Summary
Kryo-seksjon-disseksjon tillater fersk, frossen forberedelse av den største nevrogene nisjen i murinhjernen for dyp kvantitativ proteomanalyse. Metoden er presis, effektiv og forårsaker minimal vevsperturbasjon. Derfor er det ideelt egnet for å studere molekylær mikromiljø av denne nisjen, så vel som andre organer, regioner og arter.
Abstract
Den subependymale nevrogene nisjen består av et paraventrikulært bånd av den laterale ventrikkelveggen til lateral ventrikelen. Den subependymale sonen (SEZ) er et tynt og tydelig område utsatt for ventriklene og cerebrospinalvæsken. Isolasjonen av denne nisjen tillater analyse av et nevrogent stamcellemikromiljø. Imidlertid er utvinning av små vev for proteomanalyse utfordrende, spesielt for vedlikehold av betydelig måledybde og oppnåelse av pålitelig robusthet. En ny metode kalt kryo-seksjon-disseksjon (CSD), som kombinerer høy presisjon med minimal vevsperturbasjon, ble utviklet for å løse disse utfordringene. Metoden er kompatibel med toppmoderne massespektrometri (MS) metoder som tillater påvisning av lav-rikelig nisjeregulatorer. Denne studien sammenlignet CSD og dens proteomdata med metoden og dataene som ble innhentet ved laserfangstmikrodisseksjon (LCM) og en standard fullmontert disseksjon. CSD-metoden resulterte i dobbelt kvantifiseringsdybde på mindre enn halvparten av tilberedningstiden sammenlignet med LCM og utkonkurrerte samtidig klart disseksjonspresisjonen til hele demonteringen. Derfor er CSD en overlegen metode for å samle SEZ for proteomanalyse.
Introduction
Siden neurogenese er begrenset i den voksne hjernen, vil ulike reparasjonsstrategier i sentralnervesystemet ha stor nytte av økt forståelse av understøttelsene av voksen nevral erstatning. Gnagere har hjulpet oss med å forstå de grunnleggende mekanismene for postnatal neurogenese, selv om det bør bemerkes at voksen nevrogenese er sterkt artsavhengig. Hos mus er det tre voksne nevrale stamceller (NSC) nisjer. Hypothalamus er en voksen NSC nisje med nevrogent potensial1,2, mens kontinuerlig voksen neurogenese er hovedsakelig begrenset til hippocampus3 og SEZ av laterale vegger av laterale ventrikler4,5,6. SEZ er den største germinalregionen som inneholder NSC-er (type B-celler) som utvikler seg til nevroblaster (type A-celler) via transittforsterkningsceller (type C-celler). SEZ inneholder 20-35% av type B-celler, 1-15% av type C-celler, 1-30% av type A-celler og 25-50% av ependymale celler7. SEZ har en kompleks mikroarkitektur, med endotelceller, mikrogliale celler og ependymale celler som bor i og påvirker stamcellenisjen8,9,10. Selv om nevroner er knappe i SEZ, kommer axoner fra fjerne kilder som striatum, det ventrale tegmentalområdet, eller hypothalamus-rekkevidden og påvirker type B-celler4. Et unikt trekk ved denne stamcellenisjen er separasjonen mellom spredningsstedet og differensieringsstedet. Etter spredning migrerer de nevronale forfedrene flere millimeter fra SEZ til den olfaktoriske pæren, hvor de terminalt skiller seg ut i nevroner og integreres i eksisterende nevrale kretser. Undersøkelser av celleintrinsiske programmer knyttet til nevrogenese har allerede gitt kunnskap viktig for eksperimentell terapeutisk celle omprogrammering og transplantasjonsstrategier15,16,17,18,19,20. Imidlertid regulerer celleekstrinsiske signaler også nevrogenese, og vevsmiljøer kan bestemme den nevrogene skjebnen til stamceller11,12,14,21,22,23. Følgelig er undersøkelsen av mikromiljøet av de nevrogene nisjene og dens interaksjon med stamcellene av avgjørende betydning.
Den ekstracellulære matrisen (ECM) og andre utskilte proteiner er en stor del av mikromiljøet. For nøyaktig identifisering og kvantifisering er en proteomisk tilnærming bedre egnet enn en trans transcriptomisk tilnærming for å bestemme ECM-sammensetningen på grunn av den lave korrelasjonen mellom transkripsjon og proteinnivåer for ECM24,25. Videre er det betydelige bevis på at nisjeregulatorer i SEZ ikke utelukkende produseres av celler som fyller nisjen selv. Mer fjerne steder, som choroid plexus, utskiller modulatoriske signaler som overføres til stamcellene via cerebrospinalvæsken22,23. Å undersøke nisjeproteomet kan bidra til å identifisere nisjeregulatorer som er tilstede i nisjen uavhengig av produksjonsstedet, gitt at en betydelig del av det ekstracellulære mikromiljøet er samlet av proteiner.
For å samle murin ventrikkelsonen for objektiv proteomisk analyse, er det nødvendig med en metode med høy presisjon, og fanger ca. 50 μm tynt paraventrikulært bånd som inneholder stamceller mens du ekskluderer vevet til det tilstøtende striatum. Videre må vevsperturbasjon under avhandlingen minimaliseres for å analysere det ekstracellulære mikromiljøet fordi løselige proteiner, inkludert vekstfaktorer eller cytokiner, lett kan vaskes bort. Selv om det er mulig å analysere massespektraet av fast vev, vil det nødvendige middelet, for eksempel paraformaldehyd, redusere proteinidentifikasjonsdybden og kan introdusere posttranslasjonelle modifikasjoner. En vanlig helmontert SEZ-disseksjon, for eksempel for innsamling av celler for fluorescensaktivert cellesorteringsanalyse, fjerner hele SEZ med saks26. Denne standardavhandlingen er rask med minimal vevsperturbasjon. Striatal forurensning av prøvene kan imidlertid ikke unngås. På den annen side har LCM den enestående fordelen med overlegen disseksjonspresisjon. Imidlertid kan LCM introdusere vevsperturbasjoner, for eksempel på grunn av bakgrunnsfarging eller laser forårsaket protein denaturasjon. For å kombinere styrkene til hele disseksjonen og LCM ble det utviklet en ny metode som er kompatibel med MS, kalt kryo-seksjons-disseksjon (CSD), (figur 1A-D). CSD tillater utvinning av SEZ og disseksjonen av SEZ av medialveggene til laterale ventrikler (MEZ), som er et ideelt, for det meste ikke-nevrogen kontrollområde for SEZ (se protokollen). Nisjeproteomet oppnådd ved kombinasjonen av CSD og toppmoderne MS-metoder viste seg å være nyttig for karakterisering og identifisering av nye regulatorer i denne voksne NSC-nisjen25. Derfor vil denne metoden være nyttig for bestemmelse av SEZ vev proteinsammensetning.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer i denne studien ble utført i samsvar med tyske og EU-retningslinjer og ble godkjent av den institusjonelle dyrepleiekomiteen og regjeringen i øvre Bayern (Regierung von Oberbayern). Bare mannlige C57Bl6-mus mellom 8-10 uker ble brukt til forsøkene.
1. Forberedelse av musehjernen (~ 15 min per mus)
- Forbered disseksjonsmediet ved å tilsette 5 ml 1 M HEPES (sluttkonsentrasjon 10 mM) til 500 ml 1x Hanks balanserte saltløsning (HBSS).
MERK: Oppbevaringstiden til disseksjonsmediet (+4 °C) bør ikke overstige 2 uker. - Ofre musene ved cervical dislokasjon og forsiktig dissekere hjernen.
MERK: Når du undersøker ECM, bør vevet fortrinnsvis være umodifisert. Cervical dislokasjon holder avhandlingen tid så kort som mulig, og dermed hindre post-dødelig enzymatisk autodigestion så mye som mulig. Hvis fjerning av blod er kritisk for forskningsspørsmålet, bare perfuse musen transcardialt med fosfatbufret saltvann (PBS) før du fjerner hjernen. - Trekk ut hjernen ved manuell disseksjon og legg den i en kulturrett som inneholder iskald disseksjonsmedium (figur 1B - 1).
MERK: Hold hjernen i disseksjonsmedium på is gjennom hele disseksjonen. - Fjern den olfaktoriske pæren (OB) med en skalpell (figur 1B - 2) med et rett koronalsnitt mellom OB og den fremre polen på cortexen.
- Fjern fremre pol av cortex med skalpellen ved hjelp av et koronal kutt for å gjøre laterale ventrikler synlige i koronalplanet (figur 1B - 3).
MERK: Pass på at koronalsnittet er laget ~ 5 mm rostrally fra den optiske chiasmen; Ellers vil den rostrale delen av SEZ / MEZ gå tapt. - Bruk saks, åpne begge laterale ventrikler fra toppen, og start med en sagittal del fra kortikaloverflaten til ventrikulær lumen, og forlenge dette kuttet på en c-formet måte etter ventrikulær fleksjon (figur 1B - 4).
- Koble de kaudale endene av venstre og høyre sagittal snitt ved hjelp av et ekstra koronal kutt med saksen.
MERK: De tre kuttene danner nå en trapesformet og vil lette fjerningen av cortex og corpus callosum i neste trinn. - Fjern cortex og corpus callosum som dekker laterale ventrikler ved hjelp av tang (figur 1B - 5). Fjern deretter cortex og corpus callosum som dekker medial ventrikulære vegger. Her, gjør ytterligere kutt hvis vevet er festet til medialt ventrikkelvegger, eller bare løft cortex og corpus callosum med saks for å løsne vevet.
- Spred forsiktig ventrikkelveggene med tang (figur 1B - 6). Fjern choroid plexus med tang.
MERK: Fullstendig fjerning av choroid plexus er viktig for å unngå interferens med følgende disseksjonstrinn og unngå potensiell forurensning av SEZ/MEZ-prøvene. - Sett hjernen på en glasssklie og legg glasssklie på toppen av tørris for å fryse hjernen. Vedlikehold ventrikkelveggene i den åpne konfigurasjonen.
MERK: Sørg for nok avstand mellom side- og medialveggene på ventrikelen for å lette presis og eksklusiv disseksjon av SEZ og MEZ. Hvis vevet trekker seg tilbake til en lukket konfigurasjon, bruk tangene til å fikse veggene i ønsket posisjon under frysing. Unngå skade på SEZ/MEZ. Prøv å bruke minimal kraft, hovedsakelig på øvre kant av de åpnede ventriklene.
2. Seksjonering av den tilberedte hjernen (~ 15 min per mus)
- Klipp 50-100 μm tykke koronal deler av hjernen til slutten av lateral ventrikelen ved hjelp av en kryostat og monter seksjonene på glasssklier. Forsikre deg om at hjernen er festet til kryostatfesteplaten på bakbremsen med OCT-medium, og at ingen OCT kommer i kontakt med forebrain, spesielt ved ventriklene.
MERK: OCT-medium vil forstyrre MS-målinger. Men hvis vevet skal brukes til en antistoffanalyse, er det unødvendig å utelukke OCT-medium. Bruk av belagte glasssklier anbefales ikke. Belagte lysbilder bruker for mye limkraft på vevet, og hindrer dermed translokasjonen av vevsprøven fra lysbildene inn i mikrocentrifugerøret i de følgende trinnene.
3. Frihånds disseksjon av hjerneskiver (~ 30 min per mus)
- Plasser glasssklier med hjerneseksjonene på tørris under et disseksjonsmikroskop (figur 1C - 1).
- Forbered mikrosentrifugerørene på tørris, og sørg for at rørene holder seg på tørris i minst 1 min for å være tilstrekkelig kalde før prøveoverføring.
MERK: Bruk mikrosentrifugerør av høy kvalitet, da noen rør av lav kvalitet kan kaste plast i de påfølgende vevsfordøyelsestrinnene forbundet med MS-målinger. - Løft skivene fra tørrisen i 15-30 s for å oppnå en kort, ufullstendig opptining for å gjøre den kompakte myelinen i striatum observerbar som tette hvite prikker.
MERK: Det blir mulig å finne grensen mellom SEZ og striatum (figur 1C - 2, se figur 2A for utelukkelse av myelin og en sammenligning med metoden for hele forsamlingen). Hvis opptining tar for lang tid, kan prosessen akselereres ved å trykke en hanskedekket finger på motsatt side av glasssklie. Denne manøveren bør imidlertid praktiseres da overdreven opptining skjer lett. - Skill SEZ med en ferdigkjølt skalpell fra det tilstøtende striatumet (figur 1C,D).
- Overfør SEZ enten som et helt stykke eller seksjonert i 2-4 deler til et mikrosenterrør ved å bruke den stumpe kanten på den avkjølte skalpellen. Hvis vevet skal brukes til en annen type analyse annet enn MS, overfør vevsprøven til riktig beholder i stedet (f.eks. en 96-brønnsplate).
MERK: Kutting av det helt frosne vevet kan føre til at vevet raskt brekker bort og faller av skredet. Kutting av helt tint vev fører til oppløsning av vevet. Forsikre deg om at vevet verken er helt frosset eller helt tint.
Representative Results
Når du følger trinnene ovenfor, er vevsprøvene i mikrosenterrørene klare for og kompatible med MS-prøvepreparering. Etter prøvepreparering fikk vi ~ 5-7 μg peptider per prøve av enten SEZ eller MEZ per mus. De endelige mengdene av peptidene kan imidlertid avhenge av MS-tilberedningsmetoden. I proteomsammenligningene nedenfor ble proteinidentifikasjons- og kvantifiseringsdybden (500-1000 proteiner per prøve) økt ved beregningsmessig å matche peptidspektraet til peptidspektrabiblioteker opprettet for hver vevsregion25,27. Spesielt er den tapsfrie nanofraksjoneringsmetoden som brukes her for opprettelsen av peptidspektrabibliotekene for tiden ikke kommersielt tilgjengelig. De rå MS-dataene ble analysert ved hjelp av MaxQuant-programvaren28, og oppnådde massenøyaktigheter i delene per milliard rekkevidde29. Max Quant-miljøet tillater samsvar mellom MS-kjøringer. Proteinoverflod ble kvantifisert ved hjelp av en etikettfri kvantifiseringsalgoritme30. Immunhiistokjemisk farging ble gjort på ferskt frossent vev og utført som tidligere rapportert25 (se materialtabellen).
Kryo-seksjon-disseksjon
Den komplette SEZ og MEZ av voksne mus (n = 4) ble oppnådd ved hjelp av CSD (se figur 1 og protokoll). Den somatosensoriske cortex (Cx) ble dissekert med kirurgisk saks. Ytterligere 4 mus ble dissekert på samme måte; Imidlertid ble det dissekerte vevet samlet i en prøve per region for å lage proteombiblioteket (10 923 identifiserte proteiner) for økt proteinidentifikasjon og kvantifisering i de enkelte prøvene25. I de fire individuelle prøvene ble (gjennomsnittlig ± SD) 6673 ± 317,4 proteiner kvantifisert i SEZ og 6 747 ± 37,7 i MEZ. Alle MS-proteomikkdataene ble deponert i ProteomeXchange Consortium via PRIDE31-partnerlageret , og tiltredelsesnummeret for proteomene som rapporteres her er ProteomeXchange: PXD016632 (http://proteomecentral.proteomexchange.org).
Sammenligning med full demontering av disseksjon
Full demontering ble utført i henhold til en standardprotokoll26. Wholemount disseksjon avdekket et tilsvarende antall proteiner (ca. 6000 for SEZ og 6000 for Cx, n = 4 per gruppe) sammenlignet med CSD25. En av de tiltenkte forbedringene ved bruk av CSD for SEZ, i stedet for en heltmontert disseksjonsprotokoll, er reduksjonen av potensiell striatal forurensning. I SEZ-prøver forurenset med vev fra en annen region, kan oppdagede kandidatproteiner ikke tildeles en region, da betydelig berikelse kan skyldes interesseområdet og forurenseren. Immunhiistokjemisk ble de myelin-assosierte glykoprotein (MAG) positive myelinrike indre kapslene i striatum identifisert i hele 100-prøvene, men sjelden i CSD-prøvene (figur 2A). Striatal kontaminering i hele stmount-prøvene kan bekreftes ved å identifisere berikelsen av myelinproteiner i SEZ sammenlignet med de somatosensoriske cortex (Cx) Grey Matter (GM)-prøvene (figur 2B). Vær oppmerksom på at store deler av Cx GM, spesielt de øvre Cx-lagene, er unmyelinated32.
Ettersom store fiberbunter passerer gjennom striatum, resulterte forurensning av denne regionen i berikelse av myelinproteiner sammenlignet med Cx. Myelinproteinene som ble brukt som markører for striatal forurensning i SEZ-prøvene var det myelinbaserte proteinet (MBP), det myelin-assosierte glykoproteinet (MAG), proteolipidproteinet 1 (Plp1) og 2',3'-syklisk-nukleotid 3'-fosfodiesterase (Cnp). Alle myelinmarkørproteiner ble betydelig beriket i SEZ sammenlignet med Cx. Omvendt ga sammenligninger for de fire myelinmarkørproteinene i CSD-datasettet ingen signifikante forskjeller når man sammenlignet SEZ med Cx (figur 2B). Proteomiske data fra striatum33 støtter hypotesen om at berikelsen av myelinproteiner i SEZ-prøvene av hele disseksjonen var forårsaket av forurensning med striatalt vev. Derfor forhindret CSD i stor grad forurensning av striatalt vev (rik på kompakt myelin) sammenlignet med en heltmontert disseksjon.
Objektiv proteomanalyse av ikke-dissosiert vev kan avsløre interessante ekstracellulære proteiner. Med forbedret disseksjon ved hjelp av CSD ble ekstracellulære assosierte proteiner betydelig beriket i prøvene sammenlignet med hele utvalgene (figur 2C, annotningsberikelsestest). CSD- og wholemount-disseksjonen viser en sammenlignbar berikelse av gen ontologi (GO) begrepene "ekstracellulært vesikulært eksosom" og "ekstracellulær regiondel". Imidlertid er GO-begrepet "Matrisome-associated" litt mer beriket i CSD enn i hele demonteringen. Følgelig ble ECM kryssbindende enzym og nylig oppdaget neurogenese regulator transglutaminase-2 (Tgm2) funnet beriket i SEZ sammenlignet med Cx ved hjelp av CSD25. Det ble derimot ikke funnet noen forskjell mellom SEZ- og Cx-prøver oppnådd ved hele demonteringen (figur 2D). Proteomiske data fra striatum33 støtter hypotesen om at påvisning av nevrogeneseregulatoren Tgm2 ved fullmount disseksjon ble hindret av forurensning med striatalt vev. Derfor er kryo-seksjon-disseksjonen en vellykket, men også nødvendig forbedring av standard disseksjonen for nisjespesifikk proteomanalyse.
Sammenligning med Laser-capture-mikroskopi
Den fremer halvdelen av SEZ og MEZ av 3 voksne mus ble oppnådd for LCM (figur 3A ). Totalt sett har LCM-metoden noen ulemper, spesielt når det gjelder vevsperturbasjon og effektivitet. For å visualisere interesseområdet under disseksjonsmikroskopet, er bakgrunnsfarging nødvendig, og potensielt vaske bort små eller oppløselige proteiner av interesse, for eksempel vekstfaktorer, cytokiner eller ECM-regulatorer som enzymer. Videre bruker lysbilder varierende tider ved romtemperatur under laserfjerning. Dessuten kan laseren selv denaturere proteiner av interesse.
CSD har en betydelig fordel i forhold til LCM når det gjelder tid og krefter som er nødvendig for å utføre disseksjonen: trinn 1 i protokollen må utføres på samme måte for både CSD og LCM; uten dette trinnet forblir ventrikulære vegger tilhenger, noe som gjør separasjonen av MEZ- og SEZ-prøver vanskelig. Gitt at CSD-seksjonene (100 μm) er 6-7 ganger tykkere enn maksimal tykkelse34 av LCM-seksjonene (15 μm), vil trinn 2 (seksjonering av hjernen) og trinn 3 (fjerning av MEZ og SEZ fra hver koronaldel) ta minst 6-7 ganger lengre tid for LCM. Den nødvendige bakgrunnsfargingen og oppsettet av lasermikroskopet vil forbruke ekstra tid. Her tok det tre ganger lengre tid å høste 50% av SEZ og MEZ av 3 dyr av LCM sammenlignet med 100% av SEZ og MEZ av 4 dyr av CSD, som utgjør en åtte ganger hastighetsfordel med CSD. Oppsummert krever LCM ikke bare en betydelig mengde ekstra innsats, men vevet blir også utsatt for en betydelig lengre periode med manipulering og temperaturendringer som kan kompromittere dynamikken og påliteligheten til data generert ved etterfølgende analyse.
MS-resultatene av CSD ble sammenlignet med resultatene fra laserfangstmikrodeseksjonen (LCM). Begge datasettene ble matchet med det proteomiske biblioteket som ble generert ved å gruppere CSD-prøver. I gjennomsnitt ga LCM 3 441 ± henholdsvis 270,0 og 3 613 ± 238,7 individuelle proteiner i henholdsvis SEZ- og medial ventrikkelsonen (figur 3B). Gitt den bemerkelsesverdige forskjellen i proteinidentifikasjon, viste hovedkomponentanalyse (PCA) tydelig separasjon i henhold til disseksjonsmetoden (komponent 1: 62,7%, ikke vist). Komponent 2 viste størst separasjon for SEZ og MEZ blant LCM-prøvene (8,5 %, bilde 3C). Komponent 3 ser også ut til å skille LCM og CSD; Denne forskjellen kan imidlertid skyldes metodebaserte forskjeller i stedet for antall identifiserte proteiner (6,4 %). Likevel forble den samlede regionale separasjonen påfallende tydelig for kryo-disseksjonsdataene og langt bedre enn for LCM. Denne uoverensstemmelsen i datadynamikken kan skyldes forskjellige tider brukt av prøvene ved romtemperatur under laserspredningen eller en høyere følsomhet for små vevsmengder til variasjon i de påfølgende proteomiske protokollene og massespektrometrimålingene.
For å søke etter forskjeller i proteomprofilen til ECM ble det utført en 2D-merknadsberikelsestest mellom CSD og LCM for SEZ og MEZ (figur 3D). Beregning av den relative berikelsen av GO-termer mellom LCM- og CSD-prøver gjør det mulig å sammenligne relativ proteomdynamikk i ECM-proteinklyngene mellom de to metodene til tross for ulik mengde vev og forskjellene i disseksjonsprotokollen. Plottene viser en god sammenheng mellom LCM og CSD. Merknadene "extracellular region part" og "extracellular membrane-bound organelle" er tilsvarende beriket i både metoder og regioner. Derfor ser det ikke ut til at den økte tidsbehovet til LCM kompenseres av en relativt høyere følsomhet for ECM-assosierte proteiner. I stedet gir CSD mer robust identifisering/kvantifisering ved sammenligning av prøvedata for nevrogenesen og SEZ-assosierte ECM-proteiner Tgm2, Trombospondin-4 (Thbs4), S100a6 og Tenacin-C (Tnc) (figur 3E). Når det gjelder TnC, selv om det er kvantifisert i alle prøver, viste bare CSD berikelse for SEZ sammenlignet med MEZ. Likevel viste de SEZ-assosierte basale membranproteinene Nidogen-1 (Nid1), Laminin subenhet beta-2 (Lamb2) og kjellermembranspesifikke heparansulfatproteoglykankjerneprotein (Hspg2)35 en enda mer robust berikelse i SEZ (sammenlignet med MEZ) i LCM-prøvene enn i CSD-prøvene (ikke vist). Derfor kan CSD gi vevsprøver som gir et nøyaktig og dypt kvantitativt proteom for SEZ-karakterisering i en rimelig tidsramme, uten å bekymre deg for kompromittert vevsintegritet eller proteintap.
Statistikk
Statistisk testing, 2D-annotningsberikelsestester og PCA ble gjort i Perseus-miljøet. Proteiner ble inkludert i analysen hvis det ble påvist en gyldig verdi for hver metode i minst én prøve. Proteinoverflod og tallsammenligninger ble visualisert ved hjelp av dataanalyseprogramvare (se materialtabellen). En permutasjonsbasert kontroll av den falske oppdagelsesraten (FDR) (FDR ble satt til 0,05, 250 randomiseringer) ble brukt til proteinsammenligninger. For 2D-merknadsberikelsestestene36 er de viste GO-begrepene betydelig beriket (FDR ble satt til 0,02 ved hjelp av Benjamini-Hochberg FDR-kontrollmetode).
Figur 1: Cryo-Section-Dissection-metoden. (A) Oversikt over interesseområdet: lateral ventrikelen med nevrogen SEZ og den ikke-nevrogene MEZ. Neuroblaster immunostert med Dcx. (B) Trinnvis fjerning av OB, fremre pol, cortex og corpus callosum over ventriklene og choroid plexus: 1. plassering i disseksjonsmedium, 2. fjerning av OB, 3. fjerning av den fremre polen av cortex, 4. sagittale snitt av ventrikkeltoppen, 5. fjerning av ventrikkeltoppen, 5. fjerning av ventrikulær topp, 5. fjerning av ventrikkeltoppen, 5. fjerning av ventrikkeltoppen, 5. fjerning av ventrikkeltoppen, 5. 6. spredning av ventrikkelveggene. (C) 100 μm koronal skiver av den ferskfryste musehjernen, (1.) før og (2.) etter fjerning av ventrikkelveggene med en iskald skalpell. Skalastenger = 4 mm (D) Farging av en koronaldel av en lateral ventrikel (GFAP: grønn; DAPI: blå), som viser SEZ og MEZ dissekert med CSD. Skalastenger = 300 μm (A), 200 μm (D). Forkortelser: CSD = kryo-seksjon disseksjon; SEZ = subependymal sone; MEZ = medial ependymal sone; Dcx = Doublecortin; OB = olfaktorisk pære; GFAP = glial fibrillært surt protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Overlegen disseksjonspresisjon med kryo-seksjon-disseksjon sammenlignet med fullmount disseksjon. (A) Immunohistokjemisk bilde av en SEZ-prøve oppnådd ved fullmontert disseksjon (venstre). Inkluderingen av myelinrikt striatalvev visualiseres ved farging mot MAG (grønn). Farging av en SEZ dissekert med CSD (høyre). I CSD er nesten all striatal myelin (farging mot MAG, grønn) utelukket fra prøvebåndet. Nuclei ble visualisert ved hjelp av DAPI (blå). (B) Sammenligning av myelinmarkørberikelse i SEZ vs. Cx fra wholemount (MBP: p = 0,0074; MAG: p = 0,0016; Plp1: p = 0,0011; CNP: p = 0,0029) og CSD (MBP: p = 0,0667; MAG: p = 0,0236; Plp1: p = 0,3420; CNP: p = 0,1842). (C) 2D-merknadsberikelsestest som sammenligner hele SEZ med CSD-SEZ-prøvene. GO-termene ekstracellulær plass og Matrisome-assosiert er mer beriket i CSD-dataene enn i fullkomne data. (D) Proteinoverflod av NSC-regulatoren Tgm225 plottet for hele demonteringen og CSD. Tgm2 er betydelig beriket i SEZ sammenlignet med Cx i CSD (CSD: p = 0,0029; Wholemount: p = 0,1775). For B og D: Som referanse, proteome data fra Sharma et al.33 med målinger av striatum og cortex plottet for de tilsvarende proteiner som vises i hele demonterte og CSD prøver. Skalastenger = 200 μm (A). Forkortelser: CSD = kryo-seksjon disseksjon; SEZ = subependymal sone; MAG = myelin-assosiert glykoprotein; Cx = somatosensorisk cortex; MBP = myelin grunnleggende protein; Plp1 = proteolipid-protein 1; CNP = 2',3'-syklisk-nukleotid 3'-fosfodiesterase; GO = gen ontologi; NSC = nevral stamcelle; Tgm2 = tranglutaminase 2; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; LFQ = etikettfri kvantasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forbedret ekstracellulær protein kvantifisering med kryo-seksjon-disseksjon sammenlignet med LCM. (A) Cresyl fiolett farging av en lateral ventrikel før og etter laserfangst av SEZ og MEZ (venstre). Til sammenligning, CSD snittet av SEZ og MEZ (høyre). Skalastenger = 150 μm. (B) Sammenligning av antall påviste proteiner i SEZ- og MEZ-prøvene fra CSD og LCM. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SD. (C) Hovedkomponentanalyse av SEZ- og MEZ-prøvene som sammenligner CSD og LCM (komponent 2: 8,5 % av variansen; komponent 3: 6,4 %). (D) 2D-merknadsberikelse av kryo-seksjon- og laser-dissekerte MEZ (Top) og SEZ (Bottom). GO-begrepene ekstracellulær organell og ekstracellulær regiondel er betydelig beriket (røde prikker). (E) Overflod av ekstracellulære SEZ-assosierte markørproteiner i SEZ og MEZ for LCM (Tnc: p = 0,3789) og CSD-prøvene (Tgm2: p = 0,2940; S100a6: p = 0,0218; THBS4: p = 0,3941; Tnc: p = 0,0004). Forkortelser: CSD = kryo-seksjon disseksjon; LCM = laser-capture-microdissection; SEZ = subependymal sone; MEZ = medial ependymal sone; GO = gen ontologi; Tnc = Tenacin-C; Tgm2 = transglutaminase 2; S100a6 = S100 kalsiumbindende protein A6; THBS4 = trombospondin-4; LFQ = etikettfri kvantasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
CSD-metoden gjorde det mulig å nøyaktig trekke ut SEZ-vev og generere en pålitelig proteom med betydelig dybde ved hjelp av MS. CSD viser en klar fordel sammenlignet med full desinfeksjon når det gjelder sterkt redusert striatal forurensning av SEZ-prøver og ekstracellulær proteinberikelse. Siden det også er mulig å oppdage et lignende antall proteiner i individuelle prøver (~ 6500 proteiner per prøve) med CSD og full demontering, er tilleggstiden for CSD vel verdt innsatsen. LCM gir mer presis SEZ-disseksjon, men nådde en lavere proteomdybde, med bare 3500 proteiner per prøve til tross for at de brukte samme MS-protokoll som CSD (bibliotekmatching og etikettfri kvantifisering). Det er viktig at variasjonen var mye større, sannsynligvis på grunn av den åttedoble lengre tilberedningstiden per prøve. PCA av prøvene oppnådd av LCM og CSD avslører en klar separasjon av begge metodene med tette regionspesifikke klynger robust skilt fra hverandre. I motsetning viste LCM-prøvene en mer spredt distribusjon, noe som sannsynligvis delvis skyldes lengden på forberedelsen. Det er uklart om innsamling av langt flere prøver over en lengre periode ville gitt et proteom av lik robusthet og dybde med LCM. Beregning av et estimat, innsamling av et lignende prøvevolum som gjort for CSD ville ta 5-8 ganger lengre tid med LCM, selv opptil 15 ganger lenger hvis prøver gitt for peptidspektrabibliotekene ble inkludert, og mye av det under opptinte forhold. Videre, med tanke på de ekstra perturbasjonene av vevet som er nødvendig for LCM (bakgrunnsfarging, laser disseksjon), ga LCM lite, om noen, gevinst over CSD. Derfor kan CSD anses som mer egnet for ekstracellulær proteomforskning, spesielt for SEZ.
Spesielt hvis interesseområdet er mindre enn SEZ (f.eks. undersøker bare det ependymale cellelaget), faller en frihåndstilnærming bak nøyaktigheten til LCM. For eksempel er det vanskelig å bruke CSD til å skille det ependymale fra det subependymale laget, da det ependymale laget bare er en cellediameter bred, og avgrensningen mot det subependymale laget er ikke synlig for det blotte øye i ferskt frossent vev. Derfor vil LCM være et bedre valg enn CSD hvis en presis disseksjon på en skala under 50 μm er viktigere enn uforstyrret vev eller holder disseksjonstiden kort. For regioner med en bredde på 50 μm og mer er imidlertid presisjonen til CSD sammenlignbar med LCM for ECM proteinanalyse.
CSD har allerede vist seg å være nyttig ved å bidra til undersøkelsen av ECM's funksjonelle rolle i den nevrogene nisje25. Derfor kan fortsatt anvendelse av CSD i SEZ for ulike protein- og proteomundersøkelser (eller til og med enkeltkjerne RNA-sekvensering) føre til deteksjon av ytterligere nevrogeneseregulatorer, stamcelleaktiveringsmarkører og en dypere forståelse av SEZ stamcelle nisjefysiologi. Tatt i betraktning nedgangen i nevrogenese i den aldrende SEZ37, kan en kortfattet analyse av ECM-endringer av SEZ av eldre vs. unge mus fremme forståelsen av de eksakte nisjemekanismene som fremmer NSC-utvikling og vedlikehold38,39. Videre er påvirkning av betennelse og skade på SEZ neurogenese godt etablert40,41,42,43. Berikelsen av blod-avledet fibrinogen i SEZ etter kortikale hjerneskade og dens innflytelse på SEZ astrogliogenese og arrdannelse44 fremhever den potensielle påvirkningen av traumeinduserte mikromiljøet endringer på SEZ stamcelle fysiologi. Derfor kan undersøkelse av SEZ-ECM-proteomet i forbindelse med hjerneskade ved hjelp av CSD bidra til å belyse mekanismene der skade og betennelse påvirker nevrogenese. Det er viktig at metoden også kan være aktuell for nevrogene nisjer i mennesker i helse og sykdom, da ferskt frossent vev ofte kan fås fra operasjoner. Videre, gitt artsforskjellene i voksen neurogenese, ville det også være fascinerende å bruke CSD-metoden på andre arter, for eksempel i forbindelse med striatal neurogenese. Videre, med andre proteindeteksjonsmetoder, kan forskjeller i lokalt produserte vekstfaktorer undersøkes nøyaktig og effektivt ved hjelp av CSD for SEZ og MEZ (f.eks. ELISA).
Til slutt kan disseksjonsprosedyren potensielt modifiseres for nøyaktig utvinning av andre hjerneregioner, også for forskningsspørsmål som ikke er relatert til nevrogenese. For eksempel inkluderer CSD et kort halvt tinende trinn, hvor kompakt myelin er synlig som hvite områder som skiller seg fra det mer gjennomskinnelige gjenværende hjernevevet. Med en enkel modifikasjon av metoden vil denne funksjonen tillate presis disseksjon av bare corpus callosum kompakt myelinvev, som kan bli utsatt for proteomisk analyse av skaderelaterte endringer. Et forslag om en protokollendring som vil tillate corpus callous disseksjon er å utelate trinn 1.5-1.9 av protokollen og fortsette direkte til å forberede koronal seksjoner i stedet for å åpne ventriklene for å gjøre SEZ og MEZ tilgjengelig. Plasser deretter seksjonene på tørris, løft kort og skru opp skivene halvveis, og fjern bare corpus callosum med en skalpell. Dette preparatet skal nå være klart for enhver analyse som krever en effektiv disseksjon av innfødt corpus callosum vev.
Oppsummert presenterer denne studien en mikro-disseksjonsmetode som kan brukes til pålitelig ventrikulær nevrogen nisjeproteomanalyse. Dataene understreker kompatibiliteten og nytten av CSD-metoden sammen med MS-basert proteomisk analyse av SEZ-mikromiljøet. Kombinasjonen av presisjon, effektivitet og minimal vevsperturbasjon gjør CSD til en verdifull forlengelse av eksisterende metoder.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser
Acknowledgments
Vi ønsker oppriktig å takke Mathias Mann for at vi lot oss utføre store deler av eksperimentene i laboratoriet hans, Fabian Coscia for hjelp med LCM og proteomanalyse, Tatiana Simon-Ebert for hele disseksjoner, og Korbinian Mayr og Igor Paron for deres tekniske hjelp. Vi anerkjenner takknemlig finansiering fra det tyske forskningsrådet til MG (SFB870, TFR274), EU (Eranet S-700982-5008-001), ERC (aERC "NeuroCentro" til MG), Swedish Society for Medical Research (SSMF, to JK) postdoktorstipend, og KI foundations and Funds (2020-01351, til JK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat CM3050S | Leica | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip | Fine Science Tools | cat. no. 11252-00 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 | Invitrogen | cat. no. 24020 | |
| HEPES buffer solution (1 M) | Invitrogen | cat. no. 15630 | |
| Microscope slides | RS France | cat. no. BPB018 | |
| Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL | Eppendorf | cat. no. 0030123344 | |
| Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm | Fine Science Tools | cat. no. 15003-08 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | cat. no. 5518083 | |
| Tissue culture dishes 60 mm | Greiner Bio-One | cat. no. 633180 | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) | ThermoFisher Scientific | cat. no. A-11001 | |
| DAPI | Sigma | cat. no. D9542 | |
| guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 | Millipore | cat. no. AB2253, | |
| mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 | Sigma | cat. no. G3893 | |
| mouse monoclonal anti-MAG 1:400 | Millipore | cat. no. MAB1567 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism version 9 | GraphPad Software, San Diego California USA | www.graphpad.com | |
| Perseus Version 1.6.10.50 | Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ZEN imaging software | Carl Zeiss |
References
- Goodman, T., Hajihosseini, M. K. Hypothalamic tanycytes-masters and servants of metabolic, neuroendocrine, and neurogenic functions. Frontiers in Neuroscience. 9, 387 (2015).
- Chaker, Z., et al. Hypothalamic neurogenesis persists in the aging brain and is controlled by energy-sensing IGF-I pathway. Neurobiology of Aging. 41, 64-72 (2016).
- Kuhn, H. G., Toda, T., Gage, F. H. Adult hippocampal neurogenesis: a coming-of-age story. Journal of Neuroscience. 38 (49), 10401-10410 (2018).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Bordiuk, O. L., Smith, K., Morin, P. J., Semënov, M. V. Cell proliferation and neurogenesis in adult mouse brain. PloS One. 9 (11), 111453 (2014).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain. Journal of Neuroscience. 17 (13), 5046-5061 (1997).
- Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The adult ventricular-subventricular zone (V-SVZ) and olfactory bulb (OB) neurogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (5), 018820 (2016).
- Sato, K.
- Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
- Sirko, S., et al. Chondroitin sulfates are required for fibroblast growth factor-2-dependent proliferation and maintenance in neural stem cells and for epidermal growth factor-dependent migration of their progeny. Stem Cells. 28 (4), 775-787 (2010).
- Mercier, F. Fractones: extracellular matrix niche controlling stem cell fate and growth factor activity in the brain in health and disease. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (24), 4661-4674 (2016).
- Mercier, F., Kitasako, J. T., Hatton, G. I. Anatomy of the brain neurogenic zones revisited: fractones and the fibroblast/macrophage network. Journal of Comparative Neurology. 451 (2), 170-188 (2002).
- Nascimento, M. A., Sorokin, L., Coelho-Sampaio, T. Fractone bulbs derive from ependymal cells and their laminin composition influence the stem cell niche in the subventricular zone. Journal of Neuroscience. 38 (16), 3880-3889 (2018).
- Chen, G., et al. In vivo reprogramming for brain and spinal cord repair. eNeuro. 2 (5), 0106-0115 (2015).
- Zhang, Q., Chen, W., Tan, S., Lin, T. Stem cells for modeling and therapy of Parkinson's disease. Human Gene Therapy. 28 (1), 85-98 (2017).
- Wei, C., Xiong, S., Cheng, L. Reprogramming of fibroblasts to neural stem cells by a chemical cocktail. Methods in Molecular Biology. 2117, 265-270 (2020).
- Tian, Z., Zhao, Q., Biswas, S., Deng, W. Methods of reactivation and reprogramming of neural stem cells for neural repair. Methods. 133, 3-20 (2018).
- Heinrich, C., et al. Sox2-mediated conversion of NG2 glia into induced neurons in the injured adult cerebral cortex. Stem Cell Reports. 3 (6), 1000-1014 (2014).
- Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
- Seidenfaden, R., Desoeuvre, A., Bosio, A., Virard, I., Cremer, H. Glial conversion of SVZ-derived committed neuronal precursors after ectopic grafting into the adult brain. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (1-2), 187-198 (2006).
- Lepko, T., et al. Choroid plexus-derived miR-204 regulates the number of quiescent neural stem cells in the adult brain. EMBO Journal. 38 (17), 100481 (2019).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Angelidis, I., et al. An atlas of the aging lung mapped by single cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nature Communications. 10 (1), 963 (2019).
- Kjell, J., et al. Defining the adult neural stem cell niche proteome identifies key regulators of adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 26 (2), 277-293 (2020).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), e1938 (2010).
- Kulak, N. A., Geyer, P. E., Mann, M. Loss-less nano-fractionator for high sensitivity, high coverage proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 16 (4), 694-705 (2017).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47 (1), 442-450 (2019).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344 (6181), 319-324 (2014).
- Sharma, K., et al. Cell type- and brain region-resolved mouse brain proteome. Nature Neuroscience. 18 (12), 1819-1831 (2015).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerever, A., et al. Novel extracellular matrix structures in the neural stem cell niche capture the neurogenic factor fibroblast growth factor 2 from the extracellular milieu. Stem Cells. 25 (9), 2146-2157 (2007).
- Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12 (2012).
- Daynac, M., Morizur, L., Chicheportiche, A., Mouthon, M. -A., Boussin, F. D. Age-related neurogenesis decline in the subventricular zone is associated with specific cell cycle regulation changes in activated neural stem cells. Scientific Reports. 6, 21505 (2016).
- Navarro Negredo, P., Yeo, R. W., Brunet, A. Aging and rejuvenation of neural stem cells and their niches. Cell Stem Cell. 27 (2), 202-223 (2020).
- Smith, L. K., White, C. W., Villeda, S. A. The systemic environment: at the interface of aging and adult neurogenesis. Cell and Tissue Research. 371 (1), 105-113 (2018).
- Neuberger, E. J., Swietek, B., Corrubia, L., Prasanna, A., Santhakumar, V. Enhanced dentate neurogenesis after brain injury undermines long-term neurogenic potential and promotes seizure susceptibility. Stem Cell Reports. 9 (3), 972-984 (2017).
- Fisch, U., Brégère, C., Geier, F., Chicha, L., Guzman, R. Neonatal hypoxia-ischemia in rat elicits a region-specific neurotrophic response in SVZ microglia. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 26 (2020).
- Götz, M., Sirko, S., Beckers, J., Irmler, M. Reactive astrocytes as neural stem or progenitor cells: In vivo lineage, In vitro potential, and Genome-wide expression analysis. Glia. 63 (8), 1452-1468 (2015).
- Kernie, S. G., Parent, J. M. Forebrain neurogenesis after focal Ischemic and traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 37 (2), 267-274 (2010).
- Pous, L., et al. Fibrinogen induces neural stem cell differentiation into astrocytes in the subventricular zone via BMP signaling. Nature Communications. 11 (1), 630 (2020).
