Summary
Bu protokol, makrofaj ve T hücre satırlarındaki darbe denemelerini basitleştirmek için floresan muhabirleri ve hücre sıralamasını kullanır. Bu basitleştirilmiş knock-in deneyleri için iki plazmid kullanılır, yani CRISPR / Cas9- ve DsRed2 ifade eden plazmid ve bağışıklık hücrelerindeki Rosa26 lokusunda kalıcı olarak entegre edilen EBFP2'yi ifade eden homolog bir rekombinasyon donör plazmid.
Abstract
Bağışıklık sisteminin fonksiyonel genomik çalışmaları, hem hedef genlerin silinmesini hem de elementlerin ilgi çekici proteinlere eklenmesini içeren genetik manipülasyonlar gerektirir. Hücre hattı modellerinde gen fonksiyonlarının tanımlanması, gen keşfi ve hücre içi mekanizmaların araştırılması için önemlidir. Bununla birlikte, CRISPR/Cas9 aracılı darbe kullanan T hücreleri ve makrofaj hücre hatları gibi bağışıklık hücrelerinin genetik manipülasyonları, özellikle sessiz bir durumda, bu hücrelerin düşük transfeksiyon verimliliği nedeniyle zordur. Bağışıklık hücrelerindeki genleri değiştirmek için, ilaç direnci seçimi ve viral vektörler tipik olarak CRIPSR/Cas9 sistemini ifade eden hücreler için zenginleştirmek için kullanılır ve bu da kaçınılmaz olarak hücrelerin istenmeyen müdahalesiyle sonuçlanır. Daha önceki bir çalışmada, CRISPR/Cas9 ile birleştiğinde elektroporasyondan sonra geçici olarak ifade edilen çift floresan muhabir tasarladık. Bu teknik çözüm bağışıklık hücrelerinde hızlı gen silinmesine yol açar; bununla birlikte, T hücreleri ve makrofajlar gibi bağışıklık hücrelerinde ilaç direnci seçimi veya viral vektörler kullanmadan gen darbesi daha da zordur. Bu yazıda, Rosa26 lokusunu hedef alan CRISPR/Cas9 yapılarını donör plazmid ile birlikte geçici olarak ifade eden hücrelerin seçimine yardımcı olmak için hücre sıralamasını kullanarak, ilaç direnci zenginleştirmesi olmadan hem T hücrelerinde hem de makrofajlarda gen darbesi elde edilebileceğini gösteriyoruz. Örnek olarak, mevcut Covid-19 salgınından sorumlu sars-Cov-2'nin bir reseptörü olan insan ACE2'nin RAW264.7 makrofajlarında nasıl ifade edilebilir olduğunu, darbe deneyleri yaparak gösteriyoruz. Bu tür gen darbeli hücreler mekanistik çalışmalar için yaygın olarak kullanılabilir.
Introduction
Bağışıklık hücreleri patojenlere karşı savunma için kritik öneme sahiptir. Enfekte edicilerin temizlenmesi ve doku homeostazının bakımı için hem doğuştan gelen hem de uyarlanabilir bağışıklık gereklidir1,2. Hücre hattı modelleri, memeli bağışıklık sisteminin moleküler temellerini anlamak için temel araçlardır; insan T hücre aktivasyonunu modellemek gibi in vitro fonksiyonel tahlillerde ve immün yanıtların etkinleştirilmesinde veya sönümlemesinde genetik faktörlerin işlevinin belirlenmesinde kullanılırlar3,4. Memeli bağışıklık sisteminin son derece heterojen olduğunu ve aynı derecede önemli olan çok sayıda molekülün belirli bir hücre tipinin farklılaşmasını, göçlerini ve işlevini kontrol ettiğini belirtmek önemlidir5,6.
Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR)/Cas9 genom düzenleme araçları, genlerin kesin bir şekilde fonksiyonel ek açıklamalarını kolaylaştıran belirli hücre türlerinin genetik manipülasyonuna izin verir7,8. Yayınlanan birkaç protokol, CRISPR/Cas9'un HEK293 hücrelerinde ribonükleoproteinler (RNP' ler) olarak bilinen Cas9 kılavuzlu RNA kompleksleri, Jurkat hücre hatları, birincil T hücreleri9,10,makrofajlar11 , 12,13,kök hücreler 14 ve diğerleri15,16şeklinde teslimini tanımlamıştır. Bu protokollerde, gen etiketleme genellikle bir floresan etiketin endojen proteinlere kaynaştırılmasıyla elde edilir17,18. Bununla birlikte, özellikle bağışıklık hücrelerinde19,20darbeli deneyleri kolaylaştırmak için tek hücre sıralama ile uyumlu çift floresan muhabir kullanmak için çok az girişimde bulunulmuştır.
Yeni bir genetik faktörün bağışıklık hücrelerindeki işlevlerini anlamayı amaçlayan derinlemesine mekanistik analizler genellikle bir genin hücre tipi spesifik silinmesini, genetik kurtarma deneylerini ve etkileşimcilerinin ideal olarak tanımlanmasını gerektirir. İmmün hücrelerdeki genlerin genetik olarak silinmesinin optimizasyonu için yöntemler yayınlanmış olsa da, bağışıklık yanıtını anlamak için çok yönlü işlevlere sahip darbe alellerinin tanıtılması için9, 15,21, çok daha az yöntem bildirilmiştir. Bu nedenle, bu protokolde, hem insan hem de murine bağışıklık hücresi hatlarında güvenli liman locus Rosa26'da bir ilgi proteinini (POI) ifade etmek için verimli ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir protokolü ayrıntılı olarak tanımlamayı amaçlıyoruz. CRISPR/Cas9 (DsRed2) ifade eden plazmidlerle enfekte olmuş hücreler için zenginleştirmek için iki renkli bir muhabir sistemi ve hücre sıralama ile izole edilebilen bir rekombinant DNA şablonu (EBFP2) tasarladık. Bu protokolün ardından, kötü çalışılmış proteinlerin fonksiyonel analizleri için insan T hücre hattı Jurkat ve murine makrofaj RAW264.7'nin birden fazla darbe hattını elde ettik.
Örnek olarak, bu protokolde insan ACE2 'yi (SARS-Cov-2 reseptörü) 22'yi kasten ifade edenRAW264.7 makrofajlarının nasıl elde edeceğimizi gösteriyoruz. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri Covid-19 23 ,24 patogenezinde yer aldığı ve insan ACE2'nin replikasyondan önce hücrelere viral giriş için gerekli olan önemli bir reseptör olarak kabul edildiği için, insan ACE2'nin darbe aldığı makrofajlar, makrofajların içindeki viral çarpmanın mekanistik çalışmaları için yararlı bir araç olarak hizmet edebilir. Buna paralel olarak, amino terminusunda Twin-Strep-tag (OST) benzeşimi ile kaynaşmış rasgrp1 proteinini ifade etmek için insan ROSA26 lokusunda bir genin çalınmasının bir örneğini de sunuyoruz. T hücreleri immün tedavilerde temel hedef hücrelerdir ve giderek artan sayıda çalışma kansere yanıt vermelerinin manipülasyonu üzerine odaklanmıştır25,26. Rasgrp1'in T hücre reseptörünün aşağı doğru önemli bir sinyal molekülü olduğu bilindiğinden ve etkileşimcileri iyi aydınlatılmamıştır27, OST-RASGRP1 knock-in modeli, T hücrelerinin tümörlere ve enfeksiyona tepkisini düzenleyen etkileşimcileri tanımlamak için temel sağlar. Birlikte ele alındığında, bu araçlar Covid-19 çalışmaları ve Rasgrp1 ile etkileşime giren yeni moleküllerin keşfi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rosa26 Locus'u Hedefleyen sgRNA'ların Tasarımı ve Plazmid İnşaatı
- İstenilen ekleme sitesinin etrafında tasarım kılavuzu RNA'ları
- Fare Rosa26 için ekleme sitesinin (bundan böyle mRosa26olarak belirlenmiştir) çalma deneylerinin mRosa26'nınilk intronunda bulunduğundan emin olun; bu site önceki çalışmalarda kullanılmıştır28,29. İnsan hücrelerinde darbe deneyleri için, ekleme bölgesinin mRosa2630'uninsan homolog'u olarak tanımlanan insan ROSA26 locusunda (bundan sonra hROSA26olarak anılacaktır) bulunduğundan emin olun.
- Sırasıyla Fare Genom Enformatik (http://www.informatics.jax.org/) ve Ensembl genom tarayıcısından (http://www.ensembl.org/index.html) elde edilen fare ve insan türlerinin genomik dizilerini kullanın. İstenilen ekleme bölgesini kuşayan her iki tarafta mRosa26 veya hROSA26 lokusun genomik dizisinin 50 baz çiftini (bp) kopyalayın.
- Çevrimiçi web aracı CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31kullanarak tasarım kılavuzu RNA'lar . 100 bp giriş sırasını 1.1.2'den yapıştırın. Yüksek özgüllük puanı, yüksek verimlilik puanı ve düşük hedef dışı etkinlik içeren iki kılavuz RNA seçin. Ayrıca, daha yüksek Doench puanlarına sahip RNA kılavuzlarını seçin ve "Verimsiz" olarak etiketlenenlerden kaçının32.
NOT: Alternatif CRISPR tasarım araçları da değerlidir ve örneğin Benchling CRISPR tasarım aracı (https://benchling.com/crispr) gibi herkese açıktır. CRISPR/Cas9 aracılı darbeli mutasyona uğramış hücrelerin sıklığını artırmak için, mümkün olduğunda istenen ekleme bölgesine yakın iki kılavuz RNA seçin33. - mRosa26 lokus için, mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTCTAGAAGAT -3') ve mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3') olarak belirlenmiş iki bitişik kılavuz RNA kullanın (Şekil 1A). hROSA26 lokus için, hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3') ve hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3') olmak üzere bitişik iki kılavuz RNA kullanın (Şekil 1B).
NOT: mR26-sg1 ve mR26-sg2'nin genom düzenleme faaliyetleri ve hR26-sg1 ve hR26-sg2'nin genom düzenleme faaliyetleri sırasıyla RAW264.7 hücrelerinde ve Jurkat hücrelerinde değerlendirildi (Bkz. Ek Dosya, Şekil S1).
- Rosa26 Locus'u hedefleyen sgRNA içeren CRISPR ifade vektörlerinin klonlama
- Bir kılavuz RNA için ileri ve geri oligoları sentezle (Bkz. Tamamlayıcı Dosya).
NOT: U6 promotörü tarafından yönlendirilen ifadeye yardımcı olan kılavuz dizisinin başlangıcına bir 'G' nükleotid eklemek tercih edilir. Örneğin, yukarıda belirtilen mR26-sg1'i klonlamak için, ileri oligo CACCGCTCCAGTCTCTAGAAGAT ve ters oligo AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC'dir. İleri oligodaki ek G ve ters oligodaki tamamlayıcısı kalın olarak belirtilir. - Zhang's Lab (https://www.addgene.org/crispr/zhang/) tarafından geliştirilen gRNA klonlama için genel protokolü kullanarak önceki çalışmamızda üretilen pX458-DsRed2'de üretilen hepsi bir arada CRISPR ifade vektörüne kılavuz RNA'lara karşılık gelen klon sentetik oligolar21 (Şekil 1C); ancak, jel temizleme adımını atlayın ve bir PCR arıtma kiti kullanarak sindirilen vektörü arındırın (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Önceki protokollerde, BBSI sindirilen vektörün jel saflaştırılması yapıldı; ancak, bu adım zaman alıcıdır. Mevcut protokolde, sindirilen ürün bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılır ve genellikle benzer verimlilikte pozitif koloniler üreten aşağı akış ligasyon reaksiyonu için doğrudan kullanılır. - Ligasyon ürününün 10 μL'lik kısmını (adım 1.2.2) üreticinin talimatlarına göre50 μL Escherichia coli DH5α yetkin hücrelere dönüştürün. Ampisilinli (100 μg/mL) bir LB agar plakasından rastgele üç koloni seçin ve her birini bir gecede kültleme için ampisilinli 3 mL LB ortamına aşıla.
- Sanger dizilimi için geceleme bakteri kültürünün 1 mL'sini kullanın ve yapının doğru olduğu onaylanana kadar geri kalanını 4 °C'de tutun: mRosa26 locus knock-in için pDsR-mR26-sg1 ve pDsR-mR26-sg2, ve hROSA26 lokus için pDsR-hR26-sg1 ve pDsR-hR26-sg2.
- Transeksiyon sınıfı plazmidlerin saflaştırılması için bir maxiprep kiti ile yüksek konsantrasyonda plazmid DNA (yaklaşık 2 μg/μL) hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Bir kılavuz RNA için ileri ve geri oligoları sentezle (Bkz. Tamamlayıcı Dosya).
2. Homolog Rekombinasyon Şablonları Olarak Hedefleme Vektörlerinin Tasarımı ve İnşası
-
Homolojiye yönelik bir onarım şablonu tasarlama
- Önceki bir çalışmadan optimize edilmiş bir ifade kaseti kullanarak İçN'yi tam olarak ifade etmek için bir hedefleme vektörü tasarlayın29, bir CAG hibrit promotörü, İçN'nin cDNA'sının klonlanmasına izin veren bir AscI kısıtlama sitesi, bir IRES-EBFP2 muhabiri ve bir sığır büyüme hormonu poliadenilasyonu (bGH-polyA) sinyali (Şekil 1B ve Tamamlayıcı Dosya).
- Homolojiyi mRosa26 veya hROSA26 lokusun genomik dizileriyle paylaşan homoloji kolları (HAs) tasarlayın. İfade kasetinin solunda istenen ekleme sitesinden yukarı akış genomik dizisine karşılık gelen 5' HA'nın ~1 kb'ını ekleyin. Benzer şekilde, ifade kasetinin sağındaki ekleme sitesinden aşağı akış genomik dizisine karşılık gelen 3' HA'nın ~1 kb'ını ekleyin.
NOT: İfade kaseti CRISPR/Cas9 dekolte sitelerine mümkün olduğunca yakın yerleştirilir34. Hedeflenen alellerin CRISPR/Cas9 tarafından yeniden kesilmesini önlemek için, nükleotid değişikliklerini hedefleme vektörü 34,35'teki protospacer bitişik motif (PAM) dizisine (5'-NGG-3') ekleyin. - Hedefleme vektörün doğrusallaştırılmasına izin vermek için, 5' HA'nın hemen yukarısına benzersiz bir EcoRI sitesi ve 3' HA'nın hemen aşağısında benzersiz bir BamHI sitesi ekleyin.
- Ticari bir satıcının hedefleme vektörlerini sentezlemesi ve bunları sırasıyla mRosa26 ve hROSA26 çalma için pKR26-iBFP ve pKhR26-iBFP olarak belirlemesini sağlayın.
-
Homolojiye yönelik onarım şablonu olarak hedefleme vektörü oluşturma
- İçN'yi ifade etmek için, Ensembl genom tarayıcısından cDNA dizisini (kodlama dizisi) alın ve en uzun protein dizisine sahip transkripti seçin. Örneğin, insan ACE2 geninin cDNA'si ACE2-202 ENST00000427411.2 ve insan RASGRP1 geninin cDNA'si RASGRP1 ENSG00000172575'tir.
- İçN'nin cDNA'sını ticari bir satıcının yardımıyla sentezleyin. CDNA'yı PCR amplifikasyonu ile klonlamak da mümkündür (burada açıklanmaz). Bir AscI kısıtlama sitesi (italik ve kalın) ve Kozak konsensüs çeviri başlatma sitesini (altı çizili) içeren GGCGCGCCACC (5' - 3'), cDNA'nın ATG başlatma kodonunun ve başka bir AscI kısıtlama sitesinin (5'- GGCGCGCC -3') cDNA'nın durdurma kodonunun hemen önüne yerleştirin.
- Sentezlenen diziyi AscI ile sindirin ve üreticilerin talimatlarını izleyerek kısıtlama sindirimi sonrası DNA parçalarını arındırmak için tasarlanmış bir PCR saflaştırma kiti kullanarak arındırın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Saflaştırılmış cDNA kesici ucu, üreticinin talimatlarını izleyerek T4 DNA ligase kullanarak AscI doğrusallaştırılmış omurga vektörü pKR26-iBFP veya pKhR26-iBFP'ye yapıştırın.
- Sıralama yaparak son hedefleme vektörü olan pKR26-POI-iBFP veya pKhR26-POI-iBFP'yi doğrulayın. Doğrulanmış yapıları üreticinin protokolüne göre saflaştırmak için maxiprep kullanın.
- EcoRI veya BamHI kullanarak hedefleme vektörüne sindirin ve üreticinin talimatlarına göre bir PCR arıtma kiti kullanarak sindirim ürününü arındırın. Doğrusallaştırılmış hedefleme vektörü (~0,8 μg/μL) elektroporasyona kadar -20 °C'de saklayın.
3. Makrofaj ve T Hücre Hatlarının Elektropozasyonu
- Hücre kültürlerini elektroporasyona hazırlayın
- Jurkat T hücreleri için tam büyüme ortamı olarak %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640'ı hazırlayın. RAW264.7 makrofajları kültleme için Dulbecco'nun %10 FBS ile Modifiye Kartal Ortasını (DMEM) hazırlayın. Hücre sıralamadan önce transfeksiyon sonrası inkübasyon için kullanılan ortamlar dışında tüm komple büyüme ortamlarını 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomilin (Pen/Strep) ile destekleyin.
- RAW264.7 ve Jurkat T hücrelerinin alt kültürlerini tedarikçinin talimatlarına göre gerçekleştirin (Bkz. Malzeme Tablosu). RAW264.7 hücrelerini alt kültüre ederken, hücreleri ayırmak için tripsin-EDTA çözeltisini (%0.25) kullanın. RAW264.7 ve Jurkat hücreleri için kriyoprezervasyon aracı olarak %10 (v/v) DMSO ile desteklenmiş FBS kullanın.
- RAW264.7 makrofajlar için 5 dakika ve Jurkat T hücreleri için 8 dakika boyunca 90 × g için 250 × g'da hücre toplayın. Daha sonra 5-10 mL 1× DPBS ile yıkayın (Ca2+ veya Mg2+ iyonları olmadan). DPBS'yi kaldırın.
- 2 mL 1× DPBS kullanarak hücre peletini yeniden diriltin. 10 μL hücre kullanın ve hücre sayısını ve canlılığını tahmin etmek için% 0,2 trippan mavisi eşit hacimle karıştırın.
NOT: Transfection gününde hücre kültürünün %90'> canlı olduğundan emin olun. - Tek bir darbe deneyi için, beş tekrarla 10 μL nükleofeksiyon uçları ile elektroporasyon gerçekleştirin. 2.0 × 106 hücre için gereken hacmi hesaplayın ve hücreleri santrifüjleme ile peletlayın. Hücre peletini adım 3.1.3'te açıklandığı gibi 1× DPBS ile tekrar yıkayın.
NOT: 10 μL nükleofeksiyon uçları kullanırken, elektroporasyon başına 4,0 ×10 5 hücreye ihtiyaç vardır. Buna göre, bir darbe deneyi için en az 2.0 ×10 6 hücre hazırlayın. - Pen/Strep olmadan kuyu başına 0,5 mL tam büyüme ortamına sahip 24 kuyu plakası hazırlayın (adım 3,1,1'de hazırlanır) ve 37 °C inkübatörde ön ısıtma.
- CRISPR/Cas9 bileşenlerinin elektroporasyon ve hedefleme vektörü
- Elektroporasyon sistemini açın. Önceki bir çalışmada optimize edilmiş elektroporasyon parametrelerini kullanın21: RAW264.7 makrofajlar için 1.400 V/20 ms/2 darbe ve Jurkat T hücreleri için 1350 V/20 ms/2 darbe.
- Pipetleme nedeniyle numune kaybını hesaba katarak, her CRISPR/Cas9 vektörün 2,5 μg'sini, doğrusallaştırılmış hedefleme vektörün 2,4 μg'sini ve Resuspension Buffer R'yi içeren steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 55 μL elektroporasyon karışımı hazırlayın.
NOT: Zaman kazanmak için elektroporasyon karışımı santrifüjleme sırasında hazırlanabilir (adım 3.1.5). - 3.2.2 adımından itibaren 55 μL elektroporasyon karışımında 2.0 × 106 hücreyi (adım 3.1.5'te hazırlanmış) yeniden biriktirin.
- Hücre/elektroporasyon karışımını pipetli 10 μL nükleofeksiyon ucu kullanarak adım 3.2.3'ten itibaren epire edin.
NOT: Pipetleme sırasında, elektroporasyon arızasına neden olabilecek hava kabarcıklarını tanıtmaktan kaçının. - Numuneyi elektroporasyon kitinden 3 mL Tampon E ile dolu bir tüpe ekleyin.
- Adım 3.2.1'de açıklandığı gibi iki hücre tipi için elektroporasyon parametrelerini uygulayın.
- Numuneyi adım 3.1.6'dan itibaren önceden ısıtılmış orta ile 24 kuyu plakasının bir kuyusuna aktarın.
- Diğer dört yinelemenin yanı sıra yalnızca hedefleme vektörü ve yalnızca CRISPR ifade vektörü denetimleri için 3.2.4-3.2.7 adımlarını yineleyin.
NOT: Farklı bir hücre tipine/plazmid DNA'sına geçerken nükleofeksiyon ucunu ve tüpünü değiştirin. - Akış sitometri analizi veya floresanla aktive hücre sıralama (FACS) öncesinde CRISPR/Cas9 bileşenlerinin elektroporasyon ve ekspresyasyonundan sonra iyileşmeye izin vermek için transfected hücreleri 48-72 saat boyunca kültüre edin. DsRed2'nin ifadesini, transfeksiyon sonrası 24 saat kırmızı bir kanalla donatılmış floresan mikroskop kullanarak inceleyin.
NOT: DsRed2 floresan hücrelerini izlemenin bir yararı, elektroporasyonun verimliliğinin tahmin edilebilmesi ve daha fazla hücre sıralama için uygunluğun tahmin edilebilmesidir.
4. Putatif Knock-in Hücrelerini İzole Etmek için Hücre Sıralama
- FACS sıralamadan önce, transfected hücreleri bir kez tam büyüme ortamı ile yıkayın. 3.1.3 adımında açıklandığı gibi santrifüjleme ile pelet hücreleri ve peletin 500 μL taze ortamda yeniden dirildi.
- Hücre sıralayıcısını (biyogüvenlik kabininde bulunur) 85 μm nozul ve düşük akış hızı ile ayarlayın. Sıralama için "tek hücre" modunu seçin ve 20-30 hücreyi 96 kuyulu mikro plakanın kapağına sıralayarak tek hücre sıralama verimliliğini ve hassasiyetini test edin. Her kuyunun ortasına lokalize edilmiş bir damlacık, cihazın uygun şekilde ayarını gösterir.
- Hücre süspansiyonu adım 4.1'den steril FACS tüplerine aktarın ve SYTOX Kırmızı Ölü Hücre Lekesi'ni 1 nM'lik son konsantrasyona ekleyin.
- Hücre sıralayıcısındaki örnekleri analiz edin. SYTOX Red ve EBFP2, 405 nm lazer ile heyecanlanır ve sırasıyla V450/BV421 ve APC kanalları tarafından tespit edilir. DsRed2, 488 nm lazer ile heyecanlanır ve PE kanalı tarafından algılanır. Spektral kompanzasyon için kontrol olarak transknakte olmayan hücreleri ve EBFP2 ve DsRed2-tek pozitif hücreleri kullanın.
- Önceden ısıtılmış tam büyüme ortamının kuyusu başına 150 μL içeren 96 kuyulu bir mikro plakanın her kuyusuna 10 tek hücre sıralayın. Jurkat T hücreleri gibi süspansiyon hücre hatlarını kültleme için yuvarlak alt mikro plakalar ve yandaş RAW264.7 makrofajlar için düz alt mikro plakalar kullanın.
NOT: Kuyu başına 10 hücrenin sıralanıyor olması, hücre sağkalımını iyileştirmek ve tohumlaması gereken 96 kuyu mikro plakalarının sayısını ve akış sitometrisi ve genotipleme ile taranması gereken numune sayısını en aza indirmek için optimize edilmiş bir stratejidir; kuyu başına yalnızca bir hücre sıralanıyorsa, doğru düzenlenmiş hücreler elde etme şansını artırmak için daha fazla mikro plakanın tohumlantır.
5. Pozitif Darbe hücrelerinin taranıp doğrulanması
-
Akış sitometrisine göre aday darbe hücreleri için tarama
- Hücreleri 10-15 gün boyunca 4.5 adımından kuluçkaya yatırın ve buharlaşma yoluyla kaybedilen sıvıyı değiştirmek için her 3 günde bir tam büyüme ortamı ekleyin. Jurkat T hücreleri için, hücre çoğalmasını optimize etmek için yuvarlak alt 96 kuyu plakasında yetişen hücreleri düz bir alt plakaya aktarın.
- Daha fazla genişleme için genişletilmiş sıralanmış hücreleri 48 kuyu plakalarına aktarın.
- Hücreler birleştiğinde, akış sitometrisine göre EBFP2 ifadesini taramak için kültürün yarısını kullanın (Şekil 3). Normalde, bir arada büyümeden sonra kültürün yarısı 0,5-1,0 × 105 hücreye eşittir, bu da bir örneğin akış sitometrisi ile analizi için yeterlidir.
- Daha fazla çoğalma için kalan hücreleri 24 kuyu plakasına aktarın.
- Daha fazla genotipleme deneyi için aday hücre popülasyonlarını yüksek oranda EBFP2 pozitif hücreye sahip tutun.
NOT: 10 hücre 96 kuyulu mikro plakanın her kuyusuna sıralandığı için, darbe hücrelerinin darbe genini ifade etmeyen hücrelerle büyümesi mümkündür. Bu nedenle, EBFP2 pozitif hücreleri negatif hücrelerden ayırmak için ek bir hücre sıralama turu gerçekleştirmek normaldir.
-
PCR ve sıralama ile aday içeri çalma hücreleri için tarama
- 2 × 105 aday hücre toplayın. DNA hazırlık kiti kullanarak genomik DNA'nınçıkarılmasını (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Tam homolojiye yönelik onarımın (HDR) aday darbe hücrelerinin genomunda rastgele bölgelerde değil, mRosa26 lokusunda meydana geldiğini doğrulamak için, HA'ların her iki tarafını kapsayan astarlarla PCR gerçekleştirin (Şekil 4). Hedefleme vektörü (dış oligo) dışında genomik bölgede bulunan bir astarı ve hedefleme vektörün (iç oligo) içinde bulunan başka bir astar seçin.
NOT: Benzer bir tasarım, hROSA26 lokusunda HDR'yi doğrulamak için kullanılır. PCR astarları, İçN dizisinin eklenmesini tespit etmek için de kolayca tasarlanabilir. Ek olarak, vahşi tip ve darbeli alel genotipleri aynı anda üç astarlı PCR kullanılarak tespit edilebilir (Bkz. Ek Dosya, Şekil S2). - Pozitif PCR ürünlerini hızlı klonlama kiti kullanarak klonlama (bkz. Malzeme Tablosu). Reaksiyon karışımını DH5α yetkin hücrelere dönüştürün.
- Dönüşüm başına rastgele 8-10 bireysel bakteri kolonisi seçin ve Sanger dizilimi ile PCR ürünlerini adım 5.2.3'ten diziler.
-
Pozitif darbe hücrelerinin immünoblot analizi ve benzeşim saflaştırması ile doğrulanması
NOT: Aday hücreler, İçN'nin yerleştirilmesinin doğrulanması için immünoblot analizine veya protein-protein etkileşimi çalışmaları için benzeşim saflaştırmasına (AP) tabi tutulur.- Antikor üreticisinin talimatlarına göre immünoblot analizi yapın. Birincil antikorların ve ikincil antikorların kullanımı hakkında bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.
- Ost etiketli İçN'yi ifade eden darbe hücrelerinin lysates'lerini, üreticinin talimatlarını takip eden Strep-Tactin Sepharose boncuklarını kullanarak AP'ye tabidir (bkz. Malzeme Tablosu).
- Bir görüntüleyicı kullanarak chemiluminescence tespit edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolün ardından murine RAW264.7 makrofajlarını kullanarak mRosa26 lokusunda darbe deneyleri yapmak için SARS-Cov-2 virüsü için bir reseptör olan insan ACE2'yi ifade etmek için bir hedefleme vektörü tasarladık (Şekil 2A). Benzer bir tasarım kullanarak, OST etiketli RASGRP1 füzyon proteininin(Şekil 2C)çalınmasıyla insan Jurkat T hücreleri oluşturduk. crispr/cas9 (DsRed2; pDsR-mR26-sg1 ve mRosa26 knock-in için pDsR-mR26-sg2 ifade için kullanılan üç plazmid transfection sonra; hROSA26 knock-in için pDsR-hR26-sg1 ve pDsR-hR26-sg2) ve homolog rekombinasyon (EBFP2) için DNA şablonu olarak kullanılan bir diğeri, iki floresan muhabiri ifade eden çift pozitif hücreler 96 kuyulu bir plakaya sıralandı. Tek hücre sıralama modu kullanılarak sıralanan RAW264.7 hücrelerinin %0.91'i DsRed2+ EBFP2+idi, ancak her kuyuda 10 hücre toplandı (Şekil 2B). Jurkat T hücreleri daha yüksek transeksiyon verimliliğine sahipti ve bu temsili deneyde çift pozitif hücrelerin yüzdesi% 7.91 idi ve OST-RASGRP1 füzyon proteininin başarılı bir şekilde çalındığını gösterdi (Şekil 2D).
Bir sonraki adımda, EBFP2 pozitif hücrelere sahip aday kuyuları taramak için akış sitometrisi kullanıldı. Temsili histogramlar bariz EBFP2 pozitif popülasyonlar olduğunu göstermiştir (Şekil 3). Hücre sıralamadan iki hafta sonra akış sitometrisi yapılırken darbe hücrelerinin DsRed2'yi ifade etmediği dikkat çekicidir.
Hassas darbelerin ve rastgele eklemelerin ayrımcılığı için, EBFP2 pozitif hücrelerden genomik DNA, hedefleme vektörün HA'larına ve ifade kasetinin içindeki belirli bölgeye harici genomik diziyi tanıyan astarlarla PCR yapılarak daha fazla test edildi (Şekil 4A ve 4B). Bu PCR ürünlerinin sıra analizi, mRosa26 hedef sitesinde HDR oluşumunu doğruladı (Şekil 4C). Aynı genotipleme stratejisi, Jurkat T hücrelerininhROSA26 locus'una ifade kasetinin hassas bir şekilde yerleştirilmesini doğrulamak için de uygulanabilir.
HACE2 ifade eden RAW264.7 hücrelerinin saf popülasyonu elde etmek için, hücreleri daha da sıraladık ve vahşi tip hücreleri kontrol olarak kullanarak genişlemeyi takiben floresan muhabirlerin varlığını doğruladık (Şekil 5A). Genişletilmiş hücreler EBFP2 pozitifti ve hACE2 proteini murine RAW264.7 makrofajlarında(Şekil 5B ve 5C)kolayca tespit edilebilen bir proteindi. Benzer şekilde, taramadan sonra insan Jurkat T hücrelerinde floresan muhabirlerin ve OST-RASGRP1 proteininin ekspresyonunun ve ikinci bir hücre sıralama turunu(Şekil 6A ve 6B)doğruladık. Ek olarak, OST-RASGRP1 proteininin benzeşim saflaştırılması ticari olarak mevcut boncuklar kullanılarak gerçekleştirildi. Jurkat hücrelerinin toplam hücreli lysates'inde vahşi tip hücrelere göre daha yüksek miktarda RASGRP1 proteini bulduk; RASGRP1 nakavt Jurkat hücreleri kontrol olarak kullanılmıştır (Şekil 6C). OST etiketi kullanılarak saflaştırmadan sonra, yalnızca darbe örnekleri algılanabilir RASGRP1 'e sahipti (Şekil 6D).
Şekil 1. İlgi çekici bir proteini ifade eden mRosa26/hROSA26 darbe hücre hatları oluşturmak için gen hedefleme stratejisi. (A) mRosa26-spesifik kılavuz RNA hedefleme dizileri ve istenen ekleme alanındaki protospacer bitişik motifleri (PAM'ler) sırasıyla mavi ve kırmızı harflerle belirtilir. CAS9 normalde yeşil oklarla gösterilen PAM dizisinin 3-4 bp yukarı akışını ayırır. Hedefleme vektörü, fareye veya insan genomuna ifade kasetinin hassas bir şekilde yerleştirilmesine yol açan homolojiye yönelik onarım (HDR) için bir şablon olarak kullanılır. İstenen hedef alanın yukarı ve aşağı akıştaki 1 kb sıralarının her biri, hedefleme vektöründe 5' ve 3' homoloji kolları (HAs) olarak kullanılır. HA'lar bir CAG promotörü, ilgi çekici proteinin (POI) OST etiketine sahip cDNA dizisi, bir IRES-EBFP2 muhabiri ve bir bGH-polyA sinyalinden (pA) oluşan bir ifade kaseti ile ayrılır. Kısıtlama sitesi AscI, İçN'nin klonlanması için kullanılır ve EcoRI ve BamHI hedefleme vektörün doğrusallaştırılması için kullanılır. HROSA26 lokusunda CRISPR/Cas9 aracılı knock-in stratejisi benzerdir. (B) İnsan ROSA26 çekirge şeması. hR26-sg1 ve hR26-sg2 hedefleme sıraları mavi harflerle ve karşılık gelen PAM dizileri kırmızıyla gösterilir. (C) İnsan U6 tahrikli sgRNA ifade kaseti ve Cas9-T2A-DsRed2 floresan muhabir kaseti içeren hepsi bir arada CRISPR ifade vektörü pX458-DsRed2 için şematik. İki BBSI kısıtlama sitesi, kılavuz RNA'nın klonlamasına izin verir. U6, insan U6 RNA polimeraz III promotör; sgRNA, bir kimerik tek kılavuzlu RNA; CBh, tavuk β-actin hibrid organizatör; NLS, nükleer yerelleştirme sinyali; T2A, Thosea asigna virüs 2A kendinden bire bir peptit; bGH-pA, sığır büyüme hormonu poliadenilasyon sinyali. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. RAW264.7 ve Jurkat hücrelerinin tek hücreli tasnifinde CRISPR/Cas9 vektörleri ile transkredasyon ve homolog rekombinasyon için hedef vektörler. RAW264.7 (A) ve Jurkat (C) hücrelerinde kararlı gen ekspresyörü için kullanılan hedefleme vektörleri. Fare RAW264.7 makrofajları (B) ve insan Jurkat T hücrelerinin (D) temsili akış sitometrik çizimleri, DsRed2 muhabirini ve EBFP2 muhabirini ifade eden hedefleme vektörünü ifade eden CRISPR / Cas9 vektörleri ile trans enfekte olur. DsRed2 ve EBFP2'yi birlikte ifade eden hücreler hücre sıralamaya tabi tutuldu ve genişleme için kültürlendi; anahattlanan alanlara bitişik sayılar her kapıdaki hücrelerin yüzdesini gösterir ve transfected olmayan hücreler negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. EBFP2 ekspresyozunun algılanarak darbeli hücrelerin taranması. EBFP2 + ve DsRed2+ RAW264.7 makrofajlarının (A) ve Jurkat T hücrelerinin (B) elektroporasyondan 14 gün sonra akış sitometrik analizi. Histogramlarda, X ekseninde EBFP2+ veya DsRed2+ hücrelerinin floresan yoğunluğu (FI) ve her floresan kanalındaki olayların sayısı Y ekseninde görüntülenir. (A) EBFP2 ve hACE2 ifadesi, RAW264.7 murine makrofajlarındaki Rosa26 lokusunda aynı promotör tarafından yönlendirildi. (B) Jurkat hücrelerinde OST-RASGRP1 ekspresyeri insan ROSA26 lokusundaki EBFP2 ekspresyâtı ile bağlantılıdır. Elektroporasyon sonrası 14 gün boyunca, akış sitometrik analizi, sıralanmış hücreler arasında yaklaşık sıfır DsRed2+ hücre olduğunu ortaya koydu. Negatif kontrol olarak vahşi tip (WT) hücreler kullanıldı ve KI, darbeli hücreler anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. PCR ve sıralama ile aday çakma hücrelerinin taranır. (A) hACE2 darbe hücreleri oluşturma stratejisi. Hassas HDR ve rastgele eklemeyi ayırt etmek için kullanılan PCR astarlarının konumları yeşil oklarla gösterilir. (B) Şekil 3'te örneklenilen EBFP2 ekspresyifi için akış sitometrisi taraması ile tanımlanan beş aday hücrenin (#4, #15, #22, #25 ve #43)PCR genotiplemesinin, hem 5' kavşağın (1472 bp) hem de homoloji kollarını kapsayan 3' kavşak (1472 bp) doğru olduğunu göstermiştir. M, DNA merdiveni; WT, vahşi tip RAW264.7 kontrolü; H2O, negatif kontrol. (C) PCR ürünlerinin B'den sanger dizilimi, hACE2 ekspresyon kasetinin mRosa26 lokusuna mutasyon olmadan başarılı bir şekilde girdiğini ortaya çıkardı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. HACE2 ifade kasetinin RAW264.7 makrofajlarında mRosa26 lokusuna başarılı bir şekilde girildiğinin doğrulanması. (A) WT RAW264.7 makrofajları akış sitometrik analizi için negatif kontrol olarak kullanılmıştır. (B) EBFP2 pozitif hücreleri negatif hücrelerden ayırmak için, hACE2 KI hücreleri olarak belirlenen yaklaşık% 100 EBFP2+ knock-in hücrelerinden oluşan bir popülasyon elde etmek için ek bir hücre sıralama turu gerçekleştirildi. CRISPR/Cas9 plazmidinin RAW264.7 makrofajlarının genomuna entegre olmadığından emin olmak için DsRed2 ekspresyafı da incelendi. Histogramlarda, X ekseninde EBFP2+ veya DsRed2+ hücrelerinin floresan yoğunluğu (FI) ve her floresan kanalındaki olay sayısı Y ekseninde görüntülenir. (C) Tavşan anti-insan ACE2 monoklonal antikor kullanılarak immünoblot analizi ile hACE2 ekspresyonunun tespiti. Birden fazla kuyudan (#4, #15, #22, #25 ve #43) hücrelerde hACE2 ekspresy ekspresy hızı gözlendi. WT RAW264.7 makrofajları negatif kontrol, GAPDH ise yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. OST-RASGRP1 ifade kasetinin Jurkat T hücrelerindeki hROSA26 lokusuna başarılı bir şekilde girildiğinin doğrulanması. (A) WT Jurkat T hücreleri akış sitometrik analizi için negatif kontrol olarak kullanılmıştır. (B) Jurkat hücrelerinin EBPF2+ alt nüfusları ek hücre sıralama turları ile zenginleştirilmiş ve genişletilmiştir; bu hücreler OST-RASGRP1 KI hücreleri olarak belirlenmişti. Darbe hücreleri akış sitometrisi ile analiz edildi ve DsRed2 ifade eden vektörü tutmadı. Histogramlarda, EBFP2+ veya DsRed2+ hücrelerinin floresan yoğunluğu (FI) X ekseninde ve her floresan kanalındaki olayların sayısı Y ekseninde görüntülenir. (C) İki bağımsız knock-in hücrede (#1 ve #2) OST-RASGRP1 ekspresyonunun anti-RASGRP1 antikoru kullanılarak immünoblot analizi ile algılanmasını. Kontrol olarak WT Jurkat ve RASGRP1-nakavt Jurkat hücreleri, yükleme kontrolü olarak ise β-actin kullanıldı. (D) OST-RASGRP1'in ifadesini doğrulamak için RASGRP1 nakavt hücrelerini negatif kontrol olarak kullanarak OST aracılı benzeşim saflaştırması kullanılmıştır. Strep-Tactin Sepharose boncuklarında (Benzeşim saflaştırması) benzeşim saflaştırmasına maruz kalan veya doğrudan analiz edilen (Total lysates) ve RASGRP1 veya GAPDH (yükleme kontrolü) antikorları ile araştırılan hücre lysates'ten elde edilen eşit miktarda proteinin immünoblot analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya: Destekleyici şekiller, tablo ve diziler Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deneylerimizde, örnek olarak insan Jurkat T hücreleri ve murine RAW264.7 makrofajlarını kullanarak yapı tasarımından knock-in hücre taramasına ve doğrulamasına kadar bağışıklık hücrelerinde nasıl knock-in düzenlemenin gerçekleştirildiğini gösterdik. Hem T hücresi hem de makrofaj hücre hatları transfection36,37'yekarşı dirençlidir; bununla birlikte, CRISPR/Cas9 teslimatının düşük verimlilik sorunu, hücre sıralama ile birlikte floresan muhabirlerin yardımıyla aşılabilir. Bu protokol gen kurtarma deneyleri ve protein-protein etkileşim deneyleri için uygundur, ancak transkripsiyon faktörlerinin bağlanma bölgeleri gibi düzenleyici DNA dizilerinin çalışmasına uygulanamaz, çünkü protokol Rosa26 locus'un darbe modifikasyonu için geliştirilmiştir.
Çift floresan muhabir CRISPR/Cas9 knock-in düzenleme yardımcı oldu
Bağışıklık hücrelerindeki bağımsız CRISPR/Cas9 vektör setlerini geçici olarak ifade etmek için çift floresan muhabir sistemini başarıyla uyguladık, bu da önceki çalışmalarda büyük DNA parçalarının silinmesine neden oldu21. DsRed2 floresan proteinini muhabir olarak kullanarak bir CRISPR/Cas9 hedefleme aracı ve darbe modifikasyonu için DNA şablonunun teslimini izlemek için ek bir spektral olarak farklı floresan protein tasarladık. Darbeli alaşim modifikasyonunu mümkün kılmak için, homolog rekombinasyon sırasında şablon olarak hizmet veren donör DNA'sının transfeksiyonunu izlemek için RFP (bizim durumumuzda DsRed2) ile spektral dökülme olmayan EBFP2 floresan protein muhabirini kullandık. İçN ve floresan muhabiri ifade eden kaseti optimize etmek için, bağımsız proteinler elde etmek için bir IRES dizisi tanıtıldı. Önceki çalışmamızda, transkripsiyon sonrası bölünme sonrası kalan P2A veya T2A bağlayıcısından kalan amino asitlerin hücre yüzeyinde protein lokalizasyonunu etkilediğini belirtmiştik. IRES dizisi bu tür artık amino asitleri bırakmaz. Önceki bir çalışmada açıklandığı gibi, IRES, CAG promotörü38tarafından yönlendirilen Cas9 proteininin ifadesinin ardından floresan muhabirin daha yüksek seviyelerine yol açtı.
Hepsi bire bir CRISPR/Cas9 plazmid
CRISPR/Cas9 sisteminin çeşitli formatları ve kombinasyonları, cas9 transfeksiyonu gibi önceki çalışmalarda kimyasal olarak sentezlenen sgRNA'lar39ile birlikte mRNA veya protein olarak tanımlanmıştır. CRISPR/Cas9 RNP kompleksleri de memeli hücrelerine teslim edilmiştir; bu strateji, nükleaz aktivitesinin daha erken başlamasının ve daha kısa bir yarı ömrün avantajlarını sunar; bununla birlikte, RNP'leri etiketlemek, hepsi bir arada plazmid oluşturmaya kıyasla daha az uygun maliyetlidir. Önceki çalışmalarımızda, CRISPR/Cas9 (DsRed2 pozitif) ve darbe proteinini (EBFP2 pozitif) ifade eden nadir hücreleri izole etmek için tek hücre sıralama kullanmanın RNP doğumunu kullanmaktan çok daha az karmaşık olduğunu ve plazmidleri hazırlamanın kolay olduğunu bulduk. Bu iletişim kuralının tek hücre sıralamaya dayandığı doğrudur. Ancak protokolümüzün gerçekleştirilmesi kolaydır ve yüksek tekrarlanabilirlik ile başarılı darbe modifikasyonları sağlar.
Rosa26 lokusundan İçN ifadesi
Literatürde, CRISPR/Cas9 düzenleme40 , 41,42kullanarak floresan muhabirlerle endojen proteinleri etiketleme yöntemlerini açıklayan birden fazla rapor vardır. Endojen etiketlemenin avantajları, hücre altı lokalizasyonunu belirlemenin ve endojen proteinin in vivo takibini gerçekleştirmenin mümkün olmasıdır. Ancak endojen lokusta uygun bir CRIPSR kılavuz RNA'sı tasarlamak mümkün değilse sorunlarla karşılaşılabilir. Burada POI-IRES-EBFP2'yi genomik güvenli liman lokusu Rosa26'ya dahil ederek alternatif bir darbe yöntemi geliştirdik Endojen etiketleri konumlandırmak için uygun kılavuzları bulma sınırlamalarının üstesinden geliyor.
Teknik tekrarlanabilirliği sağlamak için deneyler sırasında dikkat edilmesi gereken birkaç önemli noktayı özetleriz. İlk olarak, hücre sıralayıcısının EBFP2'nin çıkarılması için 405 nm mor lazere ve DsRed2'nin çıkarılması için 488 nm mavi lazere veya alternatif olarak 561 nm sarı lazere sahip olması gerekir. Bu tür yapılandırmalarla, EBFP2 ve DsRed2 spektral dökülme olmadan tespit edilebilir ve bu da yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir. Deneylerimizde DsRed2+ EBFP2+ çift pozitif hücrelerin oranı %0,9 kadar düşüktü; bu nedenle, deneylerin başarısı için uygun popülasyonun gating'i şarttı. EBFP2+ pozitif hücrelere geçit vermek için ikinci bir sıralama turu ve ardından PCR doğrulaması gerçekleştirildi. Ek olarak, darbeli protein tespiti için OST veya başka bir etiket türü gibi bir protein etiketinin tanıtılması tercih edilir. Rosa26 locus knock-in deneylerinden önce genin nakavtı, antikorun istenen özgüllüğe sahip olup olmadığını değerlendirmek için iyi bir fırsat sağlar. Antikor özgüllüğü yeterli olmadığında, darbe proteininin tespiti protein etiketi üzerinden çekildi sonra yapılmalıdır. Son olarak, darbe alelesini ifade eden hücrelerin FACS taraması sırasında, EBFP2'nin yoğunluğu, iki kopyanın veya darbe alelesinin bir kopyasının bulunup bulunmadığını değerlendirmek için kullanılabilir.
Uygulama
Bu protokolde, T hücre aktivasyonunda yer alan önemli bir molekül olan RASGRP1'in darbe modifikasyonunu tanımladık27. İlk olarak fonksiyon kaybı çalışmaları için kullanılabilecek RASGRP1-nakavt Jurkat hücreleri elde ettik ve hROSA26 lokusta OST-RASGRP1'i ifade eden ek Jurkat hücreleri oluşturduk. Jurkat hücreleri, T hücre biyolojisi43. Kanser hastalarında T hücre tükenmesini önlemede immünoterapinin başarısı nedeniyle, immünologlar ve kanser biyologları aday moleküllerin fonksiyonel çalışmaları için Jurkat hücrelerini değiştirmeye büyük ilgi göstermektedir. Jurkat T hücre hattının sinyal yollarının diseksiyonu için yaygın olarak kullanılması da dikkat çekicidir, ancak Jurkat hücreleri uyarılma üzerine IFN-γ zayıf üreticileri olduğu için bu hücre hattının kullanılmasında sınırlamalar vardır44. Önceki çalışmalarda insan Jurkat hücrelerinde darbe deneyleri yapmak için hem endojen lokus modifikasyonu45 hem de hROSA26 locus46'da genetik mühendisliği kullanılmıştır. Her iki stratejinin de kendi avantajları vardır; endojen lokusun modifiye ederek protein muhtemelen "fizyolojik" düzeyde ifade edilir. hROSA26 lokusunda darbe modifikasyonu öngörülebilir sonuçlar üretir, çünkü mRNA'nın alternatif bir şekilde birleştirilebilir ve değiştirilmiş proteinin bolluğu da kolayca tespit edilebilir. Adeno ilişkili virüs bölgesi 1 (AAVS1) ve kemokin (CC motifi) reseptörü 5 (CCR5)47,48 gibi diğer genomik güvenli limanlar daha fazla araştırmayı hak ediyor.
Önceki çalışmamızda, Vav1-OST, çok sık kullanılan makrofaj hücreleri olan RAW264.7 hücrelerindeki Rosa26 locus faresinde daha yüksek seviyelerde ifade edildiğinde, yüksek yem proteini seviyeleri ve OST benzeşim saflaştırmasının yüksek verimliliği nedeniyle düşük eksprese edilmiş Vav3 molekülleri ile etkileşimini tespit edebildik13. Ayrıca, sars-CoV-2 için bir reseptör olan ve bol ekspresyon garantili olan hACE2'yi kasten ifade eden bir makrofaj hücresi hattı oluşturmak için yapılan darbeli deneyleri de tanımladık. Tek hücreli RNA dizileme veritabanında, murine Ace2 akciğer makrofajlarında ifade edilir ve geliştirdiğimiz hACE2'yi ifade eden genetik hücresel model SARS-CoV-2 enfeksiyonu sırasında makrofajların çalışmaları için yararlı olabilir.
Diğer hususlar
Bu protokol, bir floresan muhabirin akış sitometrik analizleri yardımıyla bir İçN'yi ifade eden darbe hücrelerini tanımlamak için tasarlanmıştır, bizim durumumuzda EBFP2 muhabiri. Bununla birlikte, FACS tarafından tespit edilebilen yüzey etiketleme antikorları bir yüzey proteini için mevcut olduğunda49, muhabir sistemini kullanmak gerekli değildir50. T hücresi ve makrofaj hücre çizgilerinin yanı sıra interactome çalışmaları için kullanılan OST etiketli protein örnekleri esas olarak sinyal çalışmaları için kullanılır ve bu sinyal moleküllerinin çoğu hücrelerin sitozol veya çekirdeğinde lokalizedir. Bu nedenle, istenen darbe hücrelerinin tanımlanması için floresan bir muhabire ihtiyaç duyulabilir.
Bu protokolün hücre hatları için geliştirildiğini ve T hücreleri, monositler/makrofajlar gibi birincil bağışıklık hücrelerine uygulamanın doğrulandığını belirtmek önemlidir. Hücrelerin çoğalma kapasitesinin sınırlı olması nedeniyle, bu protokolü birincil bağışıklık hücreleriyle kullanmak için önermiyoruz. Floresan muhabir EBFP2, bir IRES elemanı kullanılarak darbe gen veya İçN ile aynı promotör altında ifade edildiği için, darbe geninin yokluğunda floresan muhabiri ifade eden hücreleri gözlemlemedik. Floresan protein eksprese eden hücrelerin iyileşmesinin homolog rekombinasyonun başarısına oldukça bağlı olduğundan şüpheleniyoruz. Önceki bir çalışmada bildirildiği gibi, darbe verimliliği çok düşük olduğunda tek hücre sıralama ile doğru knock-in hücrelerini sıralamak, genişletmek ve tanımlamak sıkıcıdır42Başarı oranını artırmak için hücreleri neden toplu olarak sıralamamız gerektiğini de açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Xinxiang Tıp Üniversitesi'nin akış sitometri çekirdek tesisine teşekkür ederiz. Bu teknolojinin geliştirilmesi, NSFC'nin LZ, 81471595 ve 32070898 YL'ye 81601360 vermesiyle desteklenmiştir. Çalışma ayrıca 21IRTSTHN030 sayılı Henan Eğitim Komitesi Vakfı tarafından da desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amersham Imager 600 | Ge Healthcare | imaging of chemiluminescence | |
| Ampicillin, sodium salt | MP Biomedicals | 194526 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074 | at 1/5000 dilution |
| Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 | Merck | MABS146 | 1.0 μg/mL of working concentration |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| β-Actin (D6A8) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 8457 | at 1/1000 dilution |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | |
| BbsI-HF | New England BioLabs | R3539S | |
| Cellometer Mini Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | ||
| E.coli DH5α Competent Cells | Takara | 9057 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | MP Biomedicals | 196055 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | cell culture reagent |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14200075 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | HyClone | SH30022.01 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
| FACSAria™ Fusion | BD Biosciences | equipped with biosafety cabinet | |
| FACS Canto flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube | BD Biosciences | 352003 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10099141 | |
| FlowJo version 10.7 | BD Biosciences | ||
| GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 5174 | at 1/1000 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | ThermoFisher Scientific | 31430 | at 1/5000 dilution |
| Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Immobilon-PSQ PVDF Membrane | Millipore | ISEQ00010 | |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/ |
| Kanamycin sulfate | MP Biomedicals | 194531 | |
| LB agar powder | ThermoFisher Scientific | 22700041 | |
| Multi-channel Pipette (30-300 μL) | Eppendorf, or similar | ||
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
| Neon Transfection System, 10 μL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix | New England BioLabs | (M0489) | for high GC% template |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | ThermoFisher Scientific | 26616 | |
| Pipette tip 0.1-20µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.005 | |
| Pipette tip 2-200µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.021 | |
| Pipette tip 50-1000µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.064 | |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| pX458-DsRed2 | Addgene | 112219 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | purify plasmid from restriction digestion |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England BioLabs | M0494S | |
| RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | https://www.atcc.org/ |
| Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] | Abcam | ab108252 | at 1/1000 dilution |
| RPMI 1640 Medium | HyClone | SH30027.01 | |
| Strep-Tactin Sepharose beads | IBA Lifesciences | 2-1201-010 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | S34859 | |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-Rad | ||
| 1.5 mL microtubes, PCR-clean | Eppendorf, or similar | 0030 125.215 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
| 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates | Corning | 3599 | |
| 96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate | Corning | 3799 |
References
- Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
- Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
- Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
- Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
- Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
- Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
- Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
- Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
- Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
- Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
- Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
- Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
- Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
- Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
- Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
- Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
- Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
- Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
- Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
- Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
- Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
- Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
- Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
- Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
- Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
- Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
- Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
- Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
- Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
- Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
- Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
- Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
- Freen-van Heeren, J. J. -, Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
- Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
- He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
- Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
- Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
- Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
