Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מיצוי בסיוע קולי של חומצה קנבידיולית מביומסת קנאביס

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/63076
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 1,3, 2, 3
1Department of Chemistry, Colorado State University-Pueblo, 2Chuncheon Bioindustry Foundation, 3Institute for Cannabis Research, Colorado State University-Pueblo
* These authors contributed equally

Summary

מיצוי בסיוע קולי (UAE) מגביר את יעילות המיצוי של ממסים וכאשר מיישמים אותו על ביומסה של קנאביס spp. הוא מקצר את הזמן הדרוש למיצוי. זה מקטין את העלות ואת אובדן הקנבינואידים הפוטנציאלי עקב השפלה. בנוסף, איחוד האמירויות הערביות נחשבת לשיטה ירוקה בשל שימוש נמוך בממסים.

Abstract

קנבוס תעשייתי (קנאביס spp.) יש תרכובות רבות של עניין עם יתרונות רפואיים פוטנציאליים. מבין התרכובות הללו, קנבינואידים הגיעו למרכז תשומת הלב, במיוחד קנבינואידים חומציים. המיקוד פונה לכיוון קנבינואידים חומציים בשל חוסר הפעילות הפסיכוטרופית שלהם. צמחי קנאביס מייצרים קנבינואידים חומציים עם צמחי קנבוס המייצרים רמות נמוכות של קנבינואידים פסיכוטרופיים. לפיכך, שימוש בקנבוס למיצוי קנבינואידים חומצי יבטל את הצורך בדקרבוקסילציה לפני המיצוי כמקור לקנבינואידים. השימוש במיצוי מבוסס ממסים הוא אידיאלי להשגת קנבינואידים חומציים שכן המסיסות שלהם בממסים כגון CO2 סופר-קריטי מוגבלת בשל הלחץ והטמפרטורה הגבוהים הנדרשים כדי להגיע לקבועי המסיסות שלהם. שיטה חלופית שנועדה להגביר את המסיסות היא מיצוי בסיוע קולי. בפרוטוקול זה נבדקה ההשפעה של קוטביות הממסים (אצטוניטריל 0.46, אתנול 0.65, מתנול 0.76 ומים 1.00) וריכוז (20%, 50%, 70%, 90%, ו-100%) על יעילות המיצוי בסיוע קולי. התוצאות מראות כי מים היו הכי פחות יעילים ואצטוניטריל היה הממס היעיל ביותר שנבדק. אתנול נבדק עוד יותר מכיוון שיש לו את הרעילות הנמוכה ביותר והוא נחשב בדרך כלל כבטוח (GRAS). באופן מפתיע, 50% אתנול במים הוא ריכוז האתנול היעיל ביותר למיצוי הכמות הגבוהה ביותר של קנבינואידים מהמפ. העלייה בריכוז החומצה הקנאבידיולית הייתה 28% בהשוואה ל-100% אתנול, ו-23% בהשוואה ל-100% אצטוניטריל. בעוד שנקבע כי 50% אתנול הוא הריכוז היעיל ביותר עבור היישום שלנו, השיטה הוכחה גם כיעילה עם ממסים חלופיים. כתוצאה מכך, השיטה המוצעת נחשבת ליעילה ומהירה למיצוי קנבינואידים חומציים.

Introduction

קנבוס תעשייתי (Cannabis spp.) מייצר קנבינואידים חומציים ברקמות צמחיות שונות (פרחים, עלים וגבעולים), כאשר הריכוז הגבוה ביותר נמצא בפרח1. תעשיית הקנאביס משתמשת במספר שיטות למיצוי תרכובות אלה. שיטה אחת כזו היא מיצוי ממס המשתמש בממס שאינו קוטבי ו/או קוטבי, שאתנול הוא הנפוץ ביותר בו. עם זאת, מיצוי הממס לבדו מוגבל ביכולתו; לכן, טכניקות מיצוי אוגמנטטיביות, כגון מיצוי בסיוע מיקרוגל (MAE) ומיצוי בסיוע קולי (UAE), נועדו להגדיל את התפוקה. בנוסף, ניתן להפיק קנאבידיול בריכוז גבוה (CBD) באמצעות טכנולוגיות נוזל סופר קריטי2.

מיצוי הוא תהליך דינמי, ומספר גורמים משפיעים על יעילותו, כלומר תכולת הלחות, גודל החלקיקים והממס3. באופן ספציפי, עבור טכניקת איחוד האמירויות הערביות, היעילות נשלטת על ידי טמפרטורה, לחץ, תדירות וזמן4.

מיצוי בסיוע על-קולי הוא התהליך שבו גלים על-קוליים מועברים דרך נוזל כדי להתסיס חלקיקים. במהלך תהליך התסיסה, חומרים צמחיים חווים קוויטציה אקוסטית, מחזורי דחיסה והתפשטות היוצרים בועות המתמוטטות בתמיסה וכתוצאה מכך נוצרות טמפרטורה ולחץ קיצוניים5. שינויי הלחץ והטמפרטורה משנים את התכונות הפיזיקליות של הממסים, מה שעלול לגרום ליעילות מוגברת של מיצוי6. בנוסף, קוויטציה יכולה לשבש אינטראקציות מולקולריות ולהוביל לכך שתרכובות אורגניות ואנאורגניות יזרקו ממטריצת הצמח7. התהליך כולל שני סוגים עיקריים של תופעות פיזיקליות: (1) דיפוזיה לרוחב דופן התא, ו-(2) שטיפה של תכולת התאים לאחר שבירת הדופן8. עם זאת, השימוש באיחוד האמירויות אינו חף ממלכודותיה; ישנם מספר דיווחים על כך שאיחוד האמירויות הערביות יכולה להשפילמתחמים 9,10. בנוסף, הטמפרטורות הנוצרות באתרי הקוויטציה הן מעל אלה הדרושות לדקרבוקסילציה של קנבינואידים. עם זאת, Mudge et al.11 השתמשו באיחוד האמירויות הערביות ולא הבחינו בדקרבוקסילציה גדולה של CBD או טטרהידרוקנבינול (THC), ובכך הוכיחו כי איחוד האמירויות הערביות היא שיטה יעילה וירוקה להפקת קנבינואידים מכיוון שניתן להפיק אותם במהירות באמצעות אנרגיה נמוכה.

De Vita et al.12 בחנו את השימוש בשיטות MAE ו-UAE באופן ספציפי ומצאו כי בעת יישום התנאים האופטימליים עבור כל שיטה, איחוד האמירויות הערביות הוציאה יותר מה-CBD וה-THC החומציים והנייטרליים הקיימים בחומר הצמחי. באופן דומה, Rožanc et al.13 השוו שיטות מיצוי מרובות (איחוד האמירויות הערביות, סוקשלאט, מקרציה ונוזל סופר-קריטי) ובחנו את הפעילות הביולוגית של התמציות. רוז'נץ הראה כי כל השיטות יעילות במיצוי קנבינואידים; עם זאת, נוזל סופר-קריטי ואיחוד האמירויות הערביות היו היעילים ביותר במיצוי חומצה קנאבידיולית (CBDA). בנוסף, המיצוי של איחוד האמירויות הערביות היה בעל הפעילות הביולוגית הגבוהה ביותר כאשר הוא נמדד על ידי בדיקת 2,2-דיפניל-1-פיקריל-הידרזיל (DPPH). המחקר של רוז'אנק הראה גם כי בעוד שתהליכי המיצוי יעילים בייצור תמציות גולמיות, עדיין יש חלק מתרכובות שאינן קנבינואידיות המשפיעות על הפעילות הביולוגית של התמציות. בנוסף, תרכובות אלה יכולות לסבך את הבידוד והטיהור של תרכובות קנבינואידיות בודדות מהתמציות הגולמיות13.

טכניקות מיצוי נוזלים סופר-קריטיות (SFE) שימשו למיצוי קנבינואידים ניטרליים. מספר מחקרים הראו כי SFE בתוספת ממס אורגני, כגון אתנול, הביאו ליעילות מיצוי גבוהה יותר של קנבינואידים ניטרליים 2,3. כאשר הלחץ עלה לרמות המסוגלות לחלץ את הקנבינואידים החומציים, גם התכולה הלא-קנבינואידית עלתה. ככאלה, לחצים גבוהים אלה אינם מעשיים לעיבוד תעשייתי מכיוון שהסלקטיביות של SFE עבור קנבינואידים פחתה ונדרש עיבוד נוסף לאחר עיבוד. כתוצאה מכך, דה-קרבוקסילציה חייבת להיעשות לפני SFE, מה שעלול לגרום להפסדי קנבינואידים של עד 18%2. כדי להגביר את היעילות ב- SFE, הוא שולב עם טכניקות כגון מיצוי בשלב מוצק כדי להגביר את הטוהר של התמצית הסופית14. עם זאת, למרות שיש לו טוהר גבוה כמוצר הסופי, רק קנבינואידים ניטרליים מתקבלים.

באופן מסורתי, במעבדה האנליטית, קנבינואידים הופקו בתערובת מתנול:כלורופורם ביחס של 9:1. עם זאת, Mudge et al.11 הראו כי ניתן לבצע מיצוי יעיל עם ממסים בודדים בעת שימוש באיחוד האמירויות הערביות. המחקר הראה כי 80% מתנול היה יעיל כמו מיצוי המסורתי של מתנול:כלורופורם ביחס של 9:1, ובכך הצביע על כך שממסים ירוקים יותר יכולים להיות יעילים באותה מידה. ככזו, איחוד האמירויות הערביות נבחנה לשימוש הפוטנציאלי שלה בשל מספר יתרונות, כולל עלות הון נמוכה, זמן מיצוי מופחת, ושימוש נמוך יותר באנרגיה ונפחי ממסים נמוכים יותר. עם זאת, במקרה של איחוד האמירויות הערביות, כאשר נעשה שימוש בממסים קוטביים, ניתן לחלץ כלורופיל ושאר לא קנבינואידים שאינם קנבינואידים, מה שעלול לגרום לבעיה בצבע7. כתוצאה מכך, כדי לבחון את הפוטנציאל להשגת קנבינואידים חומציים בקנה מידה מסחרי, איחוד האמירויות הערביות הועסקה בשימוש בזן הקנבוס התעשייתי Cherry Wine. יין דובדבנים הוא הכלאה של C. sativa ו - C. indica, הכלאה בין הזנים של האישה והדובדבנים של שרלוט. זן יין הדובדבן הוא זן CBDA גבוה המייצר (15% עד 25% CBD) עם רמות נמוכות של חומצה טטרהידרוקנבינולית (THCA). הזן הוא זן C. indica-dominate שיש לו 7 עד 9 שבועות של פריחה.

על מנת לבסס את פרוטוקול החילוץ האופטימלי של איחוד האמירויות הערביות, ננקטו שתי גישות: האופטימיזציה המסורתית של גורם אחד בכל פעם (OFT) וגישת תכנון ניסוי (DoE) באמצעות תכנון מרוכב מרכזי (CCD)15. עבור DoE, מיצוי CBDA/CBD עבר אופטימיזציה על בסיס יחס המדגם/ממס, זמן המיצוי וריכוז הממס כגורמים, והנתונים שהתקבלו נותחו על ידי מתודולוגיית משטח התגובה (RSM). לסיכום, הפרוטוקול המתואר מתאר את השיטה האופטימלית לחילוץ הכמות הגבוהה ביותר של CBDA / CBD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת חומר צמחי

  1. קבל תפרחות יין דובדבן מצמחים שגדלו בשדה, נטועים בתצורה מדרום לצפון, עם צמחים במרחק של 1 מ' זה מזה במרכז ושורות במרחק של 1.2 מ' זה מזה (עיבוד חקלאי הממוקם בלונגמונט, קולורדו, ארה"ב).
  2. מייבשים את התפרחות באוויר בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. טחנו את התפרחות באמצעות מכונת שחיקה קבעו 177 מיקרומטר.
  3. מעבירים את החומר המחורבן דרך מסננת הרשת מס ' 80. אחסנו את האבקה שנוצרה בשקית אטומה בטמפרטורת החדר לשימוש עתידי.

2. מיצוי אולטרסאונד

  1. שוקלים 0.5 גרם של אבקת תפרחת הקנאביס לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. הוסיפו 40 מ"ל של הממס (למשל, 50% אתנול במים שעברו דה-יוניזציה) לכלי.
  2. מקם את כלי החילוץ באמבטיה האולטרה-קולית שנקבעה ב-40 קילוהרץ ובטמפרטורת החדר (הספק הסאונדציה הוא 100 W).
  3. בצע את המיצוי באמבט האולטרה-קולי במשך 30 דקות, מה שמגדיל את טמפרטורת האמבטיה מ-25 מעלות צלזיוס ל-30 מעלות צלזיוס.
  4. נקו את נוזל החילוץ לתוך צינור צנטריפוגה.
  5. צנטריפוגה את הנוזל ב 3,000 x g ב 15 °C (74 °F) במשך 15 דקות. סנן את חומר העל תחת ואקום דרך נייר סינון של 8 מיקרומטר.

3. ניתוח כמותי של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC)

  1. דילול שבעה תקנים קנבינואידים: קנביסכרום (CBC), CBD, CBDA, קנבינול (CBN), חומצה טטרהידרוקנבית (THCA), Δ8-THC ו-Δ9-THC לריכוזי פעולה של 100, 50, 25 ו-12.5 מיקרוגרם/מ"ל ב-100% מתנול. ערבוב וסוניקציה במשך 5 דקות באמבטיה על-קולית שנקבעה ב-40 קילוהרץ ובהספק קולי של 100 וואט
  2. סנן את התקנים באמצעות מסנן מזרקים של 0.45 מיקרומטר פוליטטראפלואורואתילן (PTFE). סנן את ה-supernatant לדוגמה (משלב 2.5) דרך מסנן מזרק PTFE של 0.45 מיקרומטר.
  3. שים את הדגימה לניתוח בבקבוקון 1.5 מ"ל לתוך הדגם האוטומטי של HPLC וטען 10 μL בכל פעם.
  4. הפעל את HPLC בהתאם לתנאים ולפרמטרים המופיעים בטבלה 1. גזור ריכוזי קנבינואידים ב-50-200 מיקרוגרם/מ"ל מהעקומה הסטנדרטית שנוצרה.
  5. הכפל עם נפח הממס (40 מ"ל) המשמש בתהליך המיצוי כדי להשיג מיקרוגרם של קנבינואיד. המירו את המיקרוגרם של קנבינואיד למ"ג של קנבינואיד על ידי חלוקתו ב-1000.
  6. מחלקים עם המשקל המקורי של החומר הצמחי (0.5 גרם) המשמש במיצוי לקבלת משקל יבש מ"ג/גרם.

4. אופטימיזציה באמצעות מתודולוגיית משטח התגובה

  1. קבעו את המודל, המורכב מ-15 ריצות ניסיוניות עם 12 נקודות פקטוריאליות ושלוש נקודות מרכז, כפי שמוצג בטבלה 4 באמצעות כלי לניתוח נתונים.
  2. מטב את פרמטרי החילוץ, זמן החילוץ (T), ריכוז הממס (S) ויחס המדגם/ממס (R) באמצעות מתודולוגיית משטח התגובה ותכנון מרוכב מרכזי. הגדר את טווח המשתנים T, S ו- R כ- 5-30 דקות, 20%-100% ו- 60-100 (1:X), בהתאמה.
  3. בחר את התשואה הכוללת של תמצית ליפופילית ואת התשואות של CBD מופק ו- CBDA כגורמי תגובה (RF).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הממסים המשמשים נעים בין אמצע מדד הקוטביות (0.460 - ACN) לקוטבי (1.000 - מים). מטבלה 2 ניתן לראות כי מים לא ייצרו מיצוי יעיל עבור קנבינואידים, דבר שאינו בלתי צפוי, שכן לקנבינואידים יש מסיסות מוגבלת במים בשל ההידרופוביות שלהם13. בניגוד למים, לממסים האחרים היו ערכים מופקים דומים של CBD ו-CBDA, כאשר לאצטוניטריל הממס הכי פחות קוטבי (ACN) היה מיצוי גבוה יותר בהשוואה לשני האלכוהולים. בעוד שמבחינה סטטיסטית הוא נמוך יותר, אתנול הצליח להפיק כמעט 93% ועלייה של 99% בקנבינואידים העיקריים CBDA המופקים על ידי ACN ומתנול, בהתאמה. יתר על כן, לתמצית האתנול היו הרמות הנמוכות ביותר של THCA, המבשר של Δ9-THC. רמות מופחתות של THCA היו רצויות על מנת להגביל את הפוטנציאל להמרה ל- Δ9-THC הפסיכוטרופי, דאגה ליישומים תעשייתיים16. בעוד שכל הממסים האורגניים נחשבים בדרך כלל לבטוחים (GRAS), רק לאתנול אין הגבלה על כמותו בתוצר הסופי2. ההבדל בין הערכים המתקבלים עבור אתנול ומתנול יצדיק שניתן יהיה להשתמש בכל אחד מהם, אולם הרעילות הנמוכה יותר של אתנול הופכת אותו לבחירה טובה יותר לשימוש מסחרי. כמו כן, בעוד ש-ACN הניב יותר קנבינואידים בתמצית, הרמות הנמוכות של שאריות ACN המותרות לא הצדיקו את השימוש בו לאור הטיהור הנוסף להסרת כמויות מזעריות כאשר היה רק עלייה של 7% בריכוז ה-CBDA.

בחינת ההשפעה שיש לתמיסת אתנול מימית על ריכוז הקנבינואידים מוצגת בטבלה 3. הוכח כי ריכוז התמיסה יכול להשפיע על יעילות המיצוי17,18. מיצוי הקנבינואידים באמצעות איחוד האמירויות הערביות אינו יוצא דופן. מיצוי מרבי נצפה בריכוז אתנול של 50%. מדובר בעלייה של 39.7% מעל 100% אתנול למיצוי CBDA. בנוסף, 50% אתנול גם הפחיתו את רמות ה-THCA שחולצו ב-20.3%.

כדי לאשר את התוצאות של מיטוב OFT, DoE (טבלה 4) באמצעות RSM נבדקה כפי שמוצג בטבלה 5. ניתוח RSM (איור 1) אישר מיצוי של 30 דקות ויחס דגימה לממס של 1:100. ניתוח ה-RSM הביא לריכוז אידיאלי של 53.4% אתנול במים. זה מאשר את 50% שהושגו על ידי OFT. בעוד שריכוז האתנול האופטימלי על ידי DoE נמצא מעט גבוה יותר מה-50% על ידי OFT, נעשה שימוש ב-50% אתנול בפרוטוקול בשל נוחות ההכנה שלו והירידה הזניחה במיצוי ה-CBDA/CBD הכולל.

התוצאות שהתקבלו באמצעות 50% אתנול עבור איחוד האמירויות הערביות הושוו לתוצאות שהתקבלו באמצעות 50% אתנול לצורך קירור (שקלו 0.5 גרם מאבקת תפרחת הקנאביס לתוך צינור של 50 מ"ל והוסיפו 50 מ"ל של 50% אתנול לכלי) בלבד כפי שמוצג בטבלה 6. כמות מיצוי ה-CBDA שהתקבלה הייתה גבוהה בכ-55% במדגם של איחוד האמירויות הערביות בהשוואה למדגם ה-maceration. בנוסף, חשוב לציין כי הייתה הכפלה של ריכוז ה-CBD שחולצה גם כן.

Figure 1
איור 1. גרף אופטימיזציה. גרף אופטימיזציה של משטח תגובה לזמן מיצוי, ריכוז ממס ויחס מדגם/ממס של קנאביס. הקו השחור מציין את ערך ה- y המתווה, הקו הכחול מציין את ערך ה- y המרבי, והערך המספרי שלו מוזכר גם בכחול, והקו האדום מציין את ערך ה- x כאשר ערך ה- y הוא המקסימום, והערכים המספריים עבור כל הפרמטרים הללו מוזכרים באדום בראש כל גרף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1. פרמטרים המשמשים לניתוח קנבינואידים HPLC. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2. קנבינואידים בודדים של תמציות המופקות מ-100% ממסים שנותחו על ידי HPLC (משקל יבש מ"ג/גרם). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3. קנבינואידים בודדים של תמציות המופקות מאתנול מימי נותחו על ידי HPLC (משקל יבש מ"ג/גרם). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 4. נתונים ניסיוניים על CBDA + CBD של קנאביס המבוססים על תכנון מרוכב מרכזי על ידי שיטת משטח תגובה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 5. משוואות פולינומיות המחושבות על ידי תוכנית RSM לתנאי מיצוי של קנאביס. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 6. מיצוי בסיוע קולי בהשוואה למיצוי מקרציה (ללא אולטרה-סונית) של כמות קנבינואידית בודדת (mg/g) בתמציות מממס אתנול 50%. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הקוטביות של ממס ממלאת תפקיד קריטי במיצוי יעיל של תרכובות. מאחר שקנבינואידים חומציים הם מעט קוטביים באופיים, בעיקר בשל החומצה הקרבוקסילית moiety, ההנחה הייתה שממס קוטבי כמו מתנול או אתנול יהיה היעיל ביותר. גארט והאנט19, במחקרם באמצעות THC, הראו כי מסיסות באתנול מימי התבססה על אחוז אתנול בתמיסה ועל חוזק יוני של התמיסה. אמנם העוצמה היונית לא נבחנה במחקר הנוכחי, אך ניתן להניח שהיא מילאה תפקיד חשוב ביעילות המיצוי המוגברת ב-50% אתנול. בנוסף, כפי שהודגם על ידי Garrett ו- Hunt19, ל- pH יש השפעה על המסיסות בתמיסות מימיות. מטקאלף20 גם מדגיש את החשיבות של pH כאשר הם הראו כי ה-pKa של קנאבידיול בתמיסה מימית היה בין 8.0 ל-8.5 בניגוד לדיווחים אחרים על כך שה-pKa היה בין 9.13 ל-9.64.

תמיכה נוספת בשימוש בתמיסות מימיות היא הנוהג של מיצוי ללא ממסים באמצעות מים. התהליך כולל את ההעתקה הדינמית של הקנאביס כדי לסלק את הטריכומים מהחומר הצמחי21. לאחר מכן ניתן לייבש את הטריכומים ואת חומר המיצוי כדי ליצור מוצר גיבוב זמין לעיבוד נוסף. במחקר הנוכחי, השימוש באיחוד האמירויות מספק את האמצעים לשחרור תוכן הטריכומס. שימוש בתמיסה מימית במקום במים מאפשר סולוביליזציה טובה יותר של הקנבינואידים החומציים. יתרון נוסף הקשור לאיחוד האמירויות הערביות הוא יכולתה לחלץ ולשמר את הקנבינואידים החומציים בצורתם המקורית22. Lewis-Bakker et al.22 גם הוכיחו כי איחוד האמירויות הערביות יעילה יותר בחילוץ CBDA מאשר SFE או soxhlet.

Brighenti et al.23 מצאו בקנבוס שאינו דה-קרבוקסילציה כי לא היה הבדל משמעותי בקנבינואידים בודדים שהופקו על ידי מספר טכניקות עם אתנול בטמפרטורת החדר שתפקד מעט טוב יותר כממס מיצוי. כתוצאה מכך, מחקר Brighenti23 והמחקר הנוכחי השתמשו שניהם באתנול כממס הבחירה. הבחירה באתנול במחקר זה נתמכה עוד יותר על ידי שיטות העיבוד הצפויות במורד הזרם שיש להשתמש בהן. הבחירה של אתנול תואמת את תהליך החורף שיש להשתמש בו ומאפשרת ריכוז של תמצית וטיהור באמצעות שיטות כגון פלאש או כרומטוגרפיית מחיצה צנטריפוגלית3. בנוסף, כל כמות מזערית של אתנול אינה מדאיגה בשל המגבלות המקובלות הקשורות לשימוש בו24.

ריכוז הממסים משפיע על תהליך המיצוי ונקבע כגורם החשוב ביותר בפרוטוקול. דילול של ממס אורגני במים מייצר ממס בעל קוטביות שונה ולעיתים תכונות פיסיקוכימיות משתנות. למים עם קוטביות של 1.00 יש תכונות ייחודיות בכך שככל שהטמפרטורה עולה, הקבוע הדיאלקטרי יורד וכך גם הקוטביות5. בנוסף, עלייה בטמפרטורה מפחיתה את מתח הפנים והצמיגות, ובכך משפרת את החדירה של המטריצה17. לבסוף, עלייה בטמפרטורת המים משפרת את דיפוזיית האנליטים ואת הקינטיקה של העברת המסה של מיצוי17. הכוח העיקרי באיחוד האמירויות הערביות הוא גלים על-קוליים שמייצרים חום באמצעות דחיסה ושחרור משינויים בלחץ הקול. הטמפרטורות הגבוהות שחוותה בתוך הבועות מתמתנות על ידי נוכחות של אלכוהול כפי שנראה על ידי Rae25. נוכחות של אלכוהול בבועה מגדילה את קיבולת החום של התערובת הגזית25. כתוצאה מכך, זה משפר את יכולת המיצוי של מים, וגם גורם לעשיית קוויטציה של מיקרו-בועות, ובכך משבש את דפנות התאים ומאפשר מיצוי קל יותר של ממסים.

הספרות מכילה שיטות מרובות למיצוי קנבינואידים 4,17,26,27,28. שיטות קונבנציונליות, כגון מקרציה באתנול (ללא אולטרה-סוניקציה), עדיין נמצאות בשימוש נרחב בשל הקלות שלהן והעלויות הכרוכות בשיטות מודרניות, כגון נוזל סופר-קריטי21. מיצוי בסיוע אולטרסאונד מספק את ההזדמנות לשפר את שיטות מיצוי הממסים הקונבנציונליות באמצעות טכניקת מיצוי מודרנית שנועדה לשפר את התפוקה. מיצוי בסיוע אולטרסאונד מאפשר שימוש בממסים ירוקים (כלומר, מים, אתנול וכו'), יבולים משופרים והפחתת זמן ועלויות. השימוש באיחוד האמירויות כטיפול מקדים לטכניקות חילוץ אחרות עדיין לא נחקר באופן נרחב. עם זאת, עלייה של 24% בתפוקת התמצית הגולמית הושגה באמצעות איחוד האמירויות הערביות לפני מיצויסוקשל 28, ובכך הדגימה את הפוטנציאל לשיטות מיצוי משולבות. השיטה המוצעת כיום מתמקדת במיצוי של קנבינואידים חומציים מקנבוס תעשייתי תוך שימוש באיחוד האמירויות בלבד, אולם הפוטנציאל לניצול נוסף בשילוב עם שיטות מיצוי חלופיות וקונבנציונליות אחרות מספק נתיבים מעניינים למחקר עתידי.

באופן חד משמעי, ממחקר זה, נקבע כיצד ממסים שונים של מיצוי ויחסי ממס מיצוי משפיעים על מיצוי קנבינואידים. מתודולוגיית איחוד האמירויות הערביות שימשה לבחינת ממסים נבחרים, המבוססים על כמויות מותרות במוצר הסופי, עבור יישום פוטנציאלי בתעשייה. בהתבסס על ממצאים אלה, תעסוקה באיחוד האמירויות הביאה למיצוי גבוה יותר של קנבינואידים בהשוואה לתפיחה. בנוסף, נצפה באמצעות DoE ו-RSM כי 53.4% אתנול נמצא כבעל מיצוי גבוה יותר של קנבינואידים בהשוואה לריכוזי אתנול אחרים. כתוצאה מכך, ממצאים אלה מצביעים על כך שאיחוד האמירויות הערביות יעילה כאמצעי להגברת מיצוי הקנבינואידים ולכן יש לבחון אותה לעומק בקיבולת התעשייתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי המכון לחקר הקנאביס באוניברסיטת המדינה של קולורדו-פואבלו, מענק קרן החדשנות של קוריאה שמומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT) (2021-DD-UP-0379), והעיר צ'ונצ'און (מו"פ ותיעוש קנבוס, 2020-2021).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile J.K.Baker 9017-88 solvent
Cannabichromene Cerilliant C-143 Cannabinoids standard
Cannabidiol Cerilliant C-045 Cannabinoids standard
Cannabidiolic acid Cerilliant C-144 Cannabinoids standard
Cannabidivarin Cerilliant C-140 Cannabinoids standard
Cannabigerol Cerilliant C-141 Cannabinoids standard
Cannabinol Cerilliant C-046 Cannabinoids standard
Centrifuge Hanil Scientific Inc Supra 22K Centrifuge
Cherry Wine hemp CFH, Ltd. - Flower extraction material
Distilled water TEDIA WS2211-001 solvent
Ethanol TEDIA ES1431-001 solvent
Filter paper Whatman #2 Filtering
Grinder Daesung Artlon DA280-S Milling
HPLC Shimadzu LC-10 system Analysis of Cannabinoid
Methanol TEDIA MS1922-001 solvent
Minitab 16.2.0 Minitab Inc.
Syringe filters Whatman 6779-1304 Filtering
Tetrahydrocannabivarin Cerilliant T-094 Cannabinoids standard
Trifluoroacetic acid Sigma-aldrich 302031-1L HPLC flow solvent
Untrasonic bath Jinwoo 4020P Ultrasonic extraction
Zorbax Eclipse plus C18 HPLC column Agilent 9599990-902 HPLC column
Δ8 - Tetrahydrocannabinol Cerilliant T-032 Cannabinoids standard
Δ9 - Tetrahydrocannabinol Cerilliant T-005 Cannabinoids standard
Δ9 - Tetrahydrocannabinolic acid Cerilliant T-093 Cannabinoids standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hemphill, J. K., Turner, J. C., Mahlberg, P. G. Cannabinoid content of individual plant organs from different geographical strains of Cannabis sativa L. Journal of Natural Products. 43 (1), 112-122 (1980).
  2. Baldino, L., Scognamiglio, M., Reverchon, E. Supercritical fluid technologies applied to the extraction of compounds of industrial interest from Cannabis sativa L. and to their pharmaceutical formulations: A review. Journal of Supercritical Fluids. 165, 104960 (2020).
  3. Daniel, R. G., et al. Supercritical extraction strategies using CO2 and ethanol to obtain cannabinoid compounds from cannabis hybrid flowers. Journal of CO2 Utilization. 30, 241-248 (2019).
  4. Azmir, J., et al. Techniques for extraction of bioactive compounds from plant materials: A review. Journal of Food Engineering. 117 (4), 426-436 (2013).
  5. Ohl, C. D., Kurz, T., Geisler, R., Lindau, O., Lauterborn, W. Bubble dynamics, shock waves and sonoluminescence. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 357 (1751), 269-294 (1999).
  6. Castro-Puyana, M., Marina, M. L., Plaza, M. Water as green extraction solvent: Principles and reasons for its use. Current Opinion in Green and Sustainable Chemistry. 5, 31-36 (2017).
  7. Herrera, M. C., De Castro, M. L. Ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from strawberries prior to liquid chromatographic separation and photodiode array ultraviolet detection. Journal of Chromatography A. 1100 (1), 1-7 (2005).
  8. Mason, T. J., Paniwnyk, L., Lorimer, J. P. The uses of ultrasound in food technology. Ultrasonics Sonochemistry. 3 (3), 253-260 (1996).
  9. Soares, V. P., et al. Ultrasound assisted maceration for improving the aromatization of extra-virgin olive oil with rosemary and basil. Food Research International. 135, 109305 (2020).
  10. Kshitiz, K., et al. Ultrasound assisted extraction (UAE) of bioactive compounds from fruit and vegetable processing by-products: A review. Ultrasinics Sonochemistry. 70, 105325 (2017).
  11. Mudge, E. M., Murch, S. J., Brown, P. N. Leaner and greener analysis of cannabinoids. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (12), 3153-3163 (2017).
  12. De Vita, D., et al. Comparison of different methods for the extraction of cannabinoids from cannabis. Natural Product Research. 34 (20), 2952-2958 (2020).
  13. Rožanc, J., et al. Different Cannabis sativa extraction methods result in different biological activities against a colon cancer cell line and healthy colon cells. Plants. 10 (3), 566 (2021).
  14. Karğili, U., Aytaç, E. Supercritical fluid extraction of cannabinoids (THC and CBD) from four different strains of cannabis grown in different regions. The Journal of Supercritical Fluids. 179, 105410 (2022).
  15. Sushma, C., et al. Optimization of ultrasound-assisted extraction (UAE) process for the recovery of bioactive compounds from bitter gourd using response surface methodology (RSM). Food and Bioproducts Processing. 120, 120-122 (2022).
  16. David, J. P., et al. Potency of Δ9-THC and Other Cannabinoids in Cannabis in England in 2005: Implications for Psychoactivity and Pharmacology. Journal of Forensic Sciences. 11, 129 (2008).
  17. Agarwal, C., Máthé, K., Hofmann, T., Csóka, L. Ultrasound-assisted extraction of cannabinoids from Cannabis Sativa L. optimized by response surface methodology. Journal of Food Science. 83 (3), 700-710 (2018).
  18. Oroian, M., Ursachi, F., Dranca, F. Influence of ultrasonic amplitude, temperature, time and solvent concentration on bioactive compounds extraction from propolis. Ultrasonics Sonochemistry. 64 (2020), 105021 (2020).
  19. Garrett, E. R., Hunt, A. Physiochemical properties, solubility, and protein binding of Δ9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmaceutical Sciences. 63 (7), 1056-1064 (1974).
  20. Metcalf, D. G. Chemical Abstracts. United States patent. , US10555914 267166 (2020).
  21. Lazarjani, M. P., Young, O., Kebede, L., et al. Processing and extraction methods of medicinal cannabis: a narrative review. Journal of Cannabis Research. 3 (1), 1-15 (2021).
  22. Lewis-Bakker, M. M., Yang, Y., Vyawahare, R., Kotra, L. P. Extractions of medical cannabis cultivars and the role of decarboxylation in optimal receptor responses. Cannabis and Cannabinoid Research. 4 (3), 183-194 (2019).
  23. Brighenti, V., Pellati, F., Steinbach, M., Maran, D., Benvenuti, S. Development of a new extraction technique and HPLC method for the analysis of non-psychoactive cannabinoids in fibre-type Cannabis sativa L.(hemp). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 143, 228-236 (2017).
  24. FDA. , Available from: https://www.cfsanappsexternal.fda.gov/scripts/fdcc/?set=SCOGS (2021).
  25. Rae, J., et al. Estimation of ultrasound induced cavitation bubble temperatures in aqueous solutions. Ultrasonics Sonochemistry. 12, 325-329 (2005).
  26. Moreno, T., Montanes, F., Tallon, S. J., Fenton, T., King, J. W. Extraction of cannabinoids from hemp (Cannabis sativa L.) using high pressure solvents: An overview of different processing options. Journal of Supercritical Fluids. 161, 104850 (2020).
  27. Zhang, Q. W., Lin, L. G., Ye, W. C. Techniques for extraction and isolation of natural products: a comprehensive review. Chinese Medicine. 13 (20), 1-26 (2018).
  28. Fathordoobady, F., Singh, A., Kitts, D. D., Singh, A. P. Hemp (Cannabis sativa L.) extract: Anti-microbial properties, methods of extraction, and potential oral delivery. Food Reviews International. 35 (7), 664-684 (2019).

Tags

ביוכימיה גיליון 183
מיצוי בסיוע קולי של חומצה קנבידיולית <em>מביומסת קנאביס</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Olejar, K. J., Hong, M., Lee, S. Y., … More

Olejar, K. J., Hong, M., Lee, S. Y., Kwon, T. H., Lee, S. U., Kinney, C. A., Han, J. H., Park, S. H. Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass. J. Vis. Exp. (183), e63076, doi:10.3791/63076 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter