Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Подделка генов с помощью CRISPR/Cas9 и сортировка клеток в макрофагах и Т-клеточных линиях

Published: November 13, 2021 doi: 10.3791/62328
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

Summary

Этот протокол использует флуоресцентные репортеры и сортировку клеток для упрощения экспериментов с подделкой в макрофагах и Т-клеточных линиях. Для этих упрощенных экспериментов используются две плазмиды, а именно CRISPR/Cas9- и DsRed2-экспрессивная плазмида и гомологичная рекомбинационная донорская плазмида, экспрессирующая EBFP2, которая постоянно интегрируется в локус Rosa26 в иммунных клетках.

Abstract

Исследования функциональной геномики иммунной системы требуют генетических манипуляций, которые включают как делецию генов-мишеней, так и добавление элементов к белкам, представляющим интерес. Идентификация функций генов в моделях клеточных линий важна для открытия генов и исследования клеточных механизмов. Тем не менее, генетические манипуляции с иммунными клетками, такими как Т-клетки и клеточные линии макрофагов, с использованием CRISPR / Cas9-опосредованного knock-in, затруднены из-за низкой эффективности трансфекции этих клеток, особенно в состоянии покоя. Для модификации генов в иммунных клетках отбор лекарственной устойчивости и вирусные векторы обычно используются для обогащения клеток, экспрессирующих систему CRIPSR / Cas9, что неизбежно приводит к нежелательному вмешательству клеток. В предыдущем исследовании мы разработали двойные флуоресцентные репортеры, соединенные с CRISPR / Cas9, которые были временно выражены после электропорации. Это техническое решение приводит к быстрой делеции генов в иммунных клетках; однако выбивание генов в иммунных клетках, таких как Т-клетки и макрофаги, без использования селекции лекарственной устойчивости или вирусных векторов является еще более сложной задачей. В этой статье мы показываем, что, используя сортировку клеток для облегчения отбора клеток, временно экспрессирующих конструкции CRISPR / Cas9, нацеленные на локус Rosa26 в сочетании с донорской плазмидой, выбивание гена может быть достигнуто как в Т-клетках, так и в макрофагах без обогащения лекарственной устойчивостью. В качестве примера мы показываем, как экспрессировать человеческий ACE2, рецептор SARS-Cov-2, который отвечает за текущую пандемию Covid-19, в макрофагах RAW264.7, проводя эксперименты. Такие генные клетки могут быть широко использованы для механистических исследований.

Introduction

Иммунные клетки имеют решающее значение для защиты от патогенов. Как врожденный, так и адаптивный иммунитет необходимы для клиренса инфекционных веществ и поддержания тканевого гомеостаза1,2. Модели клеточных линий являются важными инструментами для понимания молекулярных основ иммунной системы млекопитающих; они используются в функциональных анализах in vitro, таких как те, которые моделируют активацию Т-клеток человека, и в определении функции генетических факторов в активации или ослаблении иммунных реакций3,4. Важно отметить, что иммунная система млекопитающих чрезвычайно неоднородна и, что не менее важно, огромное количество молекул контролирует дифференцировку, миграцию и функцию данной клетки типа5,6.

Кластеризованные регулярно интерширидные короткие палиндромные повторы (CRISPR) / Cas9 инструменты редактирования генома позволяют проводить генетические манипуляции с конкретными типами клеток, что облегчает функциональную аннотацию генов точным образом7,8. Несколько опубликованных протоколов описали доставку CRISPR/Cas9 в виде Cas9-направляющих комплексов РНК, известных как рибонуклеопротеины (РНК) в клетках HEK293, клеточных линиях Юрката, первичных Т-клетках9,10,макрофагах11,12,13,стволовых клетках14и других15,16. В этих протоколах маркировка генов обычно достигается путем слияния флуоресцентной метки с эндогенными белками17,18. Однако было предпринято несколько попыток использовать двойные флуоресцентные репортеры, которые совместимы с сортировкой одиночных клеток, для облегчения экспериментов19,20,особенно в иммунных клетках.

Углубленный механистический анализ, направленный на понимание функций нового генетического фактора в иммунных клетках, обычно требует специфической делеции гена клеточного типа, генетических спасательных экспериментов и, в идеале, идентификации его интеракторов. Несмотря нато,что методы оптимизации генетической делеции генов в иммунных клетках были опубликованы9,15,21,было зарегистрировано гораздо меньше методов введения аллелей с универсальными функциями для понимания иммунного ответа. Поэтому в этом протоколе мы стремимся подробно описать эффективный и высоко воспроизводимый протокол для экспрессии интересующего белка (POI) в локусе безопасной гавани Rosa26 как в человеческих, так и в мышиных иммунных клеточных линиях. Мы разработали двухцветную репортерную систему для обогащения клеток, трансфектерированных плазмидами, экспрессирующими CRISPR/Cas9 (DsRed2) и рекомбинантным шаблоном ДНК (EBFP2), который может быть выделен путем сортировки клеток. Следуя этому протоколу, мы получили несколько линий Т-клеточной линии человека Jurkat и мышиного макрофага RAW264.7 для функционального анализа плохо изученных белков.

В качестве примера мы покажем в этом протоколе, как получить детонирующие макрофаги RAW264.7, стабильно экспрессирующие ACE2 человека (рецептор SARS-Cov-2)22. Поскольку врожденные иммунные клетки участвуют в патогенезе Covid-1923,24 и ace2 человека рассматривается как основной рецептор, необходимый для проникновения вируса в клетки перед репликацией, макрофаги с подделкой ACE2 человека могут служить полезным инструментом для механистических исследований размножения вируса внутри макрофагов. Параллельно мы также представляем пример выбивания гена в локусе ROSA26 человека для экспрессии белка RASGRP1, который был слит на его аминоце с аффинным Twin-Strep-tag (OST). Т-клетки являются ключевыми клетками-мишенями в иммунной терапии, и все большее число исследований сосредоточено на манипулировании их реакцией на рак25,26. Поскольку Rasgrp1, как известно, является ключевой сигнальной молекулой после рецептора Т-клеток, а его интеракторы недостаточно хорошо выяснены27,модель ОСТ-RASGRP1 обеспечивает основу для идентификации интеракторов, регулирующих реакцию Т-клеток на опухоли и инфекцию. Взятые вместе, эти инструменты могут быть использованы для исследований Covid-19 и открытия новых молекул, взаимодействующих с Rasgrp1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Проектирование и плазмидная конструкция sgRNAs, нацеленных на Локус Rosa26

  1. Руководство по проектированию РНК вокруг желаемого места вставки
    1. Убедитесь, что место вставки для мыши Rosa26 (далее обозначается как mRosa26)для экспериментов с выбиванием расположено в первом интроне mRosa26; этот сайт был использован в предыдущих исследованиях28,29. Для экспериментов с подделкой в клетках человека убедитесь, что место введения находится в локусе ROSA26 человека (далее именуемом hROSA26),который был идентифицирован как человеческий гомолог mRosa2630.
    2. Используйте геномные последовательности мышиных и человеческих видов, полученные из Mouse Genome Informatics (http://www.informatics.jax.org/) и браузера генома Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html) соответственно. Скопируйте 50 пар оснований (bp) геномной последовательности локуса mRosa26 или hROSA26 с каждой стороны, фланкируя желаемый сайт вставки.
    3. Руководство по проектированию РНК с использованием онлайн веб-инструмента CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. Вставьте 100 bp входной последовательности из 1.1.2. Выберите две направляющие РНК с высокой оценкой специфичности, высокой эффективностью и низкой нецелевых активности. Кроме того, выбирайте РНК-направляющие с более высокими баллами Дёнча и избегайте тех, которые помечены как «неэффективные»32.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные инструменты проектирования CRISPR также ценны и общедоступны, например, инструмент проектирования Benchling CRISPR (https://benchling.com/crispr). Чтобы увеличить частоту CRISPR/Cas9-опосредованных мутированных клеток, выберите две направляющие РНК, близкие к желаемому месту вставки, когда это возможно33.
    4. Для локуса mRosa26 используйте две смежные направляющие РНК, обозначенные как mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT -3') и mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3')(рисунок 1A). Для локуса hROSA26 используют две смежные направляющие РНК, а именно hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3') и hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3')(рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Активность редактирования генома mR26-sg1 и mR26-sg2 и hR26-sg1 и hR26-sg2 оценивалась в клетках RAW264.7 и клетках Jurkat соответственно (см. Дополнительный файл, рисунок S1).
  2. Клонирование векторов экспрессии CRISPR, содержащих sgRNA, нацеленных на локус Rosa26
    1. Синтезируйте прямой и обратный олиго для одной направляющей РНК (см. Дополнительный файл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно добавить нуклеотид 'G' в начало направляющей последовательности, что помогает с экспрессией, управляемой промотором U6. Например, для клонирования вышеупомянутого mR26-sg1 прямое олиго — caccGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT, а обратное олиго — AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. Дополнительный G в прямом олиго и его дополнение в обратном олиго выделены жирным шрифтом.
    2. Клонирование синтетических олиго, соответствующих направляющим РНК, в вектор экспрессии CRISPR pX458-DsRed2, сгенерированный в нашей предыдущей работе21 (Рисунок 1C),с использованием общего протокола клонирования гРНК, разработанного Zhang's Lab (https://www.addgene.org/crispr/zhang/); однако пропустите этап очистки геля и очистите переваренный вектор с помощью набора для очистки ПЦР (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В предыдущих протоколах проводилась гелевая очистка BbsI-перевариваемого вектора; однако этот шаг отнимает много времени. В настоящем протоколе переваренный продукт очищают с использованием набора для очистки ПЦР и используют непосредственно для последующей реакции лигирования, которая обычно производит положительные колонии с сопоставимой эффективностью.
    3. Преобразовать 10 мкл продукта лигирования (этап 1.2.2) в 50 мкл компетентных клетокEscherichia coli DH5α в соответствии с инструкциями производителя. Случайным образом выберите три колонии из агаровой пластины LB с ампициллином (100 мкг / мл) и инокулируйте каждую в 3 мл среды LB ампициллином для культивирования в течение ночи.
    4. Используйте 1 мл ночной бактериальной культуры для секвенирования Сэнгера, а остальное держите при 4 °C до тех пор, пока конструкция не будет подтверждена правильной: pDsR-mR26-sg1 и pDsR-mR26-sg2 для локуса mRosa26 и pDsR-hR26-sg1 и pDsR-hR26-sg2 для локуса hROSA26.
    5. Приготовьте высокую концентрацию плазмидной ДНК (приблизительно 2 мкг/мкл) с помощью максипреп-набора для очистки трансфекционной плазмиды (см. Таблицу материалов).

2. Проектирование и построение векторов таргетинга как гомологичных шаблонов рекомбинации

  1. Разработка шаблона восстановления, направленного на гомологию
    1. Спроектируйте вектор таргетинга для конститутивного выражения POI с использованием кассеты экспрессии, оптимизированной из предыдущего исследования29,которая включает гибридный промотор CAG, сайт ограничения AscI, позволяющий клонировать кДНК POI, репортер IRES-EBFP2 и сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого лова (bGH-polyA)(рисунок 1B и дополнительный файл).
    2. Проектирование гомологических рукавов (ХА), которые разделяют гомологию с геномными последовательностями локуса mRosa26 или hROSA26. Включите ~1 кб 5' ГК, соответствующей восходящей геномной последовательности от желаемого места вставки слева от кассеты экспрессии. Аналогично, включите ~1 кб 3' ГК, соответствующей нисходящей геномной последовательности от места вставки справа от кассеты экспрессии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кассета выражений вставлена как можно ближе к местам расщепления CRISPR/Cas934. Чтобы избежать повторного разрезания целевого аллеля CRISPR/Cas9, включите нуклеотидные изменения в последовательность протоспейсер-смежных мотивов (PAM) (5'-NGG-3') в векторе нацеливания34,35.
    3. Чтобы обеспечить линеаризацию вектора таргетинга, вставьте уникальный сайт EcoRI чуть выше по течению от 5'HA и уникальный сайт BamHI чуть ниже по течению от 3' HA.
    4. Попробуйте коммерческого поставщика синтезировать векторы таргетинга и обозначить их как pKR26-iBFP и pKhR26-iBFP для mRosa26 и hROSA26 knock-in соответственно.
  2. Построение вектора таргетинга в качестве шаблона восстановления, направленного на гомологию
    1. Чтобы выразить POI, получите последовательность кДНК (кодировку) из браузера генома Ensembl и выберите транскрипт, обладающий самой длинной последовательностью белка. Например, кДНК гена ACE2 человека — ЭТО ACE2-202 ENST00000427411.2, а кДНК гена RASGRP1 человека — RASGRP1 ENSG00000172575.
    2. Синтез кДНК POI с помощью коммерческого поставщика. Также возможно клонирование кДНК с помощью амплификации ПЦР (не описано здесь). Поместите последовательность GGCGCGCCACC (5' - 3'), которая включает в себя сайт ограничения AscI (курсив и жирный шрифт) и сайт инициирования консенсусного перевода Козака (подчеркнуто), непосредственно перед кодоном инициации ATG кДНК и другим сайтом ограничения AscI (5'- GGCGCGCC -3') после стоп-кодона кДНК.
    3. Переварить синтезированную последовательность с помощью AscI и очистить с помощью набора для очистки ПЦР, предназначенного для очистки фрагментов ДНК после рестрикционных перевариваний, следуя инструкциям производителей (см. Таблицу материалов).
    4. Вставьте очищенную кДНК в AscI-линеаризованный магистраль-вектор pKR26-iBFP или pKhR26-iBFP с использованием ДНК-лигазы T4 в соответствии с инструкциями производителя.
    5. Проверьте конечный вектор таргетинга, pKR26-POI-iBFP или pKhR26-POI-iBFP, путем секвенирования. Используйте maxiprep для очистки проверенных конструкций в соответствии с протоколом производителя.
    6. Переваривайте целевой вектор с помощью EcoRI или BamHI и очищайте продукт пищеварения с помощью набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя. Храните линеаризованный вектор нацеливания (~0,8 мкг/мкл) при -20 °C до электропорации.

3. Электропорация макрофагов и Т-клеточных линий

  1. Подготовка клеточных культур к электропорации
    1. Подготовьте Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 с добавлением 10% фетальной бычий сыворотки (FBS) в качестве полной питательной среды для Т-клеток Jurkat. Приготовьте модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM) с 10% FBS для культивирования макрофагов RAW264.7. Дополняйте все полные питательные среды 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Pen/Strep), за исключением сред, используемых для постпрефекционной инкубации перед сортировкой клеток.
    2. Выполнить субкультурирование Т-клеток RAW264.7 и Jurkat в соответствии с инструкциями поставщика (см. Таблицу материалов). При субкультурировании клеток RAW264.7 используют раствор трипсина-ЭДТА (0,25%) для отсоединения клеток. Используйте FBS, дополненный 10% (v/v) DMSO в качестве криоконсерваторной среды для клеток RAW264.7 и Jurkat.
    3. Собирайте клетки при 250 × г в течение 5 мин для макрофагов RAW264.7 и 90 × г в течение 8 мин для Т-клеток Юрката. Затем промыть 5-10 мл 1× DPBS (без ионов Ca2+ или Mg2+). Удалите DPBS.
    4. Повторно суспендируют ячейку гранулы с использованием 2 мл 1× DPBS. Используйте 10 мкл клеток и смешайте с равным объемом 0,2% трипан синего цвета, чтобы оценить количество и жизнеспособность клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клеточная культура обладает жизнеспособностью >90% в день трансфекции.
    5. Для одного эксперимента с выбиванием выполните электропорацию с наконечниками нуклеофекции 10 мкл с пятью повторениями. Рассчитайте объем, необходимый для 2,0 × 106 ячеек и гранулируйте ячейки путем центрифугирования. Снова промыть гранулу ячейки с помощью 1× DPBS, как описано на этапе 3.1.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании наконечников нуклеофекции 10 мкл на электропорацию необходимо 4,0 ×10 5 ячеек. Соответственно, подготовьте не менее 2,0 × 106 клеток для одного эксперимента с выбиванием.
    6. Подготовьте 24-скважинную пластину с 0,5 мл полной питательной среды (приготовленной на этапе 3.1.1) на скважину без pen/strep и предваренную в инкубаторе с 37 °C.
  2. Электропорация компонентов CRISPR/Cas9 и вектор нацеливания
    1. Включите электропорационную систему. Используйте параметры электропорации, оптимизированные в предыдущем исследовании21: 1 400 В/20 мс/2 импульса для макрофагов RAW264.7 и импульсы 1350 В/20 мс/2 для Т-клеток Юрката.
    2. Учитывая потери пробы в результате пипетирования, приготовьте электропорационную смесь 55 мкл в стерильной микроцентрифужной трубке 1,5 мл, содержащей 2,5 мкг каждого вектора CRISPR/Cas9, 2,4 мкг линеарализованного вектора нацеливания и буфер ресуспенсии R.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экономии времени электропорационную смесь можно приготовить во время центрифугирования (этап 3.1.5).
    3. Повторное суспендирование 2,0 × 106 ячеек (полученных на этапе 3.1.5) в электропорационной смеси 55 мкл со ступени 3.2.2.
    4. Аспирировать смесь ячейка/электропорация со ступени 3.2.3, используя наконечник нуклеофекции 10 мкл с пипеткой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время пипетки избегайте введения пузырьков воздуха, которые могут привести к отказу электропорации.
    5. Добавьте образец в пробирку, заполненную 3 мл буфера Е из набора для электропорации.
    6. Примените параметры электропорации для двух типов ячеек, как описано на этапе 3.2.1.
    7. Перенесите образец в одну скважину из 24-скважинной плиты с предварительной проваренной средой с этапа 3.1.6.
    8. Повторите шаги 3.2.4-3.2.7 для остальных четырех повторений, а также только для целевого вектора и только вектора выражения CRISPR.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение наконечника нуклеофекции и трубки при переходе на другой тип клетки/плазмидную ДНК.
    9. Культивируйте трансфектированные клетки в течение 48-72 ч, чтобы обеспечить восстановление после электропорации и экспрессию компонентов CRISPR/Cas9 перед анализом проточной цитометрии или флуоресцентной активацией сортировки клеток (FACS). Исследуйте экспрессию DsRed2 с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного красным каналом через 24 ч после трансфекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Преимущество мониторинга флуоресцентных ячеек DsRed2 заключается в том, что можно оценить эффективность электропорации и предсказать пригодность для дальнейшей сортировки ячеек.

4. Сортировка клеток для выделения мнимых выбивающихся клеток

  1. Перед сортировкой FACS промыть трансфекированные клетки один раз полной питательной средой. Грануляционные ячейки путем центрифугирования, как описано на этапе 3.1.3, и повторного суспендирования гранулы в 500 мкл свежей среды.
  2. Установите сортировщик ячеек (расположенный в шкафу биобезопасности) с соплом 85 мкм и низким расходом. Выберите режим «одноячеечные» для сортировки и проверьте эффективность и точность сортировки с одной ячейкой, отсортизив 20-30 ячеек на крышке 96-скважинной микропластины. Одна капля, локализованная в центре каждой скважины, указывает на правильную настройку прибора.
  3. Перенесите клеточную суспензию со ступени 4.1 в стерильные пробирки FACS и добавьте SYTOX Red Dead Cell Stain до конечной концентрации 1 нМ.
  4. Анализируйте образцы на сортировщике ячеек. SYTOX Red и EBFP2 возбуждаются 405-нм лазером и обнаруживаются каналами V450/BV421 и APC соответственно. DsRed2 возбуждается 488-нм лазером и обнаруживается полиэтиленовой канальной камерой. Используйте неперетефированные клетки и EBFP2- и DsRed2-одиночные положительные клетки в качестве контроля для спектральной компенсации.
  5. Отсортируйте 10 отдельных клеток в каждую скважину 96-скважинной микропластины, содержащей 150 мкл на скважину предварительно нагретой полной питательной среды. Используйте микропластины с круглым дном для культивирования клеточных линий суспензии, таких как Т-клетки Юрката и микропластины с плоским дном для адгезивных макрофагов RAW264.7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сортировка 10 клеток на скважину является оптимизированной стратегией для улучшения выживаемости клеток и минимизации количества 96-скважинных микропластин, которые необходимо засеять, и количества образцов, которые необходимо отсеять с помощью проточной цитометрии и генотипирования; если сортировка только одной ячейки на скважину, то требуется посев большего количества микропластин, чтобы увеличить шансы на получение правильно отредактированных ячеек.

5. Скрининг и валидация положительных нокаут-клеток

  1. Скрининг клеток-кандидатов методом проточной цитометрии
    1. Инкубируют клетки со ступени 4.5 в течение 10-15 дней и добавляют полную питательную среду каждые 3 дня, чтобы заменить жидкость, потерянную в результате испарения. Для Т-клеток Jurkat перенесите клетки, выращенные в круглой нижней 96-скважинной пластине, на плоскую нижнюю пластину для оптимизации пролиферации клеток.
    2. Перенесите расширенные отсортированные ячейки на 48-скважинные пластины для дальнейшего расширения.
    3. Когда клетки близки к слиянию, используйте половину культуры для скрининга экспрессии EBFP2 с помощью проточной цитометрии(рисунок 3). В норме половина культуры в 48-скважинной пластине после слиженного роста приравнивается к 0,5-1,0 × 105 клеток, что достаточно для анализа одного образца методом проточной цитометрии.
    4. Переложите оставшиеся клетки на 24-ю пластины для дальнейшей пролиферации.
    5. Сохраните популяции клеток-кандидатов, обладающих высоким процентом EBFP2-положительных клеток для дальнейших экспериментов по генотипированию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку 10 клеток отсортированы в каждую скважину 96-скважинной микропластины, возможно, что клетки будут расти с клетками, которые не экспрессируют ген нокаута. Поэтому нормально выполнять дополнительный раунд сортировки клеток, чтобы отделить EBFP2-положительные клетки от отрицательных клеток.
  2. Скрининг клеток-кандидатов методом ПЦР и секвенирования
    1. Соберите 2 × 105 ячеек-кандидатов. Извлеките геномную ДНК с помощью набора для подготовки ДНК (см. Таблицу материалов).
    2. Чтобы убедиться, что точное гомологическое восстановление (HDR) произошло в локусе mRosa26, а не на случайных участках в геноме клеток-кандидатов, выполните ПЦР с праймерами, охватывающими каждую сторону HAs(рисунок 4). Выберите один праймер, расположенный в геномной области вне вектора нацеливания (внешнее олиго), и другой праймер, расположенный внутри вектора нацеливания (внутреннее олиго).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогичная конструкция используется для проверки HDR в локусе hROSA26. Праймеры ПЦР также могут быть легко разработаны для обнаружения введения последовательности POI. Кроме того, генотипы аллелей дикого типа и выбивки могут быть одновременно обнаружены с помощью ПЦР с тремя праймерами (см. Дополнительный файл, рисунок S2).
    3. Клонируйте положительные продукты ПЦР с помощью набора для быстрого клонирования (см. Таблицу материалов). Превратите реакционную смесь в dh5α компетентные клетки.
    4. Случайным образом выберите 8-10 отдельных бактериальных колоний на трансформацию и последовательности продуктов ПЦР с этапа 5.2.3 путем секвенирования Сэнгера.
  3. Валидация положительных нокаутных клеток иммуноблот-анализом и аффинной очисткой
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки-кандидаты подвергаются иммуноблот-анализу для валидации введения POI или аффинной очистке (AP) для исследований белково-белкового взаимодействия.
    1. Выполните иммуноблотический анализ в соответствии с инструкциями производителя антител. Смотрите Таблицу материалов для получения информации об использовании первичных антител и вторичных антител.
    2. Подвергайте лизаты выбиваемых клеток, экспрессировающих POI с ОСТ-метками, AP с использованием штапик-тактиновых бусин Sepharose в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
    3. Обнаружение хемилюминесценции с помощью томобра.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Следуя описанному выше протоколу для проведения экспериментов в локусе mRosa26 с использованием мышиных макрофагов RAW264.7, мы разработали вектор нацеливания для экспрессии человеческого ACE2, рецептора для вируса SARS-Cov-2(рисунок 2A). Используя аналогичную конструкцию, мы сгенерировали человеческие Т-клетки Jurkat с выбиванием ОСТ-помеченного белка слияния RASGRP1(рисунок 2C). После трансфекции трех плазмид, две из которых использовались для экспрессии CRISPR/Cas9 (DsRed2; pDsR-mR26-sg1 и pDsR-mR26-sg2 для mRosa26 knock-in; pDsR-hR26-sg1 и pDsR-hR26-sg2 для hROSA26-sg2 для подделки hROSA26) и еще одна, используемая в качестве шаблона ДНК для гомологичной рекомбинации (EBFP2), двойные положительные клетки, экспрессирующие два флуоресцентных репортера, были отсортированы в 96-скважинную пластину. Из ячеек RAW264.7, отсортированных с использованием режима сортировки одной ячейки, 0,91% были DsRed2+ EBFP2+,но 10 ячеек были собраны в каждую скважину(рисунок 2B). Т-клетки Юрката имели более высокую эффективность трансфекции, а процент двойных положительных клеток составил 7,91% в этом репрезентативном эксперименте, демонстрируя успешное выбивание белка слияния OST-RASGRP1(рисунок 2D).

На следующем этапе проточная цитометрия использовалась для скрининга скважин-кандидатов с EBFP2-положительными клетками. Репрезентативные гистограммы показали, что существуют очевидные EBFP2-положительные популяции(рисунок 3). Примечательно, что нок-ин клетки не экспрессируют DsRed2, когда проточная цитометрия проводилась через две недели после сортировки клеток.

Для распознавания точных выбивания и случайных вставок геномную ДНК из EBFP2-положительных клеток дополнительно тестировали путем выполнения ПЦР с праймерами, распознающими геномную последовательность, внешнюю по отношению к ГА целевого вектора и конкретной области внутри кассеты экспрессии(рисунки 4A и 4B). Анализ последовательности этих продуктов ПЦР подтвердил возникновение HDR на целевом участке mRosa26 (рисунок 4C). Та же стратегия генотипирования может быть применена для проверки точной вставки кассеты экспрессии в локусhROSA26 Т-клеток Юрката.

Чтобы получить чистую популяцию hACE2-экспрессивных клеток RAW264.7, мы дополнительно отсортировали клетки и подтвердили наличие флуоресцентных репортеров после расширения, используя клетки дикого типа в качестве контроля(рисунок 5A). Расширенные клетки были положительными на EBFP2, а белок hACE2 легко обнаруживался в мышиных макрофагах RAW264.7(рисунок 5B и 5C). Аналогичным образом, мы проверили экспрессию флуоресцентных репортеров и белка OST-RASGRP1 в Т-клетках человека Jurkat после скрининга и второго раунда сортировки клеток(рисунок 6A и 6B). Кроме того, аффинную очистку белка OST-RASGRP1 проводили с использованием коммерчески доступных шариков. Мы обнаружили большее количество белка RASGRP1 в общих клеточных лизатах клеток Jurkat, чем в клетках дикого типа; Нокаутирующие клетки RASGRP1 Jurkat использовались в качестве контрольных элементов(рисунок 6C). После очистки с использованием метки OST только выбивные образцы имели обнаруживаемый RASGRP1(рисунок 6D).

Figure 1
Рисунок 1. Стратегия нацеливания генов для генерации клеточных линий mRosa26/hROSA26, чрезмерно экспрессирующих интересующий белок. (A) mRosa26-специфические направляющие последовательности РНК-таргетирования и протоспейсерные смежные мотивы (PAMs) в желаемом месте вставки обозначены синими и красными буквами соответственно. Cas9 обычно расщепляет 3-4 bp вверх по течению от последовательности PAM, что обозначено зелеными стрелками. Вектор таргетинга используется в качестве шаблона для гомологического восстановления (HDR), ведущего к точной вставке кассеты экспрессии в геном мыши или человека. Каждая из последовательностей 1 кб вверх и вниз по течению от желаемого целевого сайта используется в качестве 5' и 3' гомологических рычагов (ХА) в векторе целеуказания. ГА разделены экспрессией кассеты, состоящей из промотора CAG, последовательности кДНК интересующего белка (POI) с OST-меткой, репортера IRES-EBFP2 и сигнала bGH-polyA (pA). Сайт ограничения AscI используется для клонирования POI, а EcoRI и BamHI используются для линеаризации вектора таргетинга. Стратегия для CRISPR/Cas9-опосредованного нокдауна в локусе hROSA26 аналогична. (B) Диаграмма локуса ROSA26 человека. Последовательности нацеливания hR26-sg1 и hR26-sg2 обозначены синими буквами, а соответствующие последовательности PAM — красным. (C) Схема вектора экспрессии CRISPR pX458-DsRed2, который содержит человеческую U6-управляемую U6-управляемую кассету экспрессии sgRNA и флуоресцентную репортерную кассету Cas9-T2A-DsRed2. Два сайта ограничения BbsI позволяют клонировать направляющую РНК. U6, промотор РНК-полимеразы III человека U6; sgRNA, химерная одновещавая РНК; CBh, гибридный промотор куриного β-актина; NLS, сигнал ядерной локализации; T2A, вирус Thosea asigna 2A самосращивающийся пептид; bGH-pA, сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого лова. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Одноклеточная сортировка клеток RAW264.7 и Jurkat трансфекцией векторами CRISPR/Cas9 и целевыми векторами для гомологичной рекомбинации. Целевые векторы, используемые для стабильной экспрессии генов в клетках RAW264.7 (A) и Jurkat (C).  Репрезентативные цитометрические графики макрофагов RAW264.7 мыши (B) и Т-клеток человека Юрката (D), трансфектированных векторами CRISPR/Cas9, экспрессирующими репортер DsRed2 и вектор таргетинга, экспрессирующий репортер EBFP2. Клетки, совместно экспрессировывающие DsRed2 и EBFP2, подвергали сортировке клеток и культивировали для расширения; Числа, прилегающие к очерченным областям, указывают на процент клеток в каждом затворе, а неперераженные клетки использовались в качестве отрицательного контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Скрининг выбиваемых клеток путем обнаружения экспрессии EBFP2. Проточный цитометрический анализ макрофагов EBFP2+ и DsRed2+ RAW264.7 (A) и Т-клеток Юрката (B) через 14 дней после электропорации. В гистограммах интенсивность флуоресценции (FI) ячеек EBFP2+ или DsRed2+ отображается на оси X, а количество событий в каждом флуоресцентном канале отображается на оси Y. (A) Экспрессия EBFP2 и hACE2 была обусловлена тем же промоутером в локусе Rosa26 в мышиных макрофагах RAW264.7. (B) В клетках Юрката экспрессия OST-RASGRP1 связана с экспрессией EBFP2 в локусе ROSA26 человека. Через 14 дней после электропорации проточный цитометрический анализ выявил почти ноль клеток DsRed2+ среди отсортированных клеток. Клетки дикого типа (WT) использовались в качестве отрицательного контроля, а KI расшифровывается как knock-in клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4. Скрининг клеток-кандидатов методом ПЦР и секвенирования. (A) Стратегия создания выбиваемых ячеек hACE2. Положения праймеров ПЦР, используемых для различения точного HDR и случайного введения, обозначены зелеными стрелками. (B) Генотипирование ПЦР пяти клеток-кандидатов (#4, #15, #22, #25 и #43), которые были идентифицированы с помощью скрининга проточной цитометрии для экспрессии EBFP2, как показано на рисунке 3,показали, что как 5'-переход (1472 bp), так и 3'-переход (1472 bp), охватывающие гомологические рукава, были правильными. М, лестница ДНК; WT, элемент управления RAW264.7 дикого типа; H2O, отрицательный контроль. (C) Секвенирование Сэнгером продуктов ПЦР из B выявило успешное вбивание кассеты экспрессии hACE2 в локус mRosa26 без мутаций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5. Валидация успешного вбивания кассеты экспрессии hACE2 в локус mRosa26 в макрофагах RAW264.7. (A) Макрофаги WT RAW264.7 использовались в качестве отрицательного контроля для проточного цитометрического анализа. (B) Чтобы отделить EBFP2-положительные клетки от отрицательных клеток, был выполнен дополнительный раунд сортировки клеток для получения популяции, состоящей почти на 100% из EBFP2+ knock-in клеток, обозначенных как hACE2 KI-клетки. Экспрессия DsRed2 также была изучена, чтобы убедиться, что плазмида CRISPR/Cas9 не была интегрирована в геном макрофагов RAW264.7. В гистограммах интенсивность флуоресценции (FI) ячеек EBFP2+ или DsRed2+ отображается на оси X, а количество событий в каждом канале флуоресценции отображается на оси Y. (C) Обнаружение экспрессии hACE2 с помощью иммуноблот-анализа с использованием моноклонального антитела ACE2 против человека кролика. Экспрессия hACE2 наблюдалась в клетках из нескольких скважин (#4, #15, #22, #25 и #43). Макрофаги WT RAW264.7 использовались в качестве отрицательного контроля, а GAPDH использовался в качестве контроля нагрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6. Валидация успешного вбивания кассеты экспрессии OST-RASGRP1 в локус hROSA26 в Т-клетках Юрката. (A) WT Т-клетки Юрката использовались в качестве отрицательного контроля для проточного цитометрического анализа. (B) EBPF2+ субпопуляции клеток Jurkat были обогащены дополнительными раундами сортировки клеток и расширены; эти ячейки были обозначены как клетки OST-RASGRP1 KI. Выбивающие клетки анализировали с помощью проточной цитометрии и не сохранили DsRed2-экспрессирующий вектор. В гистограммах интенсивность флуоресценции (FI) ячеек EBFP2+ или DsRed2+ отображается на оси X, а количество событий в каждом флуоресцентном канале отображается на оси Y. (C) Обнаружение экспрессии OST-RASGRP1 в двух независимых клетках (No 1 и No 2) путем иммуноблотт-анализа с использованием антитела против RASGRP1. В качестве контроля использовались клетки WT Jurkat и RASGRP1-нокаут Jurkat, а в качестве контроля нагрузки использовался β-актин. (D) OST-опосредованная аффинная очистка использовалась для проверки экспрессии OST-RASGRP1 с использованием нокаут-клеток RASGRP1 в качестве отрицательного контроля. Иммуноблотический анализ равных количеств белков из клеточных лизатов, которые либо подвергались аффинной очистке на бусинах Strep-Tactin Sepharose (аффинная очистка), либо непосредственно анализировались (Total lysates) и исследовались антителами RASGRP1 или GAPDH (контроль нагрузки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл: Вспомогательные рисунки, таблицы и последовательности Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В наших экспериментах мы продемонстрировали, как выполнять редактирование в иммунных клетках от конструкции до скрининга и валидации клеток с использованием человеческих Т-клеток Jurkat и мышиных макрофагов RAW264.7 в качестве примеров. Как Т-клеточные, так и макрофаговы клеточные линии устойчивы к трансфекции36,37; однако проблема низкой эффективности доставки CRISPR/Cas9 может быть преодолена с помощью флуоресцентных репортеров в сочетании с сортировкой ячеек. Этот протокол подходит для экспериментов по спасению генов и экспериментов по взаимодействию белка и белка, но он не может быть применен к изучению регуляторных последовательностей ДНК, таких как сайты связывания факторов транскрипции, поскольку протокол был разработан для модификации локуса Rosa26.

Двойные флуоресцентные репортеры помогали crispr/Cas9 в редактировании
Мы успешно применили двойную флуоресцентную репортерную систему для временной экспрессии независимых наборов векторов CRISPR/Cas9 в иммунных клетках, что привело к делеции больших фрагментов ДНК в предыдущих исследованиях21. Мы разработали инструмент таргетирования CRISPR/Cas9 с использованием флуоресцентного белка DsRed2 в качестве репортера и дополнительного спектрально отчетливого флуоресцентного белка для отслеживания доставки шаблона ДНК для модификации нокдауна. Чтобы сделать возможной модификацию аллеля, мы использовали флуоресцентный белковый репортер EBFP2, который не имеет спектрального побочного эффекта с RFP (DsRed2 в нашем случае), для мониторинга трансфекции донорской ДНК, служащей шаблоном во время гомологичной рекомбинации. Для оптимизации кассеты, экспрессии POI и флуоресцентного репортера, была введена последовательность IRES для получения независимых белков. В нашем предыдущем исследовании мы отметили, что остаточные аминокислоты из линкера P2A или T2A, оставшиеся после посткрипционного расщепления, влияют на локализацию белка на поверхности клетки. Последовательность IRES не оставляет таких остаточных аминокислот. Как описано в предыдущем исследовании, IRES привел к более высоким уровням флуоресцентного репортера после экспрессии белка Cas9, управляемого промотором CAG38.

Плазмида CRISPR/Cas9 «все-в-одном»
Различные форматы и комбинации системы CRISPR/Cas9 были описаны в предыдущих исследованиях, таких как трансфекция Cas9 в виде мРНК или белка вместе с химически синтезированными sgRNAs39. Комплексы CRISPR/Cas9 RNP также были доставлены в клетки млекопитающих; эта стратегия дает преимущества более раннего начала нуклеазной активности и более короткого срока полураспада; однако маркировка РНК менее экономически эффективна по сравнению с построением плазмиды «все-в-одном». В наших предыдущих исследованиях мы обнаружили, что использование сортировки одиночных клеток для выделения тех редких клеток, экспрессирующих CRISPR / Cas9 (DsRed2 положительный) и белок (положительный EBFP2), гораздо менее сложно, чем использование доставки RNP, и легко подготовить плазмиды. Это правда, что этот протокол опирается на сортировку одной ячейки. Но наш протокол прост в исполнении и дает успешные модификации с высокой воспроизводимостью.

Выражение POI из локуса Rosa26
В литературе имеется множество отчетов, описывающих методы маркировки эндогенных белков флуоресцентными репортерами с использованием редактирования CRISPR/Cas940,41,42. Преимущества эндогенной маркировки заключаются в том, что целесообразно определить субклеточную локализацию и выполнить in vivo отслеживание эндогенного белка. Однако проблемы могут возникнуть, если невозможно спроектировать соответствующую направляющую РНК CRIPSR в эндогенном локусе. Здесь мы разработали альтернативный метод вбивания путем включения POI-IRES-EBFP2 в геномный локус безопасной гавани Rosa26,который преодолевает ограничения поиска соответствующих направляющих для позиционирования эндогенных меток.

Мы суммируем несколько ключевых моментов, которые необходимо учитывать в ходе экспериментов для обеспечения технической воспроизводимости. Во-первых, сортировщик клеток должен иметь фиолетовый лазер 405 нм для возбуждения EBFP2 и 488 нм синий лазер или альтернативно 561 нм желтый лазер для возбуждения DsRed2. При таких конфигурациях EBFP2 и DsRed2 могут быть обнаружены без спектрального побочлега, что может привести к ложноположительным результатам. В наших экспериментах доля DsRed2+ EBFP2+ двойных положительных клеток составляла всего 0,9%; поэтому для успеха экспериментов необходимо было отсеять надлежащую популяцию. Второй раунд сортировки был выполнен для защиты EBFP2+ положительных клеток, с последующей ПЦР-валидацией. Кроме того, для обнаружения белка предпочтительно вводить белковую метку, такую как OST или другой тип метки. Нокаут гена до экспериментов с локусом Rosa26 дает хорошую возможность оценить, обладает ли антитело желаемой специфичностью. Когда специфичность антител недостаточна, обнаружение белка-нокдауна должно быть выполнено после вытягивания через белковую метку. Наконец, во время скрининга FACS клеток, экспрессирующих нокаутирующий аллель, интенсивность EBFP2 может быть использована для оценки наличия двух копий или одной копии аллеля.

Приложений
В этом протоколе мы описали модификацию RASGRP1, ключевой молекулы, участвующей в активации Т-клеток27. Сначала мы получили RASGRP1-нокаутные клетки Юрката, которые могут быть использованы для исследований потери функции, и мы создали дополнительные клетки Юрката, экспрессирующие OST-RASGRP1 в локусе hROSA26. Клетки Юрката являются наиболее используемой клеточной линией человека для изучения биологии Т-клеток43. Из-за успеха иммунотерапии в предотвращении истощения Т-клеток у больных раком, иммунологи и биологи рака имеют большой интерес к модификации клеток Юрката для функциональных исследований молекул-кандидатов. Также примечательно, что Т-клеточная линия Юрката обычно используется для рассечения сигнальных путей, но существуют ограничения на использование этой клеточной линии, так как клетки Юрката являются плохими продуцентами IFN-γ при стимуляции44. В предыдущих исследованиях использовались как эндогенная модификация локуса45, так и генная инженерия в локусе46 hROSA26 для проведения экспериментов с подделкой в клетках Юрката человека. Обе стратегии имеют свои преимущества; путем модификации эндогенного локуса белок предположительно экспрессируется на «физиологическом» уровне. Модификация в локусе hROSA26 дает предсказуемые результаты, потому что альтернативное сплайсинг мРНК избегается, и обилие модифицированного белка также легко обнаруживается. Другие геномные безопасные гавани, такие как аденоассоциированный вирусный сайт 1(AAVS1)и хемокиновый (CC мотив) рецептор 5(CCR5)47,48, заслуживают дальнейшего изучения.

В нашем предыдущем исследовании, когда Vav1-OST экспрессировался на более высоких уровнях в локусе Rosa26 мыши в клетках RAW264.7, которые очень часто используются клетками макрофагов, мы смогли обнаружить его взаимодействие с низко экспрессируемыми молекулами Vav3 из-за высокого уровня белка приманки и высокой эффективности очисткисродства OST 13. Мы также описали эксперименты по созданию клеточной линии макрофага, стабильно экспрессировающей hACE2, рецептор для SARS-CoV-2, в котором гарантируется обильная экспрессия. В базе данных секвенирования одноклеточной РНК мышиный Ace2 экспрессируется в макрофагах легких, и разработанная ими генетическая клеточная модель, экспрессивная hACE2, может быть полезна для исследований макрофагов во время инфекции SARS-CoV-2.

Другие соображения
Этот протокол предназначен для идентификации выбивающихся клеток, которые экспрессируют POI с помощью проточного цитометрического анализа флуоресцентного репортера, в нашем случае репортера EBFP2. Однако, когда поверхностные маркировочные антитела, обнаруживаемые FACS, доступны для поверхностного белка49,нет необходимости использовать репортерную систему50. Клеточные линии Т-клеток и макрофагов, а также примеры помеченных ОСТ белков, используемых для интерактомных исследований, в основном используются для сигнальных исследований, и большинство этих сигнальных молекул локализованы в цитозоле или ядрах клеток. Таким образом, флуоресцентный репортер может потребоваться для идентификации желательных выбиваемых клеток.

Важно отметить, что этот протокол был разработан для клеточных линий, и применение к первичным иммунным клеткам, таким как Т-клетки, моноциты / макрофаги, не было подтверждено. Из-за ограниченной способности клеток к пролиферации мы не рекомендуем этот протокол для использования с первичными иммунными клетками. Поскольку флуоресцентный репортер EBFP2 экспрессировался под тем же промотором, что и ген нокаута или POI с использованием элемента IRES, мы не наблюдали клеток, которые экспрессировали флуоресцентный репортер в отсутствие гена выбивания. Мы подозреваем, что восстановление флуоресцентных белково-экспрессивных клеток сильно зависит от успеха гомологичной рекомбинации. Как сообщалось в предыдущем исследовании, утомительно сортировать, расширять и идентифицировать правильные выбивающие клетки путем сортировки одной ячейки, когда эффективность выбивания очень низкая42,что также объясняет, почему нам нужно было сортировать клетки оптом, чтобы улучшить показатель успеха.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим центр проточной цитометрии Медицинского университета Синьсян. Развитие такой технологии поддерживается грантами NSFC, 81601360 LZ, 81471595 и 32070898 YL. Работа также поддерживается Фондом Образовательного комитета Хэнань No 21IRTSTHN030.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -, Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 177 knock-in CRISPR/Cas9 Rosa26,макрофаг Т-клетки hACE2
Подделка генов с помощью CRISPR/Cas9 и сортировка клеток в макрофагах и Т-клеточных линиях
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu,… More

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter