Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Gene Knock-in fra CRISPR/Cas9 og cellesortering i makrofag og T-cellelinjer

Published: November 13, 2021 doi: 10.3791/62328
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

Summary

Denne protokollen bruker fluorescerende reportere og cellesortering for å forenkle knock-in eksperimenter i makrofag og T-cellelinjer. To plasmider brukes til disse forenklede knock-in-eksperimentene, nemlig en CRISPR /Cas9- og DsRed2-uttrykkende plasmid og en homolog rekombinasjonsdonor plasmid som uttrykker EBFP2, som er permanent integrert ved Rosa26-locus i immunceller.

Abstract

Funksjonelle genomikkstudier av immunsystemet krever genetiske manipulasjoner som innebærer både sletting av målgener og tilsetning av elementer til proteiner av interesse. Identifisering av genfunksjoner i cellelinjemodeller er viktig for genoppdagelse og utforskning av celleintrinsiske mekanismer. Imidlertid er genetiske manipulasjoner av immunceller som T-celler og makrofagcellelinjer ved hjelp av CRISPR / Cas9-mediert knock-in vanskelig på grunn av den lave transfeksjonseffektiviteten til disse cellene, spesielt i en passiv tilstand. For å modifisere gener i immunceller, brukes valg av legemiddelresistens og virale vektorer vanligvis til å berike celler som uttrykker CRIPSR / Cas9-systemet, noe som uunngåelig resulterer i uønsket inngrep av cellene. I en tidligere studie designet vi to fluorescerende reportere koblet til CRISPR/Cas9 som ble midlertidig uttrykt etter elektroporasjon. Denne tekniske løsningen fører til rask gensletting i immunceller; Imidlertid er gen-knock-in i immunceller som T-celler og makrofager uten bruk av valg av legemiddelresistens eller virale vektorer enda mer utfordrende. I denne artikkelen viser vi at ved å bruke cellesortering for å hjelpe til med å velge celler som transient uttrykker CRISPR/Cas9-konstruksjoner rettet mot Rosa26-gresset i kombinasjon med en donorplasmid, kan gen-knock-in oppnås i både T-celler og makrofager uten berikelse av legemiddelresistens. Som et eksempel viser vi hvordan man uttrykker menneskelig ACE2, en reseptor av SARS-Cov-2, som er ansvarlig for den nåværende Covid-19-pandemien, i RAW264.7 makrofager ved å utføre knock-in-eksperimenter. Slike gen knock-in celler kan brukes mye til mekanistiske studier.

Introduction

Immunceller er kritiske for forsvar mot patogener. Både medfødt og adaptiv immunitet er nødvendig for clearance av smittestoffer og vedlikehold av vev homeostase1,2. Cellelinjemodeller er viktige verktøy for å forstå det molekylære grunnleggende i pattedyrets immunsystem; de brukes i in vitro funksjonelle analyser, for eksempel de som modellerer menneskelig T-celleaktivering, og for å bestemme funksjonen til genetiske faktorer i å aktivere eller dempe immunresponser3,4. Det er viktig å merke seg at pattedyrets immunsystem er enormt heterogent og like viktig, et stort antall molekyler kontrollerer differensiering, migrasjon og funksjon av en gitt celletype5,6.

Clustered Regelmessig Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 genomredigeringsverktøy gir mulighet for genetisk manipulering av bestemte celletyper, noe som letter funksjonell merknad av gener på en presis måte7,8. Flere publiserte protokoller har beskrevet levering av CRISPR/Cas9 i form av Cas9-guide RNA-komplekser kjent som ribonukleoproteiner (RNPer) i HEK293-celler, Jurkat-cellelinjer, primære T-celler9,10, makrofager11,12,13, stamceller14og andre15,16. I disse protokollene oppnås genmerking vanligvis ved å fusjonere en fluorescerende tag til endogene proteiner17,18. Det er imidlertid gjort få forsøk på å bruke to fluorescerende reportere, som er kompatible med enkeltcellesortering, for å lette knock-in-eksperimenter19,20, spesielt i immunceller.

Dyptgående mekanistiske analyser som tar sikte på å forstå funksjonene til en ny genetisk faktor i immunceller, krever generelt cellespesifikk sletting av et gen, genetiske redningseksperimenter og ideelt identifisering av interaktivitetene. Selv om metoder for optimalisering av genetisk sletting av gener i immunceller har blitt publisert9,15,21, er det rapportert langt færre metoder for å introdusere knock-in alleler med allsidige funksjoner for å forstå immunresponsen. Derfor, i denne protokollen tar vi sikte på å beskrive i detalj en effektiv og svært reproduserbar protokoll for å uttrykke et protein av interesse (POI) på safe harbor locus Rosa26 i både menneskelige og murine immuncellelinjer. Vi designet et tofarget reportersystem for å berike for celler transfektert med plasmider som uttrykker CRISPR / Cas9 (DsRed2) og en rekombinant DNA-mal (EBFP2), som kan isoleres ved cellesortering. Etter denne protokollen fikk vi flere knock-in linjer av den menneskelige T-cellelinjen Jurkat og murine makrofag RAW264.7 for funksjonelle analyser av dårlig studerte proteiner.

Som et eksempel viser vi i denne protokollen hvordan du får knock-in RAW264.7 makrofager som stabilt uttrykker menneskelig ACE2 (en reseptor av SARS-Cov-2)22. Fordi medfødte immunceller er involvert i patogenesen av Covid-1923,24 og menneskelig ACE2 anses som en stor reseptor som kreves for viral oppføring i celler før replikering, kan makrofager med knock-in av menneskelig ACE2 tjene som et nyttig verktøy for mekanistiske studier av viral multiplikasjon inne i makrofager. Parallelt presenterer vi også et eksempel på knock-in av et gen ved det menneskelige ROSA26-locus for å uttrykke RASGRP1-proteinet, som ble smeltet sammen ved sin amino terminus med en affinitet Twin-Strep-tag (OST). T-celler er viktige målceller i immunterapi, og et økende antall studier har fokusert på manipulering av deres respons på kreft25,26. Siden Rasgrp1 er kjent for å være et viktig signalmolekyl nedstrøms for T-cellereseptoren og dens interagere ikke er godt belyst27, gir OST-RASGRP1 knock-in-modellen grunnlaget for å identifisere interagere som regulerer T-cellenes respons på svulster og infeksjon. Samlet sett kan disse verktøyene brukes til Covid-19-studier og oppdagelsen av nye molekyler som samhandler med Rasgrp1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design og plasmid konstruksjon av sgRNAer rettet mot Rosa26 Locus

  1. Designguide RNAer rundt ønsket innsettingssted
    1. Forsikre deg om at innsettingsstedet for mus Rosa26 (heretter utpekt som mRosa26) knock-in eksperimenter er plassert i den første intronen av mRosa26; dette nettstedet har blitt brukt i tidligere studier28,29. For knock-in eksperimenter i menneskelige celler, sørg for at innsettingsstedet ligger i det menneskelige ROSA26 locus (heretter referert til som hROSA26), som har blitt identifisert som den menneskelige homologen til mRosa2630.
    2. Bruk de genomiske sekvensene av mus og menneskelige arter hentet fra henholdsvis Mouse Genome Informatics (http://www.informatics.jax.org/) og Ensembl genome browser (http://www.ensembl.org/index.html). Kopier 50 basepar (bp) av den genomiske sekvensen til slimet mRosa26 eller hROSA26 på hver side som flankerer ønsket innsettingssted.
    3. Designguide RNAer ved hjelp av det elektroniske webverktøyet CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. Lim inn 100 bp inndatasekvens fra 1.1.2. Velg to veiledende RNAer med høy spesifisitetspoengsum, en høy effektivitetspoengsum og lav aktivitet utenfor målet. I tillegg velger du RNA-guider med høyere Doench-poengsummer og unngår de som er merket som "Ineffektiv"32.
      MERK: Alternative CRISPR-designverktøy er også verdifulle og offentlig tilgjengelige, for eksempel Benchling CRISPR-designverktøyet (https://benchling.com/crispr). Hvis du vil øke frekvensen for CRISPR/Cas9-medierte muterte celler, velger du to ledelinje-RNAer i nærheten av ønsket innsettingssted når det er mulig33.
    4. For mRosa26-locus, bruk to tilstøtende førings-RNAer som er angitt som mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTTTCTAGAAGAAGAT -3') og mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3') (Figur 1A). For hROSA26-locus, bruk to tilstøtende guide RNAer, nemlig hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3') og hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3') (Figur 1B).
      MERK: Genomredigeringsaktiviteter av mR26-sg1 og mR26-sg2 og de av hR26-sg1 og hR26-sg2 ble evaluert i henholdsvis RAW264.7-celler og Jurkat-celler (Se Tilleggsfil, Figur S1).
  2. Kloning av CRISPR-uttrykksvektorer som inneholder sgRNA rettet mot Rosa26 Locus
    1. Syntetiser fremover og reverser oligos for en guide RNA (Se Tilleggsfil).
      MERK: Det er å foretrekke å legge til et G-nukleotid i starten av guidesekvensen, noe som hjelper med uttrykk drevet av U6-promotoren. For eksempel, for å klone den nevnte mR26-sg1, er den fremre oligo CACCGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT og omvendt oligo er AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. Den ekstra G i fremover oligo og dens komplement i omvendt oligo er angitt i fet skrift.
    2. Klone syntetiske oligos som tilsvarer guiden RNAer i alt-i-ett CRISPR uttrykk vektor pX458-DsRed2 generert i vårt tidligere arbeid21 (Figur 1C) ved hjelp av den generelle protokollen for gRNA kloning utviklet av Zhang's Lab (https://www.addgene.org/crispr/zhang/); Hopp imidlertid over gelrensingstrinnet og rens den fordøyde vektoren ved hjelp av et PCR-rensesett (se Materialfortegnelse).
      MERK: I tidligere protokoller ble gelrensing av bbsI-fordøyd vektor utført; Dette trinnet er imidlertid tidkrevende. I den nåværende protokollen renses det fordøyde produktet ved hjelp av et PCR-rensesett og brukes direkte til nedstrøms ligasjonsreaksjonen, som generelt produserer positive kolonier med sammenlignbar effektivitet.
    3. Forvandle 10 μL av ligationproduktet (trinn 1.2.2) til 50 μLEscherichia coli DH5α kompetente celler i henhold til produsentens instruksjoner. Velg tilfeldig tre kolonier fra en LB agar plate med ampicillin (100 μg / ml) og inokulere hver i 3 ml LB medium med ampicillin for dyrking over natten.
    4. Bruk 1 ml av bakteriekulturen over natten for Sanger-sekvensering og hold resten ved 4 °C til konstruksjonen er bekreftet å være riktig: pDsR-mR26-sg1 og pDsR-mR26-sg2 for mRosa26 locus knock-in, og pDsR-hR26-sg1 og pDsR-hR26-sg2 for hROSA26-locus.
    5. Forbered en høy konsentrasjon av plasmid DNA (ca. 2 μg/μL) med et maxiprep-sett for rensing av transfeksjonsklasse plasmid (se Materialtabell).

2. Design og konstruksjon av målrettingsvektorer som homologe rekombinasjonsmaler

  1. Utforme en homologistyrt reparasjonsmal
    1. Utform en målrettingsvektor for å uttrykke POI ved hjelp av en uttrykkskassett optimalisert fra en tidligere studie29, som inkluderer en CAG hybridpromotor, et AscI-begrensningssted som tillater kloning av cDNA i POI, en IRES-EBFP2-reporter og et bovint veksthormonpolyadenylering (bGH-polyA) signal (Figur 1B og tilleggsfil).
    2. Design homologi armer (HAs) som deler homologi med genomiske sekvenser av mRosa26 eller hROSA26 locus. Inkluder ~1 kB av 5' HA som tilsvarer oppstrøms genomisk sekvens fra ønsket innsettingssted til venstre for uttrykkskassett. På samme måte inkluderer du ~ 1 kB av 3' HA som tilsvarer nedstrøms genomisk sekvens fra innsettingsstedet til høyre for uttrykkskassett.
      MERK: Uttrykkskassettet settes så nært som mulig til CRISPR/Cas9-spaltingsstedene34. For å unngå re-kutting av den målrettede allelen av CRISPR/Cas9, inkorporer nukleotidendringer i protospacer-tilstøtende motiv (PAM) sekvens (5'-NGG-3') i målvektoren34,35.
    3. For å tillate linearisering av målrettingsvektoren, sett inn et unikt EcoRI-nettsted like oppstrøms for 5' HA og et unikt BamHI-nettsted like nedstrøms for 3' HA.
    4. Få en kommersiell leverandør til å syntetisere målrettingsvektorene og angi dem som henholdsvis pKR26-iBFP og pKhR26-iBFP for mRosa26 og hROSA26 knock-in.
  2. Konstruere en målrettingsvektor som en homologistyrt reparasjonsmal
    1. For å uttrykke POI, få cDNA-sekvensen (kodesekvensen) fra Ensembl-genomleseren og velg transkripsjonen som har den lengste proteinsekvensen. For eksempel er cDNA for det menneskelige ACE2-genet ACE2-202 ENST00000427411.2 og cDNA for humant RASGRP1-gen er RASGRP1 ENSG00000172575.
    2. Syntetiser cDNA for INTERESSE ved hjelp av en kommersiell leverandør. Det er også mulig å klone cDNA via PCR-forsterkning (ikke beskrevet her). Plasser sekvensen GGCGCGCCACC (5' - 3'), som inkluderer en AscI-begrensningsside (kursiv og fet) og Kozak konsensus oversettelsesinitieringssted (understreket), umiddelbart før ATG-initieringskodonen til cDNA og et annet AscI-begrensningssted (5'- GGCGCGCC -3') etter stoppkodonen til cDNA.
    3. Fordøye den syntetiserte sekvensen med AscI og rense ved hjelp av et PCR-rensesett designet for rensing av DNA-fragmenter etter begrensning av fordøyelsen, i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialfortegnelse).
    4. Ligater den rensede cDNA-innsatsen i den AscI-lineariserte ryggradsvektoren pKR26-iBFP eller pKhR26-iBFP ved hjelp av T4 DNA-ligaer i henhold til produsentens instruksjoner.
    5. Kontroller den endelige målrettingsvektoren, pKR26-POI-iBFP eller pKhR26-POI-iBFP, ved sekvensering. Bruk maxiprep til å rense de verifiserte konstruksjonene i henhold til produsentens protokoll.
    6. Fordøye målrettingsvektoren ved hjelp av enten EcoRI eller BamHI og rense fordøyelsesproduktet ved hjelp av et PCR-rensesett i henhold til produsentens instruksjoner. Oppbevar den lineariserte målrettingsvektoren (~0,8 μg/μL) ved -20 °C til elektroporasjon.

3. Elektroporasjon av makrofag og T-cellelinjer

  1. Forbered cellekulturer for elektroporasjon
    1. Forbered Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplert med 10% foster bovint serum (FBS) som komplett vekstmedium for Jurkat T-celler. Forbered Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% FBS for å dyrke RAW264.7 makrofager. Suppler alle komplette vekstmedier med 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin (Penn/Strep) bortsett fra medier som brukes til inkubasjon etter transfeksjon før cellesortering.
    2. Utfør subkulturering av RAW264.7- og Jurkat T-celler i henhold til leverandørens instruksjoner (se Materialfortegnelse). Ved subkulturering av RAW264,7-celler, bruk trypsin-EDTA-oppløsning (0,25 %) for å løsne celler. Bruk FBS supplert med 10 % (v/v) DMSO som kryopreserveringsmedium for RAW264.7- og Jurkat-celler.
    3. Samle celler på 250 × g i 5 min for RAW264.7 makrofager og 90 × g i 8 min for Jurkat T celler. Vask deretter med 5-10 ml 1× DPBS (uten Ca2+ eller Mg2+ ioner). Fjern DPBS.
    4. Resuspend cellepellet ved hjelp av 2 ml 1× DPBS. Bruk 10 μL celler og bland med et likt volum på 0,2% trypan blå for å estimere celleantallet og levedyktigheten.
      MERK: Sørg for at cellekulturen har >90% levedyktighet på transfeksjonsdagen.
    5. For et enkelt knock-in eksperiment, utfør elektroporasjon med 10 μL nukleofeksjonsspisser med fem repetisjoner. Beregn volumet som trengs for 2,0 × 106 celler og pellet cellene ved sentrifugering. Vask cellepellet igjen med 1× DPBS som beskrevet i trinn 3.1.3.
      MERK: Ved bruk av 10 μL nukleofeksjonsspisser er det nødvendig med 4,0 ×10 5 celler per elektroporasjon. Forbered derfor minst 2,0 × 106 celler for ett knock-in-eksperiment.
    6. Forbered en 24-brønns plate med 0,5 ml komplett vekstmedium (utarbeidet i trinn 3.1.1) per brønn uten penn / strep og forvarsel i en 37 ° C inkubator.
  2. Elektroporasjon av CRISPR/Cas9-komponenter og målrettingsvektoren
    1. Slå på elektroporasjonssystemet. Bruk elektroporasjonsparametere optimalisert i en tidligere studie21:1400 V/20 ms/2 pulser for RAW264.7 makrofager og 1350 V/20 ms/2 pulser for Jurkat T-celler.
    2. Ta hensyn til prøvetap på grunn av pipettering, forbered en 55 μL elektroporasjonsblanding i et sterilt 1,5 ml mikrosenterrifugerør som inneholder 2,5 μg av hver CRISPR/Cas9-vektor, 2,4 μg av den lineariserte målrettingsvektoren og Resuspension Buffer R.
      MERK: For å spare tid kan elektroporasjonsblandingen tilberedes under sentrifugering (trinn 3.1.5).
    3. Resuspend 2,0 × 106 celler (fremstilt i trinn 3.1.5) i 55 μL elektroporasjonsblanding fra trinn 3.2.2.
    4. Aspirer celle-/elektroporasjonsblandingen fra trinn 3.2.3 ved hjelp av en 10 μL nukleofeksjonsspiss med en pipette.
      MERK: Unngå å introdusere luftbobler under pipettering, noe som kan føre til elektroporasjonsfeil.
    5. Legg prøven til et rør fylt med 3 ml buffer E fra elektroporasjonssettet.
    6. Påfør elektroporasjonsparametrene for de to celletypene som beskrevet i trinn 3.2.1.
    7. Overfør prøven til en brønn på 24-brønnsplaten med forhåndsvarslet medium fra trinn 3.1.6.
    8. Gjenta trinn 3.2.4-3.2.7 for de fire andre repetisjonene, i tillegg til bare kontrollene for målrettingsvektoren og CRISPR-uttrykksvektoren.
      MERK: Endre nukleofeksjonsspissen og røret når du bytter til en annen celletype/plasmid-DNA.
    9. Kultur de transfekterte cellene i 48-72 timer for å tillate utvinning etter elektroporasjon og uttrykk for CRISPR / Cas9-komponenter før strømningscytometrianalyse eller fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Undersøk uttrykket av DsRed2 ved hjelp av et fluorescerende mikroskop utstyrt med en rød kanal ved 24 timers ettertransfeksjon.
      MERK: En fordel med å overvåke DsRed2 fluorescerende celler er at effektiviteten av elektroporasjon kan estimeres og egnetheten for videre cellesortering kan forutsies.

4. Cellesortering for å isolere putative knock-in-celler

  1. Før FACS-sortering, vask de transfekterte cellene en gang med fullstendig vekstmedium. Pelletsceller ved sentrifugering som beskrevet i trinn 3.1.3 og resuspenderer pelletsen i 500 μL friskt medium.
  2. Sett cellesorteringen (plassert i et biosikkerhetsskap) med en dyse på 85 μm og lav strømningshastighet. Velg "single cell" -modus for sortering og test enkeltcellesorteringseffektiviteten og presisjonen ved å sortere 20-30 celler på dekselet til 96-brønns mikroplate. En dråpe lokalisert i midten av hver brønn indikerer riktig oppsett av instrumentet.
  3. Overfør cellefjæringen fra trinn 4.1 til sterile FACS-rør og tilsett SYTOX Red Dead Cell Stain til en endelig konsentrasjon på 1 nM.
  4. Analyser eksempler på cellesorteringen. SYTOX Red og EBFP2 er begeistret av en 405 nm laser og oppdaget av henholdsvis V450 / BV421- og APC-kanalene. DsRed2 er begeistret av en 488 nm laser og oppdaget av PE-kanalen. Bruk ikke-transfekerte celler og EBFP2- og DsRed2-single positive celler som kontroller for spektralkompensasjon.
  5. Sorter 10 enkeltceller i hver brønn av en 96-brønns mikroplate som inneholder 150 μL per brønn med forvarmet komplett vekstmedium. Bruk runde bunnmikroplater for å dyrke suspensjonscellelinjer som Jurkat T-celler og flate bunnmikroplater for tilhenger RAW264.7 makrofager.
    MERK: Sortering av 10 celler per brønn er en optimalisert strategi for å forbedre celleoverlevelse og minimere antall mikroplater på 96 brønner som må frøs og antall prøver som må screenes av strømningscytometri og genotyping; Hvis du bare sorterer én celle per brønn, kreves såing av flere mikroplater for å øke sjansen for å få riktig redigerte celler.

5. Screening og validering av positive knock-in celler

  1. Screening for kandidat knock-in celler ved flow cytometri
    1. Inkuber cellene fra trinn 4,5 i 10-15 dager og legg til komplett vekstmedium hver tredje dag for å erstatte væske tapt gjennom fordampning. For Jurkat T-celler, overfør celler dyrket i den runde bunnen 96-brønnsplate til en flat bunnplate for å optimalisere celleproliferasjon.
    2. Overfør de utvidede sorterte cellene til 48-brønnsplater for videre ekspansjon.
    3. Når cellene er nær samløp, bruker du halvparten av kulturen til å screene for EBFP2-uttrykk ved strømningscytometri (figur 3). Normalt tilsvarer halvparten av kulturen i en 48-brønnsplate etter konfluent vekst 0,5-1,0 × 105 celler, noe som er tilstrekkelig for analyse av en prøve ved strømningscytometri.
    4. Overfør de resterende cellene til 24-brønnsplater for videre spredning.
    5. Hold kandidatcellepopulasjonene i en høy prosentandel av EBFP2-positive celler for ytterligere genotypingsforsøk.
      MERK: Fordi 10 celler er sortert i hver brønn av 96-brønns mikroplaten, er det mulig at knock-in-cellene vil vokse med celler som ikke uttrykker knock-in-genet. Derfor er det normalt å utføre en ekstra runde med cellesortering for å skille EBFP2-positive celler fra de negative cellene.
  2. Screening for kandidat knock-in celler av PCR og sekvensering
    1. Samle 2 × 105 kandidatceller. Trekk ut det genomiske DNA-et ved hjelp av et DNA-prep-sett (Se materialfortegnelse).
    2. For å verifisere at presis homologi-rettet reparasjon (HDR) har skjedd på mRosa26 locus i stedet for på tilfeldige steder i genomet til kandidaten knock-in celler, utføre PCR med primere som spenner over hver side av HAs (Figur 4). Velg en primer som ligger i den genomiske regionen utenfor målrettingsvektoren (ekstern oligo) og en annen primer som ligger inne i målvektoren (intern oligo).
      MERK: En lignende design brukes til å verifisere HDR ved hROSA26-locus. PCR-primere kan også enkelt utformes for å oppdage innsetting av POI-sekvensen. I tillegg kan genotypene wild-type og knock-in allele oppdages samtidig ved hjelp av tre-primer PCR (Se Tilleggsfil, Figur S2).
    3. Klone de positive PCR-produktene ved hjelp av et hurtigkloningssett (se Materialfortegnelser). Forvandle reaksjonsblandingen til DH5α kompetente celler.
    4. Velg tilfeldig 8-10 individuelle bakteriekolonier per transformasjon og sekvenser PCR-produktene fra trinn 5.2.3 av Sanger-sekvensering.
  3. Validering av positive knock-in celler ved immunoblot analyse og affinitet rensing
    MERK: Kandidatceller blir utsatt for immunoblotanalyse for validering av innsetting av POI, eller affinitetsrensing (AP) for studier av proteinproteininteraksjon.
    1. Utfør immunoblotanalyse i henhold til antistoffprodusentens instruksjoner. Se Tabell over materialer for informasjon om bruk av primære antistoffer og sekundære antistoffer.
    2. Subjekt lysates av knock-in celler som uttrykker OST-merket POI til AP ved hjelp av Strep-Tactin Sepharose perler etter produsentens instruksjoner (se Tabell over materialer).
    3. Oppdag chemiluminescens ved hjelp av en imager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter protokollen beskrevet ovenfor for å utføre knock-in eksperimenter på mRosa26 locus ved hjelp av murine RAW264.7 makrofager, designet vi en målrettingsvektor for å uttrykke menneskelig ACE2, en reseptor for SARS-Cov-2-viruset (Figur 2A). Ved hjelp av en lignende design genererte vi humane Jurkat T-celler med knock-in av OST-merket RASGRP1 fusjonsprotein (Figur 2C). Etter transfeksjon av tre plasmider, hvorav to ble brukt til uttrykk for CRISPR / Cas9 (DsRed2; pDsR-mR26-sg1 og pDsR-mR26-sg2 for mRosa26 knock-in; pDsR-hR26-sg1 og pDsR-hR26-sg2 for hROSA26 knock-in) og en annen brukt som DNA-mal for homolog rekombinasjon (EBFP2), doble positive celler som uttrykte to fluorescerende reportere ble sortert i en 96-brønns plate. Av RAW264.7-cellene sortert ved hjelp av sorteringsmodus for enkeltceller, var 0,91% DsRed2+ EBFP2+, men 10 celler ble samlet inn i hver brønn (Figur 2B). Jurkat T-cellene hadde høyere transfeksjonseffektivitet, og prosentandelen av doble positive celler var 7,91% i dette representative eksperimentet, noe som viste vellykket knock-in av OST-RASGRP1 fusjonsproteinet (Figur 2D).

I neste trinn ble strømningscytometri brukt til å screene for kandidatbrønnene med EBFP2-positive celler. Representative histogrammer viste at det var åpenbare EBFP2-positive populasjoner (Figur 3). Det er bemerkelsesverdig at knock-in-cellene ikke uttrykte DsRed2 da strømningscytometri ble utført to uker etter cellesortering.

For diskriminering av presise knock-ins og tilfeldige innsettinger ble genomisk DNA fra EBFP2-positive celler ytterligere testet ved å utføre PCR med primere som gjenkjenner genomisk sekvens utenfor HAene til målvektoren og den spesifikke regionen inne i uttrykkskassett (figur 4A og 4B). Sekvensanalyse av disse PCR-produktene bekreftet forekomsten av HDR på målstedet for mRosa26 (figur 4C). Den samme genotypingsstrategien kan brukes til å validere nøyaktig innsetting av uttrykkskassett ihROSA26-locus av Jurkat T-celler.

For å få en ren populasjon av hACE2-uttrykkende RAW264.7-celler, sorterte vi cellene ytterligere og validerte tilstedeværelsen av fluorescerende reportere etter utvidelse ved hjelp av ville celler som kontroller (Figur 5A). De utvidede cellene var EBFP2 positive, og hACE2-proteinet var lett påviselig i murine RAW264.7 makrofager (Figur 5B og 5C). På samme måte validerte vi uttrykket for fluorescerende reportere og OST-RASGRP1-proteinet i humane Jurkat T-celler etter screening og en andre runde med cellesortering (Figur 6A og 6B). I tillegg ble affinitetsrensing av OST-RASGRP1-proteinet utført ved hjelp av kommersielt tilgjengelige perler. Vi fant en høyere mengde RASGRP1 protein i den totale cellen lysater av knock-in Jurkat celler enn i de av wild-type celler; RASGRP1 knockout Jurkat-celler ble brukt som kontroller (Figur 6C). Etter rensing ved hjelp av OST-koden hadde bare innslagsprøvene påvisbare RASGRP1 (figur 6D).

Figure 1
Figur 1. Genmålrettingsstrategi for å generere mRosa26/hROSA26 knock-in cellelinjer som overtrykker et protein av interesse. (A) mRosa26-spesifikk guide RNA-målsekvenser og protospacer tilstøtende motiver (PAMer) i ønsket innsettingssted er angitt i henholdsvis blå og røde bokstaver. Cas9 klemmer normalt 3-4 bp oppstrøms for PAM-sekvensen, som er indikert med grønne piler. Målrettingsvektoren brukes som mal for homologistyrt reparasjon (HDR) som fører til presis innsetting av uttrykkskassett i musen eller menneskelig genom. Hver av de 1 kb sekvenser oppstrøms og nedstrøms av ønsket mål området brukes som 5 'og 3 'homologi armer (HAs) i målretting vektoren. HAene er adskilt av en uttrykkskassett som består av en CAG-promotor, cDNA-sekvensen av proteinet av interesse (POI) med en OST-tag, en IRES-EBFP2-reporter og et bGH-polyA-signal (pA). Begrensningsstedet AscI brukes til kloning av INTERESSE, og EcoRI og BamHI brukes til linearisering av målrettingsvektoren. Strategien for CRISPR/Cas9-mediert knock-in på hROSA26-locus er lik. (B) Diagram over det menneskelige ROSA26-locus. Målsekvensene hR26-sg1 og hR26-sg2 er angitt med blå bokstaver og de tilsvarende PAM-sekvensene i rødt. (C) Skjematisk for alt-i-ett CRISPR-uttrykksvektoren pX458-DsRed2, som inneholder en human U6-drevet sgRNA-uttrykkskassett og Cas9-T2A-DsRed2 fluorescerende reporterkassett. To BbsI-begrensningssider tillater kloning av guiden RNA. U6, human U6 RNA polymerase III promotor; sgRNA, en chimeric enkeltguide RNA; CBh, en kylling β-actin hybrid promotør; NLS, kjernefysisk lokaliseringssignal; T2A, Thosea asigna virus 2A selvspleisende peptid; bGH-pA, bovin veksthormon polyadenyleringssignal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Enkeltcellesortering av RAW264.7- og Jurkat-celler transfektet med CRISPR/Cas9-vektorer og målrettingsvektorer for homolog rekombinasjon. Målrettingsvektorer som brukes for stabile genuttrykk i RAW264.7 (A) og Jurkat (C) celler. Representative flow cytometriske plott av mus RAW264.7 makrofager (B) og menneskelige Jurkat T celler (D) transfektert med CRISPR / Cas9 vektorer som uttrykker DsRed2 reporter og målretting vektor uttrykker EBFP2 reporter. Celler som uttrykte DsRed2 og EBFP2 ble utsatt for cellesortering og dyrket for utvidelse; Tall ved siden av omrissede områder angir prosentandelen av celler i hver port, og ikke-transfekterte celler ble brukt som en negativ kontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Screening av knock-in celler ved påvisning av EBFP2 uttrykk. Flow cytometrisk analyse av EBFP2+ og DsRed2+ RAW264.7 makrofager (A) og Jurkat T celler (B) 14 dager etter elektroporasjon. I histogrammer vises fluorescensintensitet (FI) for enten EBFP2+ eller DsRed2+ celler på X-aksen, og antall hendelser i hver fluorescenskanal vises på Y-aksen. (A) Uttrykket av EBFP2 og hACE2 ble drevet av samme promotor ved Rosa26 locus i RAW264.7 murine makrofager. (B) I Jurkat-celler er OST-RASGRP1-uttrykket knyttet til EBFP2-uttrykk ved det menneskelige ROSA26-locus. Ved 14 dager etter elektroporasjon viste strømningscytometrisk analyse nesten null DsRed2+ celler blant de sorterte cellene. Wild-type celler (WT) ble brukt som en negativ kontroll, og KI står for knock-in celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. Screening for kandidat knock-in celler av PCR og sekvensering. (A) Strategi for å generere hACE2 knock-in celler. Posisjonene til PCR-primere som brukes til å skille presis HDR og tilfeldig innsetting, indikeres av grønne piler. (B) PCR genotyping av fem kandidatceller (#4, #15, #22, #25 og #43) som ble identifisert ved flow cytometriscreening for EBFP2-uttrykk som eksemplifisert i figur 3, viste at både 5'-krysset (1472 bp) og 3' krysset (1472 bp) som spenner over homologiarmene var korrekte. M, DNA-stige; WT, den ville RAW264.7-kontrollen. H2O, negativ kontroll. (C) Sanger-sekvensering av PCR-produktene fra B avslørte vellykket innslag av hACE2-uttrykkskassett i mRosa26-locus uten mutasjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5. Validering av vellykket innslag av hACE2-uttrykkskassett i mRosa26-locus i RAW264.7 makrofager. (A) WT RAW264.7 makrofager ble brukt som en negativ kontroll for strømningscytometrisk analyse. (B) For å skille EBFP2-positive celler fra negative celler, ble det utført en ekstra runde med cellesortering for å oppnå en populasjon som består av nesten 100% EBFP2+ knock-in celler, utpekt som hACE2 KI-celler. DsRed2-uttrykket ble også undersøkt for å sikre at CRISPR/Cas9-plasmidet ikke ble integrert i genomet til RAW264.7 makrofager. I histogrammer vises fluorescensintensitet (FI) til enten EBFP2+ eller DsRed2+ celler på X-aksen, og antall hendelser i hver fluorescenskanal vises på Y-aksen. (C) Påvisning av hACE2-uttrykk ved immunoblotanalyse ved bruk av kanin antimennesket ACE2 monoklonalt antistoff. Uttrykk for hACE2 ble observert i celler fra flere brønner (#4, #15, #22, #25 og #43). WT RAW264.7 makrofager ble brukt som en negativ kontroll og GAPDH ble brukt som lastekontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6. Validering av vellykket innslag av OST-RASGRP1-uttrykkskassett i hROSA26-locus i Jurkat T-celler. (A) WT Jurkat T-celler ble brukt som en negativ kontroll for strømningscytometrisk analyse. (B) EBPF2+ subpopulasjoner av Jurkat-celler ble beriket av flere runder med cellesortering og utvidet; Disse cellene ble angitt som OST-RASGRP1 KI-celler. Knock-in-cellene ble analysert av strømningscytometri og holdt ikke DsRed2-uttrykkende vektor. I histogrammer vises fluorescensintensiteten (FI) til enten EBFP2+ eller DsRed2+ celler på X-aksen, og antall hendelser i hver fluorescenskanal vises på Y-aksen. (C) Påvisning av OST-RASGRP1-uttrykk i to uavhengige knock-in-celler (#1 og #2) ved immunoblotanalyse ved bruk av anti-RASGRP1 antistoff. WT Jurkat- og RASGRP1-knockout Jurkat-celler ble brukt som kontroller, og β-aktin ble brukt som lastekontroll. (D) OST-mediert affinitetsrensing ble brukt til å validere uttrykket for OST-RASGRP1 ved hjelp av RASGRP1 knockout-celler som en negativ kontroll. Immunoblot analyse av like mengder proteiner fra celle lysater som enten ble utsatt for affinitet rensing på Strep-Tactin Sepharose perler (Affinity rensing) eller direkte analysert (Total lysater) og undersøkt med RASGRP1 eller GAPDH (lasting kontroll) antistoffer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil: Støttefigurer, tabell og sekvenser Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I våre eksperimenter demonstrerte vi hvordan man utfører knock-in redigering i immunceller fra konstruksjonsdesign til knock-in cellescreening og validering ved hjelp av menneskelige Jurkat T-celler og murine RAW264.7 makrofager som eksempler. Både T-cellen og makrofagcellelinjene er motstandsdyktige mot transfeksjon36,37; Imidlertid kan problemet med lav effektivitet av CRISPR / Cas9-levering overvinnes ved hjelp av fluorescerende reportere kombinert med cellesortering. Denne protokollen er egnet for genredningseksperimenter og proteinproteininteraksjonseksperimenter, men den kan ikke brukes på studiet av regulatoriske DNA-sekvenser som bindende steder for transkripsjonsfaktorer fordi protokollen ble utviklet for knock-in modifikasjon av Rosa26-locus.

Doble fluorescerende reportere hjalp CRISPR /Cas9 knock-in redigering
Vi brukte vellykket et dobbelt fluorescerende reportersystem for å midlertidig uttrykke uavhengige sett med CRISPR / Cas9-vektorer i immunceller, noe som resulterte i sletting av store fragmenter av DNA i tidligere studier21. Vi designet et CRISPR/Cas9-målrettingsverktøy ved hjelp av DsRed2 fluorescerende protein som reporter og et ekstra spektralt distinkt fluorescerende protein for å spore levering av DNA-malen for knock-in modifikasjon. For å gjøre knock-in allele modifikasjon mulig, brukte vi EBFP2 fluorescerende proteinreporter, som ikke har noen spektral spillover med RFP (DsRed2 i vårt tilfelle), for å overvåke transfeksjon av donor-DNA som fungerer som mal under homolog rekombinasjon. For å optimalisere kassetten som uttrykker POI og fluorescerende reporter, ble det introdusert en IRES-sekvens for å skaffe uavhengige proteiner. I vår forrige studie bemerket vi at de resterende aminosyrene fra P2A- eller T2A-linkeren som er igjen etter posttranskripsjonell spalting påvirket proteinlokalisering på celleoverflaten. IRES-sekvensen etterlater ikke slike gjenværende aminosyrer. Som beskrevet i en tidligere studie ga IRES opphav til høyere nivåer av fluorescerende reporter, etter uttrykk for Cas9-proteinet drevet av CAG-promotor38.

Alt-i-ett CRISPR/Cas9-plasmid
Ulike formater og kombinasjoner av CRISPR/Cas9-systemet er beskrevet i tidligere studier, for eksempel Cas9-transfeksjon som mRNA eller protein sammen med kjemisk syntetiserte sgRNAer39. CRISPR/Cas9 RNP-komplekser er også levert inn i pattedyrceller; denne strategien gir fordelene ved tidligere utbrudd av kjerneaktivitet og kortere halveringstid; Merking av RNPene er imidlertid mindre kostnadseffektivt sammenlignet med å konstruere alt-i-ett-plasmid. I våre tidligere studier fant vi at bruk av enkeltcellesortering for å isolere de sjeldne cellene som uttrykker CRISPR / Cas9 (DsRed2 positive) og knock-in protein (EBFP2 positiv) er langt mindre komplisert enn å bruke RNP-levering, og det er lett å forberede plasmidene. Det er sant at denne protokollen er avhengig av sortering av enkeltceller. Men vår protokoll er enkel å utføre og gir vellykkede knock-in modifikasjoner med høy reproduserbarhet.

Uttrykk for et POI fra Rosa26-gresset
Det er flere rapporter i litteraturen som beskriver metoder for merking av endogene proteiner med fluorescerende reportere som bruker CRISPR / Cas9-redigering40,41,42. Fordelene med endogen merking er at det er mulig å bestemme subcellulær lokalisering og utføre in vivo-sporing av det endogene proteinet. Det kan imidlertid oppstå problemer hvis det ikke er mulig å designe en passende CRIPSR-guide RNA ved endogent locus. Her utviklet vi en alternativ knock-in metode ved å innlemme POI-IRES-EBFP2 i den genomiske trygge havnen locus Rosa26, som overvinner begrensningene ved å finne passende guider for plassering av endogene koder.

Vi oppsummerer noen viktige punkter som må vurderes under forsøkene for å sikre teknisk reproduserbarhet. Først må cellesorteringen ha en 405 nm fiolett laser for eksitasjon av EBFP2 og en 488 nm blå laser eller alternativt en 561 nm gul laser for eksitasjon av DsRed2. Med slike konfigurasjoner kan EBFP2 og DsRed2 oppdages uten spektral smitte, noe som kan føre til falske positive resultater. I våre eksperimenter var andelen DsRed2+ EBFP2+ doble positive celler så lav som 0,9%; Derfor var gating av riktig befolkning avgjørende for suksessen til forsøkene. En andre runde med sortering ble utført for å gate EBFP2+ positive celler, etterfulgt av PCR-validering. I tillegg, for knock-in proteindeteksjon, er det å foretrekke å introdusere en proteinkode som OST eller en annen type tag. Knockout av genet før Rosa26 locus knock-in eksperimenter gir en god mulighet til å vurdere om antistoffet har ønskelig spesifisitet. Når antistoffspesifikkiteten ikke er tilstrekkelig, bør påvisning av knock-in-proteinet utføres etter nedtrekk via proteintaggen. Til slutt, under FACS-screening av cellene som uttrykker knock-in-allelen, kan intensiteten til EBFP2 brukes til å vurdere om to kopier eller en kopi av knock-in-allelen er til stede.

Programmer
I denne protokollen beskrev vi knock-in modifikasjonen av RASGRP1, et nøkkelmolekyl involvert i T-celleaktivering27. Vi fikk først RASGRP1-knockout Jurkat celler som kan brukes til tap av funksjon studier, og vi genererte flere Jurkat celler som uttrykker OST-RASGRP1 på hROSA26 locus. Jurkat celler er den mest brukte menneskelige cellelinjen for å studere T cellebiologi43. På grunn av suksessen med immunterapi i å forebygge T-celleutmattelse hos kreftpasienter, har immunologer og kreftbiologer stor interesse i å modifisere Jurkat-celler for funksjonelle studier av kandidatmolekyler. Det er også bemerkelsesverdig at Jurkat T-cellelinjen ofte brukes til disseksjon av signalveier, men det er begrensninger for å bruke denne cellelinjen, da Jurkat-celler er dårlige produsenter av IFN-γ ved stimulering44. Tidligere studier brukte både endogen locus modifikasjon45 og genteknologi ved hROSA26 locus46 for å utføre knock-in eksperimenter i menneskelige Jurkat celler. Begge strategiene har sine egne fordeler; ved å modifisere det endogene gresset, uttrykkes proteinet antagelig på et "fysiologisk" nivå. Knock-in modifikasjon på hROSA26 locus gir forutsigbare resultater fordi alternativ skjøting av mRNA unngås, og overflod av det modifiserte proteinet er også lett påviselig. Andre genomiske trygge havner, for eksempel det adeno-tilknyttede virusstedet 1 (AAVS1) og kjemokinreseptoren (CC-motiv) 5 (CCR5)47,48 fortjener mer utforskning.

I vår forrige studie, da Vav1-OST ble uttrykt på høyere nivåer ved musen Rosa26 locus i RAW264.7 celler, som er svært ofte brukte makrofagceller, var vi i stand til å oppdage samspillet med lavt uttrykte Vav3-molekyler på grunn av de høye nivåene av agnprotein og høy effektivitet av OST affinitetsrensing13. Vi beskrev også knock-in eksperimenter for å etablere en makrofagcellelinje som stabilt uttrykker hACE2, en reseptor for SARS-CoV-2, der rikelig uttrykk er garantert. I enkeltcellet RNA-sekvenseringsdatabase uttrykkes murin Ace2 i lungemakrofager, og den genetiske cellulære modellen som uttrykker hACE2 vi utviklet, kan være nyttig for studier av makrofager under SARS-CoV-2-infeksjon.

Andre hensyn
Denne protokollen er designet for å identifisere knock-in celler som uttrykker en POI ved hjelp av strømning cytometriske analyser av en fluorescerende reporter, i vårt tilfelle EBFP2 reporter. Men når overflatemerking av antistoffer som kan påvises av FACS er tilgjengelige for et overflateprotein49, er det ikke nødvendig å bruke reportersystemet50. T-cellen og makrofagcellelinjene, samt eksemplene på OST-taggede proteiner som brukes til interaktivitetsstudier, brukes hovedsakelig til signalstudier, og de fleste av disse signalmolekylene er lokalisert i cytosol eller kjerne av celler. Dermed kan en fluorescerende reporter være nødvendig for identifisering av ønskelige knock-in celler.

Det er viktig å påpeke at denne protokollen ble utviklet for cellelinjer, og anvendelse på primære immunceller som T-celler, monocytter / makrofager ble ikke validert. På grunn av cellenes begrensede kapasitet til å spre seg, anbefaler vi ikke denne protokollen for bruk med primære immunceller. Ettersom den fluorescerende reporteren EBFP2 ble uttrykt under samme promotor som knock-in-genet eller POI ved hjelp av et IRES-element, observerte vi ikke celler som uttrykte den fluorescerende reporteren i fravær av knock-in-genet. Vi mistenker at utvinningen av de fluorescerende protein-uttrykkende cellene er svært avhengig av suksessen med homolog rekombinasjon. Som rapportert i en tidligere studie, er det kjedelig å sortere, utvide og identifisere de riktige knock-in-cellene etter enkeltcellesortering når knock-in-effektiviteten er svært lav42, noe som også forklarer hvorfor vi trengte å sortere cellene i bulk for å forbedre suksessraten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker strømningscytometrikjerneanlegget til Xinxiang Medical University. Utviklingen av slik teknologi har blitt støttet av NSFC-tilskudd 81601360 til LZ, 81471595 og 32070898 til YL. Arbeidet støttes også av Stiftelsen Henan Educational Committee No. 21IRTSTHN030.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -, Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 177 knock-in CRISPR/Cas9 Rosa26 makrofag T-celle hACE2
Gene Knock-in fra CRISPR/Cas9 og cellesortering i makrofag og T-cellelinjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu,… More

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter