Summary
Kryo-sektion-dissektion tillader frisk, frossen forberedelse af den største neurogene niche i murinhjernen til dyb kvantitativ proteomanalyse. Metoden er præcis, effektiv, og forårsager minimal vævforstyrrelse. Derfor er det ideelt egnet til at studere det molekylære mikromiljø af denne niche samt andre organer, regioner og arter.
Abstract
Den subependymale neurogene niche består af et paraventrikulært bånd af den laterale ventrikulære væg af den laterale ventrikel. Den subependymale zone (SEZ) er en tynd og særskilt region udsat for hjertekamre og cerebrospinalvæske. Isoleringen af denne niche gør det muligt at analysere et neurogent stamcellemikromiljø. Ekstraktion af små væv til proteomanalyse er imidlertid en udfordring, især for vedligeholdelsen af betydelig måledybde og opnåelse af pålidelig robusthed. En ny metode, der kaldes kryosektionsdektion (CSD), der kombinerer høj præcision med minimal vævsforstyrrelse, blev udviklet for at løse disse udfordringer. Metoden er kompatibel med state-of-the-art massespektrometri (MS) metoder, der tillader påvisning af lav-rigelige niche regulatorer. Denne undersøgelse sammenlignede CSD og dets proteomdata med den metode og de data, der blev opnået ved laser-capture-microdissection (LCM) og en standard dissektion af helemount. CSD-metoden resulterede i dobbelt kvantificeringsdybde på mindre end halvdelen af forberedelsestiden sammenlignet med LCM og udkonkurrerede samtidig klart dissektionspræcisionen af helmonte dissektionen. Derfor er CSD en overlegen metode til indsamling af SEZ til proteomanalyse.
Introduction
Som neurogenese er begrænset i den voksne hjerne, forskellige centralnervesystemet reparation strategier ville i høj grad drage fordel af en øget forståelse af grundlaget for voksne neurale udskiftning. Gnavere har hjulpet os med at forstå de grundlæggende mekanismer i postnatal neurogenese, selvom det skal bemærkes, at voksen neurogenese er meget artsafhængig. I mus er der tre voksne neurale stamceller (NSC) nicher. Hypothalamus er en voksen NSC niche med neurogene potentiale1,2, mens kontinuerlig voksen neurogenese er hovedsageligt begrænset til hippocampus3 og SEZ af de laterale vægge af de laterale hjertekamre4,5,6. SEZ er den største germinale region, der indeholder NSC'er (type B-celler), der udvikler sig til neuroblaster (type A-celler) via transitforstærkende stamfaderceller (type C-celler). SEZ indeholder 20-35% af type B-celler, 1-15% af type C-celler, 1-30% af type A-celler og 25-50% af ependymale celler7. SEZ har en kompleks mikroarkitektur, med endotelceller, mikrogliale celler, og ependymale celler bosat i og påvirke stamcelle niche8,9,10. Selv om neuroner er knappe i SEZ, axoner stammer fra fjerne kilder såsom striatum, ventral tegmental område, eller hypothalamus nå og påvirke type B celler4. Et unikt træk ved denne stamcelle niche er adskillelsen mellem stedet for spredning og stedet for differentiering. Efter spredning migrerer neuronale forfædre flere millimeter fra SEZ til den olfaktoriske pære, hvor de terminalt differentierer sig i neuroner og integreres i allerede eksisterende neurale kredsløb. Undersøgelser af celle-iboende programmer forbundet med neurogenese har allerede givet viden vigtigt for eksperimentel terapeutisk celle omprogrammering og transplantation strategier15,16,17,18,19,20. Men, celle-extrinsiske signaler også regulere neurogenese, og væv miljøer kan bestemme neurogene skæbne stamceller11,12,14,21,22,23. Derfor er undersøgelsen af mikromiljøet af de neurogene nicher og dets interaktion med stamcellerne af afgørende betydning.
Den ekstracellulære matrix (ECM) og andre udskillede proteiner er en stor del af mikromiljøet. For nøjagtig identifikation og kvantificering er en proteomisk tilgang bedre egnet end en transskriptom tilgang til at bestemme ECM-sammensætning på grund af den lave korrelation mellem transskriptom og proteinniveauer for ECM24,25. Desuden er der væsentlige beviser for, at nicheregulatorer i SEZ ikke udelukkende produceres af celler, der befolker selve nichen. Fjernere steder, såsom choroid plexus, udskiller modulerende signaler, der sendes til stamceller via cerebrospinalvæsken22,23. Undersøgelse af niche proteom kan bidrage til at identificere niche regulatorer til stede i nichen uafhængigt af deres produktionsanlæg, da en betydelig del af den ekstracellulære mikromiljø er samlet af proteiner.
For at indsamle murin ventrikulær zone for upartisk proteomisk analyse, en metode med høj præcision er nødvendig, indfange ca. 50 μm tynde paraventrikulære bånd, der indeholder stamceller, mens du udelukker væv af den tilstødende striatum. Desuden skal vævsforstyrrelser under dissektionen minimeres til analyse af det ekstracellulære mikromiljø, fordi opløselige proteiner, herunder vækstfaktorer eller cytokiner, let kan vaskes væk. Selv om det er muligt at analysere massespektre af fast væv, det krævede middel, såsom paraformaldehyd, vil reducere protein identifikation dybde og kan indføre posttranslationelle ændringer. En fælles SEZ-dissektion med helemount, f.eks. til indsamling af celler til fluorescensaktiveret cellesorteringsanalyse, fjerner hele SEZ med en saks26. Denne standard dissektion er hurtig med minimal vævsforstyrrelse. Striatal forurening af prøverne kan dog ikke undgås. Omvendt har LCM den enestående fordel af overlegen dissektion præcision. LCM kan dog indføre vævsforstyrrelser, for eksempel på grund af baggrundsfarvning eller laserbaseret proteindeaturering. For at kombinere styrkerne i helmount dissektion og LCM, en ny metode, der er kompatibel med MS, kaldes cryo-sektion-dissektion (CSD), blev udviklet (Figur 1A-D). CSD tillader udvinding af SEZ og dissektion af SEZ af de mediale vægge af de laterale hjertekamre (MEZ), som er en ideel, for det meste ikke-neurogen kontrol region for SEZ (se protokollen). Niche proteom opnået ved kombinationen af CSD og state-of-the-art MS metoder viste sig at være nyttige for karakterisering og identifikation af nye tilsynsmyndigheder i denne voksne NSC niche25. Derfor vil denne metode være nyttig til bestemmelse af SEZ vævsproteinsammensætning.
Protocol
Alle forsøgsprocedurer i denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med tyske og EU's retningslinjer og blev godkendt af det institutionelle dyreplejeudvalg og regeringen i Oberbayern i Oberbayern. Kun han-C57Bl6-mus i alderen 8-10 uger blev brugt til forsøgene.
1. Forberedelse af musehjernen (~ 15 min pr. Mus)
- Dissektionsmediet forberedes ved at tilsætte 5 mL 1 M HEPES (endelig koncentration 10 mM) til 500 mL 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
BEMÆRK: Dissektionsmediets opbevaringstid (+4 °C) må ikke overstige 2 uger. - Ofre musene ved cervikal dislokation og omhyggeligt dissekere hjernen.
BEMÆRK: Ved undersøgelse af ECM skal vævet helst være uændret. Cervikal dislokation holder dissektionstiden så kort som muligt og forhindrer derved post-dødelige enzymatiske autodigestion så meget som muligt. Hvis fjernelse af blod er afgørende for forskningsspørgsmålet, skal du blot gennemtrænge musen transcardially med fosfat-buffered saltvand (PBS), før du fjerner hjernen. - Udtræk hjernen ved manuel dissektion og læg den i en kulturskål, der indeholder iskold dissektionsmedium (Figur 1B - 1).
BEMÆRK: Hold hjernen i dissektionsmedium på is under hele dissektionen. - Fjern den olfaktoriske pære (OB) med en skalpel (Figur 1B - 2) med en lige koronar snit mellem OB og den forreste stang af cortex.
- Fjern den forreste stang af cortex med skalpellen ved hjælp af en koronar snit for at gøre de laterale hjertekamre synlige i koronar plan (Figur 1B - 3).
BEMÆRK: Sørg for, at koronarsnittet er lavet ~ 5 mm rostrally fra den optiske chiasm; Ellers vil den rosenkranse del af SEZ / MEZ gå tabt. - Brug en saks, åbn begge laterale hjertekamre fra toppen, begyndende med en sagittal sektion fra den kortikale overflade til ventrikulær lumen, og aflange dette snit på en c-formet måde efter ventrikulær fleksion (Figur 1B - 4).
- Tilslut de kaukale ender af venstre og højre sagittal snit ved hjælp af en ekstra koronar snit med saksen.
BEMÆRK: De tre nedskæringer danner nu en trapez og vil lette fjernelsen af cortex og corpus callosum i næste trin. - Fjern cortex og corpus callosum dækker de laterale hjertekamre ved hjælp af sammenkæd (Figur 1B - 5). Fjern derefter cortex og corpus callosum, der dækker de mediale ventrikulære vægge. Her skal du foretage yderligere nedskæringer, hvis vævet er fastgjort til de mediale ventrikulære vægge, eller blot løfte cortex og corpus callosum med en saks for at løsne vævet.
- Spred forsigtigt ventrikulære vægge med sammenkøjede (figur 1B - 6). Fjern choroid plexus med sammenkrampe.
BEMÆRK: Fuldstændig fjernelse af choroid plexus er vigtigt for at undgå interferens med følgende dissektionstrin og undgå potentiel forurening af SEZ/MEZ-prøverne. - Sæt hjernen på en glasrutschebane og læg glasrutschebanen oven på tøris for at fryse hjernen. Vedligehold ventrikulære vægge i den åbne konfiguration.
BEMÆRK: Sørg for tilstrækkelig afstand mellem ventrikelens side- og mediale vægge til at lette præcis og eksklusiv dissektion af SEZ og MEZ. Hvis vævet trækker sig tilbage i en lukket konfiguration, skal du bruge kraften til at fastgøre væggene i den ønskede position under frysning. Undgå skader på SEZ/MEZ. Prøv at anvende minimal kraft, hovedsagelig på den øverste kant af de åbnede hjertekamre.
2. Indsnit af den forberedte hjerne (~ 15 min pr. Mus)
- Skær 50-100 μm tykke koronar dele af hjernen indtil slutningen af den laterale ventrikel ved hjælp af en kryostat og montere sektionerne på glas dias. Sørg for, at hjernen er fastgjort til kryostat vedhæftet fil plade på baghjernen med OCT medium, og at ingen OCT kommer i kontakt med forhjernen, især på hjertekamrene.
BEMÆRK: OCT medium vil forstyrre MS målinger. Men hvis vævet vil blive brugt til en antistof assay, Er det unødvendigt at udelukke OLT medium. Det anbefales ikke at anvende overtrukne glasrutschebaner. Coatede dias anvender for meget klæbekraft på vævet og hæmmer derved translokationen af vævsprøven fra diasene ind i mikrocentrifugrøret i de følgende trin.
3. Frihånds dissektion af hjerneskiver (~ 30 min pr. mus)
- Placer glasrutschebanerne med hjernesektionerne på tøris under et dissektionsmikroskop (Figur 1C - 1).
- Mikrocentrifugrørene forberedes på tøris, og sørg for, at rørene bliver på tøris i mindst 1 minut til at være tilstrækkeligt kolde, inden prøveoverførslen overføres.
BEMÆRK: Brug mikrocentrifugerør af høj kvalitet, da nogle rør af lav kvalitet kan kaste plastik i de efterfølgende væv fordøjelsestrin forbundet med MS målinger. - Løft skiverne fra tøris i 15-30 s for at opnå en kort, ufuldstændig optøning for at gøre striatums kompakte myelin observerbar som tætte hvide prikker.
BEMÆRK: Det bliver muligt at lokalisere grænsen mellem SEZ og striatum (figur 1C - 2, se figur 2A for udelukkelse af myelin og en sammenligning med helhedsmetoden). Hvis optøning tager for lang tid, kan processen fremskyndes ved at trykke en handske-dækket finger på den modsatte side af glasrutschebanen. Denne manøvre bør dog praktiseres, da overdreven optøning let opstår. - Adskil SEZ med en forkogt skalpel fra den tilstødende striatum (Figur 1C,D).
- Overfør SEZ enten som et helt stykke eller opdelt i 2-4 dele i et mikrocentrifugerør ved hjælp af den stumpe kant af den afkølede skalpel. Hvis vævet skal anvendes til en anden type analyse end MS, overføres vævsprøven i stedet til den relevante beholder (f.eks. en 96-brøndsplade).
BEMÆRK: Hvis du skærer det helt frosne væv, kan det føre til, at vævet hurtigt bryder væk og falder af rutsjebanen. Skæring helt optøet væv fører til opløsning af vævet. Sørg for, at vævet hverken er helt frosset eller helt optøet.
Representative Results
Når du følger ovenstående trin, er vævsprøverne i mikrocentrifugrørene klar til og kompatible med MS-prøvepræparatet. Efter prøveforberedelse opnåede vi ~ 5-7 μg peptider pr. prøve af enten SEZ eller MEZ pr. Mus. De endelige mængder peptider kan dog afhænge af MS-tilberedningsmetoden. I proteom sammenligninger nedenfor, protein identifikation og kvantificering dybde (500-1.000 proteiner pr prøve) blev øget ved beregningsmæssigt matcher peptid spektre til peptid spektre biblioteker skabt for hver væv region25,27. Især er den tabsløse nanofraktioneringsmetode, der anvendes her til oprettelse af peptidspektrebibliotekerne, i øjeblikket ikke kommercielt tilgængelig. De rå MS-data blev analyseret ved hjælp af MaxQuant-softwaren28 og opnåede massepræcisighed i delene pr. milliard rækkevidde29. Max Quant-miljøet gør det muligt at matche mellem MS-kørsler. Protein overflod blev kvantificeret ved hjælp af en etiket-fri kvantificering algoritme30. Immunohistokemisk farvning blev udført på fersk frosset væv og udført som tidligere rapporteret25 (se materialetabellen).
Kryo-sektion-dissektion
Den komplette SEZ og MEZ af voksne mus (n = 4) blev opnået ved hjælp af CSD (se figur 1 og protokol). Den somatosensoriske cortex (Cx) blev dissekeret med kirurgisk saks. Yderligere 4 mus blev dissekeret på samme måde; Det dissekerede væv blev imidlertid samlet i én prøve pr. region for at oprette proteombiblioteket (10.923 identificerede proteiner) for øget proteinidentifikation og kvantificering i de enkelte prøver25. I de fire individuelle prøver blev (gennemsnit ± SD) 6.673 ± 317,4 proteiner kvantificeret i SEZ og 6.747 ± 37,7 i MEZ. Alle MS proteomics data blev deponeret i ProteomeXchange Consortium via PRIDE31 partner repository, og tiltrædelsesnummeret for proteomer rapporteret her er ProteomeXchange: PXD016632 (http://proteomecentral.proteomexchange.org).
Sammenligning med helsingop dissektion
Helmonteret dissektion blev udført i henhold til en standardprotokol26. Helmonteret dissektion afslørede et lignende antal proteiner (ca. 6.000 for SEZ og 6.000 for Cx, n = 4 pr. Gruppe) sammenlignet med CSD25. En af de påtænkte forbedringer ved at anvende CSD til SEZ i stedet for en helmount dissektionsprotokol er reduktionen af potentiel striatal forurening. I SEZ-prøver, der er forurenet med væv fra en anden region, kan påviste kandidatproteiner ikke allokeres til en region, da der kan opstå betydelig berigelse fra interesseområdet og forureningsforuren. Immunohistokemisk blev det myelin-tilknyttede glycoprotein (MAG) positive myelinrige interne kapsler af striatum identificeret i helemountprøverne, men sjældent i CSD-prøverne (Figur 2A). Striatalforureningen i helmonterede prøver kunne bekræftes ved at identificere berigelsen af myelinproteiner i SEZ sammenlignet med de somatosensoriske cortex (Cx) Grey Matter (GM) (figur 2B). Bemærk, at store dele af Cx GM, især de øverste Cx-lag, er umyelinerede32.
Som store fiber bundter passerer gennem striatum, forurening af denne region resulterede i berigelse af myelin proteiner i forhold til Cx. De myelinproteiner, der anvendes som markører for striatal forurening i SEZ-prøverne, var myelin basicproteinet (MBP), det myelin-associerede glycoprotein (MAG), proteolipidprotein 1 (Plp1) og 2',3'-cyklisk-nukleotid 3'-foosphodiesterase (Cnp). Alle myelin-markør proteiner blev betydeligt beriget i SEZ i forhold til Cx. Omvendt, sammenligninger for de fire myelin markør proteiner i CSD datasæt gav ingen væsentlige forskelle, når man sammenligner SEZ til Cx (Figur 2B). Proteomiske data fra striatum33 understøtter hypotesen om, at berigelsen af myelinproteiner i SEZ-prøverne af helmonterede dissektion var forårsaget af forureningen med striatalt væv. Derfor csd stort set forhindret forurening af striatal væv (rig på kompakt myelin) i forhold til en helmount dissektion.
Upartisk proteomanalyse af ikke-dissocieret væv kan afsløre interessante ekstracellulære proteiner. Ved forbedret dissektion ved hjælp af CSD blev ekstracellulære proteiner beriget betydeligt i prøverne sammenlignet med hele mængdeprøverne (Figur 2C, anmærkningsberigelsestest). CSD og helmount dissektion viser en sammenlignelig berigelse af gen ontologi (GO) udtryk "ekstracellulære vesikulære exosome" og "ekstracellulære region del." Go-udtrykket "Matrisome-associated" er dog lidt mere beriget i CSD end i den samlede dissektion. Derfor blev ECM krydsbindende enzym og nyligt opdagede neurogenese regulator transglutaminase-2 (Tgm2) fundet beriget i SEZ sammenlignet med Cx ved hjælp af CSD25. Derimod blev der ikke fundet nogen forskel mellem SEZ- og Cx-prøver, der blev udtaget ved helmonteret dissektion (figur 2D). Proteomiske data fra striatum33 understøtter hypotesen om, at påvisning af neurogeneseregulatoren Tgm2 ved helmonteret dissektion blev hæmmet af forureningen med striatalt væv. Derfor er kryosektions-dissektion generelt en vellykket, men også nødvendig forbedring af standard dissektionen til nichespecifik proteomanalyse.
Sammenligning med Laser-capture-mikroskopi
Den forreste halvdel af SEZ og MEZ på 3 voksne mus blev opnået for LCM (figur 3A ). Samlet set LCM metode udviser nogle ulemper, specielt med hensyn til vævforstyrrelser og effektivitet. For at visualisere det område af interesse under dissektion mikroskop, baggrund farvning er nødvendig, potentielt vaske væk små eller opløselige proteiner af interesse, f.eks vækstfaktorer, cytokiner, eller ECM regulatorer såsom enzymer. Desuden bruger dias forskellige tidspunkter ved stuetemperatur under laserfjernelse. Desuden kan laseren selv denaturere proteiner af interesse.
CSD har en betydelig fordel i forhold til LCM med hensyn til den tid og indsats, der er nødvendig for at udføre dissektionen: trin 1 i protokollen skal udføres på samme måde for både CSD og LCM; uden dette trin forbliver ventrikulære vægge klæbende, hvilket gør adskillelsen af MEZ- og SEZ-prøver vanskelig. Da CSD-afsnittene (100 μm) er 6-7 gange tykkere end den maksimale tykkelse34 i LCM-sektionerne (15 μm), vil trin 2 (hjernesektion) og trin 3 (fjernelse af MEZ og SEZ fra hver koronarsektion) tage mindst 6-7 gange længere for LCM. Den nødvendige baggrund farvning og opsætning af lasermikroskopet vil forbruge ekstra tid. Her tog det tre gange længere tid at høste 50% af SEZ og MEZ af 3 dyr af LCM sammenlignet med 100% af SEZ og MEZ på 4 dyr af CSD, hvilket udgør en ottedobling af CSD. Sammenfattende kræver LCM ikke kun en bemærkelsesværdig mængde ekstra indsats, men vævet udsættes også for en væsentligt længere periode med manipulation og temperaturændringer, der kan kompromittere dynamikken og pålideligheden af data genereret ved efterfølgende analyse.
MS-resultaterne af CSD blev sammenlignet med resultaterne fra laserfangstmikrosektionen (LCM). Begge datasæt blev matchet med det proteomiske bibliotek, der blev genereret ved at samle CSD-prøver. I gennemsnit gav LCM 3.441 ± henholdsvis 270,0 og 3.613 ± 238,7 individuelle proteiner i henholdsvis SEZ- og mediale ventrikulære zoner (figur 3B). I betragtning af den bemærkelsesværdige forskel i proteinidentifikation viste hovedkomponentanalyse (PCA) tydelig adskillelse i henhold til dissektionsmetoden (komponent 1: 62,7%, ikke vist). Komponent 2 viste den største adskillelse for SEZ og MEZ blandt LCM prøverne (8,5%, Figur 3C). Komponent 3 synes også at adskille LCM og CSD; Denne forskel kan dog skyldes metodebaserede forskelle snarere end antallet af identificerede proteiner (6,4 %). Ikke desto mindre forblev den samlede regionale adskillelse påfaldende forskellig for kryo-dissektionsdata og langt bedre end for LCM. Denne uoverensstemmelse i datadynamikken kan skyldes forskellige tidspunkter, som prøverne bruger ved stuetemperatur under laser dissektionen, eller en højere modtagelighed for små væv svarer til variation i de efterfølgende proteomicsprotokoller og massespektrometrimålinger.
For at søge efter forskelle i ECM's proteomprofil blev der udført en 2D-anmærkningsberigelsestest mellem CSD og LCM for SEZ og MEZ (figur 3D). Beregning af den relative berigelse af GO-termer mellem LCM- og CSD-prøver gør det muligt at sammenligne den relative proteomdynamik i ECM-proteinklyngerne mellem de to metoder på trods af den ulige mængde væv og forskellene i dissektionsprotokollen. Plottene afslører en god sammenhæng mellem LCM og CSD. Anmærkningerne "ekstracellulære region del" og "ekstracellulære membran-bundet organelle" er ligeledes beriget i både metoder og regioner. Derfor synes LCM's øgede tidsefterspørgsel ikke at blive opvejet af en relativt højere følsomhed for ECM-associerede proteiner. I stedet giver CSD mere robust identifikation/kvantificering ved sammenligning af prøvedataene for neurogenese og SEZ-associerede ECM-proteiner Tgm2, Thrombospondin-4 (Thbs4), S100a6 og Tenacin-C (Tnc) (Figur 3E). For TnC's vedkommende var det kun CSD, der udviste berigelse for SEZ i forhold til MEZ, selv om det var kvantificeret i alle prøver. Ikke desto mindre viste de SEZ-associerede basalmembranproteiner Nidogen-1 (Nid1), Laminin subunit beta-2 (Lamb2) og kældermembranspecifikke heparan sulfatsulfatprooglycankerneprotein (Hspg2)35 en endnu mere robust berigelse i SEZ (sammenlignet med MEZ) i LCM-prøverne end i CSD-prøverne (ikke vist). Derfor kan CSD give vævsprøver, der giver en præcis og dyb kvantitativ proteom for SEZ karakterisering i en rimelig tidsramme, uden at bekymre sig om kompromitteret væv integritet eller proteintab.
Statistik
Statistiske test, 2D anmærkning berigelse tests, og PCA blev udført i Perseus miljø. Proteiner blev inkluderet i analysen, hvis der blev påvist en gyldig værdi for hver metode i mindst én prøve. Protein overflod og antal sammenligninger blev visualiseret ved hjælp af dataanalyse software (se tabellen over materialer). En permutation-baseret kontrol af den falske opdagelse sats (FDR) (FDR blev sat til 0,05, 250 randomiseringer) blev anvendt til protein sammenligninger. For 2D-anmærkningsberigelsestestene36 beriges de viste GO-termer betydeligt (FDR blev sat til 0,02 ved hjælp af Benjamini-Hochberg FDR-kontrolmetoden).
Figur 1: Cryo-Section-Dissection-metoden. (A) Oversigt over interesseregionen: den laterale ventrikel med den neurogene SEZ og den ikke-neurogene MEZ. Neuroblaster immun farves med Dcx. (B) Trinvis fjernelse af OB, den forreste pol, cortex, og corpus callosum over hjertekamrene og choroid plexus: 1. placering i dissektion medium, 2. fjernelse af OB, 3. fjernelse af den forreste stang af cortex, 4. sagittal snit af ventrikulær top, 5. fjernelse af ventrikulær top, 5. fjernelse af ventrikulær top, 5. fjernelse af ventrikulær top, 5. fjernelse af ventrikulær top, 5. fjernelse af ventrikulær top, 5. fjernelse af ventrikulær top, 5. fjernelse af ventrikulær top, 5. fjernelse af ventrikulær top, 5. fjernelse af ventrikulær top, 5. fjernelse af ventrikulær top, 5. fjernelse af ventrikulær top, 6. spredning af ventrikulære vægge. (C) 100 μm koronar skiver af den friskfrosne musehjerne, (1.) før og (2.) efter fjernelse af ventrikulære vægge med en iskold skalpel. Skalastænger = 4 mm (D) Farvning af en koronar del af en sideværts ventrikel (GFAP: grøn; DAPI: blå), der viser SEZ og MEZ dissekeret med CSD. Skalastænger = 300 μm (A), 200 μm (D). Forkortelser: CSD = kryosektion dissektion; SEZ = subependymal zone; MEZ = mediale ependymal zone; Dcx = Doublecortin; OB = olfaktorisk pære; GFAP = gialflimmersyresyreholdigt protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Overlegen dissektionspræcision med kryosektions dissektionen sammenlignet med helmonteret dissektion. (A) Immunohistokemisk billede af en SEZ-prøve opnået ved helmonteret dissektion (venstre). Inddragelsen af myelin-rige striatal væv visualiseres ved farvning mod MAG (grøn). Farvning af en SEZ dissekeret med CSD (højre). I CSD, næsten alle striatal myelin (farvning mod MAG, grøn) er udelukket fra prøven bånd. Kerner blev visualiseret ved hjælp af DAPI (blå). (B) Sammenligning af myelinmarkørberigelse i SEZ vs. Cx fra helmount (MBP: p = 0,0074; MAG: p = 0,0016; Plp1: p = 0,0011; CNP: p = 0,0029) og CSD (MBP: p = 0,0667; MAG: p = 0,0236; Plp1: p = 0,3420; CNP: p = 0,1842). (C) 2D-anmærkningsberigelsestest, der sammenligner helemount-SEZ med CSD-SEZ-prøverne. GO-termerne ekstracellulære rum og Matrisome-associerede er mere beriget i CSD-data end i hele data. (D) Den NSC-regulator Tgm225, der er afbildet for helmonteret dissektion og CSD' er, er beregnet til protein. Tgm2 er betydeligt beriget i SEZ sammenlignet med Cx i CSD (CSD: p = 0,0029; Helsingt: p = 0,1775). For B og D: Som reference er proteomdata fra Sharma et al.33 med målinger af striatum og cortex afbildet for de tilsvarende proteiner, der vises i helemount- og CSD-prøverne. Skalastænger = 200 μm (A). Forkortelser: CSD = kryosektion dissektion; SEZ = subependymal zone; MAG = myelin-associeret glycoprotein; Cx = somatosensorisk cortex; MBP = myelin grundlæggende protein; Plp1 = proteolipid-protein 1; CNP = 2',3'-cyklisk-nukleotid 3'-fosfodiesterase; GO = gen ontologi; NSC = neurale stamceller; Tgm2 = tranglutaminase 2; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; LFQ = etiketfri kvantitet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Forbedret ekstracellulær protein kvantificering med kryo-sektion-dissektion i forhold til LCM. (A) Cresyl violet farvning af en lateral ventrikel før og efter laserfangst af SEZ og MEZ (venstre). Til sammenligning csd snit af SEZ og MEZ (højre). Skalabarer = 150 μm. (B) Sammenligning af antallet af påviste proteiner i SEZ- og MEZ-prøverne fra CSD og LCM. Data præsenteres som gennemsnitlige ± SD. (C) Vigtigste komponentanalyse af SEZ- og MEZ-prøverne, der sammenligner CSD- og LCM(komponent 2: 8,5% af variansen; komponent 3: 6,4%). (D) 2D anmærkning berigelse af cryo-sektion- og laser-dissekeret MEZ (Top) og SEZ (Nederst). GO-termerne ekstracellulære organelle og ekstracellulære region del er betydeligt beriget (røde prikker). (E) Overflod af ekstracellulære SEZ-associerede markørproteiner i SEZ og MEZ for LCM (Tnc: p = 0,3789) og CSD-prøverne (Tgm2: p = 0,2940; S100a6: p = 0,0218; THBS4: p = 0,3941; Tnc: p = 0,0004). Forkortelser: CSD = kryosektion dissektion; LCM = laser-capture-microdissection; SEZ = subependymal zone; MEZ = mediale ependymal zone; GO = gen ontologi; Tnc = Tenacin-C; Tgm2 = transglutaminase 2; S100a6 = S100 calciumbindende protein A6; THBS4 = trombospondin-4; LFQ = etiketfri kvantitet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
CSD-metoden gjorde det muligt præcist at udtrække SEZ-væv og generere et pålideligt proteom med betydelig dybde ved hjælp af MS. CSD viser en klar fordel i forhold til helmonteret dissektion i form af stærkt reduceret striatal forurening af SEZ-prøver og ekstracellulær proteinberigelse. Da det også er muligt at opdage et lignende antal proteiner i individuelle prøver (~ 6.500 proteiner pr. Prøve) med CSD og helmonteret dissektion, er den ekstra tid til CSD umagen værd. LCM giver mere præcis SEZ dissektion, men nåede en lavere proteom dybde, med kun 3.500 proteiner pr prøve på trods af at bruge den samme MS protokol som CSD (bibliotek matching og label-fri kvantificering). Det er vigtigt, at variationen var meget større, sandsynligvis på grund af den ottefoldige længere forberedelsestid pr. prøve. PCA af prøverne fra LCM og CSD afslører en klar adskillelse af begge metoder med stramme regionsspecifikke klynger, der er solidt adskilt fra hinanden. I modsætning hertil viste LCM-prøverne en mere spredt fordeling, hvilket sandsynligvis til dels skyldes forberedelseslængden. Det er uklart, om indsamling af langt flere prøver over en længere periode ville have givet et proteom af samme robusthed og dybde med LCM. Beregning af et skøn, indsamling af en lignende prøve volumen som gjort for CSD ville tage 5-8 gange længere med LCM, selv op til 15 gange længere, hvis prøver til peptid spektre biblioteker blev medtaget, og meget af det under optøet betingelser. I betragtning af de yderligere forstyrrelser af vævet, der er nødvendige for LCM (baggrundsfarvning, laser dissektion), LCM forudsat lidt, hvis nogen, gevinst over CSD. Derfor kan CSD anses for mere egnet til ekstracellulær proteom forskning, specielt til SEZ.
Især hvis interesseområdet er mindre end SEZ (f.eks. kun ved at undersøge det ependymale cellelag), falder en frihåndstilgang bagud i forhold til LCM'ens nøjagtighed. For eksempel er det svært at bruge CSD til at adskille ependymalt fra det subependymale lag, da det ependymale lag kun er en cellediameter bred, og afgrænsningen mod det subependymale lag er ikke synligt for det blotte øje i frisk frosset væv. Derfor vil LCM være et bedre valg end CSD, hvis en præcis dissektion på en skala under 50 μm er vigtigere end uforstyrret væv eller holde dissektionstiden kort. For regioner med en bredde på 50 μm og derover kan CSD's præcision imidlertid sammenlignes med LCM's for ECM-proteinanalyse.
CSD har allerede vist sig at være nyttig ved at bidrage til undersøgelsen af ECM'ens funktionelle rolle i den neurogene niche25. Derfor kan den fortsatte anvendelse af CSD i SEZ for forskellige protein- og proteomundersøgelser (eller endda single-nucleus RNA-sekventering) føre til påvisning af yderligere neurogeneseregulatorer, stamcelleaktiveringsmarkører og en dybere forståelse af SEZ-stamcelle nichefysiologi. I betragtning af nedgangen i neurogenese i den aldrende SEZ37, en kortfattet analyse af ECM ændringer af SEZ af alderen vs unge mus kan fremme forståelsen af de nøjagtige niche mekanismer fremme NSC udvikling og vedligeholdelse38,39. Desuden er indflydelsen af betændelse og skade på SEZ neurogenese veletableret40,41,42,43. Berigelsen af blod-afledt fibrinogen i SEZ efter kortikale hjerneskade og dens indflydelse på SEZ astrogliogenese og ar dannelse44 fremhæver den potentielle indflydelse af traume-induceret mikromiljø ændringer på SEZ stamcelle fysiologi. Derfor, undersøge SEZ-ECM proteom i forbindelse med hjerneskade ved hjælp af CSD kunne hjælpe belyse de mekanismer, hvorved skade og betændelse påvirker neurogenese. Det er vigtigt, at metoden også kan anvendes på neurogene nicher i mennesker i sundhed og sygdom, da frisk frosset væv ofte kan opnås ved operationer. I betragtning af arternes forskelle i voksen neurogenese ville det desuden også være fascinerende at anvende CSD-metoden på andre arter, f.eks. i forbindelse med striatal neurogenese. Desuden kan forskelle i lokalt producerede vækstfaktorer med andre proteindetektionsmetoder undersøges præcist og effektivt ved hjælp af CSD for SEZ og MEZ (f.eks. ELISA).
Endelig kan dissektionsproceduren potentielt ændres til nøjagtig udvinding af andre hjerneområder, også til forskningsspørgsmål, der ikke er relateret til neurogenese. For eksempel, CSD indeholder en kort semi-optøning trin, hvor kompakt myelin er synlig som hvide områder adskiller sig fra de mere gennemskinnelige resterende hjernevæv. Med en simpel ændring af metoden, ville denne funktion tillade præcis dissektion af kun corpus callosum kompakt myelin væv, som kunne udsættes for proteomisk analyse af skade-relaterede ændringer. Et forslag til en protokol ændring, der ville gøre det muligt for corpus afstumpede dissektion er at udelade trin 1.5-1.9 i protokollen og gå direkte til at forberede koronar sektioner i stedet for at åbne hjertekamrene for at gøre SEZ og MEZ tilgængelige. Derefter placeres sektionerne på tøris, løft og halvø skiverne, og fjern simpelthen corpus callosum med en skalpel. Dette præparat bør nu være klar til enhver analyse, der kræver en effektiv dissektion af indfødte corpus callosum væv.
Sammenfattende præsenterer denne undersøgelse en mikrodektionsmetode, der kan bruges til pålidelig ventrikulær neurogen nicheproomanalyse. Dataene understreger CSD-metodens kompatibilitet og anvendelighed sammen med MS-baseret proteomisk analyse af SEZ-mikromiljøet. Kombinationen af præcision, effektivitet og minimal vævsforstyrrelse gør CSD til en værdifuld udvidelse af eksisterende metoder.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser
Acknowledgments
Vi vil gerne oprigtigt takke Mathias Mann for at give os mulighed for at udføre store dele af forsøgene i hans laboratorium, Fabian Coscia for hjælp med LCM og proteom analyse, Tatiana Simon-Ebert for wholemount dissektioner, og Korbinian Mayr og Igor Paron for deres tekniske hjælp. Vi anerkender taknemmeligt finansieringen fra det tyske forskningsråd til MG (SFB870, TFR274), EU (Eranet S-700982-5008-001), ERC (aERC "NeuroCentro" til MG), Swedish Society for Medical Research (SSMF, til JK) postdoc-tilskud og KI-fonde og fonde (2020-01351 til JK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat CM3050S | Leica | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip | Fine Science Tools | cat. no. 11252-00 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 | Invitrogen | cat. no. 24020 | |
| HEPES buffer solution (1 M) | Invitrogen | cat. no. 15630 | |
| Microscope slides | RS France | cat. no. BPB018 | |
| Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL | Eppendorf | cat. no. 0030123344 | |
| Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm | Fine Science Tools | cat. no. 15003-08 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | cat. no. 5518083 | |
| Tissue culture dishes 60 mm | Greiner Bio-One | cat. no. 633180 | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) | ThermoFisher Scientific | cat. no. A-11001 | |
| DAPI | Sigma | cat. no. D9542 | |
| guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 | Millipore | cat. no. AB2253, | |
| mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 | Sigma | cat. no. G3893 | |
| mouse monoclonal anti-MAG 1:400 | Millipore | cat. no. MAB1567 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism version 9 | GraphPad Software, San Diego California USA | www.graphpad.com | |
| Perseus Version 1.6.10.50 | Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ZEN imaging software | Carl Zeiss |
References
- Goodman, T., Hajihosseini, M. K. Hypothalamic tanycytes-masters and servants of metabolic, neuroendocrine, and neurogenic functions. Frontiers in Neuroscience. 9, 387 (2015).
- Chaker, Z., et al. Hypothalamic neurogenesis persists in the aging brain and is controlled by energy-sensing IGF-I pathway. Neurobiology of Aging. 41, 64-72 (2016).
- Kuhn, H. G., Toda, T., Gage, F. H. Adult hippocampal neurogenesis: a coming-of-age story. Journal of Neuroscience. 38 (49), 10401-10410 (2018).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Bordiuk, O. L., Smith, K., Morin, P. J., Semënov, M. V. Cell proliferation and neurogenesis in adult mouse brain. PloS One. 9 (11), 111453 (2014).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain. Journal of Neuroscience. 17 (13), 5046-5061 (1997).
- Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The adult ventricular-subventricular zone (V-SVZ) and olfactory bulb (OB) neurogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (5), 018820 (2016).
- Sato, K.
- Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
- Sirko, S., et al. Chondroitin sulfates are required for fibroblast growth factor-2-dependent proliferation and maintenance in neural stem cells and for epidermal growth factor-dependent migration of their progeny. Stem Cells. 28 (4), 775-787 (2010).
- Mercier, F. Fractones: extracellular matrix niche controlling stem cell fate and growth factor activity in the brain in health and disease. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (24), 4661-4674 (2016).
- Mercier, F., Kitasako, J. T., Hatton, G. I. Anatomy of the brain neurogenic zones revisited: fractones and the fibroblast/macrophage network. Journal of Comparative Neurology. 451 (2), 170-188 (2002).
- Nascimento, M. A., Sorokin, L., Coelho-Sampaio, T. Fractone bulbs derive from ependymal cells and their laminin composition influence the stem cell niche in the subventricular zone. Journal of Neuroscience. 38 (16), 3880-3889 (2018).
- Chen, G., et al. In vivo reprogramming for brain and spinal cord repair. eNeuro. 2 (5), 0106-0115 (2015).
- Zhang, Q., Chen, W., Tan, S., Lin, T. Stem cells for modeling and therapy of Parkinson's disease. Human Gene Therapy. 28 (1), 85-98 (2017).
- Wei, C., Xiong, S., Cheng, L. Reprogramming of fibroblasts to neural stem cells by a chemical cocktail. Methods in Molecular Biology. 2117, 265-270 (2020).
- Tian, Z., Zhao, Q., Biswas, S., Deng, W. Methods of reactivation and reprogramming of neural stem cells for neural repair. Methods. 133, 3-20 (2018).
- Heinrich, C., et al. Sox2-mediated conversion of NG2 glia into induced neurons in the injured adult cerebral cortex. Stem Cell Reports. 3 (6), 1000-1014 (2014).
- Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
- Seidenfaden, R., Desoeuvre, A., Bosio, A., Virard, I., Cremer, H. Glial conversion of SVZ-derived committed neuronal precursors after ectopic grafting into the adult brain. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (1-2), 187-198 (2006).
- Lepko, T., et al. Choroid plexus-derived miR-204 regulates the number of quiescent neural stem cells in the adult brain. EMBO Journal. 38 (17), 100481 (2019).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Angelidis, I., et al. An atlas of the aging lung mapped by single cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nature Communications. 10 (1), 963 (2019).
- Kjell, J., et al. Defining the adult neural stem cell niche proteome identifies key regulators of adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 26 (2), 277-293 (2020).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), e1938 (2010).
- Kulak, N. A., Geyer, P. E., Mann, M. Loss-less nano-fractionator for high sensitivity, high coverage proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 16 (4), 694-705 (2017).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47 (1), 442-450 (2019).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344 (6181), 319-324 (2014).
- Sharma, K., et al. Cell type- and brain region-resolved mouse brain proteome. Nature Neuroscience. 18 (12), 1819-1831 (2015).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerever, A., et al. Novel extracellular matrix structures in the neural stem cell niche capture the neurogenic factor fibroblast growth factor 2 from the extracellular milieu. Stem Cells. 25 (9), 2146-2157 (2007).
- Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12 (2012).
- Daynac, M., Morizur, L., Chicheportiche, A., Mouthon, M. -A., Boussin, F. D. Age-related neurogenesis decline in the subventricular zone is associated with specific cell cycle regulation changes in activated neural stem cells. Scientific Reports. 6, 21505 (2016).
- Navarro Negredo, P., Yeo, R. W., Brunet, A. Aging and rejuvenation of neural stem cells and their niches. Cell Stem Cell. 27 (2), 202-223 (2020).
- Smith, L. K., White, C. W., Villeda, S. A. The systemic environment: at the interface of aging and adult neurogenesis. Cell and Tissue Research. 371 (1), 105-113 (2018).
- Neuberger, E. J., Swietek, B., Corrubia, L., Prasanna, A., Santhakumar, V. Enhanced dentate neurogenesis after brain injury undermines long-term neurogenic potential and promotes seizure susceptibility. Stem Cell Reports. 9 (3), 972-984 (2017).
- Fisch, U., Brégère, C., Geier, F., Chicha, L., Guzman, R. Neonatal hypoxia-ischemia in rat elicits a region-specific neurotrophic response in SVZ microglia. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 26 (2020).
- Götz, M., Sirko, S., Beckers, J., Irmler, M. Reactive astrocytes as neural stem or progenitor cells: In vivo lineage, In vitro potential, and Genome-wide expression analysis. Glia. 63 (8), 1452-1468 (2015).
- Kernie, S. G., Parent, J. M. Forebrain neurogenesis after focal Ischemic and traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 37 (2), 267-274 (2010).
- Pous, L., et al. Fibrinogen induces neural stem cell differentiation into astrocytes in the subventricular zone via BMP signaling. Nature Communications. 11 (1), 630 (2020).
