hMMT kendi kendine organizasyon sürecine müdahale ettiği için kuyunun dibindeki oval havuz şeklindeki hücre tohumlama alanını pipetle kazımaktan kaçının. Uygun teknik, Pluronic F-127 çözeltisini arzularken pipet ucunu oval havuzun hemen üzerine getirmektir. - Boru, hücre-ECM süspansiyonu, tüpün dibine batmış olabilecek hücreleri yeniden çıkarmak için dikkatlice. Ardından 105 μL hücre-ECM süspansiyonu taze, önceden soğutulmuş 1,5 mL tüpe aktarın. Çözeltinin ısınmasını önlemek için tüpü tepeye yakın kavramaya özen edin.
- 105 μL hücre-ECM süspansiyonuna 100 U/mL trombin stok çözeltisinin 0,84 μL'lik kısmını ekleyerek 0,2 U/mg fibrinojen konsantrasyonuna ulaştı. Pipet, kabarcıkların tanıtılmasından kaçınırken hızlı, dikkatli ve iyice karıştırmak için.
NOT: Trombin, fibrinojenin hızlı bir şekilde fibrin pıhtısına dönüştürülmesini başlatır. Bu nedenle, trombin ilavesi üzerine dokuları tohumlamak için sınırlı bir süre vardır. Hücre-ECM karışımı kültür kuyularına aktarılmadan önce erken pıhtılaşmayı önlemek için trombini eklemeden önce bir p20 pipetini 15 μL'ye ayarlayın. Önceden soğutulmuş uçları kullanın veya 15 μL hücre-ECM karışımını toplayıp her kuyuya aktarmadan önce pipet ucunu birkaç saniye buz gibi DMEM'e batırın. Hücre-ECM karışımı aliquots hazırlamak en iyi uygulamadır, böyle bir seferde en fazla 6 hMMT tohumlanır. - Dokuları tohumlamak için, her bireye 15 μL hücre-ECM karışımı (yani 150.000 hücre) ekleyin. Oval havuzun ortasına hücre-ECM karışımını dikkatlice ekleyin ve pipet ucunu kuyunun dibine bastırmaktan kaçının. Ardından, iki hafif hareketle, hücre süspansiyonu kuyudaki her direğin arkasına yayın. Yüzey hücre-ECM süspansiyonunda eşit olarak kaplandıktan sonra, bir sonraki kuyuya geçin.
NOT: Tüm dokular tohumlanmadan önce tüpteki hücre-ECM karışımının erken jelleşmesini önlemek için verimli bir şekilde çalışın. Kuyuları tohumlarken, kabarcık hMMT'nin yeniden şekillendirilmesine müdahale edeceğinden ve hMMT'yi kullanılamaz hale getireceğinden kabarcıkların aktarılmasından kaçınmak son derece önemlidir. - Kapağı tohumlu kuyuları içeren 10 cm'lik kültür plakasına yerleştirin ve yaklaşık 5 dakika boyunca 37 °C doku kültürü inkübatörüne aktarın.
NOT: Jel polimerizasyon işleminin teyidi olarak artık hücre-ECM karışımına sahip mikrosantrifüj tüpünü inkübatöre yerleştirin. - Hücre-ECM karışımı polimerize olduktan sonra, her MyoTACTIC kuyusuna 200 μL önceden ısıtilmiş hMMT tohumlama ortamı ekleyin. 10 cm'lik kabın kapağını değiştirin ve 10 cm'lik çanak içindeki MyoTACTIC plaka kısımlarını inkübatöre geri verin. Bu zaman noktası Gün -2 olarak adlandırılır. Bir sonraki adıma kadar dokuları rahatsız etmeyin.
- Spun aşağı hücreleri içeren konik tüpü toplayın ve hücre peletinden kaçınmak için medyayı özenerek aspire edin. Peleti yerinden çıkarmak için tüpün ucunun eldivenli bir parmakla kuvvetlice hafifçe vurun ve pelet bir hücre bulamacı olarak görünene kadar titremeye devam edin.
- hMMT'leri ayırt etme
- 2 günlük inkübasyondan sonra, bir pipet kullanarak hMMT tohumlama medyasını dikkatlice çıkarın ve% 2 at serumu içeren 200 μL önceden ısıtilmiş farklılaşma ortamı ile değiştirin, %1 Pen/Strep, %4 ACA (yani, 50 mg/mL stok konsantrasyonundan 2 mg/mL son konsantrasyon; % v/v olarak ifade edilir) ve DMEM'de 10 μg/mL insan rekombinant insülin. Bu zaman noktası, farklılaşmanın 0.
- Bundan sonraki her gün, farklılaşmanın 12.
NOT: Birincil insan miyeblastlarını kullanarak hMMT'leri imal etmek için protokol ayrıntıları başka bir yerde yayınlanmıştır30. Tohumlama sonrası hücre canlılığı ile ilgili endişeler varsa, canlılığı ölçmek için hMMT'leri kalsein ve propidium iyodür ile kuluçkaya yatırın.
4. Elektriksel stimülasyon ve hMMT kaynaklı post saptırma analizi
- Ters bir mikroskop üzerine net bir alt cam veya plastik sahne montajı kurun ve mikroskop kamera montajı kullanarak mikroskop göz merceğine bir akıllı telefon kamerası takın. 10x büyütmede faz kontrastı mikroskopisi kullanılacaktır (Şekil 3a).
NOT: 10x büyütme hedefi ile donatılmış herhangi bir ters faz kontrast mikroskobu uygun olacaktır. PDMS kuyu yapıları 10 cm'lik tabaktan çıkarılacak ve doğrudan net alt sahne montajına yerleştirilecek ve bu nedenle havaya açılacaktır. Tüm yüzeyleri ve ekipmanları %70 etanol ile sterilize edin ve deney sırasında bölgedeki trafiği en aza indirin. - Elektriksel stimülasyon elektrotlarını hazırlamak için ~ 30 cm kalay kaplı bakır tel kesin. Daha sonra, 25 G'lik normal bir eğim iğnesinin göbeğinden başlayarak, telin ~ 10 cm'lik kısmını üst yarının etrafına sıkıca sarın ve ~ 20 cm fazla tel bırakın. İkinci bir iğne için tekrarlayın ve ardından her iğnenin göbeğini kesin.
NOT: Tel hareket etmediğinden emin olmak için iğnenin etrafına sıkı olmalı ve elektrotun tel sarılmış kısmı PDMS'ye dokunmamalıdır, çünkü bu elektrik alanı üretimine engel olabilir. - Timsah klipsi konektör kablosuna BNC'yi dalga biçimi üreticisindeki bir çıkış kanalına takın ve kare darbeler için kanalı% 20 görev döngüsü, 5 V genlik (10 V / cm elektrik alan gücü) ile ayarlayın. Frekans, seğirme ve tetanoz kasılmaları için sırasıyla 0,5 Hz ile 20 Hz arasında değişmektedir.
NOT: Dalga biçimi oluşturucu ayarları deneye özgü optimizasyon gerektirebilir - Mikroskop aşamasına hMMT'ler içeren bir MyoTACTIC plaka kısmı yerleştirin ve her elektrot eğim ucını oval havuzdaki her direğin hemen arkasındaki PDMS'ye hafifçe yerleştirin. Fazla telin 20 cm'lik bölümlerini mikroskop aşamasına dikkatlice bantleyin, böylece iğneler dikey kalır ve her telin ~ 10 cm'si bağlantı için serbest kalır (Şekil 3a).
DİkKAT: Elektrotunun her iki ucuna asla çıplak parmak basmayın. PDMS'ye yerleştirmede elektrota ışık basıncı uygulamak için işaret parmağına bir yüksük takıldığından emin olun. - Mikroskop görüş alanını iki gönderiden birine odaklayın, böylece odak elektrota en yakın post kenarında keskindir. Ardından, akıllı telefon kamera odağını gönderinin en net alanına kilitleyin. Bu, aşağı akış analizi için önemlidir, çünkü kayıt analize engel olurken odaktaki bir değişikliktir.
- Bantlanmış tellerin serbest uçlarını timsah kelepçeleri ile dalga biçimi jeneratörüne bağlayın (Şekil 3a).
- Akıllı telefon kamerasında video kaydını başlatın ve ardından uyarım başlatmak için kanal çıkışını açın. hMMT'yi 3 seğirme ve 3 tetanoz kasılmalarına neden olur ve seğirme ve tetanoz stimülasyon serisi arasında 2 dakika dinlenme.
- Kanal çıkışını kapatın, timsah klipslerini kalay kaplı bakır tellerden ayırın, bandı tellerden çıkarın ve sonraki hMMT kuyularına takmadan önce her elektrodu% 70 etanol ile silin. Tüm hMMT'ler için 4.5.
NOT: HMMT'lerin inkübatör dışında geçirdikleri süreyi, aynı anda en fazla 3 dokuyu uyararak sınırlandırın. MyoTACTIC plaka kısmındaki ek hMMT'ler analiz edilmeye devam ederse, hMMT'lerin 37 °C'ye geri dönmesini sağlamak için plakayı 10 dakika boyunca inkübatöre geri döndürün. - hMMT kuvvet oluşturmayı hesaplamak üzere gönderi saptırmasını çözümlemek için GitHub'da (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC) kullanıma sunulan özel komut dosyasını kullanın. Komut dosyasını ayarlamak ve başlatmak için README.md'daki yönergeleri izleyin, ardından kuvvet analizini yapmak için her gönderi izleme videosunu açın.
- Yer değiştirme sonrası için izlenecek posta kenarı boyunca bir ilgi alanı (YATıRıMGİsİ) seçin. Yatırım getirisini onaylamak için Enter tuşuna basın ve komut dosyasını çalıştırmak için enter tuşuna tekrar basın ( Ek Video1).
NOT: Büyük sapmalar izleyicinin başarısız olmasını neden olur. İzleyici kasılma sırasında başarısız olursa, izlemeyi daha az hassas hale getirmek ancak büyük sapmaların izlenmesine izin vermek için yatırım getirisi boyutu artırılabilir. Kodda üç boyut sağlanır ve komut dosyası açıklamaları ayarlanarak ayarlanabilir. - Komut dosyası iki giriş gereksinimiyle sona erer. İlk olarak, videonun birden fazla kasılma içerdiğini onaylamak için y girin. İkinci olarak, sonuçları bir öğesinin içine vermek için y (evet) veya n (hayır) girin. CSV dosyası (Ek Video 1).
- Sapma sonrası sonuçların her daralma için piksel cinsinden yer değiştirme olarak bildirildiklerinden emin olun. Mikroskop 10x büyütme ayarı için pikselleri μm değerlerine dönüştürün. Daha sonra, 1:15 kürleme maddesine karşılık gelen 2.36 μN / μm kuvvet deplasmanı dönüştürme faktörü ile değerleri (μm) çarparak yer değiştirme sonrası sayıları mutlak kontraktil kuvvetlere (μN) dönüştürün, bu da MyoTACTIC imalatında kullanılan PDMS'nin monomer oranına karşılık gelir30.
5. Elektriksel stimülasyon kullanılarak kalsiyum geçici analizi
NOT: Kalsiyum işleme deneyleri için, ölümsüzleştirilmiş mioblastlar daha önce açıklandığı gibi MHCK7-GCAMP6 muhabiri ile saptırıldı11,12. Transdüklenmiş hücreler, pozitif popülasyonu elde etmek için GFP için sıralanmış facs'lardır ve daha sonra hMMT'leri imal etmek için kullanılır. Fura-2 ve Indo-1 gibi oran-metrik boyaların kullanılması veya kalsiyum göstergelerinin floresan ömür boyu görüntülenmesi (örneğin, Fluo-4 veya Oregon Green BAPTA1) gibi kalsiyum görüntüleme için alternatif yöntemler sistemimize uygun olabilir.
- Daha önce adım 4'te açıklandığı gibi mikroskop aşamasını ve stimülasyon ekipmanını (elektrotlar, dalga formu üreteci vb.) kurun. Bu deney için 4x büyütme kullanın.
NOT: Ccd kamera ile donatılmış karanlık bir odaya ve epifluoresans mikroskobuna ihtiyaç duyulacaktır. - Mikroskop görüntüleme yazılımını başlatın, FITC filtre kanalını (mavi ışık) seçin ve film kayıt işleviniseçin. 500 ms pozlama ve 680 x 510 çözünürlükte (Binning 2x2) ayarlayın.
NOT: Görüntüleme yazılımı değişebilir ve pozlama kullanıcı tarafından manuel olarak ayarlanır. Stimülasyondan önce hMMT'nin aşırı maruz kalmasını önlemeye özenin. Dinlenmede, spontan floresanlı koyu bir doku anahattı / gölgesi normaldir, net bir doku görüntüsü aşırı pozlama iken(Ek Video 2). Pozlamanın bir deneydeki tüm hMMT'ler için tutarlı olduğundan emin olun. - Mikroskop deklanşörunu kapatın ve fitc kanalını kalsiyum işlemeyi kaydetmeye hazır olana kadar kapalı tutun.
- Tüm ekipman ve yazılımlar kurulduğunda, analiz edilecek hMMT'leri içeren MyoTACTIC plaka kısmını alın ve doğrudan mikroskop aşamasına ayarlayın. Ardından, daha önce adım 4'te açıklandığı gibi elektrotları takın ve bağlayın.
- Görüş alanını seçili hMMT'nin ortasına odaklamak için brightfield kullanın. Ardından lambayı kapatın.
- Mikroskop FITC kanal deklanşörini açın, mavi ışığın açık olduğunu onaylayın ve ardından yazılımda Film Kaydı'nı seçin.
- Elektriksel uyarım başlatmak için dalga biçimi jeneratörünün çıkışını açın. hMMT'yi 8 seğirme ve 8 tetanoz kasılmalarına neden edin. Seğirme ve tetanoz stimülasyon serisi arasında 2 dakika dinlenmeye izin verin, bu süre zarfında FITC deklanşörü kapalı konumdadır.
NOT: Hesaplama ve veri analizi amacıyla minimum floresan kaydetmek için elektriksel stimülasyondan önce ve sonra 10 spontan aktiviteye izin verin. - Kanal çıkışını kapatın, timsah klipslerini kalay kaplı bakır tellerden ayırın, teypleri tellerden çıkarın ve sonraki hMMT kuyularına takmadan önce her elektrodu% 70 etanol ile silin. Tüm hMMT'ler için stimülasyon ve kayıt prosedürünü tekrarlayın.
- ImageJ veya alternatif görüntüleme yazılımında analiz için filmleri TIFF dosya biçiminde kaydedin.
NOT: HMMT'lerin inkübatör dışında geçirdikleri süreyi, aynı anda en fazla 3 dokuyu uyararak sınırlandırın. MyoTACTIC plaka kısmındaki ek hMMT analiz edilmeye devam ederse, hMMT'lerin 37 °C'ye geri dönmesini sağlamak için cihazı 10 dakika boyunca inkübatöre geri döndürün. - Kalsiyum geçici verilerini analiz etmek için önce ImageJ'i açın. Analiz Et 'iseçin, sonra Ölçümleri Ayarla'yı seçin, sonra Ortalama Gri Değer'i seçin ve diğer tüm seçeneklerin seçimini kaldırın. Tamamlandığında, bir kalsiyum (.tiff) videosu açın (Ek Video 2).
- Çokgen seçim aracı kullanarak mikrotissue kenarlıklarını ana hatlarıyla oluşturun ve bu alanı yatırım getirisi (Ek Video 2) olarak kaydedin. Yatırım GetiriSi Yöneticisi penceresinde Diğer'in altında Çoklu Ölçü'nün'ü seçin ve tüm dosya dilimleri için floresan yoğunluğunu dilim başına bir satırdaölçün (Ek Video 2).
- Dilim numarası (çerçeve) dahil olmak üzere tüm ölçümleri bir elektronik tabloya kopyalayın ve her dilimin floresan yoğunluğunu ΔF/F0 = (Fhemen - Fminimum)/F minimum (Ek Video 2)kullanarak dosyadakiminimum spontan floresan yoğunluğuyla karşılaştırın.
- Film kayıt kare hızını dilim numarası (kare) ile çarparak her kare için zamanı hesaplayın ve ΔF/F0'ı hMMT kalsiyum geçici uyarım yanıtı için zamana göre çizin (Ek Video 2).
- Her hMMT'nin göreli ortalama tepe floresan yoğunluk değişimini hesaplamak için ardışık 6 kasılma ve ortalama değerin her biri için en yüksek kalsiyum geçici sinyalini seçin (Ek Video 2).
NOT: İlk seğirme daralmasından kaynaklanan verileri her zaman genel analizden hariç tutun. hMMT kalsiyum geçici analizini kolaylaştırmak için GitHub'da (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) "Kalsiyum İşleme Şablonu.xlsx" başlıklı bir elektronik tablo sağlanmıştır. Değerlerin ve girişlerin girileceği doldurulabilir hücreler gri renkle vurgulanır. Tepe seçim sayılarını ayarladığından emin olun, çünkü bu yalnızca tepe seçimine yardımcı olacak bir kılavuzdur (Ek Video 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan yöntemler, bir PU kalıbından 96 kuyu PDMS tabanlı MyoTACTIC kültür platformu oluşturma, hMMT replika doku dizileri üretme ve kültür cihaz zorlama üretimi ve kalsiyum işleme içinde hMMT işlevinin iki yönünü analiz etme yöntemleridir. Şekil 1, hMMT tohumlamadan önce MyoTACTIC kültür kuyularının hazırlanmasına şematik bir genel bakış sunmaktadır. PDMS, karmaşık cihazlar oluşturmak için kolayca kalıplanabilen yaygın olarak kullanılan silikon bazlı birpolimerdir 32. PDMS tabanlı bir protokol, üretilen negatif PU kalıp30'dansınırsız sayıda 96 kuyu kültür cihazı çıkarmak için tasarlanmıştır. Son kürlenmiş PDMS pozitif plaka esnektir ve tek kenarlı jilet yardımıyla daha küçük boyutlu fonksiyonel ünitelere kolayca kesilebilir (Şekil 1). Bu, kullanıcının deneysel tasarımına özgü hMMT çoğaltma gereksinimlerini karşılamak için cihazı ölçeklendirmesine olanak tanır. Bu daha küçük fonksiyonel üniteler, kullanıcının hücre tohumlama hızına uyacak kuyu sayısını kolayca ayarlayarak fibrin hidrojelleri gibi hızla polimerize olan bir ECM iskelesi ile çalışma sınırlamasının üstesinden gelmek için de faydalıdır. Ayrıca, PDMS kolayca otoklavlanabilir ve belirsiz bir süre saklanabilir. Son olarak, lojistik açısından bakıldığında, tam bir MyoTACTIC plaka herhangi bir standart 96 kuyu plakası kapağı ile kaplanabilir ve MyoTACTIC plaka bölümlerinin boyutu ve profili, hMMT kültür sterilitesini sağlamak için 10 cm'lik bir kültür plakası içinde inkübasyona uygundur. Hücre tohumlama öncesinde pluronik F-127 çözelti kaplama, ek bir kültür iyi sterilizasyon ölçüsü sağlama ve iyonik olmayan bir yüzey aktif madde olarak, tek tip hücre lehine hücre yapışmasını önlemede ikili bir rol oynar - ECM yeniden şekillendirme (Şekil 1).
Ölümsüzleştirilmiş miyojenik progenitör hücre popülasyonu deneye hazır olduğunda, hücreler daha sonra fibrinojen ve bodrum membran özünden oluşan bir hidrojel içinde kapsüllenir. Hücre-ECM karışımı daha sonra her MyoTACTIC kuyusunun altındaki oval havuza eşit olarak biriktirilir ve daha sonra 14 günlük bir kültür süresi boyunca, hücreler bu iki dikey gönderi boyunca mekansal olarak kendi kendine organize olur ve yerli doku organizasyonunun yönlerine benzeyen hizalanmış, çok yönlü, çizgili miyotütlerden oluşan bir yatakla doldurulmuş bir 3D mikrotissue oluşturur (Şekil 2a, g,h). Yeniden şekillendirme işlemi boyunca, iki ankraj noktası arasında tek eksenli gerginlik oluşur ve bu, doku kendi kendine organizasyon sürecini kompakt bir dokunun oluşumunu sağlamak için yönlendirir. Farklılaşma döneminde, sağlıklı hastalardan elde edilen miyoblastlardan oluşturulan hMMT'lerin genişliği oldukça tutarlı kalır. Bununla birlikte, hMMT yeniden şekillendirmeyi engelleyen hata olaylarında, bu homojenlik kaybolur (Şekil 2a-f), bu basit ölçümü hMMT kalite kontrol değerlendirmesinde kullanışlı hale getirir. Örneğin, hücrenin aşırı hevesli bir şekilde karıştırılması - ECM süspansiyonu kabarcıkların oluşumuna neden olabilir. MyoTACTIC kuyuya taşınan kabarcıklar hMMT yeniden şekillendirmeyi engeller. Bu gibi durumlarda, kabarcıklar miyeoblastların bir kısmını veya tamamını kabarcık tarafından işgal edilen alandan yerinden eder ve sonunda son hMMT'de bir çatlak oluşturur (Şekil 2b; bkz. kırmızı ok). Başka bir örnek, Pluronic F-127 kaplamasının kuyulardaki bütünlüğü ile ilgilidir. Pluronic F-127, hücrelerin MyoTACTIC kuyusuna yapışmasını önleyen iyonik olmayan bir yüzey aktif maddedir. Kaplama aspirasyon sırasında kazınırsa, myoblastlar MyoTACTIC kuyularının yüzeyine yapışacak, yeni ankraj noktaları oluşturacak ve iki direk boyunca hizalanmamış miyotütlerle sonuçlanacaktır (Şekil 2c). Ek hatalar, Şekil 2d-f'de görüldüğü gibi anormal hMMT yeniden şekillendirmeye de neden olabilir. Tohumlama sonrası hücre canlılığı da kalsein / propidium iyodür bazlı boyama tahlilleri kullanılarak değerlendirilebilir. Bu teknik hatalar önlendiğinde, hMMT'ler her hMMT'nin uzunluğu boyunca uzanan hizalanmış ve çok yönlü miyotütlerden oluşan bir yatakla doldurulur (Şekil 2g). Miyotütler, uzunlukları boyunca ve farklı hMMT'ler arasında oldukça düzgündür (Şekil 2h-i). Miyotubes sarkoler α için immünostaining ile görselleştirilen sarkom striasyonlarının varlığı ile karakterizedir - aktinin (SAA; Şekil 2h).
Fonksiyonel özellikler, yaklaşık 7 günlük farklılaşmadan başlayarak hMMT'lerde de incelenebilir. Bu fonksiyonel çalışmaları tamamlamak için kurulan deneysel şekil 3a'dagösterilmiştir. Mikroskopi kurulumu bir vibraplane tablosunun üstünde resmedilmiştir; ancak, işlevsel incelemeleri tamamlamak için bu gerekli değildir. Fonksiyonel çalışmalarda, protokolün elektriksel stimülasyon bölümünde açıklandığı gibi üretilen elektrotlar PDMS'ye yerleştirilir, böylece elektrotlar direklerin arkasında yer eder. Elektrotu takmadan önce post bölgesinin iyi görselleştirilmesi önemlidir, çünkü yeniden takma ihtiyacı, dokunun posttan yer değiştirmesine neden olabilir. Elektrotların düzgün yerleştirilmesi, gönderinin keskin bir odağını elde etmek için de önemlidir, böylece post saptırma daha sonra python komut dosyasıyla izlenebilir. Şekil 3b, düşük (seğirme, 0,5 Hz) ve yüksek (tetanoz, 20Hz) frekans hMMT elektriksel stimülasyonuna yanıt olarak MyoTACTIC kuyu plakası direğinin temsili bir yer değiştirmesini göstermektedir. Post yer değiştirmenin nicelemesi, hMMT'lerin indüklenen sözleşme kuvvetini hesaplamak için kullanılabilir (Şekil 3c). Bu bilgiler hMMT kesit alanı ile birleştirildiğinde, spesifik kuvvet belirlenebilir30. Ayrıca, kalsiyum geçicileri kas kasılmasında önemli bir rol oynar. GCaMP612,30 , 33,34gibi genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesine sahip iskelet kası mioblastlarının kararlı transdüksiyon,12,30,34kalsiyum geçicilerinin canlı izlenmesini sağlar. Kalsiyum geçicileri, MHCK7-GCAMP6 muhabirini ifade eden ölümsüzleştirilmiş mioblastlarla oluşturulan 12 hMMT'yi uyarmak için yukarıda açıklanan elektriksel stimülasyon kurulumu kullanılarak analiz edildi (Şekil 4a) ve düşük (seğirme, 0,5 Hz) ve yüksek (tetanoz, 20Hz) frekans elektriksel stimülasyon sırasında ortalama tepe floresan yoğunluğu olarak ölçüldü (Şekil 4b). Farklı deneylerde ölçülen hMMT kalsiyum elleçleme özelliklerinin nispeten tutarlı olduğu gözlenmektedir (Şekil 4b). Post deflection ve kalsiyum kullanımı için nicelleştirme yöntemleri Ek Video 1 ve Tamamlayıcı Video 2'deözetlenmiştir.
Şekil 1: hMMT tohumlamadan önce MyoTACTIC PDMS plakasının hazırlanması. MyoTACTIC olarak adlandırılan 96 kuyulu platform, negatif poliüretan (PU) kalıp içinde ilk olarak polidimetilsiloksan (PDMS) kürlenerek üretilir. PDMS tabanlı kültür platformu daha sonra negatif PU kalıbından dikkatlice soyulur. Akademik bir ortamda, PDMS cihazı daha sonra 6 ± 2 fonksiyonel kuyu içeren daha küçük birimlere kesilir. Bu kuyular daha sonra sterilizasyon torbasına yerleştirilir, otoklavlanır ve kullanıma kadar saklanır. Kullanımdan bir gün öncesine kadar, istenen sayıda cihaz kısmı 10 cm'lik bir kültür plakasına yerleştirilir ve her kuyuya Pluronic F-127 eklenir. 10 cm'lik çanak kapak eklenir, plakayı 2-24 saat boyunca 4° inkübe etmeden önce kenar parafilm ile kapatılır.
Şekil 2: MyoTACTIC, hMMT öz organizasyonunu ve hizalanmış miyotüplerin oluşumunu destekler. (a) (üstte) hMMT öz organizasyonunun şematik zaman çizelgesi ve sonraki miyotube olgunlaşması 14 günlük bir kültür süresi boyunca. (altta) 3D hMMT oluşumuyla sonuçlanan iki dikey gönderide ölümsüzleştirilmiş myoblasts öz organizasyonunun kinetiğini göstermek için temsili 4x faz kontrastlı görüntüler. Ölçek çubuğu, 500 μm. (b-f) Hücre içindeki bir baloncuğun neden olduğu hMMT sonuçlarını gösterenfarklılaşmanın 12. gününde hMMT'lerin temsili 4x faz kontrast görüntüleri - tohumlama sırasında ECM (kırmızı ok hMMT hasarına neden olur), (c) Pluronic F-127 çözelti kaplamasının yanlış aspirasyonu ve (d-f ) yanlış ECM jelasyonu, kültür medyasında ACA aktivitesi eksikliği, miyeoblast ebeveyn hattının yanlış bakımı vb. Ölçek çubuğu, 500 μm. (g) 10x büyütmede çekilen 12 hMMT Gününün temsili karolu ve düzleştirilmiş konfokal görüntüsü. hMMT'ler doğrudan PDMS kalıbına sabitlenir, daha sonra dikkatlice çıkarılır ve boyama için 96 kuyu kültür plakasına yerleştirilir. Sarkolerik α-actinin (SAA) macenta ve Hoechst 33342 nükleer kontrastain siyangösterilmiştir. Ölçek çubuğu, 500 μm. (h) 40x büyütmede 12 hMMT Gününün temsili konfokal görüntüsü. hMMT miyotütleri ve çekirdekleri, SAA (macenta) için immünostaining ve Hoechst 33342 (siyan) ile karşı çekim ile görselleştirilir. Ölçek çubuğu, 50 μm. (i) Farklılaşmanın 12. Değerler ortalama olarak raporlanır ± SEM. n = sembol şekilleriyle ayırt edilen 3 biyolojik kopyadan 8 hMMT, böylece hMMT başına en az 30 miyotüt analiz edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: MyoTACTIC platformu içindeki aktil kuvvetin yerinde ölçümü. (a) Elektrik stimülasyon düzenlemesinin temsili (solda). Bu kurulumda resmedilmiş olsa da, bir vibraplane tablosu gerekli değildir. Bir akıllı telefon kamerası ve montaj, hMMTs elektrik stimülasyon sonrası yer değiştirmelerinin video kayıtları için floresan lamba ile donatılmış ters bir mikroskobun göz merceğine giydirildi (solda). 25 G iğneler kalay kaplı bakır tellerle (sağ altta) sarıldı, timsah klipsi konektör kablosuna (sağ üst) BNC'ye bağlandı ve rastgele bir dalga biçimi jeneratörüne yapıştırıldı. Elektriksel stimülasyon sırasında elektrotların yerleştirilmesi sağ altta gösterilir. (b) Farklılaşmanın 12. Videolar 10 kat büyütmede çekildi. Düz beyaz dikey çizgiler, hMMT'ler gevşediğinde post yerleşimi gösterirken, noktalı beyaz dikey çizgiler yüksek (tetanos 20 Hz) veya düşük (0,5 Hz) frekans stimülasyonunu takiben yer değiştirme sonrası gösterir. Ölçek çubuğu, 100 μm. (c) Ortalama hMMT seğirmesinin nokta çizim grafiği (0,5 Hz)- ve tetanoz (20 Hz) uyarılmış kontrtil kuvvet 12. Değerler ortalama ± SEM olarak raporlanır. n = sembol şekilleriyle ayırt edilen 3 biyolojik yinelemeden 9 hMMT. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: MyoTACTIC platformu içinde kalsiyum elleçlemenin yerinde ölçümü. (a) Düşük (seğirme kasılması, 0,5 Hz) ve yüksek (tetanoz kasılması, 20 Hz) frekanslı elektriksel uyarıma yanıt olarak spontan GCaMP6+ kalsiyum geçicileri ve kalsiyum geçicilerinin 4x büyütme video kaydından temsili görüntüler. hMMT'ler noktalı sarı bir çizgi ile özetlenir. Ölçek çubuğu, 200 μm. (b) Düşük (seğirme kasılması, 0,5 Hz) ve yüksek (tetanoz kasılma, 20 Hz) frekanslı elektriksel uyarımı takiben hMMT başına ortalama tepe floresan yoğunluğunun niceliğini gösteren nokta grafiği grafiği. Değerler ortalama ± SEM olarak raporlanır. n = sembol şekilleriyle ayırt edilen 3 biyolojik yinelemeden 9 hMMT. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video 1: Sapma sonrası verileri analiz etmek için yöntemlerin gösterimi. Tetanoz stimülasyonu sırasında özel komut dosyası tarafından izlenen farklılaşmanın 12. İlk olarak yatırım getirisi boyutu doğrudan post izleme komut dosyasında seçilir. Daha sonra video, komut dosyasını çalıştırmak için oynat düğmesi seçilerek açılır. Postanın keskin odaklı bir bölgesi yatırım getirisi olarak seçilir ve mavi posta izleme kutusu yerleştirilir. Enter, yatırım getirisini kilitlemek için basılır ve komut dosyasını çalıştırmak için yeniden basılır. "y" istemine yanıt olarak girilir "Çoklu daralma videosu? [Y/N]", ardından 'n' istemine yanıt olarak girilir "Gönderi konumları .csv dosyası olarak dışa aktar? [Y/N]". Piksel cinsinden göreli yer değiştirme olarak sapma sonrası son çıktıdır. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Video 2: GCaMP6 kalsiyum geçici verilerini analiz etmek için yöntemlerin gösterimi. Tetanoz stimülasyonu sırasında farklılaşmanın 12. İlk olarak, ImageJ'de kalsiyum geçicilerinin bir videosu (bir dizi tiff görüntüsü olarak kaydedilmiştir) açıldı ve kullanıcı hMMT görünene kadar çerçeveler arasında gezindi. Daha sonra, gerekli analiz ölçümü "ortalama gri değer" onaylanır ve hMMT çokgen çizim aracı kullanılarak özetlenmiştir. Bu anahat ilgi alanı olarak kaydedilir ve her video diliminin floresan yoğunluğu çok ölçülü kullanılarak analiz edilir. Bu ölçümler, çerçeve verileri ve kalsiyum geçici tepe değerleri doldurularak ve doğrulanarak "Kalsiyum İşleme Şablonu" elektronik tablosuna kopyalanır. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, temel kas biyolojisi, hastalık modellemesi veya aday molekül testi çalışmalarına uygulanabilecek bir 3D hMMT kültür modeli oluşturma ve analiz etme yöntemleri açıklanmaktadır. MyoTACTIC platformu maliyet dostudur, üretimi kolaydır ve iskelet kas mikrotizeleri üretmek için nispeten az sayıda hücre gerektirir. MyoTACTIC kültür platformunda oluşturulan hMMT'ler hizalanmış, çok noktalatılmış ve çizgili miyotüplerden oluşur ve kasılmayı tetikleyen kalsiyum geçicilerini başlatarak elektrik uyaranlarına yanıt verir (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4). Önceki çalışmalar, hMMT'lerin biyokimyasal uyaranlara benzer bir yanıt sunduğunu ve daha büyük formatta bildirilenlerle eşleşen olgunlaşma seviyelerine ulaşabileceğini göstermiştir 3D iskelet kas modelleri12,30.
MyoTACTIC plaka imalatı ve hMMT üretimi boyunca kritik bir tema, kabarcıkların önlenmesini ve oluşturulmuşsa kaldırılmasını sağlamaktır. Çalıştırılabilir bir PDMS kalıbının tek adımlı dökümlerini kolaylaştırmak için, daha önce Afshar ve ark.30tarafından tanımlanan ilk 3D baskılı plastik kalıbın aşağı akışında bir PU kalıbı oluşturulmuştu. Oluşturulan PU kalıbı, kullanıcıların PU kalıp imalat adımı tarafından dikte edildiği gibi maksimum 96 kuyunun işlevsel olduğu (iki direk içeren) PDMS kalıbının 96 kuyu ayak izini üretmelerini sağlar. PDMS MyoTACTIC plakasının imalatı sırasında, yeni kullanıcılar genellikle gazdan arındırıldıktan sonra bile sıvı PDMS'de geride kalan daha küçük kabarcıkları kaçırırlar. Penye esnek posta yapılarına karşılık gelen PU kalıbının bölgelerine lokalize olan kabarcıklar, PU kalıbının PDMS kültür plakasından ayrılması üzerine post kırılmasına neden olur ve bu süreçte PU kalıbında küçük bir kürlenmiş PDMS parçası bırakır. Basınçlı hava, bu iyileşmiş PDMS kalıntılarını çıkarmak için kullanılabilir ve bunun yapılmaması gelecekteki plaka dökümleri için mevcut fonksiyonel kuyuların sayısını etkili bir şekilde azaltacaktır. Bu nedenle, PDMS plakası bu platformun bir avantajı olarak tedavi edildikten önce tüm kabarcıkların çıkarıldığından emin olmak önemlidir, bu da tek başına bir cihazdır, böylece plakanın tüm özellikleri, her bir mikrotissue bağlantı noktasının kültür kuyularına manuel olarak tanıtılmasını gerektirmek yerine tek bir adımda döküldüğü35, 36,37. Çoğu akademik laboratuvar çalışması myoTACTIC kültür plakasının tamamını gerektirmez. Her PMDS plakasının kullanımını en üst düzeye çıkarmak için, manuel olarak 6 ± 2 MyoTACTIC kuyusu gruplarına kesilir. Bu işlemi iyileştirmek için kullanıcıların 6 ± 2 MyoTACTIC kuyularının fonksiyonel ünitelerini soymalarını sağlayan bir PU kalıbı bu plaka kesme adımını tamamen ortadan kaldırabilir. Ayrıca, karıştırma sırasında veya doku tohumlama işlemi sırasında hücre-ECM çözeltisine sokulan büyük kabarcıklar uygun doku oluşumunu bozacaktır. Bu büyük kabarcıklar, kabarcık kapladığı bölgeden hücreleri yerinden eder, genellikle elektriksel uyarım sırasında kasılma stresine ve kırılmaya yenik düşecek az sayıda miyotüs içeren bölgelere sahip hMMT'lerle sonuçlanır.
MyoTACTIC'in önemli bir avantajı, aktif kuvvet üretimi ve kalsiyum işleme özelliklerini yerinde ölçme yeteneğidir. Bu, 3D doku kontrtilasyon kuvvetinin araştırılmasının, dokunun kültür cihazından çıkarılmasını takiben bir uç nokta tahlil olarak uygulandığı diğer birçok 3D kültür sisteminin karşılaştığı bir zorluktur12,37. Bu nedenle, MyoTACTIC, örneğin ilaç tedavisinin iskelet kası üzerindeki zamansal etkilerini anlamak gibi uzunlamasına çalışmaları desteklemek için çok uygundur. Burada aktif kuvvet üretimi ve kalsiyum işleme özelliklerini yerinde ölçmek için açıklanan yöntemin bir sınırlaması, bu sistemin yüksek içerikli molekül test uygulamaları için kullanımını sınırlayan elektrotların manuel olarak yerleştirilmesidir. Olası bir çözüm, aynı anda birden fazla dokunun elektriksel uyarılmasını sağlayan standartlaştırılmış bir fonksiyonel kuyu setine doğrudan yerleştirilebilen paralel bir devre olarak kurulmuş net bir elektrot kapağı tasarlamak olacaktır. Alternatif olarak, bir kanalrhodopsin yapısını saptanarak ifade eden bir miyojenik progenitör hücre hattının kullanılması, kas hücresi zarı depolarizasyonuna ve dolayısıyla mavi ışığa maruz kalmanın neden olduğu doku kasılmasına izin verecektir. Ayrıca, aktif kuvvet videolarda yakalanır, çünkü kısa videolarda post saptırma ve aktif sözleşme kuvvetinin nicelemesi, özel bir yarı otomatik python komut dosyası kullanılarak tarafsız bir şekilde gerçekleştirilebilir. Bu nedenle, uyarılmış kontraktil kuvvetin tarafsız boyuna değerlendirmesi MyoTACTIC30tarafından etkinleştirilir. Veri analizinin verimliliğini artırmak için, aynı anda post saptırma videoları yakalarken kuvveti ölçmek için tasarlanmış akıllı telefon uygulamaları, verimi artırmak için idealdir.
Son olarak, bu platformun değeri daha önce ilaç yanıtını doğru bir şekilde tahmin etme yeteneğinde de tanımlanmıştır. Klinik sonuçlara benzer şekilde, daha önce hMMT'lerin (primer mioblastlarla yapılan) miyotoksik bileşiklerle (deksametazon, cerivastatin) miyotüp atrofisine neden olduğunu ve aktif kontrenktil kuvvet30'uazalttığını bildirmiştik. Ayrıca, MyoTACTIC tarafından oluşturulan hMMT'lerin tahmin değeri, genellikle cachexia2ile ilişkili bir hastalık olan pankreas kanserini tedavi etmek için kullanılan bir kemoterapötik dozajının klinik olarak ilgili bir dozajının , önemli ölçüde azaltılmış hMMT kalitesi ve kontraktil kuvvet30. Bu nedenle, MyoTACTIC'in basit imalatı ve 3D hMMT'lerin üretilmesindeki kullanım kolaylığı, yapısal ve işlevsel çıktılarla ilgili güvenilirliğinin gösterdiği gibi yüksek içerikli veri yakalama için birçok avantaj göstermektedir. PDMS tabanlı hücre kültürü cihazlarının genel bir sınırlaması, PDMS'nin proteinleri adsorbe ettiğidir. Burada açıklanan yöntem, cihazı 'bloke etmek' ve molekül ve ilaç tedavilerinin etkilerinin gözlenmesine izin vermek için hizmet ederek bu sınırlamayı aşıyor serum içeren kültür medyasından yararlanır. Bununla birlikte, bu sınırlama nedeniyle molekül dozları hakkında kesin sonuçlardan kaçınılmalıdır ve doz yanıt eğrileri teşvik edilir. Tersine, katkı maddeleri PDMS'ye adsorbe edeceği ve böylece doku sağlığını ve gelişimini engelleyeceği için bu platform serumsuz mikrotissue kültürü için uygun değildir. Gelecekte, 3D biyobaskı ve/veya otomatik sıvı işleme gibi tekniklerin entegre edilmesi, hMMT kültürlerinin üretiminde verimi artıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli ve Sadegh Davoudi'ye MyoTACTIC kültür platformunun icadına katkıda bulunduklarından ve burada açıklanan imalat ve analiz yöntemlerini kurdukları için teşekkür ederiz. HL, Organ-on-a-Chip Mühendislik ve Girişimcilik Bursu'nda Bir Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Eğitim Programı ve Toronto Wildcat Üniversitesi lisansüstü burslarından fon aldı. PMG, Endojen Onarımda Kanada Araştırma Başkanıdır ve bu çalışma için Ontario Rejeneratif Tıp Enstitüsü, Kök Hücre Ağı ve Kanada'nın İlk Araştırma Mükemmellik Programı olan Medicine by Design'dan destek almıştır. Şematik diyagramlar BioRender.com ile oluşturuldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma - Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma - Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma - Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma - Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma - Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope - Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma - Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma - Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
- Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
- DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
- Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
- Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
- Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
- Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
- Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
- Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
- Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
- Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
