Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Genknackning av CRISPR/Cas9 och cellsortering i makrofag och T-cellinjer

Published: November 13, 2021 doi: 10.3791/62328
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

Summary

Detta protokoll använder fluorescerande reportrar och cellsortering för att förenkla inknöjande experiment i makrofag och T-cellinjer. Två plasmider används för dessa förenklade knock-in experiment, nämligen en CRISPR/Cas9- och DsRed2-uttrycker plasmid och en homolog rekombination donatorplasmid uttrycker EBFP2, som är permanent integrerad vid Rosa26 locus i immunceller.

Abstract

Funktionella genomikstudier av immunsystemet kräver genetiska manipuleringar som innebär både radering av målgener och tillsats av element till proteiner av intresse. Identifiering av genfunktioner i cellinjemodeller är viktigt för genupptäckt och utforskning av cell inneboende mekanismer. Genetiska manipuleringar av immunceller som T-celler och makrofagcelllinjer med CRISPR/Cas9-medierad knock-in är dock svåra på grund av den låga transfectioneffektiviteten hos dessa celler, särskilt i ett quiescent tillstånd. För att modifiera gener i immunceller används läkemedelsresistensval och virusvektorer vanligtvis för att berika för celler som uttrycker CRIPSR / Cas9-systemet, vilket oundvikligen resulterar i oönskade ingrepp av cellerna. I en tidigare studie designade vi dubbla fluorescerande reportrar kopplade till CRISPR/Cas9 som övergående uttrycktes efter elektroporation. Denna tekniska lösning leder till snabb genborttagning i immunceller; Genknackning i immunceller som T-celler och makrofager utan användning av läkemedelsresistensval eller virusvektorer är dock ännu mer utmanande. I den här artikeln visar vi att genom att använda cellsortering för att underlätta val av celler som övergående uttrycker CRISPR / Cas9-konstruktioner riktade mot Rosa26-locus i kombination med en donatorplasmid, kan genknackning uppnås i både T-celler och makrofager utan läkemedelsresistensberikning. Som ett exempel visar vi hur man uttrycker mänskliga ACE2, en receptor av SARS-Cov-2, som är ansvarig för den nuvarande Covid-19-pandemin, i RAW264.7 makrofager genom att utföra knock-in experiment. Sådana genknackning celler kan användas i stor utsträckning för mekanistiska studier.

Introduction

Immunceller är kritiska för försvar mot patogener. Både medfödd och adaptiv immunitet krävs för clearance av infektionsmedel och underhåll av vävnad homeostas1,2. Cellinjemodeller är viktiga verktyg för att förstå de molekylära grunderna i däggdjurens immunsystem; De används i funktionella in vitro-analyser, såsom modellering av aktivering av mänskliga T-celler, och för att bestämma funktionen hos genetiska faktorer för att aktivera eller dämpa immunsvar3,4. Det är viktigt att notera att däggdjurens immunsystem är enormt heterogent och, lika viktigt, ett stort antal molekyler kontrollerar differentiering, migration och funktion hos en viss cell typ5,6.

Grupperade regelbundet interrymda korta palindromiska upprepningar (CRISPR)/Cas9 genomredigeringsverktyg möjliggör genetisk manipulering av specifika celltyper, vilket underlättar funktionell anteckning av gener på ett exakt sätt7,8. Flera publicerade protokoll har beskrivit leveransen av CRISPR/ Cas9 i form av Cas9-guide RNA-komplex som kallas ribonukleoproteiner (RNPs) i HEK293-celler, Jurkat-cellinjer, primäraT-celler 9,10, makrofager11,12,13, stamceller14och andra15,16. I dessa protokoll uppnås genmärkning vanligtvis genom att en fluorescerande tagg smälts till endogenaproteiner 17,18. Men få försök har gjorts att använda dubbla fluorescerande reportrar, som är kompatibla med enkelcellssortering, för att underlätta knock-in experiment19,20, särskilt i immunceller.

Djupgående mekanistiska analyser som syftar till att förstå funktionerna hos en ny genetisk faktor i immunceller kräver i allmänhet cellliknande specifik radering av en gen, genetiska räddningsexperiment och helst identifiering av dess interagerare. Även om metoder för optimering av genetisk borttagning av gener i immunceller har publicerats9,15,21, har mycket färre metoder rapporterats för att införa knock-in alleler med mångsidiga funktioner för att förstå immunsvaret. Därför, i detta protokoll syftar vi till att beskriva i detalj ett effektivt och mycket reproducerbart protokoll för att uttrycka ett protein av intresse (POI) vid safe harbor locus Rosa26 i både mänskliga och murin immun cellinjer. Vi designade ett tvåfärgs reportersystem för att berika för celler transfekterade med plasmider som uttrycker CRISPR / Cas9 (DsRed2) och en rekombinant DNA-mall (EBFP2), som kan isoleras genom cellsortering. Efter detta protokoll fick vi flera knock-in linjer av den mänskliga T cellinjen Jurkat och murin makrofag RAW264.7 för funktionella analyser av dåligt studerade proteiner.

Som ett exempel visar vi i detta protokoll hur man får knock-in RAW264.7 makrofager som stabilt uttrycker mänskliga ACE2 (en receptor av SARS-Cov-2)22. Eftersom medfödda immunceller är involverade i patogenesen vid Covid-1923,24 ochhuman ACE2 betraktas som en viktig receptor som krävs för viralt inträde i celler före replikering, makrofager med knock-in av mänskliga ACE2 kan fungera som ett användbart verktyg för mekanistiska studier av viral multiplikation inuti makrofager. Parallellt presenterar vi också ett exempel på knock-in av en gen vid den mänskliga ROSA26 locus för att uttrycka RASGRP1 proteinet, som smältes vid dess amino ändstation med en affinitet Twin-Strep-tag (OST). T-celler är viktiga målceller i immunterapier, och ett ökande antal studier har fokuserat på manipulation av deras lyhördhet för cancer25,26. Eftersom Rasgrp1 är känt för att vara en viktig signalmolekyl nedströms T-cellsreceptorn och dess interagerare inte är välklarlagd 27, ger OST-RASGRP1-in-modellen grunden för att identifiera interactorer som reglerar T-cells svar på tumörer och infektion. Sammantaget kan dessa verktyg användas för Covid-19-studier och upptäckt av nya molekyler som interagerar med Rasgrp1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design och Plasmid konstruktion av sgRNAs som riktar sig till Rosa26 Locus

  1. Designguide RNAs runt önskad insättningsplats
    1. Se till att införingsplatsen för musen Rosa26 (nedan kallad mRosa26)inknårsexperiment finns i mRosa26:s förstaintron. denna webbplats har använts i tidigare studier28,29. För inknämningsförsök i mänskliga celler, se till att införingsplatsen finns i den mänskliga ROSA26-locusen (nedan kallad hROSA26), som har identifierats som den mänskliga homologen av mRosa2630.
    2. Använd de genomiska sekvenserna av mus och mänskliga arter som erhållits från Mouse Genome Informatics (http://www.informatics.jax.org/) respektive Ensembl genomwebbläsare (http://www.ensembl.org/index.html), respektive. Kopiera 50 baspar (bp) av den genomiska sekvensen av mRosa26- eller hROSA26-locus på varje sida som flankerar önskad införingsplats.
    3. Designguide RNAs med online webbverktyget CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. Klistra in 100 bp ingångssekvens från 1.1.2. Välj två guide-RNAs med hög specificitetspoäng, hög effektivitetspoäng och låg aktivitet utanför målet. Välj dessutom RNA-guider med högre Doench-poäng och undvik de som är märkta som "Ineffektiva"32.
      OBS: Alternativa CRISPR-designverktyg är också värdefulla och allmänt tillgängliga, till exempel Benchling CRISPR-designverktyget (https://benchling.com/crispr). Om du vill öka frekvensen för CRISPR/Cas9-medierade muterade celler väljer du två stöddror nära önskad insättningsplats när det är möjligt33.
    4. För mRosa26-locusen, använd två angränsande guideR:er som betecknas som mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT -3') och mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3') (Figur 1A). För hROSA26-locusen, använd två intilliggande guideR:er, nämligen hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3') och hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3')(figur 1B).
      OBS: Genomredigeringsaktiviteter av mR26-sg1 och mR26-sg2 och de av hR26-sg1 och hR26-sg2 utvärderades i RAW264,7 celler respektive Jurkat celler (Se kompletterande fil, figur S1).
  2. Kloning av CRISPR-uttrycksvektorer som innehåller sgRNA som riktar sig mot Rosa26 Locus
    1. Syntetisera framåtriktade och omvända oligos för en guide RNA (Se kompletterande fil).
      OBS: Det är att föredra att lägga till en "G" -nukleotid i början av styrsekvensen, vilket hjälper till med uttryck som drivs av U6-promotorn. För att klona ovannämnda mR26-sg1 är den främre oligocacc GCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT och den omvända oligo är AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. Det extra G i den främre oligo och dess komplement i omvänd oligo anges i fetstil.
    2. Klona syntetiska oligos motsvarande guiden RNAs till allt-i-ett CRISPR-uttrycksvektor pX458-DsRed2 genererad i vårt tidigare arbete21 (Figur 1C) med hjälp av det allmänna protokollet för gRNA-kloning utvecklad av Zhang's Lab (https://www.addgene.org/crispr/zhang/); Hoppa dock över gelreningssteget och rena den smälta vektorn med hjälp av ett PCR-reningskit (se Materialförteckning ).
      OBS: I tidigare protokoll utfördes gel rening av bbsi-smälta vektorn. Detta steg är dock tidskrävande. I detta protokoll renas den smälta produkten med hjälp av ett PCR-reningskit och används direkt för nedströms ligaturreaktionen, som i allmänhet producerar positiva kolonier med jämförbar effektivitet.
    3. Omvandla 10 μL av ligationsprodukten (steg 1.2.2) till 50 μLEscherichia coli DH5α kompetenta celler enligt tillverkarens instruktioner. Slumpmässigt plocka tre kolonier från en LB agar platta med ampicillin (100 μg/mL) och inokulera var och en i 3 mL LB medium med ampicillin för odling över natten.
    4. Använd 1 ml av den över natten bakteriella kulturen för Sanger sekvensering och håll resten vid 4 °C tills konstruktionen bekräftas vara korrekt: pDsR-mR26-sg1 och pDsR-mR26-sg2 för mRosa26 locus knock-in, och pDsR-hR26-sg1 och pDsR-hR26-sg2 för hROSA26 locus.
    5. Bered en hög koncentration av plasmid-DNA (cirka 2 μg/μL) med en maxiprepsats för rening av transfection-grade plasmid (se Materialförteckning).

2. Design och konstruktion av inriktningsvektorer som homologa rekombinationsmallar

  1. Utforma en homologistyrd reparationsmall
    1. Designa en målvektor för att konstitutivt uttrycka POI med hjälp av en uttryckskassett optimerad från en tidigarestudie 29, som innehåller en CAG hybridpromotor, en AscI-begränsningsplats som tillåter kloning av POI: s cDNA, en IRES-EBFP2-reporter och en polyadenyleringssignal för bovint tillväxthormon (bGH-polyA)(figur 1B och kompletterande fil).
    2. Designa homologiarmar (HAs) som delar homologi med genomsekvenserna i mRosa26 eller hROSA26 locus. Inkludera ~1 kb av 5' HA som motsvarar den uppströms genomiska sekvensen från önskat insättningsställe till vänster om uttryckskassetten. På samma sätt, inkludera ~1 kb av 3' HA som motsvarar den nedströms genomiska sekvensen från införingsstället till höger om uttryckskassetten.
      OBS: Uttryckskassetten sätts in så nära CRISPR/Cas9 klyvningsplatserna34som möjligt. För att undvika omskärning av den riktade allelen genom CRISPR/Cas9, införliva nukleotidförändringar i protospacer-angränsande motivsekvensen (PAM) (5'-NGG-3') i målvektorn34,35.
    3. För att möjliggöra linjärisering av målvektorn, sätt in en unik EcoRI-plats strax uppströms 5' HA och en unik BamHI-plats strax nedströms 3' HA.
    4. Ha en kommersiell leverantör syntetisera målvektorerna och utse dem som pKR26-iBFP respektive pKhR26-iBFP för mRosa26 respektive hROSA26 knock-in.
  2. Konstruera en målvektor som en homologistyrd reparationsmall
    1. För att uttrycka POI, få cDNA-sekvensen (kodningssekvensen) från Ensembl-genomwebbläsaren och välj transkriptionen som har den längsta proteinsekvensen. Till exempel är cDNA av den mänskliga ACE2-genen ACE2-202 ENST00000427411.2 och cDNA av mänskliga RASGRP1 genen är RASGRP1 ENSG00000172575.
    2. Syntetisera POI:s cDNA med hjälp av en kommersiell leverantör. Det är också möjligt att klona cDNA via PCR-förstärkning (beskrivs inte här). Placera sekvensen GGCGCGCCACC (5' - 3'), som innehåller en AscI-begränsningsplats (italik och fetstil) och Kozak konsensusöversättningsinitieringswebbplats (understruken), omedelbart före ATG-initieringskodonet för cDNA och en annan AscI-begränsningsplats (5'- GGCGCGCC -3') efter cDNA: s stoppkodon.
    3. Smält den syntetiserade sekvensen med AscI och rena med hjälp av ett PCR-reningskit som är utformat för rening av DNA-fragment efter begränsningssammanfattning, i enlighet med tillverkarens instruktioner (se materialförteckning ).
    4. Ligate den renade cDNA-insatsen i den AscI-linjäriserade ryggradsvektorn pKR26-iBFP eller pKhR26-iBFP med T4 DNA-ligase enligt tillverkarens instruktioner.
    5. Kontrollera den slutliga inriktningsvektorn, pKR26-POI-iBFP eller pKhR26-POI-iBFP, genom att sekvensera. Använd maxiprep för att rena de verifierade konstruktionerna enligt tillverkarens protokoll.
    6. Smält målvektorn med antingen EcoRI eller BamHI och rena matsmältningsprodukten med hjälp av ett PCR-reningskit enligt tillverkarens instruktioner. Förvara den linjäriserade målvektorn (~0,8 μg/μL) vid -20 °C fram till elektroporation.

3. Elektroporering av makrofag och T-cellinjer

  1. Förbered cellkulturer för elektroporering
    1. Förbered Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 kompletterat med 10% fetala nötkreatur serum (FBS) som komplett tillväxtmedium för Jurkat T celler. Förbered Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% FBS för odling av RAW264.7 makrofager. Komplettera alla kompletta tillväxtmedier med 100 U/ml penicillin och 100 μg/mL streptomycin (Penna/Strep) förutom media som används för inkubation efter transfection före cellsortering.
    2. Utför subkultur av RAW264.7- och Jurkat T-celler enligt leverantörens instruktioner (se materialförteckning ). När du subkulturar RAW264,7-celler, använd trypsin-EDTA-lösning (0, 25%) för att lossa celler. Använd FBS kompletterat med 10% (v/v) DMSO som kryopreservationsmedium för RAW264.7 och Jurkat celler.
    3. Samla celler vid 250 × g i 5 min för RAW264,7 makrofager och 90 × g i 8 min för Jurkat T-celler. Tvätta sedan med 5-10 ml 1× DPBS (utan Ca2+ eller Mg2 + joner). Ta bort DPBS.
    4. Återanvänd cellpelleten med 2 ml 1× DPBS. Använd 10 μL celler och blanda med en lika stor volym på 0,2 % trypanblått för att uppskatta cellantalet och livskraften.
      OBS: Se till att cellkulturen har > 90% livskraft på transfectiondagen.
    5. För ett enda inknöjande experiment, utför elektroporering med 10 μL nukleofection tips med fem repetitioner. Beräkna volymen som behövs för 2,0 × 106 celler och pellet cellerna genom centrifugation. Tvätta cellpelleten igen med 1× DPBS enligt beskrivningen i steg 3.1.3.
      OBS: Vid användning av 10 μL nukleofection spetsar behövs 4,0 ×10 5 celler per elektroporation. Förbered därför minst 2,0 × 106 celler för ett inknårsexperiment.
    6. Förbered en 24-brunnsplatta med 0,5 ml komplett tillväxtmedium (beredd i steg 3.1.1) per brunn utan Penna/Strep och förvärmning i en 37 °C inkubator.
  2. Elektroporering av CRISPR/Cas9-komponenter och målvektorn
    1. Slå på elektroporeringssystemet. Använd elektroporeringsparametrar optimerade i en tidigarestudie 21:1 400 V/20 ms/2 pulser för RAW264.7-makrofager och 1350 V/20 ms/2 pulser för Jurkat T-celler.
    2. Med hänsyn till provförlust på grund av pipetting, förbered en 55 μL elektroporationsblandning i ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller 2,5 μg av varje CRISPR/Cas9-vektor, 2,4 μg av den linjäriserade målvektorn och Resus buffert R.
      OBS: För att spara tid kan elektroporationsblandningen beredas under centrifugation (steg 3.1.5).
    3. Återanvänd 2,0 × 106 celler (beredda i steg 3.1.5) i 55 μL elektroporationsblandningen från steg 3.2.2.
    4. Aspirera cell-/elektroporationsblandningen från steg 3.2.3 med en 10 μL nukleofection spets med en pipett.
      OBS: Undvik att införa luftbubblor under pipetting, vilket kan orsaka elektroporeringsfel.
    5. Tillsätt provet i ett rör fyllt med 3 ml buffert E från elektroporeringssatsen.
    6. Tillämpa elektroporeringsparametrarna för de två celltyperna enligt beskrivningen i steg 3.2.1.
    7. Överför provet till en brunn på 24-brunnsplattan med förvärmt medium från steg 3.1.6.
    8. Upprepa steg 3.2.4-3.2.7 för de övriga fyra repetitionerna samt för endast inriktningsvektorn och CRISPR-uttrycksvektorkontrollerna.
      OBS: Byt nukleofection spets och rör när du byter till en annan cell typ /plasmid DNA.
    9. Kultur de transfected cellerna för 48-72 h för att möjliggöra återhämtning efter elektroporation och uttryck av CRISPR/Cas9 komponenter före flöde cytometri analys eller fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS). Undersök uttrycket av DsRed2 med hjälp av ett fluorescerande mikroskop utrustat med en röd kanal vid 24 h efter transfection.
      OBS: En fördel med att övervaka DsRed2 fluorescerande celler är att elektroporationens effektivitet kan uppskattas och lämpligheten för ytterligare cellsortering kan förutsägas.

4. Cellsortering för att isolera förmodade knock-in-celler

  1. Före FACS-sortering, tvätta de transfekterade cellerna en gång med komplett tillväxtmedium. Pelletsceller genom centrifugation enligt beskrivningen i steg 3.1.3 och återanvänd pelleten i 500 μL färskt medium.
  2. Ställ in cellsorteraren (placerad i ett biosäkerhetsskåp) med ett 85 μm munstycke och lågt flöde. Välj läget "en cell" för sortering och testa den enskilda cellsorteringseffektiviteten och precisionen genom att sortera 20-30 celler på locket till 96-brunnsmikroplatta. En droppe lokaliserad i mitten av varje brunn indikerar korrekt inställning av instrumentet.
  3. Överför cellfjädringen från steg 4.1 till sterila FACS-rör och tillsätt SYTOX Red Dead Cell Stain till en slutlig koncentration på 1 nM.
  4. Analysera prover på cellsorteraren. SYTOX Red och EBFP2 är upphetsade av en 405 nm laser och detekteras av V450 / BV421 respektive APC-kanalerna. DsRed2 är upphetsad av en 488 nm laser och detekteras av PE-kanalen. Använd icke-transfekterade celler och EBFP2- och DsRed2-enstaka positiva celler som kontroller för spektralkompensation.
  5. Sortera 10 enstaka celler i varje brunn på en 96-brunns mikroplatta som innehåller 150 μL per brunn av förvärmt komplett tillväxtmedium. Använd runda bottenmikroplattor för odling av upphängningscelllinjer som Jurkat T-celler och platt bottenmikroplattor för vidhäftande RAW264.7-makrofager.
    OBS: Sortering av 10 celler per brunn är en optimerad strategi för att förbättra cellöverlevnaden och minimera antalet 96-brunnsmikroplattor som behöver sås och antalet prover som behöver screenas genom flödescytometri och genotypning; Om du bara sorterar en cell per brunn krävs sådd av fler mikroplattor för att öka chansen att få korrekt redigerade celler.

5. Screening och validering av positiva inkn överst på celler

  1. Screening för kandidatknackningsceller efter flödescytometri
    1. Inkubera cellerna från steg 4,5 i 10-15 dagar och tillsätt komplett tillväxtmedium var tredje dag för att ersätta vätska som förlorats genom avdunstning. För Jurkat T-celler, överför celler som odlas i den runda bottenplattan 96-brunnsplattan till en platt bottenplatta för att optimera cellproliferationen.
    2. Överför de expanderade sorterade cellerna till 48-brunnsplattor för vidare expansion.
    3. När celler är nära sammanflöde, använd hälften av kulturen för att screena för EBFP2-uttryck genom flödescytometri (Figur 3). Normalt motsvarar hälften av kulturen i en 48-brunnsplatta efter sammanflödestillväxt 0,5-1,0 × 105 celler, vilket är tillräckligt för analys av ett prov genom flödescytometri.
    4. Överför de återstående cellerna till 24-brunnsplattor för ytterligare spridning.
    5. Håll kandidatcellpopulationerna med en hög andel EBFP2-positiva celler för ytterligare genotypningsexperiment.
      OBS: Eftersom 10 celler sorteras i varje brunn i 96-brunnsmikroplattan är det möjligt att inknipningscellerna växer med celler som inte uttrycker inknipningsgenen. Därför är det normalt att utföra ytterligare en omgång cellsortering för att separera EBFP2-positiva celler från de negativa cellerna.
  2. Screening för kandidatknackningsceller med PCR och sekvensering
    1. Samla in 2 × 105 kandidatceller. Extrahera genomiskt DNA med hjälp av ett DNA-prep kit (Se materialförteckning ).
    2. För att kontrollera att exakt homologistyrd reparation (HDR) har skett vid mRosa26-locus snarare än på slumpmässiga platser i arvsmassan hos kandidatens inknäckta celler, utför PCR med primers som spänner över varje sida av HAs (figur 4). Välj en primer som ligger i genomisk region utanför målvektorn (extern oligo) och en annan primer som ligger inuti målvektorn (intern oligo).
      OBS: En liknande design används för att verifiera HDR vid hROSA26 locus. PCR-primers kan också enkelt utformas för att upptäcka införandet av POI-sekvensen. Dessutom kan genotyperna wild-type och knock-in allel samtidigt detekteras med hjälp av PCR med treprimrar (Se kompletterande fil, figur S2).
    3. Klona de positiva PCR-produkterna med hjälp av ett snabbkloningskit (se Materialförteckning ). Omvandla reaktionsblandningen till DH5α-kompetenta celler.
    4. Välj slumpmässigt 8-10 enskilda bakteriekolonier per omvandling och sekvensera PCR-produkterna från steg 5.2.3 genom Sanger-sekvensering.
  3. Validering av positiva knock-in celler genom immunoblot analys och affinitet rening
    OBS: Kandidatceller utsätts för immunoblot analys för validering av införandet av POI, eller affinitet rening (AP) för studier av protein-protein interaktion.
    1. Utför immunoblotanalys enligt antikroppstillverkarens instruktioner. Se Tabell över material för information om användning av primära antikroppar och sekundära antikroppar.
    2. Underkasta lysaterna från de inknäckta cellerna som uttrycker den OST-märkta POI till AP med Strep-Tactin Sepharose-pärlor enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning ).
    3. Identifiera chemiluminescens med hjälp av en bild.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter protokollet som beskrivs ovan för att utföra knock-in experiment på mRosa26 locus med hjälp av murin RAW264.7 makrofager, utformade vi en inriktning vektor för att uttrycka mänskliga ACE2, en receptor för SARS-Cov-2 virus (Figur 2A). Med en liknande design genererade vi mänskliga Jurkat T-celler med knock-in av det OST-märkta RASGRP1 fusionsproteinet (Figur 2C). Efter transfection av tre plasmider, varav två användes för uttryck av CRISPR/Cas9 (DsRed2; pDsR-mR26-sg1 och pDsR-mR26-sg2 för mRosa26 knock-in; pDsR-hR26-sg1 och pDsR-hR26-sg2 för hROSA26 knock-in) och en annan används som en DNA mall för homolog rekombination (EBFP2), dubbla positiva celler uttrycker två fluorescerande reportrar sorterades i en 96-brunn platta. Av DE RAW264,7 celler som sorterades med hjälp av sorteringsläget för en cell var 0,91 % DsRed2+ EBFP2+, men 10 celler samlades in i varje brunn (figur 2B). Jurkat T-cellerna hade en högre transfection effektivitet, och andelen dubbla positiva celler var 7,91% i detta representativa experiment, vilket visar framgångsrika knock-in av OST-RASGRP1 fusion protein (Figur 2D).

I nästa steg användes flödescytometri för att screena för kandidatbrunnarna med EBFP2-positiva celler. Representativa histogram visade att det fanns uppenbara EBFP2-positiva populationer (figur 3). Det är anmärkningsvärt att knock-in-cellerna inte uttryckte DsRed2 när flödescytometri utfördes två veckor efter cellsortering.

För diskriminering av exakta knock-ins och slumpmässiga infogningar testades genomiskt DNA från EBFP2-positiva celler ytterligare genom att utföra PCR med primers som känner igen genomisk sekvens utanför HAs av målvektorn och den specifika regionen inuti uttryckskassetten (figur 4A och 4B). Sekvensanalys av dessa PCR-produkter bekräftade förekomsten av HDR på målplatsen mRosa26 (figur 4C). Samma genotypningsstrategi kan tillämpas för att validera den exakta insättningen av uttryckskassetteni hROSA26-locusen i Jurkat T-celler.

För att få en ren population av hACE2-uttrycker RAW264.7 celler, sorterade vi cellerna ytterligare och validerade förekomsten av fluorescerande reportrar efter expansion med vilda celler som kontroller (Figur 5A). De expanderade cellerna var EBFP2 positiva, och hACE2 proteinet var lätt detekterbara i murin RAW264.7 makrofager(figur 5B och 5C). På samma sätt validerade vi uttrycket av fluorescerande reportrar och OST-RASGRP1-proteinet i mänskliga Jurkat T-celler efter screening och en andra omgång cellsortering (Figur 6A och 6B). Dessutom utfördes affinitet rening av OST-RASGRP1 proteinet med hjälp av kommersiellt tillgängliga pärlor. Vi hittade en högre mängd RASGRP1 protein i den totala cell lysates av knock-in Jurkat celler än i vilda celler; RASGRP1 knockout Jurkatceller användes som kontroller (Figur 6C). Efter rening med OST-taggen hade endast inklappningsproverna detekterbart RASGRP1 (Figur 6D).

Figure 1
Figur 1. Geninriktningsstrategi för att generera mRosa26/hROSA26 knock-in cellinjer som överuttrycker ett protein av intresse. (A) mRosa26-specifika guide RNA inriktningssekvenser och protospacer angränsande motiv (PAMs) i önskad insättningsplats anges i blå respektive röda bokstäver. Cas9 klyver normalt 3-4 bp uppströms PAM-sekvensen, vilket indikeras av gröna pilar. Målvektorn används som mall för homologistyrd reparation (HDR) vilket leder till exakt införande av uttryckskassetten i musen eller det mänskliga genomet. Var och en av 1 kb-sekvenserna uppströms och nedströms det önskade målområdet används som 5' och 3' homologiarmar (HAs) i målvektorn. HAs separeras av en uttryckskassett bestående av en CAG-promotor, cDNA-sekvensen av proteinet av intresse (POI) med en OST-tagg, en IRES-EBFP2-reporter och en bGH-polyA-signal (pA). Begränsningsplatsen AscI används för kloning av POI, och EcoRI och BamHI används för linjärisering av målvektorn. Strategin för CRISPR/Cas9-medierad knock-in på hROSA26 locus är liknande. B) Diagram över den mänskliga ROSA26-locusen. Målsekvenserna hR26-sg1 och hR26-sg2 anges med blå bokstäver och motsvarande PAM-sekvenser i rött. (C) Schematiskt för allt-i-ett CRISPR-uttrycksvektorn pX458-DsRed2, som innehåller en mänsklig U6-driven sgRNA-uttryckskassett och Cas9-T2A-DsRed2 fluorescerande reporterkassett. Två BbsI-begränsningsplatser möjliggör kloning av guide-RNA. U6, human U6 RNA polymeras III promotor; sgRNA, ett chimeriskt enguide-RNA; CBh, en kyckling β-actin hybridpromotor; NLS, lokaliseringssignal för kärnvapen; T2A, Thosea asigna virus 2A självsplicerande peptid; bGH-pA, bovint tillväxthormon polyadenylering signal. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2. Encellssortering av RAW264.7- och Jurkat-celler transfecterade med CRISPR/Cas9-vektorer och inriktningsvektorer för homolog rekombination. Inriktning vektorer som används för stabila gen uttryck i RAW264.7 (A) och Jurkat (C) celler. Representativa flöde cytometriska tomter av mus RAW264.7 makrofager (B) och mänskliga Jurkat T celler (D) transfected med CRISPR/Cas9 vektorer uttrycker DsRed2 reporter och mål vektor uttrycker EBFP2 reporter. Celler som samfördelade DsRed2 och EBFP2 utsattes för cellsortering och odlades för expansion; Tal intill skisserade områden anger procentandelen celler i varje port, och icke-transfekterade celler användes som en negativ kontroll. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3. Screening av knock-in celler genom detektion av EBFP2 uttryck. Flödescytometrisk analys av EBFP2+ och DsRed2+ RAW264,7 makrofager (A) och Jurkat T-celler (B) 14 dagar efter elektroporation. I histogrammen visas fluorescensintensitet (FI) för antingen EBFP2+ eller DsRed2+ celler på X-axeln och antalet händelser i varje fluorescenskanal visas på Y-axeln. A) Uttrycket av EBFP2 och hACE2 drevs av samma initiativtagare vid Rosa26-locus i RAW264.7 murinmakrofager. B) I jurkatceller är OST-RASGRP1-uttrycket kopplat till EBFP2-uttrycket vid den mänskliga ROSA26-locusen. Vid 14 dagar post-electroporation, flöde cytometrisk analys visade nästan noll DsRed2+ celler bland de sorterade cellerna. WT-celler (Wild-type) användes som en negativ kontroll, och KI står för inknäktande celler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4. Screening för kandidatknackningsceller med PCR och sekvensering. a) Strategi för att generera hACE2-inknöjande celler. Positionerna för PCR-primers som används för att skilja exakt HDR och slumpmässig insättning indikeras av gröna pilar. (B) PCR-genotypning av fem kandidatceller (#4, #15, #22, #25 och #43) som identifierades genom flödescytometriscreening för EBFP2-uttryck som exemplifieras i figur 3, visade att både 5' korsningen (1472 bp) och 3' korsning (1472 bp) som spänner över homologiarmarna var korrekta. M, DNA-stege; WT, RAW264.7-kontrollen av vildtyp. H2O, negativ kontroll. C) Sanger sekvensering av PCR produkter från B visade framgångsrika knock-in av hACE2-uttryck kassett i mRosa26 locus utan mutationer. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5. Validering av framgångsrika knock-in av hACE2 uttryck kassett i mRosa26 locus i RAW264.7 makrofager. (A) WT RAW264.7 makrofager användes som en negativ kontroll för flöde cytometrisk analys. B) För att skilja EBFP2-positiva celler från de negativa cellerna utfördes ytterligare en omgång cellsortering för att erhålla en population bestående av nästan 100 % EBFP2+ inknöjande celler, betecknade som hACE2 KI-celler. DsRed2-uttrycket undersöktes också för att säkerställa att CRISPR/Cas9-plasmiden inte integrerades i arvsmassan hos RAW264.7-makrofager. I histogrammen visas fluorescensintensitet (FI) för antingen EBFP2+ eller DsRed2+ celler på X-axeln och antalet händelser i varje fluorescenskanal visas på Y-axeln. c) Påvisande av hACE2-uttryck genom immunoblotanalys med kanin anti-human ACE2 monoklonal antikropp. Uttryck för hACE2 observerades i celler från flera brunnar (#4, #15, #22, #25 och #43). WT RAW264.7 makrofager användes som en negativ kontroll och GAPDH användes som lastningskontroll. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6. Validering av framgångsrika knock-in av OST-RASGRP1 uttryck kassett i hROSA26 locus i Jurkat T celler. (A) WT Jurkat T celler användes som en negativ kontroll för flöde cytometrisk analys. B) EBPF2+ delpopulationer av jurkatceller berikades av ytterligare omgångar av cellsortering och utvidgades. dessa celler betecknades som OST-RASGRP1 KI celler. Knock-in cellerna analyserades av flöde cytometri och höll inte DsRed2-uttrycker vektorn. I histogrammen visas fluorescensintensiteten (FI) för antingen EBFP2+ eller DsRed2+ celler på X-axeln och antalet händelser i varje fluorescenskanal visas på Y-axeln. (C) Detektion av OST-RASGRP1 uttryck i två oberoende knock-in celler (#1 och #2) genom immunoblot analys med anti-RASGRP1 antikroppar. WT Jurkat och RASGRP1-knockout Jurkat celler användes som kontroller och β-aktin användes som lastningskontroll. (D) OST-medierad affinitetsrening användes för att validera uttrycket ost-RASGRP1 med RASGRP1-knockoutceller som en negativ kontroll. Immunoblot analys av lika stora mängder proteiner från cell lysater som antingen utsattes för affinitet rening på Strep-Tactin Sepharose pärlor (Affinitet rening) eller direkt analyseras (Totala lysater) och sonderas med RASGRP1 eller GAPDH (lastning kontroll) antikroppar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kompletterande fil: Stödjande figurer, tabell och sekvenser Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I våra experiment visade vi hur man utför knock-in redigering i immunceller från konstruktionsdesign till knock-in cell screening och validering med mänskliga Jurkat T-celler och murin RAW264.7 makrofager som exempel. Både T-cells- och makrofatcelllinjer är resistenta mot transfekt36,37; Problemet med låg effektivitet med CRISPR / Cas9-leverans kan dock övervinnas med hjälp av fluorescerande reportrar i kombination med cellsortering. Detta protokoll är lämpligt för genräddningsexperiment och proteinproteininteraktionsexperiment, men det kan inte tillämpas på studier av regulatoriska DNA-sekvenser som bindande platser för transkriptionsfaktorer eftersom protokollet utvecklades för knock-in modifiering av Rosa26-locusen.

Dubbla fluorescerande reportrar hjälpte CRISPR / Cas9 knock-in redigering
Vi tillämpade framgångsrikt ett dubbelt fluorescerande reportersystem för att tillfälligt uttrycka oberoende uppsättningar av CRISPR / Cas9 vektorer i immunceller, vilket resulterade i radering av stora fragment av DNA i tidigare studier21. Vi designade ett CRISPR/Cas9-inriktningsverktyg med DsRed2 fluorescerande protein som reporter och ytterligare ett spektroskt distinkt fluorescerande protein för att spåra leveransen av DNA-mallen för knock-in modifiering. För att göra knock-in allel modifiering genomförbar, använde vi EBFP2 fluorescerande protein reporter, som inte har någon spektral spridning med RFP (DsRed2 i vårt fall), för att övervaka transfection av givaren DNA som fungerar som mall under homolog rekombination. För att optimera kassetten som uttrycker POI och fluorescerande reporter, introducerades en IRES-sekvens för att få oberoende proteiner. I vår tidigare studie noterade vi att de återstående aminosyrorna från P2A eller T2A-länkaren som återstår efter post-transkriptionell klyvning påverkade proteinlokaliseringen på cellytan. IRES-sekvensen lämnar inte sådana restaminosyror. Som beskrivits i en tidigare studie gav IRES upphov till högre nivåer av fluorescerande reporter, efter uttryck för Cas9-proteinet som drivs avCAG-promotorn 38.

Allt-i-ett CRISPR/Cas9-plasmid
Olika format och kombinationer av CRISPR/Cas9-systemet har beskrivits i tidigare studier, såsom Cas9-transfektion som mRNA eller protein tillsammans med kemiskt syntetiserade sgRNAs39. CRISPR/Cas9 RNP-komplex har också levererats till däggdjursceller; Denna strategi erbjuder fördelarna med tidigare uppkomsten av nukleasaktivitet och kortare halveringstid. Märkning av RNP:er är dock mindre kostnadseffektivt jämfört med att konstruera allt-i-ett-plasmid. I våra tidigare studier fann vi att det är mycket mindre komplicerat att använda encellssortering för att isolera de sällsynta celler som uttrycker CRISPR / Cas9 (DsRed2-positiv) och knock-in-proteinet (EBFP2-positiv) än att använda RNP-leverans, och det är lätt att förbereda plasmiderna. Det är sant att det här protokollet förlitar sig på sortering av en enda cell. Men vårt protokoll är lätt att utföra och ger framgångsrika knock-in modifieringar med hög reproducerbarhet.

Uttryck för en POI från Rosa26 locus
Det finns flera rapporter i litteraturen som beskriver metoder för att tagga endogena proteiner med fluorescerande reportrar med CRISPR / Cas9 redigering40,41,42. Fördelarna med endogen taggning är att det är möjligt att bestämma subcellulär lokalisering och utföra in vivo-spårning av det endogena proteinet. Problem kan dock uppstå om det inte är möjligt att utforma en lämplig CRIPSR-guide RNA vid den endogena locus. Här utvecklade vi en alternativ knock-in-metod genom att införliva POI-IRES-EBFP2 i den genomiska safe harbor locus Rosa26, som övervinner begränsningarna för att hitta lämpliga guider för positionering av endogena taggar.

Vi sammanfattar några viktiga punkter som måste beaktas under experimenten för att säkerställa teknisk reproducerbarhet. För det första måste cellsorteraren ha en 405 nm violett laser för excitation av EBFP2 och en 488 nm blå laser eller alternativt en 561 nm gul laser för excitation av DsRed2. Med sådana konfigurationer kan EBFP2 och DsRed2 detekteras utan spektralutspillning, vilket kan leda till falska positiva resultat. I våra experiment var andelen DsRed2+ EBFP2+ dubbla positiva celler så låg som 0,9%; Därför var gating av den korrekta befolkningen avgörande för att experimenten skulle lyckas. En andra omgång sortering utfördes för att gate EBFP2+ positiva celler, följt av PCR validering. Dessutom, för knock-in proteindetektering, är det att föredra att införa en proteintagg som OST eller en annan typ av tagg. Knockout av genen före Rosa26 locus knock-in experiment ger ett bra tillfälle att bedöma om antikroppen har önskvärd specificitet. När antikroppsspecifikiteten inte är tillräcklig bör detektion av inklappningsproteinet utföras efter neddragning via proteintaggen. Slutligen, under FACS screening av cellerna som uttrycker knock-in allel, intensiteten i EBFP2 kan användas för att bedöma om två kopior eller en kopia av knock-in allelen är närvarande.

Program
I detta protokoll beskrev vi knock-in modifiering av RASGRP1, en nyckelmolekyl som är involverad i T-cellsaktivering27. Vi fick först RASGRP1-knockout Jurkat celler som kan användas för förlust av funktion studier, och vi genererade ytterligare Jurkat celler uttrycker OST-RASGRP1 vid hROSA26 locus. Jurkatceller är den mest använda mänskliga cellinjen för att studera T-cellsbiologi43. På grund av framgången med immunterapi för att förhindra T-cellsutmattning hos cancerpatienter har immunologer och cancerbiologer stort intresse av att modifiera jurkatceller för funktionella studier av kandidatmolekyler. Det är också anmärkningsvärt att Jurkat T-cellinjen ofta används för dissekering av signalvägar, men det finns begränsningar för att använda denna cellinje, eftersom Jurkat-celler är dåliga producenter av IFN-γ vid stimulering44. Tidigare studier använde både endogen locus modifiering45 och genteknik vid hROSA26 locus46 för att utföra knock-in experiment i mänskliga Jurkat celler. Båda strategierna har sina egna fördelar. genom att modifiera den endogena locus proteinet uttrycks förmodligen på en "fysiologisk" nivå. Knock-in modifiering vid hROSA26 locus ger förutsägbara resultat eftersom alternativ splitsning av mRNA undviks, och överflöd av det modifierade proteinet är också lätt detekterbart. Andra genomiska säkra hamnar, såsom den adeno-associerade virusplatsen 1 (AAVS1) och chemokin (CC-motiv) receptor 5 (CCR5)47,48 förtjänar mer utforskning.

I vår tidigare studie, när Vav1-OST uttrycktes på högre nivåer vid musen Rosa26 locus i RAW264.7 celler, som används mycket ofta makrofagceller, kunde vi upptäcka dess interaktion med lågt uttryckta Vav3 molekyler på grund av de höga nivåerna av bete protein och hög effektivitet av OST affinitet rening13. Vi beskrev också knock-in experiment för att upprätta en makrofag cellinje stabilt uttrycker hACE2, en receptor för SARS-CoV-2, där rikliga uttryck garanteras. I databasen för RNA-sekvensering med en cell uttrycks murin Ace2 i lungmakrofager, och den genetiska cellulära modellen som uttrycker hACE2 som vi utvecklat kan vara användbar för studier av makrofager under SARS-CoV-2-infektion.

Andra överväganden
Detta protokoll är utformat för att identifiera inknöjande celler som uttrycker en POI med hjälp av flöde cytometriska analyser av en fluorescerande reporter, i vårt fall EBFP2 reporter. Men när ytmärkningsantikroppar som kan detekteras av FACS är tillgängliga för ett ytprotein49, är det inte nödvändigt att använda reportersystemet50. T-cell- och makrofagcelllinjerna, liksom exemplen på OST-märkta proteiner som används för interactome-studier, används främst för signalstudier, och majoriteten av dessa signalmolekyler är lokaliserade i cellernas cytosoll eller atomkärnor. Således kan en fluorescerande reporter behövas för identifiering av önskvärda knock-in celler.

Det är viktigt att påpeka att detta protokoll utvecklades för cellinjer, och tillämpning på primära immunceller såsom T-celler, monocyter/makrofager validerades inte. På grund av cellernas begränsade kapacitet att föröka sig rekommenderar vi inte detta protokoll för användning med primära immunceller. Eftersom den fluorescerande reporter EBFP2 uttrycktes under samma promotor som knock-in genen eller POI med hjälp av ett IRES-element, observerade vi inte celler som uttryckte den fluorescerande reportern i avsaknad av knock-in genen. Vi misstänker att återvinningen av fluorescerande protein-uttrycker celler är mycket beroende av framgången med homolog rekombination. Som rapporterats i en tidigare studie är det tråkigt att sortera, expandera och identifiera rätt inknändningsceller genom att sortera en cell när knock-in-effektiviteten är mycketlåg 42, vilket också förklarar varför vi behövde sortera cellerna i bulk för att förbättra framgångsgraden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar flöde cytometri kärnanläggningen vid Xinxiang Medical University. Utvecklingen av sådan teknik har fått stöd av NSFC-81601360 LZ, 81471595 och 32070898 till YL. Arbetet stöds också av Foundation of Henan Educational Committee nr 21IRTSTHN030.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -, Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Tags

Immunologi och infektion Utgåva 177 knock-in CRISPR/Cas9 Rosa26 makrofag T-cell hACE2
Genknackning av CRISPR/Cas9 och cellsortering i makrofag och T-cellinjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu,… More

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter