Summary
Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för att producera matriser av 3D mänskliga skelettmuskelmikrotissuer och minimalt invasiv nedströms in situ-analyser av funktion, inklusive kontraktil kraft och kalciumhanteringsanalyser.
Abstract
Tredimensionella (3D) in vitro-modeller av skelettmuskulatur är ett värdefullt framsteg inom biomedicinsk forskning eftersom de ger möjlighet att studera skelettmuskelreformation och fungera i ett skalbart format som är mottagligt för experimentella manipuleringar. 3D muskelkultursystem är önskvärda eftersom de gör det möjligt för forskare att studera skelettmuskulatur ex vivo i samband med mänskliga celler. 3D in vitro modeller nära efterlikna aspekter av den inhemska vävnad struktur av vuxna skelettmuskulatur. Deras universella tillämpning begränsas dock av tillgången på plattformar som är enkla att tillverka, kostnads- och användarvänliga och ger relativt stora mängder mänskliga skelettmuskelvävnader. Dessutom, eftersom skelettmuskulaturen spelar en viktig funktionell roll som är nedsatt över tid i många sjukdomstillstånd, är en experimentell plattform för mikrotissuestudier mest praktisk när minimalt invasiva kalciumövergående och kontraktila kraftmätningar kan utföras direkt inom själva plattformen. I detta protokoll beskrivs tillverkning av en 96-väl plattform som kallas "MyoTACTIC", och en massproduktion av 3D mänskliga skelettmuskulaturmikrotissuer (hMMTs). Dessutom rapporteras metoderna för en minimalt invasiv tillämpning av elektrisk stimulering som möjliggör upprepade mätningar av skelettmuskelkraft och kalciumhantering av varje mikrotissue över tid.
Introduction
Skelettmuskulaturen är en av de mest rikliga vävnaderna i människokroppen och stöder viktiga kroppsfunktioner som rörelse, värmehomeostas och metabolism1. Historiskt har djurmodeller och tvådimensionella (2D) cellodlingssystem använts för att studera biologiska processer och sjukdomspatogenes, liksom för att testa farmakologiska föreningar vid behandling av skelettmuskelsjukdomar2,3. Medan djurmodeller har avsevärt förbättrat vår kunskap om skelettmuskulatur i hälsa och vid sjukdom, har deras translationella inverkan hämmats av höga kostnader, etiska överväganden och interspecies skillnader2,4. När det gäller mänskliga cellbaserade system för att studera skelettmuskulatur är 2D-cellkultursystem gynnsamma på grund av deras enkelhet. Det finns dock en begränsning. Detta format misslyckas ofta med att rekapitulera cell-cell- och cell-extracellulära matrisinteraktioner som förekommer naturligt i kroppen5,6. Under de senaste åren har tredimensionella (3D) skelettmuskulaturmodeller dykt upp som ett kraftfullt alternativ till hela djurmodeller och konventionella 2D-odlingssystem genom att tillåta modellering av fysiologiskt och patologiskt relevanta processer ex vivo7,8. Faktum är att en mängd studier har rapporterat strategier för att modellera mänskliga skelettmuskler i ett bioartificialt 3D-kulturformat1. En begränsning för många av dessa studier är att aktiv kraft kvantifieras efter avlägsnandet av muskelvävnaderna från odlingsplattformarna och fastsättning vid en kraftgivare, som är destruktiv och därmed begränsad till att fungera som slutpunktsanalys9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Andra har utformat odlingssystem som möjliggör icke-invasiva metoder för att mäta aktiv kraft, men inte alla är mottagliga för molekyltestapplikationer med högt innehåll7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Detta protokoll beskriver en detaljerad metod för att tillverka mänskliga muskelmikrotissuer (hMMT) i skelettmuskeln (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) plattform; en 96 brunnsplatta enhet som stöder bulkproduktionen av 3D skelettmuskelmikrotissues30. MyoTACTIC platttillverkningsmetod möjliggör generering av en 96 väl polydimethylsiloxan (PDMS) odlingsplatta och alla motsvarande brunnsfunktioner i ett enda gjutsteg, varigenom varje brunn kräver ett relativt litet antal celler för microtissue-bildning. Mikrotissues som bildas inom MyoTACTIC innehåller justerade, strimmiga och multinukleära myotuber som är reproducerbara från brunn till brunn av enheten, och vid mognad, kan svara på kemiska och elektriska stimuli in situ30. Häri tekniken för att tillverka en PDMS MyoTACTIC kulturplatta enhet från en polyuretan (PU) replika, en optimerad metod för att genomföra odödliga mänskliga myogena stamceller för att tillverka hMMTs, och den funktionella bedömningen av konstruerade hMMT kraftgenerering och kalcium hantering egenskaper beskrivs och diskuteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PDMS MyoTACTIC platttillverkning
OBS: PDMS MyoTACTIC platttillverkning kräver en PU negativ mögel, som kan tillverkas som tidigarebeskrivits 30. Den datorstödda designen (CAD) SolidWorks-filen för MyoTACTIC-plåtdesignen har gjorts tillgänglig på GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
- Förbered ~ 110 g PDMS polymerlösning i en engångsplastkopp med förhållandet 1:15 mellan monomer och härdningsmedel med hjälp av komponenterna i silikonelastomersatsen. Rör om polymerlösningen i 2-3 minuter med en 5 ml engångs serologisk pipett tills den är helt blandad och homogen.
VARNING: Undvik kontakt med PDMS polymerlösning med hud och ögon; och undvika inandning. Använd alltid en labbrock och engångshandskar vid hantering av den flytande PDMS-blandningen och se Safety Data Sheet (SDS) för specifika säkerhetsprotokoll.
OBS: Skydda utrustningens ytor (t.ex. skala, bänkskiva etc.) med engångsskydd vid PDMS polymerlösningsspill. - Avgasa blandningen i rumstemperatur genom att placera koppen i en bänklucka vakuumkammare ansluten till en standard tull torr vakuumpump i ~ 30 min, eller tills alla bubblor tas bort. Bryt vakuumet var 5-10 min för att underlätta avgasning. Använd en tom 50 ml spruta för att kasta luft och blåsa ut eventuella återstående bubblor på polymerblandningens yta efter behov.
OBS: En bit av 6,35 mm ID-slangar kan användas för att ansluta en P1250 pipetterspets till pipan för att förbättra luftströmmens hastighet och noggrannhet. - Medan PDMS polymerlösning avgasas, ta bort eventuella överblivna bitar av PDMS som fästs vid PU-negativ mögel genom att försiktigt torka ner kanterna och ytan med en torr pappershandduk. Använd anläggningskompressad luft, inställd på 70-100 kPag för att avlägsna återstående fina partiklar.
OBS: Skydda PU-negativ mögel från skador och från partikelansamling genom att placera den i en förseglingsbar plastpåse och förvara den i en låda som är skyddad från laboratorietrafik. - Placera PU-formen i en kemisk huva som har skyddats med engångsskydd. Ställ formen horisontellt vid ~75° och spraya den aktiva ytan med ett jämnt lager av frigöringsmedel. Spraya formen från topp till botten, sedan från vänster till höger, samtidigt som du håller burken 15-20 cm från formen och använder en vätska fram och tillbaka svepande rörelse. Rotera formen 180° och upprepa sprayer, låt pu-formen sitta i den kemiska huven i 10-15 min för att torka.
VARNING: Se till att frigöringsmedlet används i en kemisk rökhuv, undvik kontakt med hud och ögon och se Säkerhetsdatablad (SDS) för specifika säkerhetsprotokoll
OBS: En tunn film måste helt täcka den aktiva ytan, men överdriven beläggning kan överföras till PDMS i nästa steg, vilket i sin tur kan påverka hMMT-sådd negativt. Ytan ska kännas slank vid beröring men inte våt. - Häll 100 g PDMS jämnt i PU-formen och placera i en vakuumkammare ansluten till en roterande lamellvakuumpump. Avgas den PDMS-fyllda formen i ~ 45 min, bryta vakuumtätningen var 5-10 min under de första 20 minuterna för att påskynda processen. Lämna i vakuumkammaren tills PDMS-blandningen är helt tom på alla bubblor.
OBS: En roterande lamellvakuumpump används för att uppnå ett lägre vakuum och minska den tid som krävs för detta steg. Avgasning av den PDMS-fyllda formen kan utföras med hjälp av bänkskivans vakuumkammare och den vanliga torrdammsugaren, men tiden att ogiltigförklara blandningen av alla bubblor blir längre. Det som är viktigt är att ta bort alla bubblor från PDMS polymerlösning, särskilt i de regioner som är avsedda att bli hMMT-förankringsstolpar. Bubblor i denna region kommer att resultera i ankarpostbrott, förlust av kulturbrunnar och i sin tur resultera i en liten bit PDMS som förblir kilad i formen. - Överför den avgasade PDMS-fyllda PU-formen till en 65 °C ugn, inkubation över natten för att bota det flytande gummit.
- Ta ut den härdade PDMS-positiva plattan från ugnen och kyl plattan i rumstemperatur i minst 30 minuter.
- Med en bladlös skalpell, lossa försiktigt härdat PDMS från PU-formen genom att köra baksidan av handtaget mellan PDMS och formens väggar. Börja längs den övre kanten och separera alla 4 sidor innan du trycker ner till formens botten och lossnar denna del. Det här steget är klart när handtagets baksida löper smidigt mellan PDMS och alla 4 väggarna i PU-formen.
OBS: Arbeta långsamt och försiktigt med den bladlösa skalpellen för att förhindra att PU-formen spricker eller slits sönder PDMS. Detta steg bör ta 15-20 min. - Från ena änden, använd den bladlösa skalpellen för att lyfta upp kanten på PDMS och arbeta fingrar mellan den härdade PDMS-odlingsplattan och PU-mögel. Tryck sedan fingrarna längre under plattan med båda händerna och skala långsamt upp och ut ur PU-formen.
OBS: Arbeta långsamt och använd båda händerna för att jämnt skala plattan. Minimera böjning för att minska sannolikheten för ankarpostbrott. Detta steg bör ta 5-10 min. - Använd ett rakblad med en kant för att skära plattan i grupper om 6 ± 2 MyoTACTIC-brunnar(figur 1) för vävnadssådd. Placera hela MyoTACTIC-plattor, eller tallriksdelar, i en instrumentsteriliseringspåse och autoklav under en 25 minuters torrcykel (20 min steriliseringstid och 5 min torrtid) vid 120 °C och 100-140 kPag.
2. Kultur av odödliga mänskliga myoblast stamceller
OBS: De odödliga myoblasterna som används i detta protokoll erhölls från Institut de Myologie (Paris, Frankrike)31.
- Få en flaska frysta celler från den flytande kvävedewaren och tina snabbt injektionsflaskan i ett 37 °C vattenbad (på mindre än 1 min). Cellerna fryses med en densitet av 7,5 x 105 celler per 1 ml frysmedium bestående av 90% fetalt bovinserum (FBS) och 10% dimetylsulfoxid (DMSO).
- Överför försiktigt innehållet i injektionsflaskan till ett koniskt rör på 15 ml som innehåller 9 ml förvärmt tvättmedium bestående av 89% DMEM 1x, 10% FBS och 1% Pen/Strep för att späda ut DMSO. Snurra det koniska röret på 15 ml vid 400 x g i 10 minuter och aspirera sedan bort mediet och var noga med att undvika cellpelleten.
- Resuspend pelleten i 1 mL tillväxtmedia bestående av 84% Skelettmuskulatur cell basal medium med skelettmuskulatur cell tillväxt medium tillägg mix, 15% FBS och 1% Pen / Strep och sedan överföra till en 50 mL koniskt rör med 29 ml tillväxtmedia.
- Överför 10 ml media som innehåller cirka 2,5 x 105 celler till en 100 mm x 20 mm cellodlingsskål. Upprepa detta steg med de återstående 20 ml av celllösningen. Överför sedan cellodlingsrätter till en fuktad cellodlingsinkubator inställd på 37 °C och 5% CO2.
- Uppdatera kulturmedierna varannan dag. Odla cellerna tills de uppnår ~ 70%-80% sammanflöde (vanligtvis 4-5 dagar), då cellerna är beredda för sådd. 1,5 x 105 celler krävs för att generera varje hMMT. Passera därför cellerna efter behov för att uppnå det erforderliga antalet celler.
OBS: De odödliga myoblast stamcelllinjerna bör aldrig överstiga 80% sammanflöde innan de sås celler i MyoTACTIC-brunnar, passaging cellerna eller förbereder fryslager. hMMTs tillverkade av celler som har överskridit 80% sammanflöde misslyckas ofta med att nå kontraktil mognad. Passaging-procedurer är identiska med de metoder som beskrivs nedan i steg 3.
3. Sådd konstruerad hMMTs med MyoTACTIC
- Förberedelse av MyoTACTIC kulturbrunnar och reagenser för hMMT-sådd.
OBS: Det här protokollet innehåller specifika detaljer för att producera 6 hMMTs.- 2-3 h före cellsådd, placera en 6 väl MyoTACTIC tallriksdel i en 10 cm cellodlingsfat. Förbered varje enskild MyoTACTIC-kultur väl genom att tillsätta 100 μL av en 5% Pluronic F-127-lösning i varje brunn. Sätt locket på 10 cm odlingsfat, applicera paraffin för att försegla utrymmet mellan 10 cm skålen och locket och placera sedan 10 cm-plattan som innehåller MyoTACTIC-delen i en centrifug utrustad med en plattsnurradapter.
OBS: Om en centrifugplatta spinneradapter inte finns tillgänglig kan en p20 pipetterspets användas för att försiktigt avlägsna bubblor bakom stolparna och därigenom se till att hela odlingsytan är jämnt belagd. - Centrifugera vid 1 550 x g i 1 min för att ta bort alla bubblor i kulturbrunnarna, särskilt bakom stolparna. Förvara den 10 cm långa cellodlingsformen som innehåller MyoTACTIC-plåtdelen som innehåller Pluronic F-127-lösningen vid 4 °C tills cellerna är förberedda för sådd.
OBS: Pluronic F-127 beläggning kan appliceras för så lite som 2 h till så länge som 24 timmar. Till exempel kan brunnar fyllas med Pluronic F-127-lösning i slutet av dagen för användning nästa dag. Överskrid inte 24 timmar eftersom detta kommer att påverka hMMT-ombyggnad negativt och misslyckas med att bilda friska vävnader som når kontraktil mognad. - Tina långsamt upp en 50 μL källarmembranextrakt alikvot och en 10 μL trombin alikvot (100 U/ml lagerlösning) på is i kulturhuven.
OBS: Frys inte upp källarmembranextraktet. De är engångsbruk. Thrombin alikvoter kan återanvändas, därför fryser de igen upp till 5 gånger efter användning. - Väg ~ 7 mg pulveriserad fibrinogen i ett 1,5 ml mikrocentrifugerör och överför sedan till cellodlingshuven. Tillsätt 700 μL 0,9% (wt/vol) NaCl-lösning i vatten (eller saltlösning) för att komma fram till en slutlig koncentrationslösning på 10 mg/ml. Virvelfibrinogen för att lösa inte upp, placera istället röret i en 37 °C cellodlingsinkubator i 3-5 min.
- Ta bort och snärta röret försiktigt, pulsera sedan den upplösta lösningen i en bänkskiva minicentrifu (microfuge) och återgå till kulturhuven. Filtrera fibrinogenlösningen med en 1 ml spruta utrustad med ett 0,22 μm sprutafilter. Överför den upplösta fibrinogenlösningen till is tillsammans med källarmembranextraktet och trombin alikvoterna.
- Slutligen förbereda hMMT-såddmediet som kommer att introduceras till odlingsbrunnarna efter sådd av vävnaderna. Detta medium innehåller skelettmuskulaturcell basal medium kompletterat med 20% FBS, 1% P/S och 3% 6-aminocaproic syra (ACA; 1,5 mg/ml slutlig koncentration uppnås genom utspädning från en 50 mg/mL stamlösning; % uttrycks som v/v). Förvärm mediet vid 37 °C före användning.
- 2-3 h före cellsådd, placera en 6 väl MyoTACTIC tallriksdel i en 10 cm cellodlingsfat. Förbered varje enskild MyoTACTIC-kultur väl genom att tillsätta 100 μL av en 5% Pluronic F-127-lösning i varje brunn. Sätt locket på 10 cm odlingsfat, applicera paraffin för att försegla utrymmet mellan 10 cm skålen och locket och placera sedan 10 cm-plattan som innehåller MyoTACTIC-delen i en centrifug utrustad med en plattsnurradapter.
- Beredning av celler för hMMT-sådd.
- Samla cellodlingsplattorna från kulturinkubatorn. Aspirera media från varje platta och tvätta sedan cellerna en gång med D-PBS genom att tillsätta 5 ml D-PBS i varje odlingsplatta. Därefter aspirera D-PBS och lossa cellerna genom att lägga till 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA i varje odlingsfat. Placera i cellodlingsinkubatorn i 3 min.
- Stoppa trypsin genom att tillsätta 3 ml tvättmedel (89% av 1x DMEM + 10% FBS + 1% Pen/ Strep) till odlingsrätten. Överför celllösningen till ett koniskt rör av lämplig storlek och pelletera sedan cellerna genom centrifugering vid 400 x g i 10 minuter. Aspirera media med försiktighet för att undvika cellpelleten. Återanvänd sedan cellpelleten i 1 ml av tvättmediet.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och trypan blå färgämne under brightfield mikroskopi.
Om du använder flera plattor av celler kommer denna cell suspension att vara mycket koncentrerad. Späd cellupphängningar innan du räknar efter behov. - Eftersom varje vävnad kräver 150 000 celler som återanvisats i 15 μL av den extracellulära matrisblandningen (ECM), krävs 900 000 celler i 90 μL ECM-blandning för 6 vävnader. För att ta hänsyn till cell-ECM-lösningsförlust som uppstår under beredningsprocessen på grund av bubbelbildning eller pipettförlust, förbered extra cell-ECM-blandning (dvs. 8 vävnader eller 1 200 000 celler i 120 μL ECM). Överför volymen cellfjädring som innehåller 1 200 000 celler till ett nytt koniskt rör. Öka volymen till 10 ml med tvättmedel och snurra vid 400 x g i 10 min.
- Medan cellerna snurrar ner, förbered 150 μL ECM-blandning i ett 1,5 mL mikrocentrifugerör med följande recept. Tillsätt först 60 μL DMEM (40% volym), tillsätt sedan 60 μL Fibrinogen 10 mg/ml-lösning (40% volym) och tillsätt slutligen 30 μL källarmembranextrakt (20% volym). Förvara ECM-blandningen på is tills den används.
OBS: Använd alltid spetsar förkylda vid -20 °C när du arbetar med lösningar som innehåller källarmembranextrakt. ECM-blandningen innehåller 4 mg/ml fibrinogen.
- Sådd hMMT
- Samla in det koniska röret som innehåller de spunna cellerna och aspirera på mediet och var noga med att undvika cellpelleten. Snärta kraftigt rörets ände med ett handskfinger för att lossa pelleten och fortsätt att snärta tills pelleten visas som en cellslam.
OBS: Det är viktigt att aspirera så mycket tvättmedium som möjligt för att säkerställa att cell-ECM-suspensionen är vid önskad utspädning. Använd en pipett för att ta bort återstående tvättmedel om det behövs. - Överför 120 μL ecm-lösningen till röret som innehåller cellpelleten. Pipettera upp och ner för att noggrant återanvända cellerna inom ECM för att generera en enda cellfjädring. Pipetten långsamt och försiktigt för att undvika att införa bubblor, vilket skulle minska arbetsvolymen. Placera sedan cell-ECM-lösningen på is tills den används.
- Hämta MyoTACTIC-plåtportioner som innehåller Pluronic F-127-belagda MyoTACTIC-brunnar från 4 °C kylskåp och placera 10 cm skålen som innehåller MyoTACTIC-brunnarna ovanpå en ispåse inuti cellodlingshuven.
- Aspirera pluronic F-127-lösningen från varje brunn. PDMS är poröst och kommer att suga upp Pluronic F-127-lösningen, särskilt om plattorna snurrades ner med en centrifug. Låt den kvarvarande Pluronic F-127-lösningen lossna och sätta dig i botten av brunnen genom att låta brunnarna sitta i 5 min och aspirera sedan igen.
OBS: Använd en Pasteur pipett med en p1250 spets fäst i slutet och en p200-spets över p1250-spetsen när du aspirer pluronic F-127-lösningen. Detta kommer att förbättra precisionen för att förhindra oavsiktlig aspiration av stolpstrukturerna. Undvik att skrapa det ovala poolformade cellsåddsområdet längst ner i brunnen med pipetten eftersom detta stör Pluronic F-127-beläggningen och stör hMMT-självorganiseringsprocessen. Den rätta tekniken är att sväva pipettens spets precis över den ovala poolen medan man aspirerar Pluronic F-127-lösningen. - Pipettera cell-ECM-suspensionen noggrant för att återanvända alla celler som kan ha sjunkit till botten av röret. Överför sedan 105 μL cell-ECM-suspension till ett färskt, förkylt 1,5 ml rör. Var noga med att ta tag i röret nära toppen för att förhindra att lösningen värms upp.
- Tillsätt 0,84 μL av 100 U/ml trombinbuljonglösning till 105 μL cell-ECM-suspensionen för att komma fram till en slutlig koncentration på 0,2 U/mg fibrinogen. Pipettera snabbt, noggrant och noggrant att blanda, samtidigt som du undviker att införa bubblor.
OBS: Trombin initierar snabb omvandling av fibrinogen till en fibrinpropp. Som sådan finns det begränsad tid att så vävnaderna vid trombin tillsatsen. För att undvika för tidig koagulering innan cell-ECM-blandningen överförs till odlingsbrunnarna, ställ in en p20-pipett på 15 μL innan du tillsätter trombin. Använd förkylda spetsar eller doppa pipettspetsen i iskall DMEM i några sekunder innan du samlar in och överför 15 μL av cell-ECM-blandningen till varje brunn. Det är en bästa praxis att förbereda cell-ECM blandning alikvoter så att högst 6 hMMTs sås åt gången. - Tillsätt 15 μL cell-ECM-blandning (dvs. 150 000 celler) till varje enskild brunn för att så vävnaderna. Tillsätt försiktigt cell-ECM-blandningen i mitten av den ovala poolen och undvik att trycka pipettens spets i botten av brunnen. Sedan, med två lätta rörelser, sprida cellfjädringen bakom varje stolpe i brunnen. När ytan är jämnt belagd i cell-ECM-suspensionen, gå vidare till nästa brunn.
OBS: Arbeta effektivt för att undvika för tidig gelering av cell-ECM-blandningen i röret innan alla vävnader sås. Vid sådd av brunnarna är det extremt viktigt att undvika att överföra bubblor eftersom bubblan kommer att störa ombyggnaden av hMMT, vilket gör hMMT oanvändbar. - Placera locket på den 10 cm odlingsplatta som innehåller de sådda brunnarna och överför till en 37 °C vävnadsodlingsinkubator i ca 5 min.
OBS: Placera mikrocentrifugeröret med restcell-ECM-blandningen i inkubatorn som en bekräftelse på gelpolymeriseringsprocessen. - När cell-ECM-blandningen har polymeriserats, tillsätt 200 μL förvärmda hMMT-såddmedier till varje MyoTACTIC-brunn. Sätt tillbaka locket på 10 cm skålen och återför MyoTACTIC-plåtportioner i 10 cm skålen till inkubatorn. Denna tidpunkt kallas dag -2. Stör inte vävnader förrän nästa steg.
- Samla in det koniska röret som innehåller de spunna cellerna och aspirera på mediet och var noga med att undvika cellpelleten. Snärta kraftigt rörets ände med ett handskfinger för att lossa pelleten och fortsätt att snärta tills pelleten visas som en cellslam.
- Differentiera hMMT
- Efter 2 dagars inkubation, avlägsna hMMT-såddmediet försiktigt med hjälp av en pipett och ersätt med 200 μL förvarnat differentieringsmedium innehållande 2% hästserum, 1% Pen/Strep, 4% ACA (dvs. 2 mg/ml slutlig koncentration från en lagerkoncentration på 50 mg/ml; % uttrycks som v/v) och 10 μg/ml human rekombinant insulin i DMEM. Denna tidpunkt kallas dag 0 för differentiering.
- Varannan dag därefter, utbyta hälften av medierna med nya differentieringsmedier fram till dag 12 av differentiering, den sista kulturdagen (figur 2a).
OBS: Protokolldetaljer för att tillverka hMMTs med hjälp av primära mänskliga myoblaster har publicerats någon annanstans30. Om det finns farhågor om cellviabilitet efter sådd, inkubera hMMT med kalcein och propidiumjodid för att kvantifiera livskraften.
4. Elektrisk stimulering och analys av hMMT-inducerad postavböjning
- Sätt upp ett klart bottenglas eller plaststegfäste på ett inverterat mikroskop och fäst en smartphonekamera på mikroskopögesstycket med hjälp av ett mikroskopkamerafäste. Faskontrastmikroskopi vid 10x förstoring kommer att användas (figur 3a).
OBS: Alla inverterade faskontrastmikroskop utrustade med ett 10x förstoringsmål kommer att vara lämpligt. PDMS-brunnskonstruktionerna kommer att tas bort från 10 cm skålen och placeras direkt på det klara bottenstegfästet och därmed öppet för luften. Sterilisera alla ytor och utrustning med 70% etanol och minimera trafiken i området under experiment. - För att förbereda de elektriska stimuleringselektroderna, skär ~ 30 cm tennbelagd koppartråd. Sedan, med början vid navet på en 25 G vanlig avfasningsnål, linda ~ 10 cm av tråden tätt runt den övre halvan och lämna ~ 20 cm överflödig tråd. Upprepa för en andra nål och skär sedan av navet från varje nål.
OBS: Tråden måste vara tätt runt nålen för att säkerställa att den inte rör sig och den trådlindade delen av elektroden får inte vidröra PDMS eftersom detta kan hindra elektrisk fältgenerering. - Fäst BNC på alligatorklämmakontaktkabel till en utgångskanal på vågformsgeneratorn och ställ in kanalen för kvadratpulser med 20% arbetscykel, 5 V amplitud (elektrisk fältstyrka på 10 V/cm). Frekvensen kommer att ändras mellan 0,5 Hz respektive 20 Hz för ryckningar respektive stelkrampskontraktioner.
Waveform-generatorinställningar kan kräva experimentspecifik optimering - Placera en MyoTACTIC-plåt som innehåller hMMTs på mikroskopstadiet och för försiktigt in varje elektrodfasning i PDMS direkt bakom varje stolpe i den ovala poolen. Tejpa försiktigt ner de 20 cm sektionerna av överflödig tråd till mikroskopstadiet så att nålarna förblir vertikala och ~ 10 cm av varje tråd förblir fri för anslutning (figur 3a).
VARNING: Placera aldrig ett bara finger över elektrodens ände. Se till att en fingerborg bärs på pekfingret för att applicera lätt tryck på elektroden vid införandet i PDMS. - Fokusera mikroskopets synfält på en av två stolpar, så att fokus är skarpt på stolpekanten närmast elektroden. Lås sedan smartphonekamerafokuset till det tydligaste området i inlägget. Detta är viktigt för nedströmsanalysen eftersom en förändring i fokus medan inspelningen kommer att störa analysen.
- Anslut de bandade ledningarnas fria ändar till vågformsgeneratorn via alligatorklämmor(figur 3a).
- Starta videoinspelning på smarttelefonkameran och slå sedan på kanalutgången för att initiera stimulering. Inducera hMMT att genomgå 3 ryckningar och 3 stelkrampskontraktioner, med 2 minuters vila mellan rycknings- och stelkrampsstimuleringsserien.
- Stäng av kanalutgången, lossa alligatorklämmor från de tennbelagda koppartrådarna, ta bort tejpen från ledningarna och torka av varje elektrod med 70% etanol innan du sätter in i efterföljande hMMT-brunnar. Upprepa proceduren från steg 4.5 för alla hMMTs.
OBS: Begränsa den tid som hMMTs spenderar utanför inkubatorn genom att stimulera högst 3 vävnader åt gången. Om ytterligare hMMTs inom MyoTACTIC-plåtdelen återstår att analysera, sätt tillbaka plattan till inkubatorn i 10 minuter så att hMMTs återgår till 37 °C. - Om du vill analysera avböjning efter avböjning för att beräkna hMMT-kraftgenerering använder du det anpassade skriptet, som har gjorts tillgängligt på GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). Följ anvisningarna i README.md för att konfigurera och starta skriptet och öppna sedan varje inläggsspårningsvideo för att utföra kraftanalysen.
- Välj en region av intresse (ROI) längs stolpekanten som ska spåras för efterförskjutning. Tryck på Retur för att bekräfta avkastningen och tryck på Retur igen för att köra skriptet(Kompletterande video 1).
OBS: Stora avböjningar gör att spåraren misslyckas. Om spåraren misslyckas under sammandragning kan ROI-storleken ökas för att göra spårningen mindre känslig men tillåter spårning av stora avböjningar. Tre storlekar finns i koden och kan justeras genom att justera skriptkommentarerna. - Skriptet avslutas med två inmatningskrav. Ange först y för att bekräfta att videon innehöll flera sammandragningar. För det andra anger du y (ja) eller n (nej) för export av resultat till en . CSV-fil (Kompletterande video 1).
- Se till att resultaten efter avböjning rapporteras som förskjutning i pixlar för varje sammandragning. Konvertera pixlar till μm-värden för mikroskopet 10x förstoringsinställning. Konvertera sedan postförskjutningstal till absoluta kontraktila krafter (μN) genom att multiplicera värden (μm) med kraftförskjutningskonverteringsfaktorn 2,36 μN / μm, vilket motsvarar 1:15 härdningsmedlet till monomerförhållandet för PDMS som används i MyoTACTIC-tillverkning30.
5. Kalcium transient analys med elektrisk stimulering
OBS: För kalciumhanteringsexperiment omvandlades odödliga myoblaster stabilt med MHCK7-GCAMP6-reportern som tidigare beskrivits11,12. Transduced celler sorterades FACS sorteras för GFP för att få den positiva befolkningen, och sedan används för att tillverka hMMTs. Alternativa metoder för kalciumavbildning som användning av ratio-metriska färgämnen som Fura-2 AM och Indo-1 eller fluorescens livstidsavbildning av kalciumindikatorer (t.ex. Fluo-4 eller Oregon Green BAPTA1) kan vara mottagliga för vårt system.
- Ställ in mikroskopstadiet och stimuleringsutrustningen (elektroder, vågformsgenerator, etc.) som tidigare beskrivits i steg 4. För det här experimentet använder du en 4x förstoring.
OBS: Ett mörkt rum och ett epifluorescensmikroskop utrustat med ccd-kamera kommer att behövas. - Starta programvara för mikroskopavbildning, välj FITC-filterkanal (blått ljus) och välj filminspelningsfunktion. Ställ in vid en exponering på 500 ms och en upplösning på 680 x 510 (Binning 2x2).
Bildbehandlingsprogramvaran kan variera och exponeringen ställs in manuellt av användaren. Var noga med att undvika hMMT över exponering före stimulering. I vila är en mörk vävnad kontur / skugga med spontan fluorescens normal medan en klar vävnadsbild är över exponering(Kompletterande Video 2). Se till att exponeringen är konsekvent för alla hMMTs i ett experiment. - Stäng mikroskopluckan och håll FITC-kanalen avstängd tills den är klar att spela in kalciumhantering.
- När all utrustning och programvara är konfigurerad hämtar du MyoTACTIC-plåtdelen som innehåller hMMT som ska analyseras och ställ in den direkt på mikroskopstadiet. Sätt sedan in och anslut elektroder som tidigare beskrivits i steg 4.
- Använd brightfield för att fokusera synfältet på mitten av den valda hMMT. Stäng sedan av lampan.
- Öppna mikroskopet FITC-kanalluckan, bekräfta att blått ljus är på och välj sedan Filminspelning i programvaran.
- Slå på utgången på vågformsgeneratorn för att initiera den elektriska stimuleringen. Inducera hMMT att genomgå 8 ryckningar och 8 stelkrampskontraktioner. Låt 2 minuters vila mellan rycknings- och stelkrampsstimuleringsserien, under vilken tid FITC-slutaren är i stängt läge.
OBS: Tillåt 10 s spontan aktivitet före och efter elektrisk stimulering för att registrera minsta fluorescens för beräknings- och dataanalysändamål. - Stäng av kanalutgången, lossa alligatorklämmor från de tennbelagda koppartrådarna, ta bort tejpen från ledningarna och torka av varje elektrod med 70% etanol innan du sätter in i efterföljande hMMT-brunnar. Upprepa stimulerings- och inspelningsproceduren för alla hMMTs.
- Spara filmer i TIFF-filformat för analys i ImageJ eller alternativ bildbehandlingsprogram.
OBS: Begränsa den tid som hMMTs spenderar utanför inkubatorn genom att stimulera högst 3 vävnader åt gången. Om ytterligare hMMT inom MyoTACTIC-plåtdelen återstår att analysera, returnera enheten till inkubatorn i 10 minuter så att hMMTs återgår till 37 °C. - För att analysera kalciumövergående data öppnar du först ImageJ. Välj Analyseraoch ange sedan måttoch välj sedan Medelvärdet för grått och avmarkera alla andra alternativ. När du är klar, öppna en kalcium (.tiff) video(Kompletterande video 2).
- Skissera mikrotissuens kant med hjälp av ett polygonvalsverktyg och spara det här området som ROI(Kompletterande video 2). Under Mer i ROI Manager-fönstret väljer du Multi measure och mäter fluorescerande intensitet för alla filsegment med en rad per segment(Kompletterande video 2).
- Kopiera alla mått, inklusive segmentnummer (bildruta), till ett kalkylblad och jämför fluorescerande intensitet för varje segment med minsta spontana fluorescerande intensitet från filen med hjälp av ΔF/F0 = (Fomedelbar - Fminimum)/Fminimum (Kompletterande video 2).
- Beräkna tiden för varje bildruta genom att multiplicera filminspelningsramhastigheten med segmentnummer (bildruta) och rita ΔF/F0 mot tid för hMMT kalcium transienta svaret på stimulering(Kompletterande video 2).
- Välj den maximala kalciumtransgående signalen för var och en av 6 på varandra följande sammandragningar och medelvärden för att beräkna den relativa genomsnittliga topp lysrörsintensiteten för varje hMMT(Kompletterande video 2).
OBS: Uteslut alltid data som härrör från den första twitch-sammandragningen från den övergripande analysen. Ett kalkylblad med titeln "Calcium Handling Template.xlsx" har tillhandahållits på GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) för att underlätta hMMT kalcium transient analys. Fyllningsbara celler där värden och indata ska matas in markeras i grått. Se till att justera toppvalssiffror eftersom detta bara är en guide för att underlätta toppval(Kompletterande video 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beskrivs häri är metoder för att kasta en 96-väl PDMS-baserad MyoTACTIC kulturplattform från en PU mögel, att tillverka matriser av hMMT replika vävnader, och att analysera två aspekter av hMMT funktion inom kulturen enhet-kraft generering och kalcium hantering. Figur 1 ger en schematisk översikt över beredningen av MyoTACTIC kulturbrunnar före hMMT-sådd. PDMS är en allmänt använd silikonbaserad polymer, som enkelt kan gjutas för att skapa komplexa enheter32. Ett PDMS-baserat protokoll utformades för att kasta ett obegränsat antal 96-brunnskulturenheter från en tillverkad negativ PU-form30. Den slutliga härdade PDMS-positiva plattan är flexibel och kan enkelt skäras i mindre funktionella enheter med hjälp av ett enkelt kant rakblad(figur 1). Detta gör det möjligt för användaren att skala enheten för att uppfylla hMMT-repliken som är specifik för deras experimentella design. Dessa mindre funktionella enheter är också fördelaktiga för att övervinna en begränsning av att arbeta med en ECM-byggnadsställning som polymeriserar snabbt, till exempel fibrinhydrogeler, genom att enkelt justera antalet brunnar för att matcha användarens cellsåddhastighet. Dessutom är PDMS lätt autoklaverbart och det kan lagras på obestämd tid. Slutligen, ur logistiksynpunkt, kan en full MyoTACTIC-platta täckas av alla standard 96-brunnsplåtlock, och dimension och profil av MyoTACTIC-plåtportioner är mottagliga för inkubation inom en 10 cm odlingsplatta, för att säkerställa hMMT-kultursterilitet. Pluronic F-127 lösning beläggning före cellsådd tjänar en dubbel roll att ge ett extra mått av kultur väl sterilisering, och som en icke-jonisk tensid, förhindra cell vidhäftning till förmån för enhetlig cell - ECM remodeling (figur 1).
När den odödliga myogena stamcellpopulationen är redo för experiment, är cellerna sedan inkapslade i en hydrogel bestående av fibrinogen och källarmembranextrakt. Cell-ECM-blandningen deponeras sedan jämnt i den ovala poolen längst ner i varje MyoTACTIC-brunn, och sedan under en 14-dagars kulturperiod organiserar cellerna rumsligt över dessa två vertikala inlägg för att bilda en 3D-mikrotissue befolkad med en säng av justerade, multinukleära, tvärsrade myotubes som liknar aspekter av inhemsk vävnadsorganisation (figur 2a, g,h). Under ombyggnadsprocessen genereras enaxlig spänning mellan de två förankringspunkterna, och detta vägleder vävnadens självorganiseringsprocess för att i sin tur driva bildandet av en kompakt vävnad. Under differentieringsperioden är bredden på hMMT konstruerade från myoblaster som härrör från friska patienter fortfarande ganska konsekvent. Men i händelse av fel som stör hMMT-ombyggnad går denna enhetlighet förlorad (figur 2a-f), vilket gör detta enkla mått användbart vid hMMT-kvalitetskontrollbedömning. Till exempel kan övernitisk blandning av cellen - ECM-suspension resultera i bildandet av bubblor. Bubblor överförs till MyoTACTIC väl hindrar hMMT ombyggnad. I sådana fall förskjuter bubblor några eller alla myoblaster från det område som upptas av bubblan och bildar så småningom en spricka i den slutliga hMMT (Figur 2b; se röd pil). Ett annat exempel gäller integriteten hos Pluronic F-127-beläggningen i brunnarna. Pluronic F-127 är ett icke-joniskt tensid som hindrar celler från att hålla sig till MyoTACTIC-brunnen. Om beläggningen skrapas bort under aspirationen kommer myoblaster att fästa på ytan av MyoTACTIC-brunnarna, bilda nya förankringspunkter och resultera i myotubes som inte är justerade över de två stolparna (figur 2c). Ytterligare fel kan också leda till avvikande hMMT-ombyggnad, som visas i figur 2d-f. Cell vitalitet efter sådd kan också utvärderas med hjälp av kalcein / propidiumjodidbaserade färgningsanalyser. När dessa tekniska fel undviks fylls hMMT av en bädd av justerade och multinukleära myotuber som sträcker sig över längden på varje hMMT (figur 2g). Myotuberna är ganska enhetliga i storlek över sin längd och mellan olika hMMTs (figur 2h-i). Myotubes kännetecknas av närvaron av sarkomeriska strimmor som visualiseras av immunstaining för sarkomerisk α - aktinin (SAA; Bild 2h).
Funktionella egenskaper kan också undersökas i hMMTs som börjar cirka 7 dagars differentiering. Den experimentella uppsättningen för att slutföra dessa funktionella studier illustreras i figur 3a. Mikroskopiinställningen är avbildad ovanpå ett vibraplansbord. Detta krävs dock inte för att slutföra funktionella undersökningar. I funktionella studier sätts elektroder som genereras enligt beskrivningen i protokollets elektriska stimuleringssektion in i PDMS, så att elektroder finns bakom stolparna. Det är viktigt att ha god visualisering av postområdet innan du sätter in elektroden eftersom behovet av att återinföra kan leda till förskjutning av vävnaden från posten. Korrekt införande av elektroderna är också viktigt för att få skarp fokus på inlägget så att postavböjning därefter kan spåras med python-skriptet. Figur 3b visar en representativ förskjutning av MyoTACTIC brunnsplatta stolpe som svar på låg (twitch, 0,5 Hz) och hög (stelkramp, 20Hz) frekvens hMMT elektrisk stimulering. Kvantifiering av postförskjutning kan användas för att beräkna den inducerade kontraktilkraften hos hMMT(figur 3c). När denna information kombineras med hMMT tvärsnittsområde kan specifik kraft bestämmas30. Dessutom spelar kalcium transienter en viktig roll i muskelkontraktion. Stabil transduktion av skelettmuskulaturen myoblaster med en genetiskt kodad kalciumindikator som GCaMP612,30,33,34, möjliggör levande övervakning av kalcium transienter12,30,34. Kalcium transienter analyserades med hjälp av afore beskrivna elektriska stimulering setup upp för att stimulera dag 12 hMMTs genereras med odödliga myoblaster uttrycker MHCK7-GCAMP6 reporter(figur 4a), och kvantifieras som genomsnittlig topp fluorescerande intensitet under låg (twitch, 0,5 Hz) och hög (stelkramp, 20Hz) frekvens elektrisk stimulering(figur 4b). Det observeras att hMMT kalciumhanteringsegenskaper som mäts över olika experiment är relativt konsekventa (figur 4b). Kvantifieringsmetoder för avböjning och kalciumhantering beskrivs i kompletterande video 1 och kompletterande video 2.
Figur 1: Beredning av MyoTACTIC PDMS-plattan före hMMT-sådd. Den 96-brunnsplattform som kallas MyoTACTIC tillverkas genom att först härda polydimethylsiloxan (PDMS) inom en negativ polyuretanform (PU). Den PDMS-baserade odlingsplattformen skalas sedan försiktigt från den negativa PU-formen. I en akademisk miljö skärs PDMS-enheten sedan i mindre enheter som innehåller 6 ± 2 funktionella brunnar. Dessa brunnar placeras sedan i en steriliseringspåse, autoklaveras och lagras fram till användning. Upp till en dag före användning placeras önskat antal enhetsdelar inom en 10 cm odlingsplatta och Pluronic F-127 läggs till varje brunn. 10 cm disklocket läggs till, kanten förseglas med parafilm innan du inkuberar plattan vid 4° i 2-24 timmar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: MyoTACTIC stöder hMMT självorganisering och bildandet av justerade myotubes. (a) (överst) Schematisk tidslinje för hMMT självorganisering och efterföljande myotube-mognad under en 14-dagars kulturperiod. (nederkant) Representativa 4x faskontrastbilder för att illustrera kinetiken hos odödliga myoblaster självorganisering över de två vertikala inläggen som resulterar i bildandet av en 3D hMMT. Skalstång, 500 μm. (b-f) Representativa 4x faskontrastbilder av hMMT på dag 12 av differentiering som visar hMMT-resultat orsakade av (b) en bubbla i cellen - ECM vid tidpunkten för sådd (röda pilpunkter till bubbla inducera hMMT-skada), (c) felaktig strävan hos pluronic F-127 lösningsbeläggning, och (d-f ) hMMT överrenovering som kan signalera felaktig ECM-gelering, brist på ACA-aktivitet i kulturmedier, felaktig vård av myoblast föräldralinje etc. Skalstång, 500 μm. (g) Representativ kaklad och tillplattad konfokal bild av en dag 12 hMMT tagen vid 10x förstoring. hMMTs fixeras direkt i PDMS-formen, avlägsnas sedan försiktigt och placeras i en 96 välkulturplatta för färgning. Sarkomisk α-aktinin (SAA) visas i magenta och Hoechst 33342 kärndiskstain visas i cyan. Skalstång, 500 μm. (h) Representativ konfokal bild av en dag 12 hMMT vid 40x förstoring. hMMT myotubes och atomkärnor visualiseras genom immunstaining för SAA (magenta) och mottaining med Hoechst 33342 (cyan). Skalstång, 50 μm.i) Punktdiagramdiagramdiagram med genomsnittlig hMMT myotube diameter vid dag 12 av differentiering. Värden rapporteras som medelvärde ± SEM. n = 8 hMMTs från 3 biologiska replikat, kännetecknade av symbolformer, varigenom minst 30 myotuber per hMMT analyseras. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: In situ-mätning av kontraktil kraft inom MyoTACTIC-plattformen. a ) Representation av det elektriska stimuleringsarrangemanget (vänster). Även om det visas i den här inställningen krävs ingen vibraplantabell. En smartphonekamera och fäste var utrustade till okularet på ett inverterat mikroskop utrustat med en fluorescenslampa för videoinspelningar av hMMTs elektriska stimuleringsstolpar (vänster). 25 G nålar var inslagna med tennbelagda koppartrådar (nedre högra), anslutna till en BNC till alligator clip connector kabel (uppe till höger) och fästes upp till en godtycklig vågform generator. Placering av elektroder under elektrisk stimulering visas längst ner till höger. b)Representativa ögonblicksbilder tagna från videor efter avböjning som förvärvats från hMMTs på dag 12 av differentiering. Videor fångades vid 10x förstoring. Helvita vertikala linjer visar stolpplacering när hMMTs är avslappnade, medan prickade vita vertikala linjer visar postförskjutning efter hög (stelkramp 20 Hz) eller låg (0,5 Hz) frekvensstimulering. Skalstång, 100 μm. (c) Punktdiagramdiagramdiagram med medelvärde hMMT-ryck (0,5 Hz) - och stelkramp (20 Hz) -inducerad kontraktil kraft dag 12 av differentiering. Värden rapporteras som medelvärde ± SEM. n = 9 hMMTs från 3 biologiska replikat, som kännetecknas av symbolformer. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: In situ-mätning av kalciumhantering inom MyoTACTIC-plattformen. a ) Representativa bilder från en 4x förstoringsvideoinspelning av spontanA GCaMP6+ kalcium transienter och kalcium transienter som svar på låg (ryckkontraktion, 0,5 Hz) och hög (stelkrampskontraktion, 20 Hz) frekvens elektrisk stimulering. hMMTs beskrivs med en prickad gul linje. Skalstång, 200 μm. (b) Punktdiagramdiagramdiagram som visar kvantifiering av genomsnittlig topp fluorescerande intensitet per hMMT efter låg (twitch-sammandragning, 0,5 Hz) och hög (stelkrampskontraktion, 20 Hz) frekvens elektrisk stimulering. Värden rapporteras som medelvärde ± SEM. n = 9 hMMTs från 3 biologiska replikat, som kännetecknas av symbolformer. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande video 1: Demonstration av metoder för att analysera data efter avböjning. En representativ video av post avböjning analys på dag 12 av differentiering spåras av anpassade skript under stelkramp stimulering. Först väljs ROI-storleken direkt i efterspårningsskriptet. Därefter öppnas videon genom att välja uppspelningsknappen för att köra skriptet. En skarp fokuserad region i inlägget väljs som ROI och den blå postspårningsrutan placeras. Retur trycks ned för att låsa ROI och trycks på igen för att köra skriptet. "y" anges som svar på prompten "Flera sammandragningsvideo? [Y/N]", anges n som svar på uppmaningen "Exportera inläggsplatser som .csv fil? [Y/N]". Efterböjning som relativ förskjutning i pixlar är den slutliga utdata. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video 2: Demonstration av metoder för att analysera övergående GCaMP6-data för kalcium. En representativ video av epifluorescens kalcium hantering analys på dag 12 av differentiering under stelkramp stimulering. Först har en video av kalcium transienter (sparat som en serie tiff-bilder) öppnats i ImageJ och användaren har navigerat genom ramar tills hMMT är synlig. Därefter bekräftas den önskade analysmätningen "medelvärdet grå värde" och hMMT skisseras med hjälp av polygonal ritverktyget. Den här dispositionen sparas när intresseområdet och fluorescerande intensitet för varje videosegment analyseras med hjälp av multimått. Dessa mätningar kopieras till kalkylbladet "Calcium Handling Template" med ramdata och kalciumövergående toppvärden ifyllda och bekräftade. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskriver metoder för att fabricera och analysera en 3D hMMT-kulturmodell som kan tillämpas på studier av grundläggande muskelbiologi, sjukdomsmodellering eller för kandidatmolekyltestning. MyoTACTIC-plattformen är kostnadseffektiv, lätt att tillverka och kräver ett relativt litet antal celler för att producera skelettmuskelmikrotissuer. hMMTs som bildas inom MyoTACTIC-kulturplattformen består av justerade, multikärnor och strimmor myotuber och svarar på elektriska stimuli genom att initiera kalcium transienter som utlöser sammandragning (figur 2, figur 3, figur 4). Tidigare studier visade att hMMTs erbjuder ett liknande svar på biokemiska stimuli och kan nå mognadsnivåer som matchar de som rapporterats i större format 3D skelettmuskelmodeller12,30.
Ett kritiskt tema under hela MyoTACTIC-plåttillverkningen och hMMT-generationen är att se till att bubblor förhindras och om de bildas har tagits bort. För att underlätta enstegsgjutning av en fungerande PDMS-form hade en PU-form genererats nedströms den ursprungliga 3D-utskrivna plastformen som tidigare beskrivits av Afshar m.fl.30. PU-formen som har genererats gör det möjligt för användare att producera ett 96 brunnsavtryck av PDMS-mögel där högst 96 brunnar är funktionella (innehåller två inlägg), som dikteras av PU-mögeltillverkningssteget. Under tillverkningen av PDMS MyoTACTIC-plattan saknar nya användare ofta mindre bubblor som finns kvar i det flytande PDMS, även efter avgasning. Bubblor som lokaliserar till regioner i PU-formen som motsvarar förankrings flexibla stolpstrukturer kommer att resultera i postbrott vid separation av PU-formen från PDMS-odlingsplattan, och i processen lämnar efter sig en liten bit härdad PDMS i PU-formen. Tryckluft kan användas för att ta bort dessa härdade PDMS-rester, och ett misslyckande med att göra det kommer effektivt att minska antalet funktionella brunnar som är tillgängliga för framtida plåtgjutningar. Därför är det viktigt att se till att alla bubblor har tagits bort innan PDMS-plattan härdas som en fördel med denna plattform är att det är en fristående enhet, varigenom alla funktioner på plattan gjuts i ett enda steg snarare än att kräva att varje enskild microtissue förankringspunkt introduceras till kulturbrunnarna manuellt35, 36,37. De flesta akademiska laboratoriestudier kräver inte en hel MyoTACTIC odlingsplatta. För att maximera användningen av varje PMDS-platta skärs den manuellt i grupper om 6 ± 2 MyoTACTIC-brunnar. För att förbättra denna process kan en PU-form som låter användare skala funktionella enheter på 6 ± 2 MyoTACTIC-brunnar helt eliminera detta plattskärningssteg. Dessutom kommer stora bubblor som införs i cell-ECM-lösningen under blandning eller under vävnadssåddproceduren att försämra korrekt vävnadsbildning. Dessa stora bubblor förskjuter celler från den region som bubblan upptar, vilket ofta resulterar i hMMTs med regioner med få myotubes som kommer att duka under för kontraktil stress och knäppa under elektrisk stimulering.
En anmärkningsvärd fördel med MyoTACTIC är förmågan att kvantifiera aktiva kraftgenererings- och kalciumhanteringsegenskaper på plats. Detta är en utmaning som många andra 3D-odlingssystem står inför, där undersökning av 3D-vävnadskontraktilkraft implementeras som en slutpunktsanalys efter avlägsnande av vävnaden från odlingsanordningen12,37. Därför är MyoTACTIC väl lämpad för att stödja longitudinella studier, till exempel förstå de tidsmässiga effekterna av läkemedelsbehandling på skelettmuskulaturen. En begränsning av den metod som beskrivs häri för att kvantifiera aktiva kraftgenererings- och kalciumhanteringsegenskaper på plats är den manuella placeringen av elektroder, vilket begränsar användningen av detta system för molekyltestapplikationer med högt innehåll. En möjlig lösning skulle vara att konstruera ett tydligt lock av elektroder som är uppsatta som en parallell krets som direkt kan sättas in i en standardiserad uppsättning funktionella brunnar som möjliggör elektrisk stimulering av flera vävnader samtidigt. Alternativt, användning av en myogenisk stamceller cellinje stably uttrycker en channelrhodopsin konstruktion skulle tillåta muskel cell membran depolarization, och därmed vävnad sammandragning framkallas av blått ljus exponering. Dessutom fångas aktiv kraft i videor eftersom postavböjning och kvantifiering av aktiv kontraktil kraft kan utföras på ett opartiskt sätt genom att använda ett anpassat halvautomatiskt python-skript för att spåra postavböjning i korta videor. Därför möjliggör myoTACTIC30opartiskdinitudinell bedömning av stimulerad kontraktilkraft. För att förbättra effektiviteten i dataanalys är smartphone-applikationer som är utformade för att mäta kraft samtidigt som de fångar videor av efterböjning idealiska för att öka genomströmningen.
Slutligen har värdet av denna plattform också tidigare beskrivits i dess förmåga att exakt förutsäga läkemedelsrespons. I likhet med kliniska resultat har vi tidigare rapporterat att behandling av hMMTs (gjord med primära myoblaster) med myotoxiska föreningar (dexametason, cerivastatin) inducerade myotubeatrofi och minskad aktiv kontraktil kraft30. Dessutom validerades det prediktiva värdet av MyoTACTIC-genererade hMMTs genom att visa att en kliniskt relevant dos av en kemoterapeutisk som används för att behandla bukspottkörtelcancer, en sjukdom som ofta är förknippad med kakexi2, signifikant minskad hMMT-kvalitet och kontraktil kraft30. Därför visar den enkla tillverkningen av MyoTACTIC och dess användarvänlighet vid generering av 3D hMMTs många fördelar för datainsamling med högt innehåll, vilket framgår av dess tillförlitlighet när det gäller strukturella och funktionella utgångar. En allmän begränsning av PDMS-baserade cellodlingsenheter är att PDMS adsorberar proteiner. Metoden som beskrivs häri använder seruminnehållande kulturmedier, som övervinner denna begränsning genom att tjäna till att "blockera" enheten och tillåta att effekterna av molekyl- och läkemedelsbehandlingar observeras. På grund av denna begränsning ska dock slutgiltiga slutsatser om molekyldoser undvikas och dosresponskurvor uppmuntras. Omvänt är denna plattform inte lämplig för serumfri mikrotissuekultur eftersom tillsatserna kommer att adsorbera till PDMS, vilket hindrar vävnadens hälsa och utveckling. I framtiden kommer integrering av tekniker som 3D-bioprinting och/eller automatiserad vätskehantering att förbättra genomströmningen vid tillverkning av hMMT-kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi vill tacka Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli och Sadegh Davoudi för att de bidragit till uppfinningen av myoTACTIC-kulturplattformen och fastställt de tillverknings- och analysmetoder som beskrivs häri. HL fick finansiering från ett naturvetenskapligt och tekniskt forskningsråd (NSERC) utbildningsprogram i Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship och ett University of Toronto Wildcat examensstipendier. PMG är Kanadas forskningsordförande i Endogen reparation och fick stöd för denna studie från Ontario Institute for Regenerative Medicine, Stem Cell Network, och från Medicine by Design, ett Canada First Research Excellence Program. Schematiska diagram skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma - Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma - Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma - Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma - Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma - Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope - Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma - Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma - Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
- Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
- DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
- Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
- Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
- Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
- Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
- Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
- Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
- Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
- Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
