Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Криосекционное рассечение субэпендимальной зоны взрослого человека для точного и глубокого количественного анализа протеома

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/63047
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4
1Division of Physiological Genomics, Biomedical Center, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, 3SYNERGY, Excellence Cluster Systems Neurology, University of Munich, 4Department of Clinical Neuroscience, Karolinska Institutet

Summary

Крио-секция-рассечение-рассечение позволяет свежей, замороженной подготовке самой большой нейрогенной ниши в мышином мозге для глубокого количественного анализа протеома. Метод является точным, эффективным и вызывает минимальное возмущение тканей. Поэтому он идеально подходит для изучения молекулярного микроокружения этой ниши, а также других органов, регионов и видов.

Abstract

Субэпендимальная нейрогенная ниша состоит из паравентрикулярной ленты боковой желудочковой стенки бокового желудочка. Субэпендимальная зона (ОЭЗ) представляет собой тонкую и отчетливую область, подверженную воздействию желудочков и спинномозговой жидкости. Выделение этой ниши позволяет провести анализ микроокружения нейрогенных стволовых клеток. Однако извлечение мелких тканей для анализа протеома является сложной задачей, особенно для поддержания значительной глубины измерения и достижения надежной прочности. Для решения этих проблем был разработан новый метод, называемый криосекцией-диссекцией (CSD), сочетающий высокую точность с минимальным возмущением тканей. Метод совместим с современными методами масс-спектрометрии (МС), которые позволяют обнаруживать низкообильные нишевые регуляторы. В этом исследовании сравнивали CSD и его протеомные данные с методом и данными, полученными с помощью лазерного захвата-микродиссекции (LCM) и стандартной рассечения цельного расстояния. Метод CSD привел к удвоенной глубине количественной оценки менее чем за половину времени приготовления по сравнению с LCM и одновременно явно превзошел точность рассечения всего рассечения. Следовательно, CSD является превосходным методом сбора ОЭЗ для анализа протеома.

Introduction

Поскольку нейрогенез ограничен во взрослом мозге, различные стратегии восстановления центральной нервной системы значительно выиграют от более глубокого понимания основ замены нейронов у взрослых. Грызуны помогли нам понять основные механизмы постнатального нейрогенеза, хотя следует отметить, что взрослый нейрогенез сильно зависит от вида. У мышей есть три ниши взрослых нервных стволовых клеток (NSC). Гипоталамус представляет собой взрослую нишу НСК с нейрогенным потенциалом1,2, в то время как непрерывный взрослый нейрогенез в основном ограничен гиппокампом3 и ОЭЗ боковых стенок боковых желудочков4,5,6. ОЭЗ является крупнейшей зародышевой областью, содержащей НСК (клетки типа В), которые развиваются в нейробласты (клетки типа А) через транзитно-амплифицирующие клетки-предшественники (клетки типа С). ОЭЗ содержит 20-35% клеток типа В, 1-15% клеток типа С, 1-30% клеток типа А и 25-50% эпендимальных клеток7. ОЭЗ имеет сложную микроархитектуру с эндотелиальными клетками, микроглиальными клетками и эпендимальными клетками, находящимися в нише стволовых клеток и влияющими на нее8,9,10. Хотя нейронов в ОЭЗ мало, аксоны, исходящие из отдаленных источников, таких как полосатое тело, вентральная тегментальная область или гипоталамус, достигают и влияют на клетки типа B4. Уникальной особенностью этой ниши стволовых клеток является разделение между участком пролиферации и участком дифференцировки. После пролиферации предшественники нейронов мигрируют на несколько миллиметров из ОЭЗ в обонятельную луковицу, где они терминально дифференцируются в нейроны и интегрируются в уже существующие нейронные цепи. Исследования клеточных программ, связанных с нейрогенезом, уже предоставили знания, важные для экспериментальных терапевтических стратегий перепрограммирования и трансплантации клеток15,16,17,18,19,20. Однако клеточно-внешние сигналы также регулируют нейрогенез, и тканевая среда может определять нейрогенную судьбу стволовых клеток11,12,14,21,22,23. Следовательно, исследование микросреды нейрогенных ниш и ее взаимодействия со стволовыми клетками имеет решающее значение.

Внеклеточный матрикс (ECM) и другие секретируемые белки составляют большую часть микросреды. Для точной идентификации и количественной оценки лучше подходит протеомный подход, чем транскриптомный подход, для определения состава ECM из-за низкой корреляции между транскриптомомом и уровнями белка для ECM24,25. Более того, есть существенные доказательства того, что нишевые регуляторы в ОЭЗ не производятся исключительно клетками, заполняющими саму нишу. Более отдаленные места, такие как сосудистое сплетение, секретируют модулирующие сигналы, передаваемые стволовым клеткам через спинномозговую жидкость22,23. Исследование нишевого протеома может помочь идентифицировать нишевые регуляторы, присутствующие в нише независимо от их производственной площадки, учитывая, что значительная часть внеклеточной микросреды собирается белками.

Для сбора мышиной желудочковой зоны для объективного протеомного анализа требуется метод с высокой точностью, захват тонкий паравентрикулярной ленты толщиной около 50 мкм, содержащей стволовые клетки, при исключении ткани соседнего полосатого тела. Кроме того, возмущение тканей во время рассечения должно быть сведено к минимуму для анализа внеклеточной микросреды, поскольку растворимые белки, включая факторы роста или цитокины, могут быть легко смыты. Хотя можно анализировать масс-спектры неподвижной ткани, требуемый агент, такой как параформальдегид, уменьшит глубину идентификации белка и может ввести посттрансляционные модификации. Обычное рассечение цельной СЭЗ, например, для сбора клеток для анализа сортировки клеток, активированных флуоресценцией, удаляет всю ОЭЗ ножницами26. Это стандартное рассечение является быстрым с минимальным возмущением тканей. Однако стриатального загрязнения образцов не избежать. И наоборот, LCM имеет выдающееся преимущество в превосходной точности рассечения. Тем не менее, LCM может вводить возмущения тканей, например, из-за фонового окрашивания или лазерной денатурации белка. Чтобы объединить сильные стороны рассечения цельного монтажа и LCM, был разработан новый метод, совместимый с РС, называемый крио-секционным рассечением (CSD), (рисунок 1A-D). CSD позволяет экстракцию ОЭЗ и рассечение ОЭЗ медиальных стенок боковых желудочков (MEZ), что является идеальной, в основном ненейрогенной областью контроля для ОЭЗ (см. протокол). Нишевый протеом, полученный комбинацией CSD и современных методов MS, оказался полезным для характеристики и идентификации новых регуляторов в этой взрослой нише NSC25. Следовательно, этот метод будет полезен для определения белкового состава тканей ОЭЗ.

Protocol

Все экспериментальные процедуры в этом исследовании были выполнены в соответствии с руководящими принципами Германии и Европейского Союза и были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и правительством Верхней Баварии (Regierung von Oberbayern). Для экспериментов использовались только самцы мышей C57Bl6 в возрасте от 8 до 10 недель.

1. Подготовка мозга мыши (~ 15 мин на мышь)

  1. Подготовьте среду для рассечения, добавив 5 мл 1 M HEPES (конечная концентрация 10 мМ) к 500 мл 1x сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Срок хранения рассеченной среды (+4 °C) не должен превышать 2 недель.
  2. Приносят в жертву мышам вывих шейки матки и тщательно рассекают мозг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При исследовании ECM ткань предпочтительно должна быть немодифицированной. Вывих шейки матки сохраняет время рассечения как можно короче, тем самым максимально предотвращая постсмертное ферментативное аутопереварение. Если удаление крови имеет решающее значение для исследовательского вопроса, просто перфицитируйте мышь транскардиально с фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) перед удалением мозга.
  3. Извлеките мозг методом ручного рассечения и поместите его в культуральную посуду, содержащую ледяную среду для рассечения (рисунок 1B - 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите мозг в среде рассечения на льду на протяжении всего рассечения.
  4. Удалите обонятельную луковицу (OB) скальпелем (рисунок 1B - 2) прямым корональным срезом между OB и передним полюсом коры.
  5. Удалите передний полюс коры скальпелем с помощью коронального разреза, чтобы сделать боковые желудочки видимыми в корональной плоскости (рисунок 1B - 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что корональный разрез сделан ~ 5 мм рострально из оптического хиазма; в противном случае ростральная часть ОЭЗ/МЭЗ будет утрачена.
  6. С помощью ножниц откройте оба боковых желудочка сверху, начиная с сагиттального сечения от кортикальной поверхности до просвета желудочков, и удлините этот разрез с помощью С-образного сгибания после сгибания желудочка (рисунок 1B - 4).
  7. Соедините каудальные концы левого и правого сагиттального разреза с помощью дополнительного коронального разреза ножницами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Три разреза теперь образуют трапецию и облегчат удаление коры и мозолистого тела на следующем этапе.
  8. Удалите кору и мозолистое тело, покрывающие боковые желудочки, с помощью щипцов (Рисунок 1В - 5). Затем удалите кору и мозолистое тело, которые покрывают медиальные стенки желудочков. Здесь делают дополнительные разрезы, если ткань прикреплена к медиальным желудочковым стенкам, или просто поднимают кору и мозолистое тело ножницами, чтобы выбить ткань.
  9. Аккуратно разложите стенки желудочков щипцами (рисунок 1В - 6). Удалить сосудистое сплетение щипцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полное удаление сосудистого сплетения важно, чтобы избежать вмешательства в следующие этапы рассечения и избежать потенциального загрязнения образцов SEZ/MEZ.
  10. Положите мозг на стеклянную горку и поместите стеклянную горку поверх сухого льда, чтобы заморозить мозг. Поддерживайте стенки желудочков в открытой конфигурации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте достаточное расстояние между боковой и медиальной стенками желудочка, чтобы облегчить точное и эксклюзивное рассечение ОЭЗ и MEZ. Если ткань сжимается обратно в закрытую конфигурацию, используйте щипцы, чтобы зафиксировать стенки в нужном положении во время замораживания. Избегайте любого ущерба для ОЭЗ/МЭЗ. Старайтесь прикладывать минимальное усилие, в основном к верхнему краю открытых желудочков.

2. Секционирование подготовленного мозга (~ 15 мин на мышь)

  1. Вырежьте корональные участки мозга толщиной 50-100 мкм до конца бокового желудочка с помощью криостата и установите участки на стеклянные слайды. Убедитесь, что мозг прикреплен к пластине крепления криостата в заднем мозге со средой OCT и что ОКТ не вступает в контакт с передним мозгом, особенно в желудочках.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среда OCT будет мешать измерениям MS. Однако, если ткань будет использоваться для анализа антител, нет необходимости исключать среду OCT. Использование стеклянных горок с покрытием не рекомендуется. Слайды с покрытием оказывают слишком большую адгезивную силу на ткань, тем самым препятствуя транслокации образца ткани со слайдов в трубку микроцентрифуги на следующих этапах.

3. Свободное рассечение срезов мозга (~ 30 мин на мышь)

  1. Поместите стеклянные слайды с участками мозга на сухой лед под рассеченным микроскопом (рисунок 1С - 1).
  2. Подготовьте микроцентрифужные трубки на сухом льду и убедитесь, что трубки остаются на сухом льду не менее 1 минуты, чтобы быть достаточно холодными перед переносом образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте микроцентрифужные трубки высокого качества, так как некоторые низкокачественные трубки могут выделять пластик на последующих этапах переваривания тканей, связанных с измерениями РС.
  3. Поднимите ломтики из сухого льда на 15-30 с, чтобы добиться кратковременного, неполного оттаивания, чтобы сделать компактный миелин полосатого тела видимым в виде плотных белых точек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определение границы между ОЭЗ и полосатым телом становится возможным (Рисунок 1С - 2, см. Рисунок 2А для исключения миелина и сравнения с методом wholemount). Если оттаивание занимает слишком много времени, процесс можно ускорить, надавливая пальцем, покрытым перчатками, на противоположную сторону стеклянного слайда. Однако этот маневр следует практиковать, так как чрезмерное оттаивание происходит легко.
  4. Отделите ОЭЗ предварительно охлажденным скальпелем от соседнего полосатого тела (рисунок 1С,D).
  5. Перенесите ОЭЗ либо целым куском, либо разрезанным на 2-4 части в микроцентрифужную трубку с помощью тупого края охлажденного скальпеля. Если ткань должна быть использована для другого типа анализа, отличного от РС, перенесите образец ткани в соответствующий контейнер (например, 96-луночную пластину).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разрезание полностью замороженной ткани может привести к тому, что ткань быстро отколется и упадет с горки. Разрезание полностью размороженной ткани приводит к распаду ткани. Убедитесь, что ткань не заморожена полностью и не полностью разморожена.

Representative Results

При выполнении вышеуказанных этапов образцы тканей в пробирках микроцентрифуги готовы и совместимы с пробоподготовкой MS. После пробоподготовки мы получили ~5-7 мкг пептидов на образец СЭЗ или МЭЗ на мышь. Однако конечные количества пептидов могут зависеть от способа получения РС. В приведенных ниже сравнениях протеомов глубина идентификации и количественной оценки белков (500-1000 белков на образец) была увеличена путем вычислительного сопоставления спектров пептидов с библиотеками спектров пептидов, созданными для каждой области ткани25,27. Примечательно, что метод нанофракционирования без потерь, используемый здесь для создания библиотек пептидных спектров, в настоящее время коммерчески недоступен. Необработанные данные MS были проанализированы с использованием программного обеспечения MaxQuant28, достигнув точности массы в диапазоне частей на миллиард29. Среда Max Quant позволяет сопоставлять между запусками MS. Содержание белка было количественно определено с использованием алгоритма количественной оценки без меток30. Иммуногистохимическое окрашивание проводили на свежезамороженных тканях и выполняли, как сообщалось ранее25 (см. Таблицу материалов).

Крио-секция-рассечение
Полная ОЭЗ и MEZ взрослых мышей (n = 4) были получены с использованием CSD (см. Рисунок 1 и протокол). Соматосенсорная кора (Cx) была рассечена хирургическими ножницами. Еще 4 мыши были рассечены таким же образом; однако рассеченная ткань была объединена в один образец на область для создания библиотеки протеомов (10 923 идентифицированных белка) для повышения идентификации и количественной оценки белка в отдельных образцах25. В четырех отдельных образцах (среднее ± SD) 6 673 ± 317,4 белка были количественно определены в ОЭЗ и 6 747 ± 37,7 в MEZ. Все данные ms proteomics были депонированы в консорциуме ProteomeXchange через партнерский репозиторий PRIDE31 , а номер присоединения для протеомов, о котором сообщается здесь, - ProteomeXchange: PXD016632 (http://proteomecentral.proteomexchange.org).

Сравнение с цельным рассечением
Рассечение Wholemount проводилось по стандартному протоколу26. Рассечение Wholemount выявило аналогичное количество белков (примерно 6000 для ОЭЗ и 6000 для Cx, n = 4 на группу) по сравнению с CSD25. Одним из предполагаемых улучшений использования CSD для ОЭЗ вместо протокола рассечения целых гор является снижение потенциального стриатального загрязнения. В образцах ОЭЗ, загрязненных тканью из другого региона, обнаруженные белки-кандидаты не могут быть выделены в область, поскольку значительное обогащение может быть получено из интересующей области и загрязняющего вещества. Иммуногистохимически, миелин-ассоциированные гликопротеины (MAG) положительные миелино-богатые внутренние капсулы полосатого тела были идентифицированы в образцах цельного маунта, но редко в образцах CSD (рисунок 2A). Стриатальное загрязнение в образцах wholemount может быть подтверждено путем идентификации обогащения белков миелина в ОЭЗ по сравнению с образцами серого вещества (GM) соматосенсорной коры (Cx) (GM) (рисунок 2B). Обратите внимание, что большие части Cx GM, особенно верхние слои Cx, являются немиелинизированными32.

Когда большие пучки волокон проходят через полосатое тело, загрязнение этой областью привело к обогащению миелиновых белков по сравнению с Cx. Миелиновые белки, используемые в качестве маркеров стриатального загрязнения в образцах ОЭЗ, включали основной белок миелина (MBP), миелин-ассоциированный гликопротеин (MAG), протеолипид-белок 1 (Plp1) и 2',3'-циклический-нуклеотид 3'-фосфодиэстераза (Cnp). Все миелин-маркерные белки были значительно обогащены в ОЭЗ по сравнению с Cx. И наоборот, сравнения четырех белков-маркеров миелина в наборе данных CSD не дали существенных различий при сравнении ОЭЗ с Cx (рисунок 2B). Протеомные данные полосатого тела33 подтверждают гипотезу о том, что обогащение миелиновых белков в образцах ОЭЗ цельного рассечения было вызвано загрязнением стриатальной тканью. Следовательно, CSD в значительной степени предотвращал загрязнение стриатальной тканью (богатой компактным миелином) по сравнению с рассечением цельной горы.

Непредвзятый анализ протеома недиссоциированной ткани может выявить интересные внеклеточные белки. При улучшенной диссекции с использованием CSD внеклеточные ассоциированные белки были значительно обогащены в образцах по сравнению с образцами wholemount (рисунок 2C, тест на обогащение аннотации). CSD и цельная диссекция демонстрируют сопоставимое обогащение терминов генной онтологии (GO) «внеклеточная везикулярная экзосома» и «часть внеклеточной области». Тем не менее, термин GO «Matrisome-associated» немного больше обогащен в CSD, чем в целом рассечении. Соответственно, кросс-связывающий фермент ECM и недавно обнаруженный регулятор нейрогенеза трансглутаминаза-2 (Tgm2) были найдены обогащенными в ОЭЗ по сравнению с Cx с использованием CSD25. Напротив, не было обнаружено никакой разницы между образцами SEZ и Cx, полученными путем рассечения цельного монтажа (рисунок 2D). Протеомные данные полосатого тела33 подтверждают гипотезу о том, что обнаружению регулятора нейрогенеза Tgm2 путем рассечения цельной горы препятствовало загрязнение стриатальной тканью. Следовательно, в целом, криосекция-рассечение является успешным, но также необходимым улучшением стандартного рассечения для нишевого анализа протеома.

Сравнение с лазерной захватной микроскопией
Передняя половина ОЭЗ и МЭЗ 3 взрослых мышей были получены для LCM (рисунок 3A). В целом, метод LCM имеет некоторые недостатки, особенно в отношении возмущения тканей и эффективности. Для визуализации интересующей области под рассеченным микроскопом необходимо фоновое окрашивание, потенциально смывающее мелкие или растворимые белки, представляющие интерес, например, факторы роста, цитокины или регуляторы ECM, такие как ферменты. Кроме того, слайды проводят разное время при комнатной температуре во время лазерного удаления. Более того, сам лазер может денатурировать интересующие белки.

CSD имеет значительное преимущество перед LCM в отношении времени и усилий, необходимых для выполнения вскрытия: шаг 1 протокола должен выполняться аналогично как для CSD, так и для LCM; без этого шага стенки желудочков остаются адгезионными, что затрудняет разделение образцов MEZ и SEZ. Учитывая, что срезы CSD (100 мкм) в 6-7 раз толще максимальной толщины34 секций LCM (15 мкм), этап 2 (сечение мозга) и шаг 3 (удаление MEZ и SEZ из каждого коронального сечения) займет у ЛКМ не менее 6-7 раз больше времени. Необходимое окрашивание фона и настройка лазерного микроскопа отнимут дополнительное время. Здесь потребовалось в три раза больше времени, чтобы собрать 50% ОЭЗ и MEZ 3 животных LCM по сравнению со 100% ОЭЗ и MEZ 4 животных CSD, что составляет восьмеричное преимущество CSD в скорости. Таким образом, LCM не только требует значительного количества дополнительных усилий, но ткань также подвергается значительно более длительному периоду манипуляций и изменений температуры, которые могут поставить под угрозу динамику и надежность данных, генерируемых последующим анализом.

Результаты MS CSD сравнивались с результатами микродиссекции лазерного захвата (LCM). Оба набора данных были сопоставлены с протеомной библиотекой, созданной путем объединения образцов CSD. В среднем LCM дал 3 441 ± 270,0 и 3 613 ± 238,7 отдельных белков в ОЭЗ и медиальной желудочковой зоне соответственно (рисунок 3B). Учитывая замечательную разницу в идентификации белка, анализ главных компонентов (PCA) показал отчетливое разделение в соответствии с методом диссекции (компонент 1: 62,7%, не показан). Компонент 2 показал наибольшее разделение для ОЭЗ и MEZ среди образцов LCM (8,5%, рисунок 3C). Компонент 3 также, как представляется, разделяет LCM и CSD; однако эта разница может быть вызвана различиями на основе методов, а не количеством идентифицированных белков (6,4%). Тем не менее, общее региональное разделение оставалось поразительно отличным для данных криодиссекции и значительно лучше, чем для LCM. Это расхождение в динамике данных может быть результатом различного времени, проведенного образцами при комнатной температуре во время лазерной диссекции, или более высокой восприимчивости мелких тканей, что приводит к изменчивости в последующих протоколах протеомики и измерениях масс-спектрометрии.

Для поиска различий в протеомном профиле ECM для ОЭЗ и MEZ был выполнен 2D-тест обогащения аннотации между CSD и LCM (рисунок 3D). Расчет относительного обогащения терминов GO между образцами LCM и CSD позволяет сравнивать относительную динамику протеомов белковых кластеров ECM между двумя методами, несмотря на неравное количество ткани и различия в протоколе рассечения. Графики показывают хорошую корреляцию между LCM и CSD. Аннотации «внеклеточная часть области» и «внеклеточная мембранно-связанная органелла» одинаково обогащены как в методах, так и в областях. Следовательно, повышенная потребность во времени LCM, по-видимому, не компенсируется относительно более высокой чувствительностью к белкам, связанным с ECM. Вместо этого CSD обеспечивает более надежную идентификацию / количественную оценку при сравнении выборочных данных для нейрогенеза и связанных с ОЭЗ белков ECM Tgm2, Thrombospondin-4 (Thbs4), S100a6 и Tenacin-C (Tnc) (рисунок 3E). В случае TnC, хотя и количественно оценен во всех образцах, только CSD показал обогащение для SEZ по сравнению с MEZ. Тем не менее, связанные с ОЭЗ белки базальной мембраны Nidogen-1 (Nid1), субъединица ламинина бета-2 (Lamb2) и базальная мембранно-специфический протеогликановый белок протеогликана гепарансульфата (Hspg2)35 показали еще более надежное обогащение в ОЭЗ (по сравнению с MEZ) в образцах LCM, чем в образцах CSD (не показано). Следовательно, CSD может предоставить образцы тканей, которые обеспечивают точный и глубокий количественный протеом для характеристики SEZ в разумные сроки, не беспокоясь о нарушенной целостности тканей или потере белка.

Статистика
Статистическое тестирование, тесты на обогащение 2D-аннотаций и PCA проводились в среде Персея. Белки были включены в анализ, если было обнаружено допустимое значение для каждого метода по крайней мере в одном образце. Сравнение содержания белка и количества визуализировалось с помощью программного обеспечения для анализа данных (см. Таблицу материалов). Для сравнения белков использовался основанный на перестановках контроль скорости ложного обнаружения (FDR) (FDR был установлен на уровне 0,05, 250 рандомизаций). Для тестов обогащения 2D-аннотаций36 отображаемые термины GO значительно обогащаются (FDR был установлен на 0,02 с использованием метода Бенджамини-Хохберга FDR-control).

Figure 1
Рисунок 1: Метод крио-секции-диссекции. (А) Обзор интересующей области: боковой желудочек с нейрогенной ОЭЗ и ненейрогенной МЭЗ. Нейробласты иммуноокрашены Dcx. (B) Ступенчатое удаление OB, переднего полюса, коры и мозолистого тела над желудочками и сосудисто-сростком: 1. размещение в среде рассечения, 2. удаление OB, 3. удаление переднего полюса коры, 4. сагиттальные разрезы верхушки желудочка, 5. удаление верхушки желудочка, 5. удаление верхушки желудочка, 6. распространение желудочковых стенок. (C) 100 мкм корональных срезов свежезамороженного мозга мыши, (1)до и (2.) после удаления стенок желудочков ледяным скальпелем. Шкала стержней = 4 мм (D) Окрашивание коронального сечения бокового желудочка (GFAP: зеленый; DAPI: синий), показывающий ОЭЗ и MEZ, расчлененные с ПОМОЩЬЮ CSD. Шкала стержней = 300 мкм (A), 200 мкм (D). Сокращения: CSD = криосекционное рассечение; ОЭЗ = субэпендимальная зона; MEZ = медиальная эпендимальная зона; Dcx = Даблкортин; OB = обонятельная лампа; GFAP = глиальный фибриллярный кислый белок; DAPI = 4′,6-диамидин-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Превосходная точность рассечения с крио-сечением-рассечением по сравнению с рассечением цельного сечения. (А) Иммуногистохимическое изображение образца ОЭЗ, полученное методом рассечения цельного сечения (слева). Включение богатой миелином стриатальной ткани визуализируется окрашиванием против MAG (зеленый). Окрашивание ОЭЗ, рассеченной с помощью CSD (справа). В CSD почти весь полосатый миелин (окрашивание против MAG, зеленый) исключается из ленты образца. Ядра были визуализированы с помощью DAPI (синий). (B) Сравнение обогащения маркерами миелина в ОЭЗ и Cx от wholemount (MBP: p = 0,0074; MAG: p = 0,0016; Plp1: p = 0,0011; CNP: p = 0,0029) и CSD (MBP: p = 0,0667; MAG: p = 0,0236; Plp1: p = 0,3420; CNP: p = 0,1842). (C) 2D-тест на обогащение аннотации, сравнивающий цельную ОЭЗ с образцами CSD-SEZ. Термины GO внеклеточное пространство и матрисома-ассоциированные больше обогащены данными CSD, чем данными wholemount. (D) Обилие белка регулятора NSC Tgm225, построенное для рассечения всей горы и CSD. Tgm2 значительно обогащается в ОЭЗ по сравнению с Cx в CSD (CSD: p = 0,0029; Полное расстояние: p = 0,1775). Для B и D: в качестве справочной информации, данные о протеомах от Sharma et al.33 с измерениями полосатого тела и коры головного мозга, построенными для соответствующих белков, отображаемых в образцах wholemount и CSD. Шкала стержней = 200 мкм (А). Сокращения: CSD = криосекционное рассечение; ОЭЗ = субэпендимальная зона; MAG = миелин-ассоциированный гликопротеин; Cx = соматосенсорная кора; MBP = основной белок миелина; Plp1 = протеолипид-белок 1; CNP = 2',3'-циклически-нуклеотид-3'-фосфодиэстераза; GO = онтология генов; NSC = нервные стволовые клетки; Tgm2 = транглутаминаза 2; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; LFQ = количественное определение без меток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Улучшенная количественная оценка внеклеточного белка с помощью криосекции-диссекции по сравнению с LCM. (A) Крезиловое окрашивание бокового желудочка до и после лазерного захвата ОЭЗ и MEZ (слева). Для сравнения, разрез CSD ОЭЗ и MEZ (справа). Шкала батончиков = 150 мкм. (B) Сравнение количества обнаруженных белков в образцах SEZ и MEZ из CSD и LCM. Данные представлены в виде среднего ± SD. (C) Анализ главных компонентов образцов ОЭЗ и MEZ, сравнивающий CSD и LCM (компонент 2: 8,5% дисперсии; компонент 3: 6,4%). (D) Обогащение 2D-аннотации крио-секционных и лазерно-рассеченных MEZ (вверху) и ОЭЗ (снизу). В терминах GO внеклеточная органелла и часть внеклеточной области значительно обогащены (красные точки). (E) Обилие внеклеточных маркерных белков, связанных с ОЭЗ, в ОЭЗ и MEZ для образцов LCM (Tnc: p = 0,3789) и CSD (Tgm2: p = 0,2940; S100a6: p = 0,0218; THBS4: p = 0,3941; Tnc: p = 0,0004). Сокращения: CSD = криосекционное рассечение; LCM = лазерный захват-микродиссекция; ОЭЗ = субэпендимальная зона; MEZ = медиальная эпендимальная зона; GO = онтология генов; Tnc = Тенацин-С; Tgm2 = трансглутаминаза 2; S100a6 = S100 кальций-связывающий белок A6; THBS4 = тромбоспондин-4; LFQ = количественное определение без меток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Метод CSD позволил точно извлечь ткань ОЭЗ и получить надежный протеом со значительной глубиной с использованием MS. CSD демонстрирует явное преимущество по сравнению с цельноразмерной диссекцией с точки зрения значительно сниженного стриатального загрязнения образцов ОЭЗ и внеклеточного обогащения белка. Поскольку также можно обнаружить аналогичное количество белков в отдельных образцах (~ 6 500 белков на образец) с помощью CSD и рассечения wholemount, дополнительное время для CSD стоит усилий. LCM обеспечивает более точную рассечение ОЭЗ, но достигает более низкой глубины протеома, имея только 3 500 белков на образец, несмотря на использование того же протокола MS, что и CSD (сопоставление библиотек и количественная оценка без меток). Важно отметить, что изменчивость была намного больше, вероятно, из-за восьмикратно более длительного времени подготовки на образец. PCA образцов, полученных LCM и CSD, показывает четкое разделение обоих методов с плотными кластерами, специфичными для региона, надежно отделенными друг от друга. Напротив, образцы LCM показали более рассеянное распределение, что, вероятно, частично связано с продолжительностью подготовки. Неясно, дал ли бы сбор гораздо большего количества образцов в течение более длительного периода протеом такой же прочности и глубины с LCM. Расчет оценки, сбор аналогичного объема образца, как это было сделано для CSD, занял бы в 5-8 раз больше времени с LCM, даже до 15 раз дольше, если бы были включены образцы, предоставленные для библиотек пептидных спектров, и большая часть из них в размороженных условиях. Кроме того, учитывая дополнительные возмущения ткани, необходимые для LCM (фоновое окрашивание, лазерное рассечение), LCM обеспечил небольшой, если таковой имелся, выигрыш по сравнению с CSD. Следовательно, CSD можно считать более подходящим для внеклеточных исследований протеома, особенно для ОЭЗ.

Примечательно, что если область интереса меньше, чем ОЭЗ (например, исследуя только эпендимальный клеточный слой), подход от руки отстает от точности LCM. Например, использование CSD для отделения эпендимального от субэпендимального слоя затруднено, поскольку эпендимальный слой имеет ширину только диаметр клетки, а демаркация в сторону субэпендимального слоя не видна невооруженным глазом в свежезамороженной ткани. Следовательно, LCM будет лучшим выбором, чем CSD, если точное рассечение по шкале ниже 50 мкм более важно, чем ненарушенная ткань или сохранение короткого времени рассечения. Однако для областей шириной 50 мкм и более точность CSD сопоставима с точностью LCM для анализа белка ECM.

CSD уже доказал свою полезность, внеся свой вклад в исследование функциональной роли ECM в нейрогенной нише25. Следовательно, продолжающееся применение CSD в ОЭЗ для различных исследований белков и протеомов (или даже секвенирования одноядерной РНК) может привести к обнаружению дальнейших регуляторов нейрогенеза, маркеров активации стволовых клеток и более глубокому пониманию нишевой физиологии стволовых клеток SEZ. Учитывая снижение нейрогенеза в стареющей SEZ37, краткий анализ изменений ECM ОЭЗ пожилых и молодых мышей может способствовать пониманию точных нишевых механизмов, способствующих развитию и поддержанию NSC38,39. Кроме того, влияние воспаления и травмы на нейрогенез ОЭЗ хорошо известно40,41,42,43. Обогащение фибриногена крови в ОЭЗ после корковой черепно-мозговой травмы и его влияние на астроглиогенез ОЭЗ и образование рубцов44 подчеркивает потенциальное влияние вызванных травмой изменений микросреды на физиологию стволовых клеток ОЭЗ. Следовательно, исследование протеома SEZ-ECM в связи с черепно-мозговой травмой с использованием CSD может помочь прояснить механизмы, с помощью которых травма и воспаление влияют на нейрогенез. Важно отметить, что метод также может быть применим к нейрогенным нишам человеческого мозга в области здоровья и заболеваний, поскольку свежезамороженная ткань часто может быть получена из операций. Кроме того, учитывая видовые различия во взрослом нейрогенезе, было бы также интересно применить метод CSD к другим видам, например, в ассоциации со стриатальным нейрогенезом. Кроме того, с помощью других методов обнаружения белка различия в локально продуцируемых факторах роста могут быть исследованы точно и эффективно с использованием CSD для ОЭЗ и MEZ (например, ИФА).

Наконец, процедура рассечения потенциально может быть модифицирована для точного извлечения других областей мозга, а также для исследовательских вопросов, не связанных с нейрогенезом. Например, CSD включает в себя короткую стадию полуоттаивания, во время которой компактный миелин виден в виде белых областей, отличных от более полупрозрачной остаточной ткани мозга. При простой модификации метода эта особенность позволила бы точно рассечение только компактной миелиновой ткани мозолистого тела, которая могла бы быть подвергнута протеомному анализу изменений, связанных с травмой. Предложение об изменении протокола, которое позволило бы мозолистому рассечению тела, состоит в том, чтобы опустить шаги 1.5-1.9 протокола и перейти непосредственно к подготовке корональных секций вместо открытия желудочков, чтобы сделать SEZ и MEZ доступными. Затем поместите срезы на сухой лед, ненадолго поднимите и полуоттравьте ломтики, а также просто удалите мозолистое тело скальпелем. Теперь этот препарат должен быть готов к любому анализу, требующему эффективного рассечения нативной ткани мозолистого тела.

Таким образом, в этом исследовании представлен метод микродиссекции, который может быть использован для надежного анализа нейрогенного нишевого протеома желудочков. Полученные данные подчеркивают совместимость и полезность метода CSD вместе с протеомным анализом микросреды ОЭЗ на основе MS. Сочетание точности, эффективности и минимального возмущения тканей делает CSD ценным расширением существующих методов.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов

Acknowledgments

Мы хотим искренне поблагодарить Матиаса Манна за то, что он позволил нам выполнить большую часть экспериментов в его лаборатории, Фабиана Кошиа за помощь в анализе LCM и протеомов, Татьяну Симон-Эберт за вскрытие целых гор и Корбиняна Майра и Игоря Парона за их техническую помощь. Мы с благодарностью признаем финансирование от Немецкого исследовательского совета MG (SFB870, TFR274), ЕС (Eranet S-700982-5008-001), ERC (aERC «NeuroCentro» для MG), Шведского общества медицинских исследований (SSMF, для JK) постдокторского гранта и фондов KI (2020-01351, для JK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat CM3050S Leica
Dissecting microscope Leica
Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip Fine Science Tools cat. no. 11252-00
Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 Invitrogen cat. no. 24020
HEPES buffer solution (1 M) Invitrogen cat. no. 15630
Microscope slides RS France cat. no. BPB018
Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL Eppendorf cat. no. 0030123344
Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm Fine Science Tools cat. no. 15003-08
Surgical disposable scalpels B. Braun cat. no. 5518083
Tissue culture dishes 60 mm Greiner Bio-One cat. no. 633180
Antibodies
Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) ThermoFisher Scientific cat. no. A-11001
DAPI Sigma cat. no. D9542
guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 Millipore cat. no. AB2253,
mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 Sigma cat. no. G3893
mouse monoclonal anti-MAG 1:400 Millipore cat. no. MAB1567
Software
GraphPad Prism version 9 GraphPad Software, San Diego California USA www.graphpad.com
Perseus Version 1.6.10.50 Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany https://maxquant.net/perseus/
ZEN imaging software Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodman, T., Hajihosseini, M. K. Hypothalamic tanycytes-masters and servants of metabolic, neuroendocrine, and neurogenic functions. Frontiers in Neuroscience. 9, 387 (2015).
  2. Chaker, Z., et al. Hypothalamic neurogenesis persists in the aging brain and is controlled by energy-sensing IGF-I pathway. Neurobiology of Aging. 41, 64-72 (2016).
  3. Kuhn, H. G., Toda, T., Gage, F. H. Adult hippocampal neurogenesis: a coming-of-age story. Journal of Neuroscience. 38 (49), 10401-10410 (2018).
  4. Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
  5. Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
  6. Bordiuk, O. L., Smith, K., Morin, P. J., Semënov, M. V. Cell proliferation and neurogenesis in adult mouse brain. PloS One. 9 (11), 111453 (2014).
  7. Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain. Journal of Neuroscience. 17 (13), 5046-5061 (1997).
  8. Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The adult ventricular-subventricular zone (V-SVZ) and olfactory bulb (OB) neurogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (5), 018820 (2016).
  9. Sato, K. Effects of microglia on neurogenesis. Glia. 63 (8), 1394-1405 (2015).
  10. Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
  11. Sirko, S., et al. Chondroitin sulfates are required for fibroblast growth factor-2-dependent proliferation and maintenance in neural stem cells and for epidermal growth factor-dependent migration of their progeny. Stem Cells. 28 (4), 775-787 (2010).
  12. Mercier, F. Fractones: extracellular matrix niche controlling stem cell fate and growth factor activity in the brain in health and disease. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (24), 4661-4674 (2016).
  13. Mercier, F., Kitasako, J. T., Hatton, G. I. Anatomy of the brain neurogenic zones revisited: fractones and the fibroblast/macrophage network. Journal of Comparative Neurology. 451 (2), 170-188 (2002).
  14. Nascimento, M. A., Sorokin, L., Coelho-Sampaio, T. Fractone bulbs derive from ependymal cells and their laminin composition influence the stem cell niche in the subventricular zone. Journal of Neuroscience. 38 (16), 3880-3889 (2018).
  15. Chen, G., et al. In vivo reprogramming for brain and spinal cord repair. eNeuro. 2 (5), 0106-0115 (2015).
  16. Zhang, Q., Chen, W., Tan, S., Lin, T. Stem cells for modeling and therapy of Parkinson's disease. Human Gene Therapy. 28 (1), 85-98 (2017).
  17. Wei, C., Xiong, S., Cheng, L. Reprogramming of fibroblasts to neural stem cells by a chemical cocktail. Methods in Molecular Biology. 2117, 265-270 (2020).
  18. Tian, Z., Zhao, Q., Biswas, S., Deng, W. Methods of reactivation and reprogramming of neural stem cells for neural repair. Methods. 133, 3-20 (2018).
  19. Heinrich, C., et al. Sox2-mediated conversion of NG2 glia into induced neurons in the injured adult cerebral cortex. Stem Cell Reports. 3 (6), 1000-1014 (2014).
  20. Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
  21. Seidenfaden, R., Desoeuvre, A., Bosio, A., Virard, I., Cremer, H. Glial conversion of SVZ-derived committed neuronal precursors after ectopic grafting into the adult brain. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (1-2), 187-198 (2006).
  22. Lepko, T., et al. Choroid plexus-derived miR-204 regulates the number of quiescent neural stem cells in the adult brain. EMBO Journal. 38 (17), 100481 (2019).
  23. Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
  24. Angelidis, I., et al. An atlas of the aging lung mapped by single cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nature Communications. 10 (1), 963 (2019).
  25. Kjell, J., et al. Defining the adult neural stem cell niche proteome identifies key regulators of adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 26 (2), 277-293 (2020).
  26. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), e1938 (2010).
  27. Kulak, N. A., Geyer, P. E., Mann, M. Loss-less nano-fractionator for high sensitivity, high coverage proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 16 (4), 694-705 (2017).
  28. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  29. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  30. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  31. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47 (1), 442-450 (2019).
  32. Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344 (6181), 319-324 (2014).
  33. Sharma, K., et al. Cell type- and brain region-resolved mouse brain proteome. Nature Neuroscience. 18 (12), 1819-1831 (2015).
  34. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  35. Kerever, A., et al. Novel extracellular matrix structures in the neural stem cell niche capture the neurogenic factor fibroblast growth factor 2 from the extracellular milieu. Stem Cells. 25 (9), 2146-2157 (2007).
  36. Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12 (2012).
  37. Daynac, M., Morizur, L., Chicheportiche, A., Mouthon, M. -A., Boussin, F. D. Age-related neurogenesis decline in the subventricular zone is associated with specific cell cycle regulation changes in activated neural stem cells. Scientific Reports. 6, 21505 (2016).
  38. Navarro Negredo, P., Yeo, R. W., Brunet, A. Aging and rejuvenation of neural stem cells and their niches. Cell Stem Cell. 27 (2), 202-223 (2020).
  39. Smith, L. K., White, C. W., Villeda, S. A. The systemic environment: at the interface of aging and adult neurogenesis. Cell and Tissue Research. 371 (1), 105-113 (2018).
  40. Neuberger, E. J., Swietek, B., Corrubia, L., Prasanna, A., Santhakumar, V. Enhanced dentate neurogenesis after brain injury undermines long-term neurogenic potential and promotes seizure susceptibility. Stem Cell Reports. 9 (3), 972-984 (2017).
  41. Fisch, U., Brégère, C., Geier, F., Chicha, L., Guzman, R. Neonatal hypoxia-ischemia in rat elicits a region-specific neurotrophic response in SVZ microglia. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 26 (2020).
  42. Götz, M., Sirko, S., Beckers, J., Irmler, M. Reactive astrocytes as neural stem or progenitor cells: In vivo lineage, In vitro potential, and Genome-wide expression analysis. Glia. 63 (8), 1452-1468 (2015).
  43. Kernie, S. G., Parent, J. M. Forebrain neurogenesis after focal Ischemic and traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 37 (2), 267-274 (2010).
  44. Pous, L., et al. Fibrinogen induces neural stem cell differentiation into astrocytes in the subventricular zone via BMP signaling. Nature Communications. 11 (1), 630 (2020).

Tags

Неврология Выпуск 176
Криосекционное рассечение субэпендимальной зоны взрослого человека для точного и глубокого количественного анализа протеома
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Friess, C., Götz, M., Kjell, J. … More

Friess, C., Götz, M., Kjell, J. Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis. J. Vis. Exp. (176), e63047, doi:10.3791/63047 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter