Summary
La cryo-section-dissection permet une préparation fraîche et congelée de la plus grande niche neurogène du cerveau murin pour une analyse quantitative approfondie du protéome. La méthode est précise, efficace et provoque une perturbation tissulaire minimale. Par conséquent, il est idéal pour étudier le microenvironnement moléculaire de cette niche, ainsi que d’autres organes, régions et espèces.
Abstract
La niche neurogène sous-épendymaire est constituée d’un ruban paraventriculaire de la paroi ventriculaire latérale du ventricule latéral. La zone sous-épendymaire (ZES) est une région mince et distincte exposée aux ventricules et au liquide céphalo-rachidien. L’isolement de cette niche permet l’analyse d’un microenvironnement de cellules souches neurogènes. Cependant, l’extraction de petits tissus pour l’analyse du protéome est difficile, en particulier pour le maintien d’une profondeur de mesure considérable et l’obtention d’une robustesse fiable. Une nouvelle méthode appelée cryo-section-dissection (CSD), combinant une haute précision avec une perturbation tissulaire minimale, a été développée pour relever ces défis. La méthode est compatible avec les méthodes de spectrométrie de masse (SEP) de pointe qui permettent la détection de régulateurs de niche à faible abondance. Cette étude a comparé les données du CSD et de son protéome à la méthode et aux données obtenues par microdissection par capture laser (LCM) et une dissection complète standard. La méthode CSD a permis d’obtenir deux fois plus de profondeur de quantification en moins de la moitié du temps de préparation par rapport au LCM et a simultanément nettement surpassé la précision de dissection de l’ensemble de la dissection. Par conséquent, csd est une méthode supérieure pour collecter la ZES pour l’analyse du protéome.
Introduction
Comme la neurogenèse est limitée dans le cerveau adulte, diverses stratégies de réparation du système nerveux central bénéficieraient grandement d’une meilleure compréhension des fondements du remplacement neuronal adulte. Les rongeurs nous ont aidés à comprendre les mécanismes de base de la neurogenèse postnatale, bien qu’il faille noter que la neurogenèse adulte dépend grandement de l’espèce. Chez la souris, il existe trois niches de cellules souches neurales adultes (NSC). L’hypothalamus est une niche NSC adulte avec un potentiel neurogène1,2, tandis que la neurogenèse adulte continue est principalement limitée à l’hippocampe3 et à la ZES des parois latérales des ventricules latéraux4,5,6. La ZES est la plus grande région germinale contenant des CSN (cellules de type B) qui se développent en neuroblastes (cellules de type A) via des cellules progénitrices amplifiant le transit (cellules de type C). La ZES contient 20 à 35 % des cellules de type B, 1 à 15 % des cellules de type C, 1 à 30 % des cellules de type A et 25 à 50 % des cellules épendymaires7. La ZES comporte une microarchitecture complexe, avec des cellules endothéliales, des cellules microgliales et des cellules épendymaires résidant dans la niche des cellules souches et influençant 8,9,10. Bien que les neurones soient rares dans la ZES, les axones émanant de sources lointaines telles que le striatum, la région tegmentale ventrale ou l’hypothalamus atteignent et influencent les cellules de type B4. Une caractéristique unique de cette niche de cellules souches est la séparation entre le site de prolifération et le site de différenciation. Après prolifération, les progéniteurs neuronaux migrent de plusieurs millimètres de la ZES vers le bulbe olfactif, où ils se différencient en phase terminale en neurones et s’intègrent dans des circuits neuronaux préexistants. Les recherches sur les programmes cellulaires intrinsèques associés à la neurogenèse ont déjà fourni des connaissances importantes pour les stratégies expérimentales de reprogrammation et de transplantation de cellules thérapeutiques15,16,17,18,19,20. Cependant, les signaux cello-extrinsèques régulent également la neurogenèse, et les environnements tissulaires peuvent déterminer le devenir neurogène des cellules souches11,12,14,21,22,23. Par conséquent, l’étude du microenvironnement des niches neurogènes et de son interaction avec les cellules souches est d’une importance cruciale.
La matrice extracellulaire (ECM) et d’autres protéines sécrétées constituent une grande partie du microenvironnement. Pour une identification et une quantification précises, une approche protéomique est mieux adaptée qu’une approche transcriptomique pour déterminer la composition ecm en raison de la faible corrélation entre les niveaux de transcriptome et de protéines pour ECM24,25. En outre, il existe des preuves substantielles que les régulateurs de niche dans la ZES ne sont pas exclusivement produits par des cellules peuplant la niche elle-même. Des endroits plus éloignés, tels que le plexus choroïde, sécrètent des signaux modulateurs transmis aux cellules souches via le liquide céphalo-rachidien22,23. L’étude du protéome de niche peut aider à identifier les régulateurs de niche présents dans la niche indépendamment de leur site de production, étant donné qu’une proportion substantielle du microenvironnement extracellulaire est assemblée par des protéines.
Pour recueillir la zone ventriculaire murine pour une analyse protéomique impartiale, une méthode de haute précision est nécessaire, capturant le ruban paraventriculaire mince d’environ 50 μm contenant des cellules souches tout en excluant le tissu du striatum adjacent. De plus, la perturbation tissulaire pendant la dissection doit être minimisée pour analyser le microenvironnement extracellulaire, car les protéines solubles, y compris les facteurs de croissance ou les cytokines, pourraient être facilement éliminées. Bien qu’il soit possible d’analyser les spectres de masse des tissus fixes, l’agent requis, tel que le paraformaldéhyde, réduira la profondeur d’identification des protéines et peut introduire des modifications post-traductionnelles. Une dissection commune de ZES à montage entier, par exemple pour la collecte de cellules pour l’analyse de tri cellulaire activée par fluorescence, élimine l’ensemble de la ZES avec des ciseaux26. Cette dissection standard est rapide avec une perturbation tissulaire minimale. Cependant, la contamination striatale des échantillons ne peut être évitée. Inversement, le LCM présente l’avantage exceptionnel d’une précision de dissection supérieure. Cependant, le LCM peut introduire des perturbations tissulaires, par exemple, en raison d’une coloration de fond ou d’une dénaturation des protéines causée par le laser. Pour combiner les forces de la dissection de montage complet et de la LCM, une nouvelle méthode compatible avec la SEP, appelée cryo-section-dissection (CSD), a été développée (Figure 1A-D). Le CSD permet l’extraction de la ZES et la dissection de la ZES des parois médiales des ventricules latéraux (MEZ), qui est une région de contrôle idéale, principalement non neurogène pour la ZES (voir le protocole). Le protéome de niche obtenu par la combinaison de CSD et de méthodes de pointe de SEP s’est avéré utile pour la caractérisation et l’identification de nouveaux régulateurs dans ce créneau NSC adulte25. Par conséquent, cette méthode sera utile pour la détermination de la composition des protéines tissulaires SEZ.
Protocol
Toutes les procédures expérimentales de cette étude ont été réalisées conformément aux directives allemandes et de l’Union européenne et ont été approuvées par le comité institutionnel de soins aux animaux et le gouvernement de Haute-Bavière (Regierung von Oberbayern). Seules les souris mâles C57Bl6 âgées de 8 à 10 semaines ont été utilisées pour les expériences.
1. Préparation du cerveau de la souris (~ 15 min par souris)
- Préparer le milieu de dissection en ajoutant 5 mL de 1 M HEPES (concentration finale 10 mM) à 500 mL de 1x solution saline équilibrée de Hank (HBSS).
REMARQUE: La durée de stockage du milieu de dissection (+4 °C) ne doit pas dépasser 2 semaines. - Sacrifiez les souris par luxation cervicale et disséquez soigneusement le cerveau.
REMARQUE: Lors de l’examen de l’ECM, le tissu doit de préférence être non modifié. La luxation cervicale maintient le temps de dissection aussi court que possible, empêchant ainsi autant que possible l’autodigestion enzymatique post-mortelle. Si l’élimination du sang est essentielle à la question de recherche, il suffit de perfuser la souris par voie transcardique avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant de retirer le cerveau. - Extraire le cerveau par dissection manuelle et le placer dans une boîte de culture contenant un milieu de dissection glacé (Figure 1B - 1).
REMARQUE: Gardez le cerveau dans un milieu de dissection sur de la glace tout au long de la dissection. - Retirer le bulbe olfactif (OB) avec un scalpel (Figure 1B - 2) par une coupe coronale droite entre l’OB et le pôle antérieur du cortex.
- Enlever le pôle antérieur du cortex avec le scalpel à l’aide d’une coupe coronale pour rendre les ventricules latéraux visibles dans le plan coronal (Figure 1B - 3).
REMARQUE: Assurez-vous que la coupe coronale est faite ~ 5 mm rostrally à partir du chiasme optique; sinon, la partie rostrale de la ZES/ZEM sera perdue. - À l’aide de ciseaux, ouvrez les deux ventricules latéraux par le haut, en commençant par une section sagittale de la surface corticale à la lumière ventriculaire, et allongez cette coupe en forme de C en suivant la flexion ventriculaire (Figure 1B - 4).
- Connectez les extrémités caudales de l’incision sagittale gauche et droite au moyen d’une coupe coronale supplémentaire avec les ciseaux.
REMARQUE: Les trois coupes forment maintenant un trapèze et faciliteront l’élimination du cortex et du corps calleux à l’étape suivante. - Enlever le cortex et le corps calleux recouvrant les ventricules latéraux à l’aide d’une pince (Figure 1B - 5). Ensuite, retirez le cortex et le corps calleux qui recouvrent les parois ventriculaires médiales. Ici, faites des coupures supplémentaires si le tissu est attaché aux parois ventriculaires médiales, ou soulevez simplement le cortex et le corps calleux avec des ciseaux pour déloger le tissu.
- Étalez soigneusement les parois ventriculaires à l’aide d’une pince (Figure 1B - 6). Retirez le plexus choroïde avec une pince.
REMARQUE: Le retrait complet du plexus choroïde est important pour éviter toute interférence avec les étapes de dissection suivantes et éviter une contamination potentielle des échantillons de ZES / MEZ. - Mettez le cerveau sur une lame de verre et placez la lame de verre sur de la glace sèche pour geler le cerveau. Maintenez les parois ventriculaires dans la configuration ouverte.
REMARQUE: Assurer une distance suffisante entre les parois latérales et médiales du ventricule pour faciliter la dissection précise et exclusive de la ZES et de la ZEM. Si le tissu se contracte à nouveau dans une configuration fermée, utilisez la pince pour fixer les parois dans la position souhaitée pendant le gel. Évitez tout dommage à la ZES/ZEM. Essayez d’appliquer une force minimale, principalement sur le bord supérieur des ventricules ouverts.
2. Sectionnement du cerveau préparé (~ 15 min par souris)
- Coupez des sections coronales de 50 à 100 μm d’épaisseur du cerveau jusqu’à l’extrémité du ventricule latéral à l’aide d’un cryostat et montez les sections sur des lames de verre. Assurez-vous que le cerveau est attaché à la plaque de fixation du cryostat au niveau du cerveau postérieur avec un milieu OCT et qu’aucun OCT n’entre en contact avec le cerveau antérieur, en particulier au niveau des ventricules.
REMARQUE: Le milieu OCT interférera avec les mesures de SEP. Cependant, si le tissu sera utilisé pour un test d’anticorps, il n’est pas nécessaire d’exclure le milieu OCT. L’utilisation de lames en verre revêtu n’est pas recommandée. Les lames enduites appliquent trop de force adhésive sur le tissu, empêchant ainsi la translocation de l’échantillon de tissu des lames dans le tube de microcentrifugation dans les étapes suivantes.
3. Dissection à main levée de tranches de cerveau (~ 30 min par souris)
- Placez les lames de verre avec les sections du cerveau sur de la glace carbonique sous un microscope à dissection (Figure 1C - 1).
- Préparez les tubes de microcentrifugation sur de la glace carbonique et assurez-vous que les tubes restent sur la glace carbonique pendant au moins 1 minute pour être suffisamment froids avant le transfert de l’échantillon.
REMARQUE: Utilisez des tubes de microcentrifugation de haute qualité, car certains tubes de mauvaise qualité peuvent perdre du plastique dans les étapes ultérieures de digestion des tissus associées aux mesures de SEP. - Soulevez les tranches de la glace carbonique pendant 15 à 30 s pour obtenir une décongélation brève et incomplète afin de rendre la myéline compacte du striatum observable sous forme de points blancs denses.
REMARQUE: Il devient possible de localiser la frontière entre la ZES et le striatum (figure 1C - 2, voir la figure 2A pour l’exclusion de la myéline et une comparaison avec la méthode du montage complet). Si la décongélation prend trop de temps, le processus peut être accéléré en appuyant sur un doigt recouvert d’un gant sur le côté opposé de la glissière en verre. Cependant, cette manœuvre doit être pratiquée car une décongélation excessive se produit facilement. - Séparer la ZES à l’aide d’un scalpel prérefroidi du striatum adjacent (Figure 1C,D).
- Transférer la ZES en tant que pièce entière ou sectionnée en 2 à 4 parties dans un tube de microcentrifugation en utilisant le bord émoussé du scalpel refroidi. Si le tissu doit être utilisé pour un autre type d’analyse que la SP, transférer plutôt l’échantillon de tissu dans le contenant approprié (p. ex., une plaque de 96 puits).
REMARQUE: Couper le tissu complètement gelé peut entraîner une rupture rapide du tissu et sa chute de la lame. Couper un tissu complètement décongelé conduit à la désintégration du tissu. Assurez-vous que le tissu n’est ni complètement congelé ni complètement décongelé.
Representative Results
En suivant les étapes ci-dessus, les échantillons de tissus dans les tubes de microcentrifugation sont prêts et compatibles avec la préparation des échantillons de SEP. Après la préparation de l’échantillon, nous avons obtenu environ 5 à 7 μg de peptides par échantillon de SEZ ou de MEZ par souris. Cependant, les quantités finales de peptides peuvent dépendre de la méthode de préparation de la SEP. Dans les comparaisons de protéome ci-dessous, la profondeur d’identification et de quantification des protéines (500 à 1 000 protéines par échantillon) a été augmentée en faisant correspondre informatiquement les spectres peptidiques aux bibliothèques de spectres peptidiques créées pour chaque région tissulaire25,27. Notamment, la méthode de nano-fractionnement sans perte utilisée ici pour la création des bibliothèques de spectres peptidiques n’est actuellement pas disponible dans le commerce. Les données brutes sur la SEP ont été analysées à l’aide du logiciel MaxQuant28, ce qui a permis d’obtenir une précision de masse de l’ordre de parties par milliard29. L’environnement Max Quant permet la correspondance entre les exécutions MS. L’abondance des protéines a été quantifiée à l’aide d’un algorithme de quantification sans étiquette30. La coloration immunohistochimique a été effectuée sur des tissus frais congelés et effectuée comme indiqué précédemment25 (voir la table des matériaux).
Cryo-section-dissection
La ZES et la ZEM complètes de souris adultes (n = 4) ont été obtenues à l’aide de CSD (voir la figure 1 et le protocole). Le cortex somatosensoriel (Cx) a été disséqué avec des ciseaux chirurgicaux. 4 souris supplémentaires ont été disséquées de la même manière; cependant, le tissu disséqué a été regroupé en un échantillon par région pour créer la bibliothèque de protéome (10 923 protéines identifiées) afin d’accroître l’identification et la quantification des protéines dans les échantillons individuels25. Dans les quatre échantillons individuels, (moyenne ± ET) 6 673 ± 317,4 protéines ont été quantifiées dans la ZES et 6 747 ± 37,7 dans la ZEM. Toutes les données protéomiques de la SEP ont été déposées dans le consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE31 , et le numéro d’acquisition des protéomes rapportés ici est ProteomeXchange: PXD016632 (http://proteomecentral.proteomexchange.org).
Comparaison avec la dissection de l’ensemble
La dissection de montage complet a été effectuée selon un protocole standard26. La dissection en monture a révélé un nombre similaire de protéines (environ 6 000 pour la ZES et 6 000 pour Cx, n = 4 par groupe) par rapport à csd25. L’une des améliorations prévues de l’utilisation de la SDR pour la ZES, au lieu d’un protocole de dissection à montage complet, est la réduction de la contamination striatale potentielle. Dans les échantillons de ZES contaminés par des tissus provenant d’une autre région, les protéines candidates détectées ne peuvent pas être attribuées à une région, car un enrichissement important peut résulter de la région d’intérêt et du contaminateur. Sur le plan immunohistochimique, les capsules internes riches en myéline du striatum, une glycoprotéine associée à la myéline associée à la myéline (MAG), ont été identifiées dans les échantillons de montage entier, mais rarement dans les échantillons csd (figure 2A). La contamination striatale dans l’ensemble des échantillons a pu être confirmée en identifiant l’enrichissement des protéines de myéline dans la ZES par rapport aux échantillons de matière grise (GM) du cortex somatosensoriel (Cx) (Figure 2B). Notez que de grandes parties du Cx GM, en particulier les couches supérieures de Cx, ne sont pas myélinisées32.
Lorsque de grands faisceaux de fibres traversent le striatum, la contamination par cette région a entraîné l’enrichissement des protéines de myéline par rapport au Cx. Les protéines de myéline utilisées comme marqueurs de la contamination striatale dans les échantillons de ZES étaient la protéine de base de la myéline (MBP), la glycoprotéine associée à la myéline (MAG), la protéine protéolipide 1 (Plp1) et la nucléotide 2',3'-cyclique 3'-phosphodiestérase (Cnp). Toutes les protéines marqueurs de la myéline ont été significativement enrichies dans la ZES par rapport au Cx. Inversement, les comparaisons pour les quatre protéines marqueurs de la myéline dans l’ensemble de données CSD n’ont donné aucune différence significative lors de la comparaison de la ZES au Cx (Figure 2B). Les données protéomiques du striatum33 soutiennent l’hypothèse selon laquelle l’enrichissement des protéines de myéline dans les échantillons de ZES de la dissection complète a été causé par la contamination par du tissu striatal. Par conséquent, le CSD a largement empêché la contamination par le tissu striatal (riche en myéline compacte) par rapport à une dissection complète.
Une analyse impartiale du protéome des tissus non dissociés peut révéler des protéines extracellulaires intéressantes. Avec l’amélioration de la dissection à l’aide du CSD, les protéines associées extracellulaires ont été significativement enrichies dans les échantillons par rapport aux échantillons en montage entier (Figure 2C, test d’enrichissement par annotation). Le CSD et la dissection de la monture présentent un enrichissement comparable des termes d’ontologie génique (GO) « exosome vésiculeux extracellulaire » et « partie de région extracellulaire ». Cependant, le terme GO « associé au matrisome » est légèrement plus enrichi dans la CDD que dans la dissection globale. En conséquence, l’enzyme de liaison croisée ECM et la transglutaminase-2 récemment découverte du régulateur de la neurogenèse (Tgm2) se sont avérées enrichies dans la ZES par rapport à Cx en utilisant le CSD25. En revanche, aucune différence n’a été observée entre les échantillons SEZ et Cx obtenus par la dissection de montage entier (figure 2D). Les données protéomiques du striatum33 soutiennent l’hypothèse que la détection du régulateur de neurogenèse Tgm2 par dissection complète a été entravée par la contamination par le tissu striatal. Par conséquent, dans l’ensemble, la cryo-section-dissection est une amélioration réussie mais également nécessaire de la dissection standard pour l’analyse du protéome spécifique à une niche.
Comparaison avec la microscopie à capture laser
La moitié avant de la ZES et la MEZ de 3 souris adultes ont été obtenues pour la LCM (Figure 3A). Dans l’ensemble, la méthode LCM présente certains inconvénients, en particulier en ce qui concerne la perturbation et l’efficacité des tissus. Pour visualiser la région d’intérêt sous le microscope à dissection, une coloration de fond est nécessaire, ce qui peut éliminer les protéines d’intérêt petites ou solubles, par exemple les facteurs de croissance, les cytokines ou les régulateurs ECM tels que les enzymes. De plus, les lames passent des temps variables à température ambiante lors du retrait au laser. De plus, le laser lui-même pourrait dénaturer les protéines d’intérêt.
CSD a un avantage considérable sur LCM en ce qui concerne le temps et les efforts nécessaires pour effectuer la dissection: l’étape 1 du protocole doit être effectuée de la même manière pour CSD et LCM; sans cette étape, les parois ventriculaires restent adhérentes, ce qui rend difficile la séparation des échantillons de MEZ et de SEZ. Étant donné que les sections CSD (100 μm) sont 6 à 7 fois plus épaisses que l’épaisseur maximale34 des sections LCM (15 μm), l’étape 2 (sectionnement du cerveau) et l’étape 3 (retrait de la MEZ et de la SEZ de chaque section coronale) prendront au moins 6 à 7 fois plus de temps pour la LCM. La coloration de fond nécessaire et la mise en place du microscope laser prendront plus de temps. Ici, il a fallu trois fois plus de temps pour récolter 50% de la ZES et de la MEZ de 3 animaux par LCM contre 100% des ZES et MEZ de 4 animaux par CSD, constituant un avantage de vitesse huit fois supérieur à CSD. En résumé, le LCM nécessite non seulement une quantité notable d’efforts supplémentaires, mais le tissu est également soumis à une période de manipulation et de changements de température beaucoup plus longue qui peuvent compromettre la dynamique et la fiabilité des données générées par une analyse ultérieure.
Les résultats de la SEP de CSD ont été comparés aux résultats de la microdissection par capture laser (LCM). Les deux ensembles de données ont été appariés à la bibliothèque protéomique générée par la mise en commun d’échantillons CSD. En moyenne, le LCM a produit 3 441 ± 270,0 et 3 613 ± 238,7 protéines individuelles dans la ZES et la zone ventriculaire médiale, respectivement (Figure 3B). Compte tenu de la différence remarquable dans l’identification des protéines, l’analyse en composantes principales (ACP) a montré une séparation distincte selon la méthode de dissection (composante 1: 62,7%, non montrée). La composante 2 présentait la plus grande séparation entre la ZES et la ZME parmi les échantillons de LCM (8,5 %, figure 3C). La composante 3 semble également séparer LCM et CSD; toutefois, cette différence pourrait résulter de différences fondées sur la méthode plutôt que du nombre de protéines identifiées (6,4 %). Néanmoins, la séparation régionale globale est restée étonnamment distincte pour les données de cryo-dissection et bien meilleure que pour le LCM. Cet écart dans la dynamique des données peut résulter de différents temps passés par les échantillons à température ambiante pendant la dissection au laser ou d’une plus grande susceptibilité des petites quantités tissulaires à la variabilité des protocoles protéomiques ultérieurs et des mesures de spectrométrie de masse.
Pour rechercher des différences dans le profil de protéome de l’ECM, un test d’enrichissement d’annotation 2D entre CSD et LCM a été effectué pour la SEZ et la MEZ (Figure 3D). Le calcul de l’enrichissement relatif des termes GO entre les échantillons LCM et CSD permet de comparer la dynamique relative du protéome des groupes de protéines ECM entre les deux méthodes malgré la quantité inégale de tissu et les différences dans le protocole de dissection. Les graphiques révèlent une bonne corrélation entre LCM et CSD. Les annotations « partie de région extracellulaire » et « organite lié à la membrane extracellulaire » sont enrichies de manière similaire dans les méthodes et les régions. Par conséquent, la demande accrue en temps de LCM ne semble pas être compensée par une sensibilité relativement plus élevée pour les protéines associées à l’ECM. Au lieu de cela, CSD fournit une identification / quantification plus robuste lors de la comparaison des données de l’échantillon pour la neurogenèse et les protéines ECM associées aux ZES Tgm2, Thrombospondine-4 (Thbs4), S100a6 et Tenacin-C (Tnc) (Figure 3E). Dans le cas de la TnC, bien que quantifiée dans tous les échantillons, seule la CDD a affiché un enrichissement pour la ZES par rapport à la ZEM. Néanmoins, les protéines membranaires basales Nidogen-1 (Nid1), la sous-unité bêta-2 (Lamb2) associées à la ZES et la protéine de noyau de protéoglycane de sulfate d’héparane spécifique à la membrane basale (Hspg2)35 ont montré un enrichissement encore plus robuste dans la ZES (par rapport à la ZEM) dans les échantillons de LCM que dans les échantillons csd (non montrés). Par conséquent, CSD peut fournir des échantillons de tissus qui fournissent un protéome quantitatif précis et profond pour la caractérisation des ZES dans un délai raisonnable, sans se soucier de l’intégrité des tissus compromis ou de la perte de protéines.
Statistiques
Les tests statistiques, les tests d’enrichissement des annotations 2D et l’APC ont été effectués dans l’environnement Perseus. Les protéines ont été incluses dans l’analyse si une valeur valide a été détectée pour chaque méthode dans au moins un échantillon. Les comparaisons de l’abondance et des nombres de protéines ont été visualisées à l’aide d’un logiciel d’analyse de données (voir le Tableau des matériaux). Un contrôle basé sur la permutation du taux de fausse découverte (FDR) (FDR a été fixé à 0,05, 250 randomisations) a été utilisé pour les comparaisons de protéines. Pour les tests d’enrichissement par annotation 2D36, les termes GO affichés sont significativement enrichis (FDR a été défini sur 0,02 en utilisant la méthode de contrôle FDR benjamini-Hochberg).
Figure 1: La méthode cryo-section-dissection. (A) Vue d’ensemble de la région d’intérêt: le ventricule latéral avec la ZES neurogène et la ZEM non neurogène. Neuroblastes immunocolorés avec Dcx. (B) Ablation progressive de l’OB, du pôle antérieur, du cortex et du corps calleux au-dessus des ventricules et du plexus choroïde: 1. placement dans le milieu de dissection, 2. ablation de l’OB, 3. ablation du pôle antérieur du cortex, 4. incisions sagittales du sommet ventriculaire, 5. ablation du sommet ventriculaire, 6. étalement des parois ventriculaires. (C) tranches coronales de 100 μm du cerveau de souris fraîchement congelé, (1.) avant et (2.) après l’ablation des parois ventriculaires avec un scalpel glacé. Barres d’échelle = 4 mm (D) Coloration d’une section coronale d’un ventricule latéral (GFAP: vert; DAPI: bleu), montrant la ZES et la MEZ disséquées avec le CSD. Barres d’échelle = 300 μm (A), 200 μm (D). Abréviations : CSD = dissection cryo-section; ZES = zone sous-épendymaire; MEZ = zone épendymaire médiale; Dcx = Doublecortin; OB = bulbe olfactif; GFAP = protéine acide fibrillaire gliale; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Précision de dissection supérieure avec la dissection cryo-section par rapport à la dissection à montage complet. (A) Image immunohistochimique d’un échantillon de ZES obtenue par dissection de montage entier (à gauche). L’inclusion de tissu striatal riche en myéline est visualisée par coloration contre MAG (vert). Coloration d’une ZES disséquée avec le CSD (à droite).. Dans CSD, presque toute la myéline striatale (coloration contre MAG, vert) est exclue du ruban d’échantillonnage. Les noyaux ont été visualisés à l’aide de DAPI (bleu). (B) Comparaison de l’enrichissement en marqueurs de myéline dans la ZES par rapport au Cx à partir du montage entier (MBP: p = 0,0074; MAG: p = 0,0016; Plp1: p = 0,0011; CNP: p = 0,0029) et CSD (MBP: p = 0,0667; MAG: p = 0,0236; Plp1 : p = 0,3420 ; CNP : p = 0,1842). (C) Essai d’enrichissement par annotation 2D comparant l’ensemble de la ZES avec les échantillons CSD-SEZ. Les termes GO espace extracellulaire et associé aux matrisomes sont plus enrichis dans les données CSD que dans l’ensemble des données. (D) L’abondance protéique du régulateur NSC Tgm225 tracée pour la dissection de la monture entière et le CSD. Tgm2 est significativement enrichi dans la ZES par rapport au Cx dans csd (CSD: p = 0,0029; Montage entier : p = 0,1775). Pour B et D: à titre de référence, les données sur le protéome de Sharma et al.33 avec des mesures du striatum et du cortex tracées pour les protéines correspondantes affichées dans les échantillons de montage entier et de CSD. Barres d’échelle = 200 μm (A). Abréviations : CSD = dissection cryo-section; ZES = zone sous-épendymaire; MAG = glycoprotéine associée à la myéline; Cx = cortex somatosensoriel; MBP = protéine de base de la myéline; Plp1 = protéine protéolipide 1; CNP = 2',3'-nucléotide cyclique 3'-phosphodiestérase; GO = ontologie génique; NSC = cellule souche neurale; Tgm2 = tranglutaminase 2; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole; LFQ = quantification sans étiquette. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Amélioration de la quantification des protéines extracellulaires avec cryo-section-dissection par rapport à la LCM. (A) Coloration violette de cresyle d’un ventricule latéral avant et après la capture laser de la SEZ et de la MEZ (à gauche). À titre de comparaison, l’incision CSD de la ZES et de la MEZ (à droite). Barres d’échelle = 150 μm. (B) Comparaison du nombre de protéines détectées dans les échantillons de ZES et de MEZ provenant de CSD et de LCM. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. (C) Analyse en composantes principales des échantillons de ZES et de ZEM comparant les CDD et les LCM (composante 2 : 8,5 % de la variance; composante 3 : 6,4 %). (D) Enrichissement par annotation 2D de la MEZ (en haut) et de la ZES (en bas) disséquées par cryo-section et au laser. Les termes GO organite extracellulaire et partie de région extracellulaire sont considérablement enrichis (points rouges). (E) Abondances de protéines marqueurs extracellulaires associées à la ZES dans la ZES et la ZEM pour la LCM (Tnc: p = 0,3789) et les échantillons csd (Tgm2: p = 0,2940; S100a6: p = 0,0218; THBS4: p = 0,3941; Tnc: p = 0,0004). Abréviations : CSD = dissection cryo-section; LCM = microdissection de capture laser; ZES = zone sous-épendymaire; MEZ = zone épendymaire médiale; GO = ontologie génique; Tnc = T ténacine-C; Tgm2 = transglutaminase 2; S100a6 = S100 protéine de liaison au calcium A6; THBS4 = thrombospondine-4; LFQ = quantification sans étiquette. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
La méthode CSD a permis d’extraire avec précision le tissu SEZ et de générer un protéome fiable avec une profondeur significative en utilisant MS. CSD présente un net avantage par rapport à la dissection complète en termes de contamination striatale considérablement réduite des échantillons de ZES et d’enrichissement en protéines extracellulaires. Comme il est également possible de détecter un nombre similaire de protéines dans des échantillons individuels (~ 6 500 protéines par échantillon) avec CSD et dissection complète, le temps supplémentaire pour CSD en vaut la peine. LCM fournit une dissection SEZ plus précise mais a atteint une profondeur de protéome plus faible, avec seulement 3 500 protéines par échantillon malgré l’utilisation du même protocole MS que CSD (correspondance de bibliothèque et quantification sans étiquette). Il est important de noter que la variabilité était beaucoup plus grande, probablement en raison du temps de préparation huit fois plus long par échantillon. L’APC des échantillons obtenus par LCM et CSD révèle une séparation claire des deux méthodes avec des grappes étroites spécifiques à une région solidement séparées les unes des autres. En revanche, les échantillons de LCM présentaient une distribution plus dispersée, ce qui est probablement dû en partie à la durée de la préparation. Il n’est pas clair si la collecte de beaucoup plus d’échantillons sur une période plus longue aurait donné un protéome de robustesse et de profondeur égales à celles du LCM. Le calcul d’une estimation, la collecte d’un volume d’échantillon similaire à celui effectué pour csd prendraient 5 à 8 fois plus de temps avec LCM, voire jusqu’à 15 fois plus longtemps si les échantillons fournis pour les bibliothèques de spectres peptidiques étaient inclus, et une grande partie dans des conditions de dégel. De plus, compte tenu des perturbations supplémentaires du tissu nécessaires à la LCM (coloration de fond, dissection au laser), la LCM a fourni peu, voire aucun, gain par rapport à la CSD. Par conséquent, le CSD peut être considéré comme plus approprié pour la recherche sur le protéome extracellulaire, en particulier pour la ZES.
Notamment, si la région d’intérêt est plus petite que la ZES (p. ex., en étudiant uniquement la couche de cellules épendymaires), une approche à main levée est en retard sur la précision de la LCM. Par exemple, l’utilisation de CSD pour séparer l’épendymaire de la couche sous-épendymaire est difficile car la couche épendymaire n’a qu’un diamètre cellulaire de large et la démarcation vers la couche sous-épendymaire n’est pas visible à l’œil nu dans les tissus frais congelés. Par conséquent, le LCM sera un meilleur choix que le CSD si une dissection précise sur une échelle inférieure à 50 μm est plus importante que le tissu non perturbé ou le temps de dissection court. Pour les régions d’une largeur de 50 μm et plus, cependant, la précision du CSD est comparable à celle du LCM pour l’analyse des protéines ECM.
Csd s’est déjà avéré utile en contribuant à l’étude du rôle fonctionnel de l’ECM dans le créneau neurogène25. Par conséquent, l’application continue de CSD dans la ZES pour diverses études de protéines et de protéomes (ou même le séquençage de l’ARN à noyau unique) pourrait conduire à la détection d’autres régulateurs de neurogenèse, de marqueurs d’activation des cellules souches et à une compréhension plus approfondie de la physiologie de niche des cellules souches SEZ. Compte tenu du déclin de la neurogenèse dans la SEZ37 vieillissante, une analyse concise des changements ECM de la ZES des souris âgées par rapport aux jeunes pourrait promouvoir la compréhension des mécanismes de niche exacts favorisant le développement et le maintien du NSC38,39. En outre, l’influence de l’inflammation et des lésions sur la neurogenèse des ZES est bien établie40,41,42,43. L’enrichissement du fibrinogène sanguin dans la ZES après une lésion cérébrale corticale et son influence sur l’astrogliogenèse de la ZES et la formation de cicatrices44 mettent en évidence l’influence potentielle des changements de microenvironnement induits par un traumatisme sur la physiologie des cellules souches de la ZES. Par conséquent, l’étude du protéome SEZ-ECM en association avec une lésion cérébrale à l’aide de CSD pourrait aider à élucider les mécanismes par lesquels la blessure et l’inflammation affectent la neurogenèse. Il est important de noter que la méthode pourrait également être applicable aux niches neurogènes du cerveau humain dans la santé et la maladie, car des tissus frais congelés peuvent souvent être obtenus à partir de chirurgies. De plus, étant donné les différences entre les espèces dans la neurogenèse adulte, il serait également fascinant d’appliquer la méthode CSD à d’autres espèces, par exemple en association avec la neurogenèse striatale. De plus, avec d’autres méthodes de détection des protéines, les différences dans les facteurs de croissance produits localement peuvent être étudiées avec précision et efficacité à l’aide de CSD pour la ZES et la MEZ (par exemple, ELISA).
Enfin, la procédure de dissection pourrait potentiellement être modifiée pour une extraction précise d’autres régions du cerveau, y compris pour des questions de recherche non liées à la neurogenèse. Par exemple, csd comprend une brève étape de semi-décongélation, au cours de laquelle la myéline compacte est visible sous forme de zones blanches distinctes du tissu cérébral résiduel plus translucide. Avec une simple modification de la méthode, cette caractéristique permettrait la dissection précise du seul tissu de myéline compact du corps calleux, qui pourrait être soumis à une analyse protéomique des changements liés aux blessures. Une suggestion d’une modification du protocole qui permettrait la dissection insensible du corpus est d’omettre les étapes 1.5-1.9 du protocole et de procéder directement à la préparation des sections coronales au lieu d’ouvrir les ventricules pour rendre la ZES et la MEZ accessibles. Ensuite, placez les sections sur de la glace carbonique, soulevez et semi-décongelez brièvement les tranches et retirez simplement le corps calleux avec un scalpel. Cette préparation devrait maintenant être prête pour toute analyse nécessitant une dissection efficace du tissu natif du corps calleux.
En résumé, cette étude présente une méthode de micro-dissection qui pourrait être utilisée pour une analyse fiable du protéome de niche neurogène ventriculaire. Les données soulignent la compatibilité et l’utilité de la méthode CSD ainsi que de l’analyse protéomique basée sur la SEP du microenvironnement des ZES. La combinaison de la précision, de l’efficacité et de la perturbation minimale des tissus fait du CSD une extension précieuse des méthodes existantes.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent
Acknowledgments
Nous tenons à remercier sincèrement Mathias Mann de nous avoir permis d’effectuer de grandes parties des expériences dans son laboratoire, Fabian Coscia pour l’aide à l’analyse LCM et protéome, Tatiana Simon-Ebert pour les dissections complètes, et Korbinian Mayr et Igor Paron pour leur aide technique. Nous remercions le Conseil allemand de la recherche d’apporter un financement à MG (SFB870, TFR274), à l’UE (Eranet S-700982-5008-001), à l’ERC (aERC « NeuroCentro » à MG), à la société suédoise de recherche médicale (SSMF, à JK) et aux fondations et fonds KI (2020-01351, à JK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat CM3050S | Leica | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip | Fine Science Tools | cat. no. 11252-00 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 | Invitrogen | cat. no. 24020 | |
| HEPES buffer solution (1 M) | Invitrogen | cat. no. 15630 | |
| Microscope slides | RS France | cat. no. BPB018 | |
| Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL | Eppendorf | cat. no. 0030123344 | |
| Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm | Fine Science Tools | cat. no. 15003-08 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | cat. no. 5518083 | |
| Tissue culture dishes 60 mm | Greiner Bio-One | cat. no. 633180 | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) | ThermoFisher Scientific | cat. no. A-11001 | |
| DAPI | Sigma | cat. no. D9542 | |
| guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 | Millipore | cat. no. AB2253, | |
| mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 | Sigma | cat. no. G3893 | |
| mouse monoclonal anti-MAG 1:400 | Millipore | cat. no. MAB1567 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism version 9 | GraphPad Software, San Diego California USA | www.graphpad.com | |
| Perseus Version 1.6.10.50 | Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ZEN imaging software | Carl Zeiss |
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