Summary
A extração ultrassônica assistida (EAU) aumenta a eficiência de extração de solventes e, quando aplicada à cannabis spp. biomassa, reduz o tempo necessário para a extração. Isso diminui o custo e a perda potencial de canabinoides devido à degradação. Além disso, os Emirados Árabes Unidos são considerados um método verde devido ao baixo uso de solventes.
Abstract
O cânhamo industrial (Cannabis spp.) tem muitos compostos de interesse com potenciais benefícios médicos. Desses compostos, os canabinóides chegaram ao centro das atenções, especificamente canabinóides ácidos. O foco está se voltando para canabinóides ácidos devido à falta de atividade psicotrópica. Plantas de cannabis produzem canabinóides ácidos com plantas de cânhamo produzindo baixos níveis de canabinoides psicotrópicos. Como tal, a utilização do cânhamo para extração ácida de canabinoides eliminaria a necessidade de descarboxingação antes da extração como fonte para os canabinóides. O uso da extração à base de solventes é ideal para a obtenção de canabinoides ácidos, pois sua solubilidade em solventes como o CO2 supercrítica é limitada devido à alta pressão e temperatura necessária para atingir suas constantes de solubilidade. Um método alternativo projetado para aumentar a solubilidade é a extração assistida por ultrassom. Neste protocolo, foi examinado o impacto da polaridade solvente (acetonitrilo 0,46, etanol 0,65, metanol 0,76 e água 1,00) e concentração (20%, 50%, 70%, 90% e 100%) na eficiência de extração assistida por ultrassom. Os resultados mostram que a água foi a menos eficaz e a acetonitrila foi o solvente mais eficaz examinado. O etanol foi examinado ainda mais, pois tem a menor toxicidade e é geralmente considerado seguro (GRAS). Surpreendentemente, 50% de etanol na água é a concentração de etanol mais eficaz para extrair a maior quantidade de canabinóides do cânhamo. O aumento da concentração de ácido canabidílico foi de 28% em relação ao 100% etanol, e 23% quando comparado com 100% de acetonitrilo. Embora tenha sido determinado que 50% do etanol é a concentração mais eficaz para nossa aplicação, o método também tem demonstrado ser eficaz com solventes alternativos. Consequentemente, o método proposto é considerado eficaz e rápido para a extração de canabinoides ácidos.
Introduction
O cânhamo industrial (Cannabis spp.) produz canabinoides ácidos em diversos tecidos vegetais (flores, folhas e caules), com a maior concentração encontrada na flor1. A indústria da Cannabis utiliza vários métodos para extrair esses compostos. Um desses métodos é a extração de solventes que utiliza um solvente não polar e/ou polar, do qual o etanol é o mais utilizado. No entanto, a extração de solventes por si só é limitada em sua capacidade; portanto, técnicas de extração aumentada, como extração assistida por micro-ondas (MAE) e extração assistida por ultrassom (EAU), são projetadas para aumentar o rendimento. Além disso, o canabidiol de alta concentração (CBD) pode ser extraído usando tecnologias de fluidos supercríticos2.
A extração é um processo dinâmico, e vários fatores influenciam sua eficiência, ou seja, teor de umidade, tamanho de partículas e solvente3. Especificamente, para a técnica dos Emirados Árabes Unidos, a eficiência é regida pela temperatura, pressão, frequência e tempo4.
Extração ultrassônica assistida é o processo onde ondas ultrassônicas são passadas através de um líquido para agitar partículas. Durante o processo de agitação, os materiais vegetais experimentam cavitação acústica, ciclos de compressão e expansão que formam bolhas que colapsam em solução resultando na geração de temperatura extrema e pressão5. As mudanças de pressão e temperatura alteram as propriedades físicas dos solventes, o que pode resultar em maior eficácia da extração6. Além disso, a cavitação pode interromper as interações moleculares que levam a compostos orgânicos e inorgânicos que lixiviam da matriz vegetal7. O processo envolve dois tipos principais de fenômenos físicos: (1) difusão através da parede celular, e (2) enxaguar o conteúdo celular após quebrar a parede8. No entanto, o uso dos Emirados Árabes Unidos não é sem suas armadilhas; há vários relatos de que os Emirados Árabes Unidos podem degradar compostos 9,10. Além disso, as temperaturas geradas nos locais de cavitação estão acima das necessárias para a descarboxingação de canabinóides. No entanto, Mudge et al.11 usaram os Emirados Árabes Unidos e não observaram grande descarboxingação de CBD ou tetrahidrocanabinol (THC), demonstrando assim que os Emirados Árabes Unidos são um método eficiente e verde para a extração de canabinoides, uma vez que podem ser extraídos rapidamente usando baixa energia.
De Vita et al.12 examinaram especificamente o uso de métodos MAE e Emirados Árabes Unidos e descobriram que, ao aplicar as condições ideais para cada método, os Emirados Árabes Unidos extrairam mais do CBD ácido e neutro e THC presente no material vegetal. Da mesma forma, Rožanc et al.13 compararam múltiplos métodos de extração (Emirados Árabes Unidos, soxhlet, maceração e fluido supercrítico) e examinaram a atividade biológica dos extratos. Rožanc demonstrou que todos os métodos foram eficazes na extração de canabinoides; no entanto, fluido supercrítico e Emirados Árabes Unidos foram mais eficazes na extração de ácido canabidiolico (CBDA). Além disso, a extração dos Emirados Árabes Unidos teve a maior atividade biológica quando medida pelo ensaio 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH). O estudo de Rožanc também mostrou que, embora os processos de extração sejam eficazes na produção de extratos brutos, permanece uma porção de compostos não canabinoides que influenciam a atividade biológica dos extratos. Além disso, esses compostos podem complicar o isolamento e purificação de compostos canabinoides individuais dos extratos brutos13.
Técnicas de extração de fluidos supercríticos (SFE) têm sido usadas para extrair canabinoides neutros. Vários estudos demonstraram que a SFE mais um solvente orgânico, como o etanol, resultou em maior eficiência de extração de canabinóides neutros 2,3. Quando a pressão foi aumentada para níveis capazes de extrair os canabinoides ácidos, o conteúdo não canabinoide também aumentou. Como tal, essas altas pressões não são práticas para o processamento industrial, pois a seletividade da SFE para canabinoides diminuiu e é necessário um pós-processamento adicional. Consequentemente, a descarboxingação deve ser feita antes da SFE, o que pode resultar em perdas canabinoides de até 18%2. Para aumentar a eficiência na SFE, foi combinado com técnicas como extração em fase sólida para aumentar a pureza do extrato final14. No entanto, apesar de ter alta pureza como produto final, apenas canabinoides neutros são obtidos.
Tradicionalmente, no laboratório analítico, os canabinóides eram extraídos em uma mistura de metanol:clorofórmio 9:1. No entanto, Mudge et al.11 demonstraram que a extração efetiva pode ser realizada com solventes únicos ao empregar os Emirados Árabes Unidos. O estudo mostrou que 80% de metanol foi tão eficaz quanto a tradicional extração de metanol 9:1:clorofórmio, indicando assim que solventes mais verdes podem ser tão eficazes. Como tal, os Emirados Árabes Unidos foram examinados por seu potencial uso devido a vários benefícios, incluindo baixo custo de capital, redução do tempo de extração e menor uso de energia e volumes de solventes. No entanto, no caso dos Emirados Árabes Unidos, quando solventes polares são usados, clorofila e outros não-canabinóides podem ser extraídos, o que pode causar um problema na cor7. Consequentemente, para examinar o potencial de obtenção de canabinoides ácidos em escala comercial, os Emirados Árabes Unidos foram empregados usando a variedade industrial de cânhamo Cherry Wine. Cherry Wine é um híbrido de C. sativa e C. indica, um cruzamento entre as variedades de The Wife e Charlotte's Cherries. A variedade Cherry Wine é uma cepa de produção de CBDA alta (15% a 25% CBD) com baixos níveis de ácido tetrahidrocanabinolic (THCA). A variedade é uma cepa C. indica-dominate que tem de 7 a 9 semanas de floração.
Para estabelecer o protocolo de extração ideal dos Emirados Árabes Unidos, foram tomadas duas abordagens: o fator tradicional de cada vez (OFT) e uma abordagem de Design of Experiment (DoE) usando um Design Composto Central (CCD)15. Para o DoE, a extração CBDA/CBD foi otimizada com base na relação amostra/solvente, tempo de extração e concentração de solventes como fatores, e os dados resultantes foram analisados pela Response Surface Methodology (RSM). Em conclusão, o protocolo descrito descreve o método ideal para extrair a maior quantidade de CBDA/CBD.
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Protocol
1. Preparação do material vegetal
- Obtenha inflorescências de Cerejeira de plantas cultivadas no campo, plantadas em uma configuração sul-norte, com plantas de 1 m de distância no centro e fileiras de 1,2 m de distância (cultivo localizado em Longmont, Colorado, EUA).
- Seque as inflorescências a 35 °C por 48 h. Triture as inflorescências usando uma máquina de moagem de 177 μm.
- Passe o material pulverizado através da peneira de malha nº 80. Armazene o pó resultante em um saco selado à temperatura ambiente para uso futuro.
2. Extração de ultrassom
- Pesar 0,5 g do pó de inflorescência da Cannabis em um tubo cônico de 50 mL. Adicione 40 mL do solvente (por exemplo, 50% de etanol em água deionizada) ao navio.
- Coloque o recipiente de extração no banho ultrassônico a 40 kHz e à temperatura ambiente (a potência de sônica é de 100 W).
- Realize a extração no banho ultrassônico por 30 minutos, aumentando a temperatura do banho de 25 °C para 30 °C.
- Decante o fluido de extração em um tubo de centrífuga.
- Centrifugar o fluido a 3.000 x g a 15 °C por 15 min. Filtre o sobrenatante sob vácuo através de um papel filtro de 8 μm.
3. Análise quantitativa de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)
- Diluir sete padrões canabinóides: canabirómene (CBC), CBD, CBDA, canabinol (CBN), tetrahidrocanabinolic (THCA), Δ8-THC e Δ9-THC para concentrações operacionais de 100, 50, 25 e 12,5 μg/mL em 100% de metanol. Misture e sonicate por 5 min em um conjunto de banho ultrassônico a 40 kHz e potência de sônica de 100 W
- Filtre as normas através de um filtro de seringa de politefluoroetileno de 0,45 μm (PTFE). Filtre a amostra sobrenatante (a partir da etapa 2.5) através de um filtro de seringa PTFE de 0,45 μm.
- Coloque a amostra a ser analisada em um frasco de 1,5 mL no autosampler HPLC e carregue 10 μL de cada vez.
- Execute o HPLC de acordo com as condições e parâmetros fornecidos na Tabela 1. Derivar concentrações canabinoides em 50-200 μg/mL a partir da curva padrão gerada.
- Multiplique com o volume do solvente (40 mL) utilizado no processo de extração para obter μg de canabinoide. Converta o μg de canabinoide em mg de canabinoide dividindo-o por 1000.
- Divida com o peso original do material vegetal (0,5 g) utilizado na extração para obter mg/g de peso seco.
4. Otimização utilizando metodologia de superfície de resposta
- Estabeleça o modelo, composto por 15 corridas experimentais com 12 pontos de fatorial e três pontos centrais, como mostrado na Tabela 4 , utilizando uma ferramenta de análise de dados.
- Otimize os parâmetros de extração, tempo de extração (T), concentração de solventes (S) e razão amostra/solvente (R) utilizando metodologia de superfície de resposta e design composto central. Definir a faixa das variáveis T, S e R como 5-30 min, 20%-100% e 60-100 (1:X), respectivamente.
- Selecione o rendimento total do extrato lipofílico e os rendimentos de CBD e CBDA extraídos como fatores de resposta (RF).
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Representative Results
Os solventes utilizados variam do médio do índice de polaridade (0,460 - ACN) ao polar (1.000 - água). A partir da Tabela 2, pode-se ver que a água não fez um extrator eficaz para os canabinoides, o que não é inesperado, pois os canabinóides têm solubilidade limitada na água devido à sua hidroofobidade13. Em contraste com a água, os outros solventes apresentaram valores extraídos similares de CBD e CBDA, com o menor acetonitrilo solvente polar (ACN) tendo maior extração quando comparado com os dois álcoois. Embora estatisticamente menor, o etanol foi capaz de extrair quase 93% e 99% de aumento na CBDA canabinoide maior extraído pela ACN e metanol, respectivamente. Além disso, o extrato de etanol apresentou os níveis mais baixos de THCA, o precursor de Δ 9-THC. Foram desejados níveis reduzidos de THCA para limitar o potencial de conversão ao psicotrópico Δ 9-THC, uma preocupação para as aplicações industriais16. Embora todos os solventes orgânicos sejam geralmente considerados seguros (GRAS), apenas o etanol não tem limitação à sua quantidade no produto final2. A diferença entre os valores obtidos para o etanol e o metanol garantiria que qualquer um deles pudesse ser utilizado, no entanto, a menor toxicidade do etanol torna-o uma melhor escolha para uso comercial. Da mesma forma, enquanto a ACN produziu mais canabinóides no extrato, os baixos níveis de ACN residual permitidos não justificavam seu uso à luz da purificação adicional para remover quantidades de vestígios quando havia apenas um ganho de 7% na concentração de CBDA.
O exame do impacto que uma solução aquosa de etanol tem na concentração de canabinoides é mostrado na Tabela 3. Foi demonstrado que a concentração da solução pode influenciar a eficiência de extração 17,18. A extração de canabinóides usando os Emirados Árabes Unidos não é exceção. A extração máxima foi observada na concentração de 50% de etanol. Isso representa um aumento de 39,7% em relação ao etanol de 100% para a extração da CBDA. Além disso, 50% do etanol também reduziu os níveis de THCA extraídos em 20,3%.
Para confirmar os resultados da otimização do OFT, o DoE (Tabela 4) utilizando RSM foi examinado conforme mostrado na Tabela 5. A análise RSM (Figura 1) confirmou uma extração de 30 min e uma relação amostra de 1:100 para solvente. A análise do RSM resultou em uma concentração ideal de 53,4% de etanol na água. Isso confirma os 50% obtidos pelo OFT. Enquanto a concentração ideal de etanol pelo DoE foi encontrada ligeiramente superior aos 50% por OFT, 50% de etanol foi utilizado no protocolo devido à sua conveniência de preparação e à diminuição insignificante da extração global cbda/cbd.
Os resultados obtidos utilizando 50% de etanol para os Emirados Árabes Unidos foram comparados aos resultados obtidos utilizando 50% de etanol para maceração (pesar 0,5 g do pó de inflorescência da Cannabis em um tubo de 50 mL e adicionar 50 mL de 50% de etanol ao navio) sozinho como mostrado na Tabela 6. A quantidade de extração resultante da CBDA foi cerca de 55% maior na amostra dos Emirados Árabes Unidos em comparação com a amostra de maceração. Além disso, é importante notar que houve uma duplicação da concentração de CBD extraída também.
Figura 1. Gráfico de otimização. Gráfico de otimização de uma superfície de resposta para tempo de extração, concentração de solventes e razão amostra/solvente da Cannabis. A linha preta indica o valor y plotado, a linha azul indica o valor máximo y, e seu valor numérico também é mencionado em azul, e a linha vermelha indica o valor x quando o valor y é o máximo, e os valores numéricos para todos esses parâmetros são mencionados em vermelho na parte superior de cada gráfico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Mesa 1. Parâmetros utilizados para análise canabinoide HPLC. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Mesa 2. Canabinóides individuais de extratos derivados de solventes 100% analisados pelo HPLC (peso seco mg/g). Clique aqui para baixar esta Tabela.
Mesa 3. Canabinóides individuais de extratos derivados de etanol aquoso foram analisados pelo HPLC (mg/g peso seco). Clique aqui para baixar esta Tabela.
Mesa 4. Dados experimentais sobre CBDA + CBD da Cannabis baseados no design composto central por método de superfície de resposta. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Mesa 5. Equações polinômias calculadas pelo programa RSM para condições de extração da Cannabis. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Mesa 6. Extração ultrassônica assistida em comparação com a extração de maceração (sem ultrassônico) de quantidade individual de canabinoide (mg/g) em extratos de 50% de solvente de etanol. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
A polaridade de um solvente desempenha um papel crítico na efetiva extração de compostos. Uma vez que as canabinóides ácidas são ligeiramente polares na natureza, devido em grande parte à moiety ácido carboxílico, assumiu-se que um solvente polar como o metanol ou o etanol seria mais eficaz. Garrett e Hunt19, em seu estudo usando THC, demonstraram que a solubilidade no etanol aquoso foi baseada em percentual de etanol na solução e força iônica da solução. Embora a força iônica não tenha sido examinada no presente estudo, pode-se supor que ela desempenhou um papel importante no aumento da eficiência extração em 50% do etanol. Além disso, como demonstrado por Garrett e Hunt19, o pH tem um impacto na solubilidade em soluções aquosas. Metcalf20 também enfatiza a importância do pH onde eles mostraram que o pKa de canabidiol em solução aquosa foi entre 8,0 e 8,5 em contraste com outros relatos da pKa sendo de 9,13 a 9,64.
Apoiar ainda mais o uso de soluções aquosas é a prática de extração sem solventes usando água. O processo envolve a maceração dinâmica da Cannabis para desalojar os trichomes do material vegetal21. Os trichomes e extrator podem então ser secos para resultar em um produto hash disponível para posterior processamento. No presente estudo, o uso dos Emirados Árabes Unidos fornece os meios para a liberação dos conteúdos de trichomes. Utilizar uma solução aquosa em vez de água permite uma melhor solubilização dos canabinoides ácidos. Um benefício adicional associado aos Emirados Árabes Unidos é sua capacidade de extrair e reter os canabinoides ácidos em sua forma original22. Lewis-Bakker et al.22 também demonstraram que os Emirados Árabes Unidos foram mais eficientes na extração da CBDA do que a SFE ou soxhlet.
Brighenti et al.23 encontraram no cânhamo não descarboxilado que não houve diferença significativa nos canabinoides individuais extraídos por várias técnicas com etanol de temperatura ambiente com desempenho ligeiramente melhor como solvente de extração. Consequentemente, o estudo Brighenti23 e o presente estudo utilizaram o etanol como solvente de escolha. A escolha do etanol neste estudo foi ainda apoiada pelos métodos de processamento a jusante previstos a serem empregados. A seleção do etanol é compatível com o processo de inverno a ser empregado e permite a concentração do extrato e purificação utilizando métodos como cromatografia de partição flash ou centrífuga3. Além disso, quaisquer vestígios de etanol não são preocupantes devido aos limites aceitáveis associados ao seu uso24.
A concentração de solventes influencia o processo de extração e foi determinado como o fator mais importante no protocolo. A diluição de um solvente orgânico com água produz um solvente com uma polaridade modificada e às vezes propriedades físico-químicas modificadas. A água com uma polaridade de 1,00 tem características únicas, pois à medida que a temperatura aumenta, a constante dielétrica diminui e a polaridade5 também. Além disso, um aumento na temperatura reduz a tensão e a viscosidade da superfície, melhorando assim a penetração da matriz17. Por fim, um aumento na temperatura da água melhora a difusão de analitos e a cinética de transferência de massa de uma extração17. A principal força nos Emirados Árabes Unidos são ondas ultrassônicas que geram calor via compressão e liberam de mudanças de pressão sonora. As altas temperaturas experimentadas dentro das bolhas são atenuadas pela presença de álcool como visto por Rae25. A presença de álcool na bolha aumenta a capacidade de calor da mistura gasosa25. Consequentemente, isso melhora a extrabilidade da água, e também causa a cavitação de micro-bolhas, interrompendo assim as paredes celulares permitindo uma extração mais fácil do solvente.
A literatura contém múltiplos métodos para a extração de canabinóides 4,17,26,27,28. Métodos convencionais, como a maceração no etanol (sem ultrassônica), ainda são amplamente utilizados devido à sua facilidade e aos custos associados aos métodos modernos, como o fluido supercrítico21. A extração assistida por ultrassom oferece a oportunidade de melhorar os métodos convencionais de extração de solventes com uma técnica de extração moderna projetada para aumentar o rendimento. A extração assistida por ultrassom permite o uso de solventes verdes (ou seja, água, etanol, etc.), rendimentos aprimorados e redução de tempo e custos. O uso dos Emirados Árabes Unidos como pré-tratamento para outras técnicas de extração ainda é amplamente inexplorado. No entanto, um aumento de 24% no rendimento do extrato bruto foi obtido usando os Emirados Árabes Unidos antes da extração de soxhlet28, demonstrando assim o potencial para métodos combinados de extração. O método atualmente proposto se concentra na extração de canabinóides ácidos a partir de cânhamo industrial utilizando apenas os Emirados Árabes Unidos, no entanto, o potencial de utilização adicional em combinação com outros métodos alternativos e convencionais de extração fornece caminhos interessantes para futuras pesquisas.
Conclusivamente, a partir deste estudo, foi estabelecido como várias razões de solventes de extração e solventes de extração afetam a extração de canabinoides. A metodologia dos Emirados Árabes Unidos foi empregada para examinar solventes selecionados, com base em quantidades permitidas no produto final, para aplicação potencial na indústria. Com base nesses achados, o emprego nos Emirados Árabes Unidos resultou em maior extração de canabinoides em comparação com a maceração. Além disso, observou-se utilizando DoE e RSM que 53,4% do etanol foi encontrado com maior extração de canabinóides em comparação com outras concentrações de etanol. Consequentemente, esses achados sugerem que os Emirados Árabes Unidos são eficazes como um meio de aumentar a extração de canabinoides e, portanto, devem ser examinados mais adiante na capacidade industrial.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto de Pesquisa da Cannabis da Universidade do Estado do Colorado-Pueblo, a bolsa da Korea Innovation Foundation financiada pelo governo coreano (MSIT) (2021-DD-UP-0379) e pela cidade de Chuncheon (Hemp P&D e industrialização, 2020-2021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | J.K.Baker | 9017-88 | solvent |
| Cannabichromene | Cerilliant | C-143 | Cannabinoids standard |
| Cannabidiol | Cerilliant | C-045 | Cannabinoids standard |
| Cannabidiolic acid | Cerilliant | C-144 | Cannabinoids standard |
| Cannabidivarin | Cerilliant | C-140 | Cannabinoids standard |
| Cannabigerol | Cerilliant | C-141 | Cannabinoids standard |
| Cannabinol | Cerilliant | C-046 | Cannabinoids standard |
| Centrifuge | Hanil Scientific Inc | Supra 22K | Centrifuge |
| Cherry Wine hemp | CFH, Ltd. | - | Flower extraction material |
| Distilled water | TEDIA | WS2211-001 | solvent |
| Ethanol | TEDIA | ES1431-001 | solvent |
| Filter paper | Whatman | #2 | Filtering |
| Grinder | Daesung Artlon | DA280-S | Milling |
| HPLC | Shimadzu | LC-10 system | Analysis of Cannabinoid |
| Methanol | TEDIA | MS1922-001 | solvent |
| Minitab 16.2.0 | Minitab Inc. | ||
| Syringe filters | Whatman | 6779-1304 | Filtering |
| Tetrahydrocannabivarin | Cerilliant | T-094 | Cannabinoids standard |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-aldrich | 302031-1L | HPLC flow solvent |
| Untrasonic bath | Jinwoo | 4020P | Ultrasonic extraction |
| Zorbax Eclipse plus C18 HPLC column | Agilent | 9599990-902 | HPLC column |
| Δ8 - Tetrahydrocannabinol | Cerilliant | T-032 | Cannabinoids standard |
| Δ9 - Tetrahydrocannabinol | Cerilliant | T-005 | Cannabinoids standard |
| Δ9 - Tetrahydrocannabinolic acid | Cerilliant | T-093 | Cannabinoids standard |
References
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