Summary
本文介绍了一种简单的方法，用于快速生产具有包封细胞骨架蛋白的巨型单层囊泡。该方法被证明可用于自下而上的细胞骨架结构在约束和细胞骨架 - 膜相互作用中的重建。
Abstract
巨型单层囊泡（GUV）经常被用作生物膜的模型，因此是 研究体外膜相关细胞过程的绝佳工具。近年来，GUV中的封装已被证明是细胞生物学和相关领域重建实验的有用方法。它更好地模拟活细胞内的限制条件，而不是传统的生化重建。在GUV内部封装的方法通常不容易实施，并且不同实验室的成功率可能会有很大差异。一种已被证明可以成功封装更复杂的蛋白质系统的技术称为连续液滴界面交叉封装（cDICE）。这里提出了一种基于cDICE的方法，用于在GUV中快速包封细胞骨架蛋白，具有高包封效率。在该方法中，首先，通过在脂质/油混合物中乳化感兴趣的蛋白质溶液来产生脂质 - 单层液滴。在被添加到旋转的3D打印室后，这些脂质单层液滴随后在腔室内的水/油界面处通过第二个脂质单层，形成含有蛋白质系统的GUV。该方法简化了GUV内封装的整体过程并加快了该过程，从而使我们能够限制和观察脂质双层囊泡内网络组装的动态演变。该平台对于研究禁闭中细胞骨架 - 膜相互作用的力学非常方便。
Introduction
脂质双层隔室用作模型合成细胞，用于研究封闭的有机反应和基于膜的过程，或用作药物递送应用中的载体模块1，2。具有纯化成分的自下而上的生物学需要最少的实验系统来探索生物分子（例如蛋白质和脂质）之间的性质和相互作用3，4。然而，随着该领域的进步，对更复杂的实验系统的需求增加，这些系统可以更好地模仿生物细胞中的条件。GUV中的包封是一种实用的方法，可以通过提供可变形和选择性渗透的脂质双层和有限的反应空间来提供一些这些细胞样特性。特别是，细胞骨架系统的 体外 重建，作为合成细胞的模型，可以从膜室5中的包封中受益。许多细胞骨架蛋白与细胞膜结合并相互作用。由于大多数细胞骨架组装形成跨越整个细胞的结构，因此它们的形状自然由细胞大小的限制6决定。
使用不同的方法来产生GUV，例如溶胀7，8，小囊泡融合9，10，乳液转移11，12，脉冲喷射13，以及其它微流体方法14，15。尽管这些方法仍在使用，但每种方法都有其局限性。因此，非常需要一种具有高GUV封装率的稳健而直接的方法。尽管诸如自发溶胀和电膨胀之类的技术被广泛用于GUV的形成，但这些方法主要与特定的脂质组合物16，低盐浓度缓冲液17，较小的封装胶分子尺寸18相容，并且需要大量封装胶。将多个小囊泡融合到GUV中本质上是不利于能量的，因此需要在带电脂质组合物9 和/或外部融合诱导剂（例如肽19或其他化学物质）中具有特异性。另一方面，乳液转移和微流体方法可能需要在双层形成后通过表面活性剂和溶剂去除来稳定液滴，分别为18，20。微流体技术（如脉冲喷射）中实验设置和装置的复杂性带来了额外的挑战21。cDICE是一种基于乳液的方法，其衍生自类似的支配乳液转移的原理22，23。水溶液（外溶液）和脂质油混合物在旋转圆柱形室（cDICE室）中通过离心力分层，形成脂质饱和界面。将脂质单层水滴穿梭到旋转的cDICE室中导致双层的拉链，因为液滴穿过脂质饱和界面进入外层水溶液22，24。cDICE方法是一种用于GUV封装的强大技术。使用所提出的改进方法，不仅可以实现cDICE典型的高囊泡产量，并且具有显着缩短的封装时间（几秒钟），而且允许观察时间依赖性过程（例如，肌动蛋白细胞骨架网络形成）的GUV生成时间显着降低。该方案从开始到GUV收集和成像大约需要15-20分钟。在这里，GUV的产生是使用修饰的cDICE方法包封肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白（ABP）来描述的。然而，所提出的技术适用于包封广泛的生物反应和膜相互作用，从生物聚合物的组装到无细胞蛋白质表达再到基于膜融合的货物转移。
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Protocol
1. 油脂混合物的制备
注意：该步骤需要在通风橱中按照处理氯仿的所有安全指南进行。
- 在15毫升玻璃小瓶中取0.5毫升氯仿。将88μL的25mg / mL二油酰基磷酸胆碱（DOPC），9.3μL的50mg / mL胆固醇和5μL的1mg / mL二分子酰基 - 磷酸乙醇胺 - 赖胺罗丹明B（罗丹明PE）（参见 材料表）加入15ml玻璃小瓶中。
注意：硅油/矿物油中DOPC和胆固醇的最终摩尔分数分别为69.9%和30%。确定20-30摩尔%胆固醇是使用所提出的技术25，26生成的GUV的膜流动性和稳定性的优化浓度。从生理学上讲，这些值完全在哺乳动物细胞质膜6中发现的胆固醇浓度范围内。脂质储备作为氯仿溶液获得并储存在-20°C。 脂质储备瓶在打开之前应适应室温。 - 将7.2 mL硅油和1.8 mL矿物油移液到第二个15 mL小瓶中（参见 材料表）。一般来说，这需要在低湿度的手套箱中完成，主要是在矿物油重复使用的情况下。
- 通过以最大转速（3200rpm）涡旋混合油10秒，将混合物加入含有氯仿脂质混合物的小瓶中，并立即将其置于涡旋混合器上。在最大转速 （3200 rpm） 下涡旋 10-15 秒。所得的油中脂质混合物应略微浑浊，因为脂质没有完全溶解在油中，而是分散为小聚集体24。
- 将油中脂质分散体置于浴式超声处理器（见 材料表）中，超声功率为80 W，工作频率为40 kHz，室温下30分钟。立即使用混合物或在4°C下储存最多24小时。
2. 囊泡生成
- 将黑色树脂制成的3D打印轴（补充文件1）安装在台式搅拌板上，并将转速设置为1200 rpm。
- 将由透明树脂制成的3D打印cDICE室（补充文件2）安装在轴上（图1A，B）。
- 分别制备肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白（ABP）溶液，总体积为20μL。
- 在球状肌动蛋白缓冲液（G缓冲液）中制备1-10μM肌动蛋白，包括10%ATTO 488肌动蛋白（见 材料表）。
注意：1x G缓冲液包括5 mM的Tris-HCl，pH 8.0和0.2 mM的CaCl2。 - 加入丝状肌动蛋白聚合缓冲液（F缓冲液）开始在冰上进行肌动蛋白聚合。在加入交联剂之前，将溶液保存在冰上以减缓肌动蛋白聚合。
注意：1x F缓冲液含有50 mM的KCl，2 mM的MgCl2和3 mM的ATP，10 mM的Tris，pH 7.5。 - 等待15分钟以允许在冰上启动肌动蛋白聚合，然后以所需的摩尔比加入感兴趣的交联剂。将溶液保存在冰上，直到封装。
- 在微管中分别制备肌动蛋白结合蛋白（ABPs）（图1C）。
注意：当ABPs（例如，肌球蛋白，α肌动蛋白，fascin，Arp2/3复合物）与肌动蛋白25，26，27组合封装时，执行此步骤。在这种情况下，从其库存中提取所需量的每个ABP并添加到指定用于ABP的微管中。由于总溶液为20μL，因此必须制备ABP的原液等分试样，以使总ABP混合物的所需量不超过5-6μL。此处代表性结果中使用的唯一ABP是fascin，其制备方法如下所述。- 从1.75mg / mL的fascin储备中等分1.57μL法菌素（参见 材料表），并在步骤2.7中直接加入到肌动蛋白溶液中。这相当于溶液中2.5μM的筋膜。
- 在球状肌动蛋白缓冲液（G缓冲液）中制备1-10μM肌动蛋白，包括10%ATTO 488肌动蛋白（见 材料表）。
- 在肌动蛋白溶液中加入7.5%的密度梯度介质（见 材料表），在外水相和内水相之间形成密度梯度，便于GUV沉降。
- 将700μL200mM葡萄糖的外溶液分配到腔室中（图1D，左）。
注意：内部溶液的渗透压决定了葡萄糖的浓度。对于这些实验，内溶液的渗透压约为200 mOsm，因此使用200 mM葡萄糖溶液作为外溶液。 - 向腔室中加入足够量的脂油混合物（根据腔室尺寸>3 mL），直到填充腔室的60%-80%（图1D，右）。在脂油混合物和外溶液之间将形成界面。
- 将ABPs（在步骤2.3.4中制备）转移到肌动蛋白溶液中。使用常规的100-1000μL移液器，立即将700μL脂质油混合物转移到肌动蛋白 - ABP混合物中（图1E，左）。上下移液8次，以产生细胞大小的脂质单层液滴，直径范围为7-100μm（图1E，中间）。
注：步骤2.7需要在几秒钟内完成，以避免封装前出现任何肌动蛋白网络组装。因此，在执行该步骤之前，请确保移液器吸头已插入移液器并准备转移混合物。 - 使用相同的100-1000μL移液器，立即将整个乳液分配到旋转室中。液滴将通过在油 - 外溶液界面处穿过脂质单层来获得第二个小叶，从而形成GUV（图1E，右）。
- 从搅拌板上取出腔室，并通过在废物容器中倾斜腔室来丢弃大部分脂油混合物，以便从腔室中心的大开口中排出大部分脂油混合物。
注意：通过这种方式，将脂质 - 油混合物从腔室中抽出，避免脂质 - 油混合物与下一步中的外部溶液混合。 - 握住腔室，其盖子朝向用户。打开腔室盖，将腔室向用户稍微倾斜。含有GUV的外溶液与脂油混合物之间的界面从腔室开口（盖子所在的位置）可见。
- 使用移液器，收集足够的含有GUV的外部溶液，并将50-300μL外部溶液分配到96孔板中以获得适当密度的GUV。
注意：按照该协议，在腔室内的外部溶液中总共释放约2 x 105 GUV。GUV分散性未量化;然而，大约90%的GUV的直径在12-30μm的范围内，在群体中可以找到任何直径在7-50μm范围内的GUV。根据孔板中封装的密度梯度介质，GUV尺寸和溶液深度，GUV在表面上沉降需要2-15分钟。具有重组肌动蛋白束的GUV的收率约为90%。
3. 成像和3D图像重建
- 将96孔板设置在配备旋转盘（或激光扫描）共聚焦单元，EMCCD或sCMOS相机以及油浸式60x物镜的倒置显微镜的载物台上（参见 材料表）。
- 聚焦于任何感兴趣区域 （ROI），并从 ROI 中获取 z 轴堆栈图像序列，z 步长间隔为 0.5 μm。
注意：由于GUV会随着时间的推移在表面上略微位移，因此如果对多个荧光团进行成像，建议在每个z平面上捕获一组多波长图像，即一次在每个z通道上拍摄一组561nm和488nm的图像，以捕获ATTO 488肌动蛋白和Rhod PE图像。 - 以.tiff格式保存每个 z 堆栈图像序列。
- 在图像处理软件（ImageJ/Fiji）中打开感兴趣的图像序列。识别具有最高强度的图像。按住“ctrl + shift + c”以打开“亮度和对比度”窗口，然后单击“ 重置”。
- 从 ImageJ/Fiji 菜单中，转到 分析>设置比例 ，然后输入每个图像像素的已知物理距离及其单位。
- 从 ImageJ/Fiji 菜单中，转到 Image > Stacks > 3D 项目 ，以从 z 堆栈重建 3D 图像。将“投影方法”设置为 亮度点，将“切片间距（μm）”设置为 0.5，并选中 插值。默认选项可用于其余设置。
注意：某些显微镜中的z区间可能没有校准，z方向的实际运动可能与输入的z区间略有不同（即0.5μm）。在这种情况下，可以使用3D校准样品（例如具有已知直径的荧光微球）来获得实际的z区间。因此，此值将用作 3D 投影的“切片间距 （μm）”。
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Representative Results
为了证明使用当前方案成功生成细胞骨架GUV，重建了GUV中的fascin-actin束结构。Fascin是肌动蛋白丝的短交联剂，其形成坚硬的平行排列的肌动蛋白束，并从 大肠杆菌 中纯化为谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白26。首先重构5 μM肌动蛋白，包括肌动蛋白聚合缓冲液中的0.53 μM ATTO488肌动蛋白和7.5%的密度梯度培养基。在以2.5μM的浓度加入筋膜并包封法氏菌素 - 肌动蛋白混合物时，在GUV中形成肌动蛋白束结构。在封装后1小时捕获罗丹明PE标记的GUV中封装的肌动蛋白束结构的Z-stack共聚焦图像序列（图2A）。使用该协议，封装的肌动蛋白交联剂，α肌动蛋白和fascin的固有竞争和分选，它们一起以GUV大小依赖性的方式形成不同的肌动蛋白束模式，先前已证明26。
与这里介绍的改良倒置乳液方法一样，传统的cDICE工艺产生具有高产量的细胞骨架GUV，但需要注射器泵和管道设置，以控制将蛋白质溶液以低流速注射到旋转室中，以纳升每秒22，28的数量级。在这种方法中，乳液直接在旋转的cDICE室中产生;在油相中插入薄毛细管。蛋白质溶液通过注射泵注射。液滴在毛细管尖端形成并被剪切掉，然后它们向水性外相移动，在那里它们变成GUV，类似于上述方法。 图2B 显示了使用这种方法封装反应混合物的囊泡。反应混合物含有6μM肌动蛋白，其被0.9μM的fascin捆绑。在这里，这两种方法及其结果没有进行比较，但请注意，它们都产生了高产率的GUV。
图1：用于生成GUV的实验设置。 （A）cDICE室的顶视图和侧截面视图。（B）旋转室设置的照片。（C-E）用于生成 GUV 的逐步程序的示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图2：肌动蛋白束结构的封装。 （A）图像显示了GUV的代表性荧光共聚焦切片（左）和肌动蛋白和脂质通道共聚焦z堆栈的最大投影（右）。筋膜， 2.5 μM;肌动蛋白，5μM（包括10%ATTO 488肌动蛋白）。比例尺 = 10 μm. （B） 使用常规 cDICE 封装肌动蛋白束结构。该图像显示了在筋膜存在下形成的封装肌动蛋白束的共聚焦荧光图像的代表性最大投影。筋膜，0.9 μM;肌动蛋白，6 μM.比例尺 = 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：3D打印轴设计。请点击此处下载此文件。
补充文件2：3D打印cDICE室的设计。请点击此处下载此文件。
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Discussion
已经探索了产生GUV的不同方法来创建合成细胞然而，程序的复杂性，获得封装的时间延长，密封剂的脂质类型和分子组成的限制，需要非生理化学物质来促进封装，低GUV产率以及封装效率的不一致一直困扰着该领域的研究人员。考虑到可以在自下而上的合成生物学中开展的广泛潜在研究，一种无缝的高通量GUV封装方法，与不同的脂质组成兼容，并且可以封装任何分子，无论大小如何，都可能激发研究复杂仿生合成系统的新机会。cDICE方法消除了先前GUV生成方法固有的大多数挑战和限制。
使用cDICE方法生成GUV的方法和管理原则早于该平台并且已经在诸如倒置乳液转移12的早期技术中实现。然而，倒置乳液转移方法具有囊泡产率低和囊泡异质性等局限性。对于这里介绍的cDICE方法，脂质以数十纳米的聚集体的形式分散在油中（脂质聚集体的大小取决于脂质的总浓度）24。脂质的分散存在于两种可混溶油中，其中一种（矿物油）可以溶解脂质，另一种油（硅油）不能与脂质混溶。这通过溶剂转移29的方式产生脂质聚集体共铿化物。这种特殊的分散方法有助于水性液滴的瞬时单层饱和，并且当水性液滴连续穿过脂质饱和的油水界面时，脂质在油水界面处的更快更新。这也随后改善了双层拉链以形成GUV并提高GUV吞吐量。旋转室产生的离心力最适合将多分散液滴穿穿脂饱和界面。cDICE方法的原始版本利用微毛细管喷嘴将内部溶液注入油脂混合物中。在这种方法中，由旋转的油脂混合物产生的剪切力产生水性液滴，最终转化为如上所述的GUV。然而，为了减少制备注射平台所需的时间，特别是对于快速反应，例如肌动蛋白网络组装和微毛细管的潜在堵塞，现在通过将油脂 - 脂质混合物直接添加到内部溶液中并上下移液来产生具有脂质单层的水性液滴。这种方法消除了GUV封装中的时间滞后，以实现快速反应实验。
早期GUV生成方法引起的挑战之一是限制脂质类型（脂质的电荷和脂质相位），这取决于GUV生成技术。测试多种脂质类型，包括DOPC，二油酰甘油 - 软管丝氨酸（DOPS），二油酰基甘油琥珀酸酯（DGS），二肉豆蔻酰 - 甘油 - 磷酸胆碱（DMPC），以及不同浓度的不同脂质和胆固醇的组合。对于所有条件，cDICE方法被证明可以形成具有高封装效率的GUV，同时具有始终如一的高GUV产率。此外，cDICE方法还被证明可以有效地封装不同的细胞成分，包括细胞骨架蛋白，无细胞表达反应，拥挤剂，染料和其他不同大小的细胞分子，而不会降低封装效率或降低通量。此外，像正常的倒置乳液转移方法30一样，改进的cDICE可以潜在地允许生成不对称的GUV用于未来的工作。不同的脂质组合物可用于内部小叶和外部小叶，因为在将双层在cDICE腔室内拉链之前，单层液滴是单独形成的（通过上下移液在微管内）。当脂质 - 油混合物长时间保持时，观察到脂质沉降;然而，人们可以简单地在封装之前涡旋脂质 - 油混合物以重新分散脂质聚集体。重要的是要注意，当脂质 - 油混合物保持更长时间时，包封质量可能会受到影响，如脂质 - 油混合物中比通常的脂质聚集体更重要所表明的那样。虽然没有经过测试，但这些聚集体可能会导致双层拉链的缺陷，并且这些聚集体也可能最终被内溶液封装，从而损害所需的化学环境。
所提出的形成水性液滴的改进方法的局限性在于产生液滴大小的均匀性。虽然这可以通过使用不同流速的微毛细管注射内部溶液来改善，以调节GUV大小，但不太需要监测快速反应，如封装GUV中的肌动蛋白组装。通过上下移液来制造液滴，产生不同的GUV大小，可以分析相似大小的囊泡群体。对双分子层中可能保持油的担忧阻碍了大多数GUV生成技术的采用，包括基于乳液的GUV生成技术，如cDICE21。然而，通过使用有机试剂例如1-辛醇可以减少膜中剩余的油的量，其可以在产生囊泡31，32后除去。需要研究未来对方法的修改，可能是通过改变溶剂成分。
自下而上的合成生物学中有许多领域尚未得到研究，可能需要对GUV进行细胞模拟限制。这种实验努力需要像cDICE这样的GUV生成平台来可靠地生成GUV，同时有效地封装各种感兴趣的分子。许多细胞过程的发生速度比使用先前的GUV生成技术封装分子所需的时间更快。如这里所述，肌动蛋白溶液被包封得足够快，以观察由肌动蛋白网络组装引起的囊泡变形。这种具有重组的肌动蛋白细胞骨架的合成细胞在存在不同的交联剂5，25，33和膜重塑25，27，28的情况下揭示了肌动蛋白网络组织的特征。它们将激发未来创造更复杂的合成细胞的工作。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
APL感谢洪堡研究奖学金对有经验的研究人员以及国家科学基金会（1939310和1817909）和美国国立卫生研究院（R01 EB030031）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
| 96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
| ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
| Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
| Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
| Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
| Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Fascin | homemade | N/A | |
| F-buffer | homemade | N/A | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
| G-buffer | homemade | N/A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
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