Summary
크릴로 단부-해부는 깊은 정량적 프로테오메 분석을 위해 뮤린 뇌에서 가장 큰 신경 성 틈새 시장을 신선하고 냉동 준비 할 수 있습니다. 이 방법은 정확하고 효율적이며 최소한의 조직 혼란을 일으킵니다. 따라서, 그것은 이상적으로이 틈새 시장, 뿐만 아니라 다른 장기, 지역 및 종의 분자 미세 환경을 공부에 적합.
Abstract
피하 신경 성 틈새 시장 측면 심실의 측면 심실 벽의 심실 리본으로 구성 됩니다. subependymal 영역 (SEZ)은 심실및 뇌척수액에 드러나는 얇고 뚜렷한 영역입니다. 이 틈새 시장을 분리하면 신경 줄기 세포 미세 환경의 분석을 할 수 있습니다. 그러나 프로테오메 분석을 위한 작은 조직을 추출하는 것은 특히 상당한 측정 깊이의 유지 보수와 신뢰할 수 있는 견고성의 성취를 위해 도전적입니다. 고정밀과 최소한의 조직 교란을 결합한 저온 절제부(CSD)라는 새로운 방법이 이러한 과제를 해결하기 위해 개발되었다. 이 방법은 풍부한 틈새 규제 기관을 감지할 수 있는 최첨단 질량 분석법(MS) 방법과 호환됩니다. 이 연구는 CSD와 프로테옴 데이터를 레이저 포획-마이크로절(LCM) 및 표준 전체마운트 해부에 의해 얻은 방법 및 데이터와 비교했습니다. CSD 방법은 LCM에 비해 준비 시간의 절반 미만으로 정량화 깊이의 두 배 미만을 초래하고 동시에 전체 마운트 해분의 해부 정밀도를 명확하게 능가하였다. 따라서, CSD는 프로테옴 분석을 위한 SEZ를 수집하는 우수한 방법입니다.
Introduction
신경 발생은 성인 두뇌에 제한, 다양 한 중추 신 경계 복구 전략은 크게 성인 신경 교체의 기초의 증가 이해에서 혜택을 받을 것 이다. 설치류는 우리가 산후 신경 발생의 기본 메커니즘을 이해하는 데 도움이되었습니다, 그것은 성인 신경 발생이 크게 종 의존한다는 것을 주의해야하지만. 마우스에는 3개의 성인 신경 줄기 세포 (NSC) 틈새가 있습니다. 시상 하 부 신경 성 잠재력을 가진 성인 NSC 틈새 시장1,2, 지속적인 성인 신경 발생은 주로 해 마에 제한 하는 동안3 그리고 측면 심실의 측면 벽의 SEZ4,5,6. SEZ는 트랜지케이팅 증폭 선조 세포(C 형 세포)를 통해 신경 폭발성(A형 세포)으로 발전하는 NSC(유형 B 세포)를 함유하는 가장 큰 발아 영역입니다. SEZ는 타입 B 세포의 20-35%, 타입 C 세포의 1-15%, 타입 A 세포의 1-30%, 및 연피 세포의 25-50%를 포함합니다7. SEZ는 내피 세포, 미세 글리아 세포 및 줄기 세포 틈새 에 거주 및 영향을 미치는 연골 세포와 복잡한 마이크로 아키텍처를 갖추고 있습니다8,9,10. 뉴런은 SEZ에서 부족하지만, 축축은 줄무늬, 복부 테지멘트 영역, 또는 시상 하부 도달 및 영향 유형 B 세포4와 같은 먼 소스에서 방출된다. 이 줄기 세포 틈새 의 독특한 특징은 증식 의 사이트와 분화 의 사이트 사이의 분리입니다. 증식 후, 신경 전구는 SEZ에서 후각 전구로 몇 밀리미터 이동하여 말단으로 뉴런으로 분화하고 기존의 신경 회로에 통합합니다. 신경 발생과 관련 된 세포 본질적인 프로그램에 대 한 조사는 이미 실험 치료 세포 재프로그래밍 및 이식 전략에 대 한 중요 한 지식을 제공 15,16,17,18,19,20. 그러나, 세포 외외 신호는 또한 신경 발생을 통제하고, 조직 환경은 줄기 세포의 신경 발생 운명을 결정할 수 있습니다11,12,14,21,22,23. 따라서 신경질적 틈새 의 미세 환경과 줄기 세포와의 상호 작용에 대한 조사는 매우 중요합니다.
세포 외 매트릭스 (ECM) 및 기타 분비 된 단백질은 마이크로 환경의 큰 부분입니다. 정확한 식별 및 정량화를 위해, 프로테오믹 접근법은 ECM24,25에 대한 전사와 단백질 수준 사이의 낮은 상관관계로 인해 ECM 조성물을 결정하는 전사적 접근법보다 더 적합합니다. 더욱이, SEZ의 틈새 규제 기관이 틈새 시장을 채우는 세포에 의해 독점적으로 생산되지 않는다는 실질적인 증거가 있습니다. 코로이드 신경총과 같은 더 먼 위치, 뇌척수액을 통해 줄기 세포로 전달되는 변조 신호를 분비22,23. 틈새 프로테오메를 조사하는 것은 세포 외 미세 환경의 상당 부분이 단백질에 의해 조립된다는 점을 감안할 때 생산 현장과 는 별개로 틈새 시장에서 존재하는 틈새 규제 기관을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
편견없는 프로테오믹 분석을 위해 뮤린 심실 영역을 수집하기 위해서는, 높은 정밀도를 가진 방법이 필요하며, 인접한 줄무늬의 조직을 배제하면서 줄기 세포를 포함하는 50 μm 얇은 심실 리본을 포착한다. 더욱이, 해부 중 조직 분동은 성장 인자 또는 사이토카인을 포함한 용해성 단백질이 쉽게 씻겨질 수 있기 때문에 세포외 미세 환경을 분석하기 위해 최소화되어야 한다. 고정 조직의 질량 스펙트럼을 분석할 수 있지만, 파라포름알데히드와 같은 필수 제제는 단백질 식별 깊이를 감소시키고 번역 후 수정을 도입할 수 있다. 형광 활성화 세포 선별 분석을 위한 세포의 수집을 위해 일반적인 전체 마운트 SEZ 해부는 가위26으로 전체 SEZ를 제거합니다. 이 표준 해부는 최소한의 조직 동요로 빠릅니다. 그러나 시료의 적지 오염은 피할 수 없습니다. 반대로 LCM은 우수한 해부 정밀도의 뛰어난 장점을 가지고 있습니다. 그러나, LCM은 조직 동요를 소개할 수 있습니다, 예를 들면, 배경 염색 또는 레이저 로 인한 단백질 성소 때문. 전체마운트 해부 및 LCM의 강점을 결합하기 위해, MS와 호환되는 새로운 방법, 극저온 단면 해부(CSD)라고 불림) 개발되었다(도 1A-D). CSD는 SEZ에 대한 이상적이고 대부분 비 신경성 제어 영역인 측면 심실(MEZ)의 내측 벽의 SEZ 및 SEZ의 해부를 추출할 수 있게 한다(프로토콜 참조). CSD와 최첨단 MS 방법의 조합에 의해 얻은 틈새 proteome이 성인 NSC 틈새 에서 새로운 규제 기관의 특성화 및 식별에 유용 한 것으로 판명되었다 25. 따라서, 이 방법은 SEZ 조직 단백질 조성물의 결정에 유용할 것이다.
Protocol
이 연구의 모든 실험 절차는 독일과 유럽 연합 (EU) 지침에 따라 수행되었으며 기관 동물 관리위원회와 바이에른 상부 정부 (레지옹 폰 오버바이엔)의 정부에 의해 승인되었습니다. 만 남성 C57Bl6 쥐의 나이 사이 8-10 주 실험에 사용 되었다.
1. 마우스 뇌의 준비 (마우스 당 15 분)
- 1m HEPES(최종 농도 10mMM)의 5mL를 1x 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)의 500mL에 추가하여 해부 매체를 준비한다.
참고: 해부 매체(+4°C)의 저장 시간은 2주를 초과해서는 안 됩니다. - 자궁 경부 탈구로 마우스를 희생하고 조심스럽게 뇌를 해부.
참고: ECM을 조사할 때 조직은 바람직하게는 수정되지 않아야 합니다. 자궁 경부 탈구는 가능한 한 짧은 해부 시간을 유지하여 필멸의 효소 자동 소화 후 가능한 한 많이 방지할 수 있습니다. 혈액의 제거가 연구 질문에 중요한 경우에, 단순히 뇌를 제거하기 전에 인산염 완충식 염선 (PBS)와 마우스를 투명하게 퍼프. - 수동 해부에 의해 뇌를 추출하고 얼음 차가운 해부 매체를 포함하는 문화 접시에 배치 (도 1B - 1).
참고: 해부 전체의 얼음 에 해부 매체에 뇌를 유지합니다. - 메스(도 1B - 2)로 후각 전구(OB)를 OB와 피질의 전방 극 사이의 직선 관상 절단으로 제거합니다.
- 관상 동맥 절단을 사용하여 메스로 피질의 전방 기둥을 제거하여 관상 평면에서 측면 심실을 볼 수 있도록 합니다(그림 1B - 3).
참고 : 관상 절단이 광학 치아솜에서 ~ 5mm 로스트리하게 만들어졌는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 SEZ/MEZ의 장밋빛 부분이 손실됩니다. - 가위를 사용하여, 피질 표면에서 심실 루멘에 처진 섹션으로 시작하여 상단에서 측면 심실을 모두 열고 심실 굴곡 (그림 1B - 4)에 따라 c 자형 방식으로이 절단을 길게합니다.
- 가위와 함께 추가 관상 절단을 통해 왼쪽과 오른쪽 처진 절개의 코달 끝을 연결합니다.
참고: 세 컷은 이제 사다리꼴을 형성하고 다음 단계에서 피질과 코퍼스 캘로섬의 제거를 용이하게합니다. - 집게를 사용하여 측면 심실을 덮는 피질 및 코퍼스 캘러섬을 제거합니다(그림 1B - 5). 그런 다음 내측 심실 벽을 덮는 피질과 코퍼스 캘로섬을 제거합니다. 여기서, 조직이 내측 심실 벽에 부착되어 있는 경우 추가 컷을 만들거나, 가위로 피질과 코퍼스 캘로섬을 들어 올려 조직을 빼낼 수 있습니다.
- 조심스럽게 집게심실 벽을 확산 (그림 1B - 6). 집게로 치로이드 신경을 제거합니다.
참고: choroid 신경총의 완전한 제거는 다음 해부 단계와의 간섭을 피하고 SEZ/MEZ 샘플의 잠재적오염을 방지하는 것이 중요합니다. - 유리 슬라이드에 뇌를 넣고 뇌를 동결건조 얼음 위에 유리 슬라이드를 배치합니다. 열린 구성에서 심실 벽을 유지합니다.
참고: SEZ와 MEZ의 정밀하고 독점적인 해부를 용이하게 하기 위해 심실의 측면 벽과 내측 벽 사이의 충분한 거리를 보장합니다. 조직이 닫힌 구성으로 다시 수축하는 경우 집게를 사용하여 동결 중에 원하는 위치에 있는 벽을 수정합니다. SEZ/MEZ의 손상은 피하십시오. 주로 열린 심실의 상단 가장자리에 최소한의 힘을 적용해 보십시오.
2. 준비된 뇌의 절제 (마우스 당 15 분)
- 저온심실이 끝날 때까지 뇌의 50-100 μm 두께의 관상 섹션을 잘라 유리 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 뇌가 OCT 매체와 뒤이어뇌의 극저온 부착 판에 부착되어 있으며, 특히 심실에서 10월이 전뇌와 접촉하지 않도록 하십시오.
참고: 10월 매체는 MS 측정을 방해합니다. 그러나, 조직이 항체 분석에 사용될 경우, OCT 배지를 배제할 필요가 없습니다. 코팅 된 유리 슬라이드의 사용은 권장하지 않습니다. 코팅 된 슬라이드는 조직에 너무 많은 접착제 힘을 적용하여 슬라이드에서 다음 단계에서 미세 원심 분리기 튜브로 조직 표본의 전좌를 방해합니다.
3. 뇌 슬라이스의 자유 손 해부 (마우스 당 30 분)
- 해부 현미경 (그림 1C - 1)의 밑에 건조한 얼음에 두뇌 단면도와 유리 슬라이드를 놓습니다.
- 건조한 얼음에 미세 원심 분리관을 준비하고, 튜브가 시편 이송 전에 충분히 차가워질 수 있도록 적어도 1 분 동안 건조한 얼음에 머물러 있는지 확인하십시오.
참고: 일부 저품질 튜브가 MS 측정과 관련된 후속 조직 소화 단계에서 플라스틱을 흘릴 수 있기 때문에 고품질의 미세원심분리관을 사용하십시오. - 드라이 아이스에서 슬라이스를 15-30초로 들어 올려 짧고 불완전한 해동을 이루어 조밀한 흰색 점으로 관찰할 수 있는 줄무늬의 컴팩트한 마일린을 렌더링합니다.
참고: SEZ와 줄무늬 사이의 테두리를 찾는 것이 가능해진다(그림 1C - 2, myelin 제외 및 전체 마운트 방법과의 비교를 위한 도 2A 참조). 해동이 너무 오래 걸리면 장갑으로 덮인 손가락을 유리 슬라이드의 반대편에 눌러 공정을 가속화할 수 있습니다. 그러나 과도한 해동이 쉽게 발생하기 때문에 이 기동은 실행되어야 합니다. - SEZ를 인접한 줄무늬 에서 미리 냉각된 메스로 분리합니다(도 1C,D).
- SEZ를 전체 조각으로 옮기거나 냉각 된 메스의 무딘 가장자리를 사용하여 2-4 부분으로 미세 원심 분리기 튜브로 분리됩니다. 조직이 MS 이외의 다른 유형의 분석을 위해 사용되는 경우, 조직 시편을 대신 적절한 용기로 옮긴다(예를 들어, 96웰 플레이트).
참고 : 완전히 얼어 붙은 조직을 절단하면 조직이 빠르게 부서지고 슬라이드에서 떨어질 수 있습니다. 완전히 해동 된 조직을 절단하면 조직의 붕괴로 이어집니다. 조직이 완전히 얼거나 완전히 해동되지 않았는지 확인하십시오.
Representative Results
상기 단계를 따르는 경우, 마이크로센심분리기 튜브의 조직 샘플은 MS 샘플 준비와 호환될 준비가 되어 있다. 시료 준비 후, 마우스당 SEZ 또는 MEZ 샘플당 ~5-7 μg의 펩티드를 획득했습니다. 그러나, 펩티드의 최종 양은 MS 제제 방법에 의존할 수 있다. 아래의 프로테아메 비교에서, 단백질 식별 및 정량화 깊이(샘플당 500-1,000 단백질)는 각 조직 영역에 대해 생성된 펩티드 스펙트럼 라이브러리에 펩티드 스펙트럼을 계산적으로 매칭하여 증가하였다25,27. 특히, 펩타이드 스펙트럼 라이브러리의 생성을 위해 여기에 사용되는 손실리스 나노 분획 방법은 현재 시판되지 않고 있다. 원시 MS 데이터는 MaxQuant software28을 사용하여 분석하여 10억 범위당 부품의 질량 정확도를 달성했습니다29. Max Quant 환경에서는 MS 실행 간에 일치할 수 있습니다. 단백질 풍부는 라벨이 없는 정량화 알고리즘30을 사용하여 정량화되었다. 면역조직화학적 염색은 신선한 냉동 조직에 이루어졌으며 이전에 보고된 바와 같이 수행되었다25(재료의 표 참조).
냉동 섹션 해부
성인 마우스의 완전한 SEZ 및 MEZ(n = 4)는 CSD를 사용하여 수득하였다( 도 1 및 프로토콜 참조). somatosensory 피질 (Cx)는 외과 가위로 해부되었습니다. 추가 4 마우스는 동일한 방식으로 해부되었다; 그러나, 해부조직은 개별 샘플25에서 단백질 식별 및 정량화를 증가시키기 위해 프로테오메 라이브러리(10,923개의 확인된 단백질)를 만들기 위해 지역당 하나의 샘플로 풀을 하였다. 4개의 개별 샘플에서, (평균 ± SD) 6,673 ± 317.4 단백질은 SEZ에서 정량화되었고 MEZ에서는 6,747± 37.7. 모든 MS proteomics 데이터는 PRIDE31 파트너 저장소를 통해 ProteomeXchange 컨소시엄에 증착되었고, 여기에 보고된 프로테옴의 가입 번호는 ProteomeXchange: PXD016632 (http://proteomecentral.proteomexchange.org)입니다.
전체마운트 해부에 대한 비교
전체마운트 해부는 표준 프로토콜26에 따라 수행되었다. 전산 해부는 CSD25에 비해 유사한 수의 단백질(SEZ의 경우 약 6,000개, Cx의 경우 6,000개, 그룹당 n=4)을 나타났다. SEZ에 CSD를 사용하는 의도된 개선 사항 중 하나는 전체 탈제 해부 프로토콜 대신 잠재적인 줄무늬 오염의 감소입니다. 다른 지역에서 조직으로 오염된 SEZ 샘플에서는, 검출된 후보 단백질은 관심 영역과 오염기로부터 발생할 수 있기 때문에 유의한 농축이 지역에 할당될 수 없다. 면역히스토화학적으로, 골수린 관련 당단백질(MAG) 양성 골수린이 풍부한 내부 캡슐은 전체마운트 샘플에서 확인되었지만 CSD 샘플에서는 거의 확인되지 않았다(도 2A). 전체마운트 샘플의 줄무늬 오염은 SEZ에서 골수린 단백질의 농축을 확인하여 somatosensory 피질(Cx) 그레이 매터(GM) 샘플(도 2B)에 비해 확인될 수 있다. Cx GM의 큰 부분, 특히 상부 Cx 층은 미근한32개입니다.
큰 섬유 번들이 줄무늬를 통과함에 따라 이 부위에 의한 오염으로 인해 Cx에 비해 미엘린 단백질이 풍부해짐에 따라 이러한 결과가 발생했습니다. SEZ 샘플에서 현자 오염을 위한 마커로 사용되는 골린 단백질은 골린 기본 단백질(MBP), 골린 관련 당단백질(MAG), 프로테오리피드 단백질 1(Plp1), 및 2',3'-사이클-뉴클레오타이드 3'-인포다아제(Cnp)였다. 모든 myelin 마커 단백질은 Cx에 비해 SEZ에서 현저히 농축되었다. 반대로, CSD 데이터 셋에 있는 4개의 myelin 마커 단백질에 대한 비교는 Cx에 SEZ를 비교할 때 유의한 차이를 산출하지 않았습니다 (도 2B). striatum33의 프로테아텀 데이터는 전체 마운트 해부의 SEZ 샘플에서 myelin 단백질의 농축이 줄무늬 조직으로 오염에 의해 유발되었다는 가설을 뒷받침한다. 따라서 CSD는 전체 탈산 해부에 비해 줄무늬 조직 (콤팩트 마일린이 풍부)에 의한 오염을 크게 방지했습니다.
비 해리 조직의 편견 없는 프로테아메 분석은 흥미로운 세포 외 단백질을 드러낼 수 있습니다. CSD를 사용하여 향상된 해부로, 세포외 관련 단백질은 전체마운트 샘플(도 2C, 음장 농축 시험)에 비해 샘플에서 현저히 농축되었다. CSD 및 전산 해부는 유전자 상학(GO) 용어 "세포외 성 성 외종" 및 "세포외 지역 부분"의 유사한 농축을 표시합니다. 그러나 GO 용어 "Matrisome-related"는 전체 마운트 해부보다 CSD에서 약간 더 풍부합니다. 이에 따라, ECM 교차 결합 효소와 최근 발견된 신경발생 조절기 트랜스글루타미나제-2(Tgm2)는 CSD25를 이용하여 Cx에 비해 SEZ에서 농축된 것으로 나타났다. 대조적으로, 전체마운트 해부에 의해 얻어진 SEZ와 Cx 샘플 사이에는 차이가 발견되지 않았다(도 2D). striatum3의 프로테아텀 데이터는 전체 마운트 해부에 의한 신경 발생 조절제 Tgm2의 검출이 줄무늬 조직으로 오염에 의해 방해되었다는 가설을 뒷받침한다. 따라서, 전반적으로, 저온 절제는 틈새 특정 proteome 분석을 위한 표준 해부에 성공하지만 또한 필요 한 개선.
레이저 캡처 현미경 검사법과 비교
SEZ와 MEZ의 전면 절반은 LCM(도 3A)을 위해 수득하였다. 전반적으로, LCM 방법은 조직 동요 및 효율성에 관한 몇 가지 단점을 나타낸다. 해부 현미경하에서 관심 영역을 시각화하려면 배경 얼룩이 필요하며, 잠재적으로 작은 또는 수용성 단백질(예: 성장 인자, 사이토카인 또는 효소와 같은 ECM 조절제)을 씻어내도록 합니다. 또한, 슬라이드는 레이저 제거 하는 동안 실온에서 다양 한 시간을 보낸다. 더욱이, 레이저 자체는 관심의 단백질을 변성 할 수 있습니다.
CSD는 해부를 수행하는 데 필요한 시간과 노력에 대해 LCM에 비해 상당한 이점을 가지고 있습니다: 프로토콜의 1단계는 CSD와 LCM 모두에 대해 유사하게 수행해야 합니다. 이 단계가 없으면 심실 벽이 부착되어 있어 MEZ 및 SEZ 샘플의 분리가 어려워지게 됩니다. CSD 단면(100 μm)이 LCM 섹션(15 μm)의 최대 두께34 보다 6-7배 더 두껍다는 점을 감안할 때, 2단계(뇌의 단면) 및 3단계(각 관상 부에서 MEZ 및 SEZ 를 제거)는 LCM에 대해 적어도 6-7배 더 오래 소요된다. 필요한 배경 염색 및 레이저 현미경을 설정하면 추가 시간이 소모됩니다. 여기서, CSD에 의해 4마리동물의 SEZ와 MEZ의 100%에 비해 LCM에 의한 3마리의 SEZ와 MEZ의 50%를 수확하는 데 3배 더 걸렸으며, CSD의 8배 속도 우위를 구성하였다. 요약하자면, LCM은 주목할 만한 양의 추가 노력이 필요할 뿐만 아니라, 조직도 후속 분석에 의해 생성된 데이터의 역학및 신뢰성을 손상시킬 수 있는 실질적으로 더 긴 조작 및 온도 변화를 겪게 된다.
CSD의 MS 결과는 레이저 포획 마이크로절(LCM)의 결과와 비교하였다. 두 데이터 집합모두 CSD 샘플을 풀링하여 생성된 프로테오믹 라이브러리와 일치했습니다. 평균적으로 LCM은 SEZ 및 내측 심실 존에서 각각 270.0 및 3,613± 238.7개의 개별 단백질을 ± 3,441을 산출했습니다(그림 3B). 단백질 식별의 현저한 차이를 감안할 때, 주요 성분 분석(PCA)은 해부 방법에 따라 뚜렷한 분리를 보였다(성분 1: 62.7%, 도시되지 않음). 구성 요소 2는 LCM 샘플(8.5%, 도 3C) 중 SEZ 및 MEZ에 대한 가장 큰 분리를 나타냈다. 구성 요소 3또한 LCM 및 CSD를 분리하는 것으로 보인다; 그러나, 이 다름은 확인된 단백질의 수보다는 방법 기지를 둔 다름에서 유래할 수 있습니다 (6.4%). 그럼에도 불구하고, 전체 지역 분리는 극저온 해부 데이터에 대해 현저하게 뚜렷하게 남아 있으며 LCM보다 훨씬 우수했습니다. 데이터 역학의 이러한 불일치는 레이저 해부 동안 실온에서 표본에 의해 소비된 다른 시간 또는 후속 프로테오믹스 프로토콜 및 질량 분광법 측정에서 가변성에 달하는 작은 조직의 더 높은 감수성에서 발생할 수 있다.
ECM의 프로테옴 프로파일의 차이를 검색하기 위해, CSD와 LCM 간의 2D 기여 도화 농축 시험이 SEZ와 MEZ(도 3D)에 대해 수행되었다. LCM과 CSD 샘플 간의 GO 용어의 상대적 농축을 계산하면 조직의 불평등한 양과 해부 프로토콜의 차이에도 불구하고 두 가지 방법 간에 ECM 단백질 클러스터의 상대적 프로테옴 역학을 비교할 수 있습니다. 플롯은 LCM과 CSD 간의 좋은 상관 관계를 보여줍니다. 주석 "세포 외 영역 부분" 및 "세포외 막 바인딩 된 세포"는 유사하게 방법과 영역 모두에서 풍부합니다. 따라서, LCM의 증가된 시간 수요는 ECM 관련 단백질에 대한 상대적으로 더 높은 감도에 의해 보상되는 것으로 나타나지 않습니다. 대신, CSD는 신경 발생 및 SEZ 관련 ECM 단백질 Tgm2, Thrombospondin-4 (Thbs4), S100a6 및 Tenacin-C(Tnc)에 대한 샘플 데이터를 비교할 때 보다 강력한 식별/정량화를 제공합니다(그림 3E). TnC의 경우 모든 샘플에서 정량화되었지만 MEZ에 비해 CSD만 SEZ에 대한 농축을 표시했습니다. 그럼에도 불구하고, SEZ-관련 기저막 단백질 니도겐-1(Nid1), 라미닌 서브유닛 베타-2(Lamb2), 및 지하 막 특이적 헤파란 황산염 프로테오글리칸 코어 단백질(Hspg2)35는 CSD 샘플보다 LCM 샘플에서 더욱 강력한 농축을 나타냈다. 따라서 CSD는 손상된 조직 무결성 또는 단백질 손실에 대해 걱정하지 않고 합리적인 기간에 SEZ 특성화에 대한 정확하고 깊은 정량적 프로테옴을 제공하는 조직 샘플을 제공할 수 있습니다.
통계
통계 테스트, 2D 음장 농축 테스트 및 PCA는 Perseus 환경에서 수행되었습니다. 단백질은 적어도 하나의 샘플에서 각 방법에 대해 유효한 값이 검출되었는지 분석에 포함시켰다. 단백질 풍부와 수 비교는 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 시각화되었습니다( 재료표 참조). 거짓 발견율(FDR)의 순열계 제어(FDR)는 단백질 비교를 위해 0.05, 250임의로 설정되었다. 2D-기여 농축 시험36의 경우, 표시된 GO 용어가 현저히 풍부합니다(FDR은 Benjamini-Hochberg FDR 제어 방법을 사용하여 0.02로 설정되었습니다).
그림 1: Cryo-Section-해부 방법. (A) 관심 영역의 개요: 신경 유발 SEZ 및 비 신경성 MEZ를 가진 측면 심실. Dcx. (B) 영양부, 전방 기둥, 피질 및 코퍼스 캘로섬을 심실 과 choroid 발비 위의 단계별 제거로 면역 염색한 신경 폭발은 1. 해부 배지에 배치, OB2. 제거, 피질의 전방 기둥 제거, 4. 처리탈 의 상부 제거, 상부 심실 제거, 상부 심실 제거. 6. 심실 벽의 확산. (C) 신선한 냉동 마우스 뇌의 100 μm 관상 슬라이스, (1.) 전후 (2.) 얼음 차가운 메스와 심실 벽을 제거 한 후. 스케일 바 = 측면 심실의 관상 동맥 부분의 4mm (D) 염색 (GFAP : 녹색; DAPI: 파란색), CSD로 해부된 SEZ및 MEZ를 보여 주었다. 스케일 바 = 300 μm(A), 200 μm(D). 약어: CSD = 저온 절 해부; SEZ = 피하 영역; MEZ = 내측 연화 영역; Dcx = 더블코르틴; OB = 후각 전구; GFAP = 신경교 세동 산 성 단백질; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 전산 해부에 비해 극저온 절부-해부를 가진 우수한 해부 정밀도. (A) 전산 해부(왼쪽)에 의해 얻어진 SEZ 샘플의 면역히토케미컬 이미지(왼쪽). 골린이 풍부한 줄무늬 조직의 포함은 MAG (녹색)에 대해 염색하여 시각화됩니다. CSD(오른쪽)로 해부된 SEZ의 염색. CSD에서, 거의 모든 줄무늬 골수린 (MAG에 대한 염색, 녹색)은 샘플 리본에서 제외된다. 핵은 DAPI(파란색)를 사용하여 시각화하였다. (B) SEZ 대 Cx에서 골린 마커 농축의 비교 (MBP : p = 0.0074; MAG: p = 0.0016; Plp1: p = 0.0011; CNP: p = 0.0029) 및 CSD(MBP: p = 0.0667; MAG: p = 0.0236; Plp1: p = 0.3420; CNP: p = 0.1842). (C) CSD-SEZ 샘플과 전체 마운트-SEZ를 비교하는 2D-음장 농축 테스트. GO 용어 세포 외 공간 및 Matrisome 관련 은 전체 마운트 데이터보다 CSD 데이터에서 더 풍부합니다. (D) NSC 레귤레이터 Tgm225의 단백질 풍부는 전체 탈제 해부 및 CSD를 위해 플롯. Tgm2는 CSD의 Cx에 비해 SEZ에서 현저히 농축된다(CSD: p = 0.0029; 전체 마운트 : p = 0.1775). B 및 D의 경우: 참고로, Sharma 외.33의 프로테옴 데이터는 전체마운트 및 CSD 샘플에 표시된 해당 단백질에 대해 플롯된 striatum 및 피질의 측정을 제공합니다. 스케일 바 = 200 μm(A). 약어: CSD = 저온 절 해부; SEZ = 피하 영역; MAG = 골수린 관련 당단백질; Cx = 색소 감각 피질; MBP = 골수린 기본 단백질; Plp1 = 프로테오라이트-단백질 1; CNP = 2',3'-순환-뉴클레오티드 3'-인포디세아제; GO = 유전자 종양학; NSC = 신경 줄기 세포; Tgm2 = 트랜글루타미나아제 2; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌; LFQ = 라벨이 없는 수량. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: LCM에 비해 극저온 단부-해부로 세포외 단백질 정량화가 개선 되었습니다. (A) SEZ 와 MEZ의 레이저 포획 전후측면 심실의 크레실 바이올렛 염색(왼쪽). 비교를 위해, SEZ와 MEZ의 CSD 절개 (오른쪽). 스케일 바 = 150 μm. (B) CSD 및 LCM에서 SEZ 및 MEZ 샘플에서 검출된 단백질의 수를 비교한다. 데이터는 CSD 및 LCM(구성 요소 2: 8.5% 분산; 구성 요소 3: 6.4%)을 비교하는 SEZ 및 MEZ 샘플의 평균 ± SD. (C) 주요 성분 분석으로 제시됩니다. (D) 저온 섹션 및 레이저 해부 MEZ (상단) 및 SEZ (하단)의 2D 음장 농축. GO 용어 세포 세포 세포 및 세포 외 영역 부분은 크게 농축된다 (빨간 점). (E) LCM에 대한 SEZ 및 MEZ에서 세포외 SEZ 관련 마커 단백질의 풍부 (Tnc : p = 0.3789) 및 CSD 샘플 (Tgm2 : p = 0.2940; S100a6: p = 0.0218; THBS4: p = 0.3941; Tnc: p = 0.0004). 약어: CSD = 저온 절 해부; LCM = 레이저 포획-미세 절; SEZ = 피하 영역; MEZ = 내측 연화 영역; GO = 유전자 종양학; Tnc = 테나신-C; Tgm2 = 트랜스글루타미나아제 2; S100a6 = S100 칼슘 결합 단백질 A6; THBS4 = 혈전증-4; LFQ = 라벨이 없는 수량. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
CSD 방법은 SEZ 조직을 정밀하게 추출하고 MS를 사용하여 상당한 깊이로 신뢰할 수 있는 프로테옴을 생성할 수 있게 하였고, SEZ 샘플의 현저 오염 및 세포외 단백질 농축의 현저 오염을 크게 감소시켰습니다. CSD 및 전체 마운트 해부를 사용하여 개별 샘플(샘플당 6,500단백질)에서 유사한 수의 단백질을 검출할 수 있기 때문에 CSD의 추가 시간은 노력할 만한 가치가 있습니다. LCM은 보다 정확한 SEZ 해부를 제공하지만 CSD와 동일한 MS 프로토콜(라이브러리 매칭 및 라벨 없는 정량화)을 사용했음에도 불구하고 샘플당 3,500개의 단백질만으로 더 낮은 프로테오메 깊이에 도달했습니다. 중요한 것은, 가변성은 샘플 당 8배 더 긴 준비 시간으로 인해 훨씬 더 컸을 것입니다. LCM 및 CSD에 의해 얻어진 샘플의 PCA는 서로 강력하게 분리된 단단한 지역 별 클러스터를 가진 두 방법의 명확한 분리를 제시합니다. 대조적으로 LCM 샘플은 더 흩어져 분포를 보였으며, 이는 아마도 준비 기간 때문일 것입니다. 더 긴 기간 동안 훨씬 더 많은 샘플을 수집하는 것이 LCM과 동등한 견고성과 깊이의 proteome을 산출했을지 여부는 불분명합니다. 추정을 계산하고, CSD에 대해 수행된 유사한 샘플 부피를 수집하는 데는 LCM으로 5-8배 더 오래 걸리며, 펩타이드 스펙트럼 라이브러리에 제공된 샘플이 포함된 경우에도 최대 15배 이상 걸리며, 해동 된 조건 하에서 그 중 상당 부분은 해동된 조건하에서 그 중 상당부분을 차지한다. 더욱이, LCM (배경 염색, 레이저 해부)에 필요한 조직의 추가 혼란을 고려, LCM은 거의 제공, 있는 경우, CSD를 통해 이득. 따라서, CSD는 세포외 프로테오메 연구에 더 적합한 것으로 간주될 수 있다, 특히 SEZ에 대 한.
특히 관심 영역이 SEZ(예: 연피 세포 층만 조사)보다 작으면 자유손 접근법이 LCM의 정확도에 뒤쳐집니다. 예를 들어, CSD를 사용하여 경피층으로부터 연경을 분리하는 것은 연동층이 세포 직경이 넓고, 피연층을 향한 경계가 신선한 냉동 조직에서 육안으로 는 보이지 않기 때문에 어렵다. 따라서, LCM은 50 μm 이하의 척도에 정밀한 해부가 방해받지 않는 조직 또는 해부 시간을 짧게 유지하는 것보다 더 중요한 경우에 CSD 보다는 더 나은 선택이 될 것입니다. 그러나 폭이 50μm 이상인 영역의 경우 CSD의 정밀도는 ECM 단백질 분석을 위한 LCM의 정밀도와 유사합니다.
CSD는 이미 신경성 틈새 에서 ECM의 기능적 역할에 대한 조사에 기여함으로써 유용할 것으로 입증되었다. 따라서, 다양한 단백질 및 프로테옴 조사(또는 단하나 핵 RNA 시퀀싱)를 위해 SEZ에서 CSD를 지속적으로 적용하면 추가 신경 발생 조절제, 줄기 세포 활성화 마커 및 SEZ 줄기 세포 틈새 생리학에 대한 심층적인 이해가 발생할 수 있다. 노화SEZ37의 신경발생의 감소를 고려할 때, 노인과 젊은 쥐의 SEZ의 ECM 변화에 대한 간결한 분석은 NSC 개발 및 유지 보수를 육성하는 정확한 틈새 메커니즘에 대한 이해를 촉진할 수 있다38,39. 더욱이, SEZ 신경 발생에 염증과 부상의 영향은 잘 설립40,41,42,43. 피질 뇌 손상 후 SEZ에서 혈액 유래 피브리노겐의 농축과 SEZ 천체 발생 및 흉터 형성에 미치는 영향44 SEZ 줄기 세포 생리학에 외상 유발 미세 환경 변화의 잠재적 영향을 강조. 따라서 CSD를 사용하여 뇌 손상과 관련하여 SEZ-ECM proteome을 조사하는 것은 부상과 염증이 신경 발생에 영향을 미치는 메커니즘을 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 중요한 것은, 그 방법은 또한 신선한 냉동 조직이 수시로 수술에서 얻을 수 있기 때문에 건강과 질병에 있는 인간 두뇌 신경생성 틈새소에 적용될 수 있었습니다. 더욱이, 성인 신경 발생에 있는 종 다름을 감안할 때, 그것은 또한 다른 종에 CSD 방법을 적용하는 것이 매혹적일 것입니다, 예를 들면, striatal 신경 발생에 협회에서. 더욱이, 다른 단백질 검출 방법을 통해, SEZ 및 MEZ(예를 들어, ELISA)를 위해 CSD를 사용하여 현지에서 생산된 성장 인자의 차이를 정확하고 효율적으로 조사할 수 있다.
마지막으로, 해부 절차는 잠재적으로 다른 뇌 영역의 정확한 추출을 위해 수정 될 수있다, 또한 신경 발생과 관련이없는 연구 질문에 대한. 예를 들어, CSD는 짧은 반 해동 단계를 포함, 그 동안 소형 myelin 더 반투명 잔류 뇌 조직에서 구별 흰색 영역으로 볼 수 있습니다. 방법의 간단한 수정으로,이 기능은 부상 관련 변화의 proteomic 분석을 실시 할 수있는 만 코퍼스 캘로섬 컴팩트 myelin 조직의 정확한 해부를 허용 할 것이다. 코퍼스 냉담해부를 허용하는 프로토콜 수정의 제안은 프로토콜의 1.5-1.9 단계를 생략하고 SEZ및 MEZ에 접근할 수 있도록 심실을 여는 대신 관상 섹션을 준비하는 것입니다. 그런 다음, 마른 얼음에 섹션을 놓고, 슬라이스를 잠시 들어 올리고 반 해동하고, 메스로 코퍼스 캘로섬을 제거하십시오. 이 준비는 이제 네이티브 코퍼스 캘로섬 조직의 효율적인 해부를 요구하는 모든 분석을 위해 준비되어야합니다.
요약하자면, 이 연구는 신뢰할 수 있는 심실 신경질 신경질 프로테오메 분석에 사용될 수 있는 마이크로 해부 방법을 제시합니다. 이 데이터는 SEZ 마이크로 환경의 MS 기반 프로테오믹 분석과 함께 CSD 방법의 호환성과 유용성을 강조합니다. 정밀도, 효율성 및 최소한의 조직 교란의 조합은 CSD를 기존 방법의 귀중한 확장으로 만듭니다.
Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다
Acknowledgments
우리는 진심으로 우리가 자신의 실험실에서 실험의 큰 부분을 수행 할 수 있도록 마티아스 만, LCM 및 proteome 분석에 대한 도움을 파비안 코스시아, 전체 마운트 해부를위한 타티아나 사이먼 - 에버트, 그리고 코르비니안 메이어와 이고르 파론의 기술적 인 도움을 받고 싶습니다. 우리는 감사MG (SFB870, TFR274), 유럽 연합 (에라넷 S-700982-5008-001), ERC (AERC "NeuroCentro"에서 MG에), 스웨덴 의학 연구 협회 (SSMF, JK) 후 의사 보조금, 그리고 KI 재단 (JK 재단에 201,JK 기금)에 자금을 감사하게 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat CM3050S | Leica | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip | Fine Science Tools | cat. no. 11252-00 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 | Invitrogen | cat. no. 24020 | |
| HEPES buffer solution (1 M) | Invitrogen | cat. no. 15630 | |
| Microscope slides | RS France | cat. no. BPB018 | |
| Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL | Eppendorf | cat. no. 0030123344 | |
| Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm | Fine Science Tools | cat. no. 15003-08 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | cat. no. 5518083 | |
| Tissue culture dishes 60 mm | Greiner Bio-One | cat. no. 633180 | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) | ThermoFisher Scientific | cat. no. A-11001 | |
| DAPI | Sigma | cat. no. D9542 | |
| guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 | Millipore | cat. no. AB2253, | |
| mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 | Sigma | cat. no. G3893 | |
| mouse monoclonal anti-MAG 1:400 | Millipore | cat. no. MAB1567 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism version 9 | GraphPad Software, San Diego California USA | www.graphpad.com | |
| Perseus Version 1.6.10.50 | Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ZEN imaging software | Carl Zeiss |
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